CN110325553B - 多硫酸戊聚糖、药物组合物及抗凝剂 - Google Patents

多硫酸戊聚糖、药物组合物及抗凝剂 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种多硫酸戊聚糖或其可药用盐或者它们的可药用溶剂化物，其中，多硫酸戊聚糖或其可药用盐或者它们的可药用溶剂化物的重均分子量为5000以下、并且乙酰基含量为0～2.0质量％。本发明的多硫酸戊聚糖或其可药用盐或者它们的可药用溶剂化物表现出适于实用的抗Xa活性和抗Xa/抗IIa活性比、作为抗凝剂等药物组合物是有用的。

Description

多硫酸戊聚糖、药物组合物及抗凝剂
技术领域
本发明涉及多硫酸戊聚糖、药物组合物及抗凝剂。
背景技术
以往，作为血栓症、骨关节病等的治疗药，使用肝素。但是，肝素由于为由牛、猪等动物性器官分离得到的物质，因此品质管理上存在困难。另外，由于宗教上的伦理观等而在治疗时有可能犹豫使用其。因此，要求开发替代肝素的无源自动物的成分的替代治疗药。
作为替代肝素的物质，例如已知多硫酸戊聚糖。多硫酸戊聚糖通过将源自植物的低聚木糖进行硫酸化来得到。这种多硫酸戊聚糖为无源自动物的成分的物质，因此作为替代肝素的治疗药，其应用值得期待(例如专利文献1)。
阔叶树的多缩木糖已知在天然状态下，相对于10个木糖，以5-7个的比率在2位或3位具有乙酰基(非专利文献1)。另外，专利文献2中公开了医药用途中使用的多硫酸戊聚糖含有在4位键合糖醛酸的同时、在3位乙酰基化的木糖单元。由专利文献3中公开的内容认为，作为多硫酸戊聚糖的活性公知的活性，都为含有一定量的乙酰基的多硫酸戊聚糖的活性。因此，仍然没有提供低乙酰基含量的多硫酸戊聚糖，也不知道其活性。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开第2010/000013号
专利文献2：国际公开第2014/114723号
非专利文献
非专利文献1：CMC-Group出版、“木材化学的技术(ウッドケミカルスの技術)”、2007年初版发行、第108页
发明内容
发明要解决的问题
本发明的目的在于，提供在医药用途具有优选活性的硫酸戊聚糖。
用于解决问题的方案
本发明人等发现，重均分子量低、低乙酰基含量的多硫酸戊聚糖与以往公知的多硫酸戊聚糖相比具有高的Xa抑制活性和/或抗Xa/抗IIa活性比，基于该发现，完成了本发明。
具体而言，本发明具有以下的技术特征。
[1]一种多硫酸戊聚糖或其可药用盐或者它们的可药用溶剂化物，其中，所述多硫酸戊聚糖或其可药用盐或者它们的可药用溶剂化物的重均分子量为5000以下、并且乙酰基含量为0～2.0质量％。
[2]根据[1]所述的多硫酸戊聚糖或其可药用盐或者它们的可药用溶剂化物，其中，所述多硫酸戊聚糖或其可药用盐或者它们的可药用溶剂化物的乙酰基含量为0～0.3质量％。
[3]根据[1]或[2]所述的多硫酸戊聚糖或其可药用盐或者它们的可药用溶剂化物，其中，所述多硫酸戊聚糖或其可药用盐或者它们的可药用溶剂化物的重均分子量为4000以下。
[4]根据[1]～[3]中任一项所述的多硫酸戊聚糖或其可药用盐或者它们的可药用溶剂化物，其具有以下的通式所示的结构。
Figure BDA0002179024730000031
上述通式中，R各自独立地为氢原子、-SO3X1，至少1个R为-SO3X1，X1为氢原子或者一价或二价的金属，X为氢原子或者一价或二价的金属，n1和n2各自独立地表示0以上且15以下的整数，n1和n2中的至少一者为1以上的整数。
[5]根据[4]所述的多硫酸戊聚糖或其可药用盐或者它们的可药用溶剂化物，其中，上述结构式中，X为钠。
[6]根据[1]～[5]中任一项所述的多硫酸戊聚糖或其可药用盐或者它们的可药用溶剂化物，其中，所述多硫酸戊聚糖或其可药用盐或者它们的可药用溶剂化物的分散度为1.00以上且1.20以下。
[7]一种药物组合物，其含有[1]～[6]中任一项所述的多硫酸戊聚糖或其可药用盐或者它们的可药用溶剂化物作为有效成分。
[8]一种抗凝剂，其含有[1]～[6]中任一项所述的多硫酸戊聚糖或其可药用盐或者它们的可药用溶剂化物作为有效成分。
从其它观点考虑，通过本发明提供：
一种血液凝固抑制方法，其包括适用[1]～[6]中任一项所述的多硫酸戊聚糖或其可药用盐或者它们的可药用溶剂化物的有效量的工序；
[1]～[6]中任一项所述的多硫酸戊聚糖或其可药用盐或者它们的可药用溶剂化物在制造抗凝剂中的应用；
[1]～[6]中任一项所述的多硫酸戊聚糖或其可药用盐或者它们的可药用溶剂化物在抑制血液凝固中的应用；以及
用于作为抗凝剂的使用的[1]～[6]中任一项所述的多硫酸戊聚糖或其可药用盐或者它们的可药用溶剂化物。
发明的效果
通过本发明，提供在医药用途具有优选活性的多硫酸戊聚糖。可以使用本发明的多硫酸戊聚糖来提供药物组合物和抗凝剂。
附图说明
图1为表示乙酰基含量不同的多硫酸戊聚糖的抗IIa活性和抗Xa活性的图。
具体实施方式
以下对于本发明进行详细说明。以下记载的构成要件的说明，有时基于代表性的实施方式、具体例来提出，但是本发明不被该实施方式所限定。
(多硫酸戊聚糖)
多硫酸戊聚糖为通过将低聚木糖的羟基的至少1个进行硫酸化而得到的化合物。本说明书中，多硫酸戊聚糖也包括多硫酸戊聚糖的盐以及多硫酸戊聚糖的溶剂化物和多硫酸戊聚糖的盐的溶剂化物。多硫酸戊聚糖盐优选为可药用盐，可列举出例如多硫酸戊聚糖钠、多硫酸戊聚糖钾、多硫酸戊聚糖钙等。溶剂化物优选为可药用溶剂化物，作为溶剂，可列举出例如水。
源自酸性低聚木糖的多硫酸戊聚糖具有以下的通式所示的结构。本发明的多硫酸戊聚糖可以含有以下的通式所示的结构1个、也可以含有以下的通式所示的结构2个以上。含有以下的通式所示的结构2个以上的情况下，以下的结构形成表示多硫酸戊聚糖的重复单元的结构。
Figure BDA0002179024730000051
在此，本发明的多硫酸戊聚糖在上述通式中，R各自独立地为氢原子、-COCH3、-SO3X1，至少1个R为-SO3X1。X1为氢原子或者一价或二价的金属，优选为氢原子、钠、钾或钙，更优选钠、钾或钙，特别优选钠。X为氢原子或者一价或二价的金属，优选为钠、钾或钙，特别优选钠。另外，n1和n2各自独立地表示0以上且15以下的整数，n1和n2中的至少一者为1以上的整数。
本发明的多硫酸戊聚糖在上述通式中，n1+n2优选为1～15、更优选2～12、进一步优选3～9。
上述通式中，X优选为一价或二价的金属、优选为可药用的多硫酸戊聚糖的盐。例如X优选为钠、钾或钙，此时多硫酸戊聚糖的盐为多硫酸戊聚糖钠、多硫酸戊聚糖钾、多硫酸戊聚糖钙。其中，多硫酸戊聚糖的盐特别优选为多硫酸戊聚糖钠。
本发明的多硫酸戊聚糖可以含有上述通式所示的结构1个、也可以含有上述通式所示的结构2个以上。含有上述结构式所示的结构2个以上的情况下，上述结构形成表示多硫酸戊聚糖的重复单元的结构。
本发明的多硫酸戊聚糖中，作为上述通式所示的结构的末端、没有与上述通式所示的结构键合的部分只要形成-OR即可。即，只要在上述通式的左末端(n1侧)键合-OR、在上述通式的右末端(n2侧)键合-R即可。
本发明的多硫酸戊聚糖通过将酸性低聚木糖进行硫酸化来得到。在此，酸性低聚木糖为在低聚木糖1分子中的至少任意一个木糖单元键合至少1个糖醛酸而成的。即，酸性低聚木糖在低聚木糖1分子中具有至少1个以上的糖醛酸残基作为侧链。需要说明的是，酸性低聚木糖每1分子的糖醛酸残基平均数优选为1以上且3以下、更优选1以上且2以下。在此，酸性低聚木糖1分子中含有的糖醛酸残基数可以通过咔唑硫酸法、使用了四硼酸钠的比色法测定。
若基于上述的国际公开第2014/114723号和木材化学的技术(CMC-Group出版)的记载，则认为公知的多硫酸戊聚糖含有一定量的键合有糖醛酸残基的同时、键合有乙酰基(-COCH3)的木糖单元。本发明的多硫酸戊聚糖的乙酰基的含量降低，特别是如上所述与特定的木糖单元键合的乙酰基含量也降低。
具体而言，本发明的多硫酸戊聚糖的乙酰基含量为0～2.0质量％。本发明的多硫酸戊聚糖的乙酰基含量优选为0～1.0质量％、更优选0～0.4质量％、进一步优选0～0.3质量％、特别优选实质上为0质量％。即，本发明的多硫酸戊聚糖特别优选在上述通式中实质上不含有作为-COCH3的R。
多硫酸戊聚糖中的乙酰基含量如实施例所示，可以由1H-NMR测定中的峰的积分比算出。具体而言，首先使用含有特定量的多硫酸戊聚糖和特定量的内标物质的1H-NMR测定溶液进行1H-NMR测定。在所得到的光谱中，比较内标物质的特定基团的峰与乙酰基的峰的积分比，求出溶液中的乙酰基摩尔量。然后，将乙酰基摩尔量乘以43得到的值除以另外得到的平均分子量，由此时得到的值可以求出质量％。
本发明的多硫酸戊聚糖中含有的硫含量优选为10.0质量％以上、更优选12.0质量％以上、进一步优选15.5质量％以上、特别优选16.5质量％以上。另外，多硫酸戊聚糖中含有的硫含量优选为20.0质量％以下。在此，多硫酸戊聚糖中含有的硫含量为利用日本药典中记载的氧瓶燃烧法测定得到的值。
本发明的多硫酸戊聚糖的重均分子量(Mw)为5000以下、优选4000以下。如后述的实施例所示，对于重均分子量(Mw)5000以下、特别是4000以下的本发明的多硫酸戊聚糖而言，在医药用途中，可以得到更优选的活性。本发明的多硫酸戊聚糖的重均分子量(Mw)例如也可以为3900以下、也可以为3800以下、也可以为3750以下。此时，多硫酸戊聚糖的重均分子量(Mw)的下限值优选为1000。
多硫酸戊聚糖的数均分子量(Mn)优选为5000以下、例如也可以为4000以下、也可以为3900以下、也可以为3800以下、也可以为3750以下。此时，多硫酸戊聚糖的数均分子量(Mn)的下限值优选为300。
本发明的多硫酸戊聚糖的重均分子量(Mw)和数均分子量(Mn)可以利用GPC(凝胶渗透色谱)测定。作为GPC色谱柱，可以使用TOSOH CORPORATION制的TSKgel G2000SWXL。另外，作为GPC的条件，例如采用下述条件。
洗脱液：300mM氯化钠/50mM乙酸钠缓冲液(pH 4.0)
流速：1mL/分钟
测定温度：40℃
检测器：差示折射率检测器
分析时间：15分钟
本发明的多硫酸戊聚糖的分散度优选为1.00以上且1.40以下、更优选1.00以上且1.35以下。另外，多硫酸戊聚糖的分散度也优选为1.00以上且1.20以下。在此，多硫酸戊聚糖的分散度(D)通过以下式子算出。
分散度(D)＝重均分子量(Mw)/数均分子量(Mn)
通过后述的制造方法得到的多硫酸戊聚糖发现纯度高、分子量分布狭窄的倾向。另外，通过后述的制造方法得到的多硫酸戊聚糖的品质稳定性优异。
(多硫酸戊聚糖的用途：药物组合物、抗凝剂)
本发明的多硫酸戊聚糖可以用于药物、食品、化妆品等用途。例如可以提供含有本发明的多硫酸戊聚糖(多硫酸戊聚糖或其可药用盐或者它们的溶剂化物)作为有效成分的药物组合物。特别是多硫酸戊聚糖具有抗凝活性，因此上述药物组合物可以用作抗凝剂。
通常，抗凝活性基于凝血因子的抑制活性。即，抗凝活性高的状态下，血液的凝固反应得到抑制。凝血因子指的是出血时等用于生物体凝固血液的一系列的分子的作用系，通过许多凝血因子相继活化而使纤维蛋白凝集，进行出血部的止血。作为凝血因子的代表性的例子，可列举出例如Xa因子、IIa因子等，通过抑制这些因子的活性，可以抑制血液的凝固。
多硫酸戊聚糖的Xa因子的抑制活性(抗Xa活性)优选为0.10IU/mg以上、更优选0.12IU/mg以上。
另外，多硫酸戊聚糖的IIa因子的抑制活性(抗IIa活性)优选为0.50IU/mg以下、更优选0.40IU/mg以下、进一步优选0.30IU/mg以下。
在此，Xa因子的抑制活性(抗Xa活性)可以使用Testzym(注册商标)肝素S(SEKISUIMEDICAL CO.,LTD.制)测定。
另外，IIa因子的抑制活性(抗IIa活性)可以使用Biophen heparin anti-IIa(Hyphen Biomed公司制)测定。
多硫酸戊聚糖的Xa因子的抑制活性(抗Xa活性)与IIa因子的抑制活性(抗IIa活性)的活性比优选处于规定的范围内。具体而言，抗Xa活性/抗IIa活性的值优选为0.50以上、更优选1.00以上、进一步优选1.10以上、进一步优选1.20以上。
本发明的多硫酸戊聚糖可以将抗Xa活性、抗IIa活性、和抗Xa活性/抗IIa活性的值控制于上述范围内。即，本发明的多硫酸戊聚糖与抗Xa活性相比，可以将抗IIa活性抑制得低。通过将抗Xa活性/抗IIa活性的值控制于上述范围内，可以更有效地提高抗凝活性，可以抑制出血风险增大或者血小板减少等副作用的产生。
含有本发明的多硫酸戊聚糖的药物组合物例如可以用作医疗器材或医疗材料的表面处理剂。例如可以用作植入型人造器官、人造血管、导管、支架、血袋、隐形眼镜、眼内透镜、手术用辅助器具的表面处理剂。作为将药物组合物固定于医疗器材或医疗材料的表面的方法，可列举出例如使医疗器材或医疗材料与药物组合物接触、向其照射辐射线的方法等。
另外，药物组合物也可以用作经口给药剂、外用剂。
(多硫酸戊聚糖的制造方法)
本发明的多硫酸戊聚糖作为一例，可以通过包括由源自植物的原料得到酸性低聚木糖的第1工序和由酸性低聚木糖得到多硫酸戊聚糖的第2工序的同时、包括脱乙酰基化工序的多硫酸戊聚糖的制造方法得到。在此，第1工序包括将源自植物的原料解聚的工序。通过源自植物的原料的解聚工序和硫酸化工序为这种顺序，可以有效地制造多硫酸戊聚糖。进而通过包括脱乙酰基化工序，能够降低低乙酰基含量的多硫酸戊聚糖的制造成本，可以更廉价地提供多硫酸戊聚糖。
＜源自植物的原料＞
本发明中，酸性低聚木糖通过将源自植物的原料解聚来得到。作为源自植物的原料，可列举出例如源自木材的原料、源自种子的原料、源自谷物的原料、源自果实的原料等。另外，作为源自植物的原料，也可以使用棉绒、皮棉等棉花、洋麻、麻、苎麻、稻秆等草本系植物等。作为源自植物的原料，也可以将上述的各源自植物的原料组合来使用。
其中，作为源自植物的原料，优选使用源自木材的原料。作为源自木材的原料，可列举出例如针叶树、阔叶树等的木材原料。作为源自木材的原料，优选使用选自针叶树和阔叶树中的至少一种、更优选使用阔叶树。需要说明的是，作为源自木材的原料，也可以使用针叶树和阔叶树的混合物。另外，作为源自木材的原料，可以使用树皮。
作为阔叶树，可列举出山毛榉、蓝桉、巨桉、尾巨桉(Eucalyptus urograndis)、粗皮桉(Eucalyptus pellita)、褐桉(Eucalyptus brassiana)、黑荆(Acacia mearnsii)等。作为针叶树，可列举出柳杉、扁柏、松树、丝柏、日本铁杉等。
源自木材的原料的比重优选为450kg/m3以上且700kg/m3以下、更优选500kg/m3以上且650kg/m3以下。通过源自木材的原料的比重处于上述范围内，可以进一步提高酸性低聚木糖的生产效率。
源自木材的原料优选为将上述木材破碎而成的木片。通过使用木片作为源自植物的原料，可以有效地进行源自植物的原料的解聚，可以提高酸性低聚木糖的生产效率。
＜第1工序＞
[解聚工序]
将源自植物的原料解聚的工序为将源自植物的原料在化学上和/或物理上分解、生成酸性低聚木糖的工序。作为化学上和/或物理上分解的工序，可列举出例如加热处理工序、碱处理工序、酸处理工序、酶处理工序、离子液体处理工序、催化剂处理工序等。其中，进行解聚的工序优选为选自加热处理工序和酶处理工序中的至少任意一种、更优选加热处理工序。另外，加热处理工序可以为加热加压工序。
解聚工序优选在非碱性条件下(本说明书中，指的是pH 9以下、优选pH 8以下、更优选pH 7以下)进行。
加热处理工序为将源自植物的原料在溶液的存在下加热的工序。这种加热处理工序中，源自植物的原料被水解，因此加热处理工序有时被称为水解处理工序、前水解处理工序。加热处理工序中使用的溶液优选为水，水相对于源自植物的原料的比率(质量比)优选为1:1～1:10。通过水相对于源自植物的原料的比率处于上述范围内，可以有效地进行水解反应。需要说明的是，加热处理工序中使用的水可以与源自植物的原料不同另外地添加的水分，但是其一部分也可以为源自植物的原料中本来含有的水分。
加热处理工序中，除了源自植物的原料和水之外，也可以添加其它药品。作为其它药品，可列举出例如碱、酸、螯合剂。另外，也可以添加氧化抑止剂、色调控制(pitchcontrol)剂、离子液体等直接地·间接地辅助多糖的解聚的药品。
加热处理工序为将源自植物的原料在水的存在下加热的工序，此时的加热温度(液温)优选为30℃以上、更优选50℃以上、进一步优选75℃以上、更进一步优选90℃以上、特别优选100℃以上、最优选120℃以上。另外，加热温度(液温)优选为300℃以下、更优选250℃以下、进一步优选200℃以下。
加热处理工序中的处理时间可以根据处理温度适当确定。处理时间例如优选为5分钟以上、更优选10分钟以上、进一步优选20分钟以上。需要说明的是，下述式所示的P因子为加热处理时的温度和时间的乘积，优选将P因子调整到优选范围内。
Figure BDA0002179024730000111
上述式中，P表示P因子、T表示绝对温度(℃+273.5)、t表示加热处理时间、KH1(T)/K100℃表示配糖体键的水解的相对速度。
加热处理工序中，优选P因子为200以上、更优选250以上、进一步优选300以上。需要说明的是，P因子优选为1000以下。加热处理工序中，通过适当调整P因子，可以使酸性低聚木糖的平均聚合度处于所希望的范围内。通过酸性低聚木糖的平均聚合度的调整，将重均分子量调整到2000以下、优选1600以下，由此可以将所得到的多硫酸戊聚糖的分子量调整到5000以下、优选4000以下。
加热处理工序中，含有源自植物的原料的溶液的pH优选为9以下、更优选8以下、进一步优选7以下。即，加热处理工序优选在非碱性条件下进行。需要说明的是，上述的pH的值为进行加热处理之前的溶液的pH。
加热处理工序中，源自原料的酸离解，可以至少一部分进行酸水解。作为源自植物原料的酸，可列举出例如乙酸、甲酸等有机酸。此时，含有酸水解后的源自植物的原料的溶液的pH进一步降低。
多硫酸戊聚糖的制造方法中，作为最初的工序，优选设置加热处理工序。由此可以提高酸性低聚木糖的生产效率，进而可以提高多硫酸戊聚糖的制造效率。通过设置加热处理工序作为最初的工序，与以往方法相比，可以大幅减少直至得到酸性低聚木糖为止的工序数。另外，通过在非碱性条件下设置加热处理工序作为最初的工序，己烯糖醛酸不会置换为酸性低聚木糖，可以有效地生产着色得到抑制的酸性低聚木糖。
本发明中，解聚工序优选为加热处理工序，但是也可以采用加热处理工序以外的工序。例如解聚工序为酶处理工序的情况下，解聚工序包含将源自植物的原料和酶混合的工序。作为酶，例如可以使用半纤维素酶等。具体而言，可以使用商品名Cellulosine HC100(HBI Enzymes Inc.制)、商品名Cellulosine TP25(HBI Enzymes Inc.制)、商品名Cellulosine HC(HBI Enzymes Inc.制)、商品名Cartazyme(Clariant公司制)、商品名Eco-Pulp(ROHM ENZYME株式会社制)、商品名Sumizyme(新日本化学工业株式会社制)、Pulpzyme(Novo Nordisk公司制)、Multifect 720(Genencor公司)等市售的酶制剂，利用木霉(Trichoderma)属、嗜热真菌(Thermomyces)属、短梗霉(Aureobasidium)属、链霉菌(Streptomyces)属、曲霉(Aspergillus)属、梭菌(Clostridium)属、芽胞杆菌(Bacillus)属、栖热孢菌(Thermotoga)属、热子囊菌(Thermoascus)属、热纤维菌(Caldocellum)属、高温单孢菌(Thermomonospora)属等微生物生产的木聚糖酶。
酶处理工序中，向源自植物的原料和水混合而成的溶液添加酶。此时的溶液的温度优选为10℃以上且90℃以下、更优选30℃以上且60℃以下。需要说明的是，溶液的温度优选为接近于所使用的酶的最适温度的温度。另外，溶液的pH也调整于酶的活性提高这样的范围内，例如优选将pH调整为3以上且10以下。
另外，解聚工序为碱处理工序、酸处理工序的情况下，包括将源自植物的原料和碱溶液或酸溶液混合的工序。碱处理工序中，优选添加氢氧化钠、氢氧化钾。另外，酸处理工序中，优选添加盐酸、硫酸、乙酸等。需要说明的是，这种情况下也可以适当进行加热、加压。
解聚工序为选自酶处理工序、碱处理工序和酸处理工序中的至少任意一种的情况下，有时在该处理工序之后还设置压榨工序、萃取工序、加热工序、过滤工序、分离工序、纯化工序、浓缩工序、脱盐工序等。另外，有时需要在该处理工序之后设置低分子化工序。需要说明的是，作为其它工序，可列举出日本特开2003-183303号公报中记载的工序，这些内容被引进到本说明书。
[过滤工序]
第1工序在上述解聚工序之后可以还包括过滤工序。过滤工序中，分离为源自植物的原料的固体成分、和除了固体成分之外的溶液。具体而言，通过在解聚工序之后设置过滤工序，分离为成为浆粕原料的固体成分和滤液。需要说明的是，成为浆粕原料的固体成分经过作为后工序的蒸煮工序等，由此形成纤维素原料(溶解浆粕)。
所回收的滤液可以分为气体层和液层。气体层含有很多糠醛类，因此通过将它们回收，可以分离糠醛类。另一方面，液层含有很多包含酸性低聚木糖、中性低聚木糖的半纤维素。后述的工序中，可以将该液层中含有的酸性低聚木糖分离纯化。
[分离纯化工序]
第1工序在上述解聚工序之后可以还包括分离纯化工序。第1工序包括上述过滤工序的情况下，分离纯化工序优选设置于过滤工序之后。
第1工序中，可以在刚进行解聚的工序之后设置分离纯化工序，但是优选在进行解聚的工序之后设置过滤工序、设置由所得到的滤液将酸性低聚木糖分离纯化的工序。需要说明的是，过滤工序可以作为分离纯化工序的一部分设置、也可以作为与分离纯化工序不同的独立的一个工序设置。分离纯化工序为将酸性低聚木糖分离纯化的工序。过滤工序中得到的滤液中，除了酸性低聚木糖之外，还含有中性低聚木糖等，因此分离纯化工序也为根据需要将这些其它糖类去除的工序。
分离纯化工序中，例如优选采用离子交换色谱、亲和色谱、凝胶过滤、离子交换处理、NF膜处理、UF膜处理、RO膜处理、活性炭处理等方法。分离纯化工序中，也优选将多种上述方法组合来进行。其中，在分离纯化工序中进行离子交换色谱，由此可以将酸性低聚木糖选择性地分离纯化。离子交换色谱中，通过吸附酸性低聚木糖，可以由糖液(滤液)主要取出酸性低聚木糖。具体而言，将糖液首先用强阳离子交换树脂进行处理、去除糖液中的金属离子。接着使用强阴离子交换树脂将糖液中的硫酸根离子等去除。接着用弱阴离子交换树脂进行处理、使酸性低聚木糖吸附于树脂。吸附于树脂的酸性低聚糖通过低浓度的盐(NaCl、CaCl2、KCl、MgCl2等)洗脱，由此可以得到夹杂物少的酸性低聚木糖液。
[浓缩工序]
第1工序可以还包括浓缩工序。浓缩工序例如优选设置于过滤工序之后、分离纯化工序之前。通过设置这种浓缩工序，可以更有效地进行分离纯化工序，可以提高多硫酸戊聚糖的生产效率。
作为浓缩工序，可列举出例如使用了NF膜、超滤膜、反渗透膜等的膜处理工序、利用了蒸发等的浓缩工序等。
浓缩工序中，优选进行浓缩以使酸性低聚木糖的含量相对于浓缩液的总质量为10％以上且80％以下、优选进行浓缩以使酸性低聚木糖的含量相对于浓缩液的总质量为20％以上且60％以下。
[脱水工序]
第1工序中得到的酸性低聚木糖可以作为酸性低聚木糖液得到，但是也可以通过经过脱水工序，作为酸性低聚木糖浓缩物、酸性低聚木糖粉末得到。制造酸性低聚木糖粉末的情况下，优选在分离纯化工序之后还设置粉末化工序。本发明中，通过设置脱水工序，可以有效地进行后述的硫酸化工序中的硫酸化。
粉末化工序中，通过对于分离纯化工序中得到的酸性低聚木糖液，例如使用喷雾干燥器、冷冻干燥机、热风干燥机、水溶性的有机溶剂等进行处理，可以得到酸性低聚木糖粉末。
＜第2工序＞
[硫酸化工序]
第2工序中，将上述那样的工序中得到的酸性低聚木糖进行硫酸化。通过将第1工序中得到的酸性低聚木糖进行硫酸化，得到多硫酸戊聚糖。
供于硫酸化的酸性低聚木糖的平均聚合度优选根据作为最终产物得到的多硫酸戊聚糖的分子量适当调整。
酸性低聚木糖的平均聚合度可以通过酸性低聚木糖的总糖量除以还原糖量来算出。算出总糖量时，首先将酸性低聚木糖液保持于50℃、以15000rpm进行15分钟离心分离。然后利用苯酚硫酸法(“还原糖的定量法”学会出版中心发行)将上清液的总糖量定量。此时，所使用的标准曲线使用D-木糖(和光纯药工业)制成。另外利用Somogi-Nelson法(“还原糖的定量法”学会出版中心发行)将还原糖量定量。此时所使用的标准曲线也使用D-木糖(和光纯药工业)制成。
硫酸化工序中，向酸性低聚木糖液加入硫酸或硫酸衍生物、进行硫酸化。作为硫酸衍生物，可列举出例如三氧化硫·吡啶络合物、氯磺酸等。此时，酸性低聚木糖液的浓度优选为0.1质量％以上且20质量％以下，优选向这种浓度的酸性低聚木糖液以0.1质量％以上且50质量％以下添加硫酸。添加硫酸之后的酸性低聚木糖液的pH优选为1以上且9以下。
[硫酸化后纯化工序]
第2工序在硫酸化之后可以还包括硫酸化后纯化工序。通过设置这种硫酸化后纯化工序，可以得到纯度高的多硫酸戊聚糖。
硫酸化后纯化工序中，例如优选采用离心分离、膜过滤、透析、水溶性有机溶剂处理、活性炭处理等方法。其中，水溶性有机溶剂处理和活性炭处理由于可以将经过硫酸化的多硫酸戊聚糖选择性地分离纯化，因此优选使用。
[粉末化工序]
第2工序中，经过硫酸化的多硫酸戊聚糖可以作为多硫酸戊聚糖溶液得到，但是也可以通过经过粉末化工序、作为多硫酸戊聚糖粉末得到。制造多硫酸戊聚糖粉末的情况下，优选在硫酸化后纯化工序之后还设置进行粉末化的工序。
作为粉末化工序，对于硫酸化后纯化工序中得到的多硫酸戊聚糖溶液，例如使用喷雾干燥器、冷冻干燥机、热风干燥机、水溶性的有机溶剂等进行处理，由此可以得到多硫酸戊聚糖粉末。
＜脱乙酰基化工序＞
脱乙酰基化工序若在解聚工序之后的任意一阶段中包括即可。通过脱乙酰基化工序，可以降低多硫酸戊聚糖所具有的乙酰基含量。具体而言，脱乙酰基化工序是为了使含有酸性低聚木糖等基于源自植物的原料得到的物质的溶液(本说明书中也称为“含有酸性低聚木糖等的溶液”)为pH 11以上而添加碱的工序。脱乙酰基化工序中，若解聚后得到的溶液、过滤工序中得到的滤液、分离纯化工序后且硫酸化工序前的含有酸性低聚木糖的溶液、或硫酸化工序后的含有酸性低聚木糖(多硫酸戊聚糖)的溶液等为pH 11以上即可。它们之中，分离纯化工序后且硫酸化工序前的含有酸性低聚木糖的溶液为pH11以上的情况下，可以得到稳定品质且乙酰基含量降低了的多硫酸戊聚糖，另外，键合乙酰基的部位也可以硫酸化，因此能够改善硫酸化的效率、进而多硫酸戊聚糖的制造效率。另外，硫酸化工序后的含有酸性低聚木糖(多硫酸戊聚糖)的溶液为pH 11以上的情况下，可以将纯化工序效率化。含有酸性低聚木糖等的溶液优选为水溶液。本说明书中，含有酸性低聚木糖的溶液也有时称为酸性低聚木糖液。
脱乙酰基化工序中适用的pH优选为11～14、更优选12～13。被附着脱乙酰基化工序的溶液优选在pH 11以上维持0.5小时以上、更优选在pH 11以上维持1.0小时以上、进一步优选在pH 11以上维持2.0小时以上、特别优选在pH 11以上维持3.0小时以上。特别是pH不足12时优选维持1.0小时以上。作为特别优选的条件，可列举出在pH 12～13维持3小时以上的条件。
维持于上述pH期间，上述溶液优选被搅拌。对于维持于上述pH期间的温度条件没有特别限定，但是优选为室温。
脱乙酰基化工序中，向被附着脱乙酰基化工序的(含有酸性低聚木糖的溶液等)添加碱即可。所添加的碱只要可以达成目的的pH则没有特别限定，但是优选为氢氧化钠。
脱乙酰基化工序在上述pH下的维持后可以包括将通过碱的添加而形成pH 11以上的溶液调整为不足pH 11的pH调整工序。pH调整工序中，例如若调整为pH 9以下、pH 8以下、pH 7以下、pH 6以下、pH 5以下、pH 4以下等即可。调整若通过酸的添加进行即可。作为酸，可列举出盐酸。
脱乙酰基化工序也优选在上述pH调整工序之后包括脱盐工序。脱盐例如可以使用透析膜、NF膜进行。
脱乙酰基化工序进而为了此后的处理，可以包括将产物进行粉末化的工序。
＜其它工序＞
[分子量调整工序]
在上述第1工序与第2工序之间可以设置分子量调整工序。分子量调整工序可以为脱乙酰基化工序的之前或之后。分子量调整工序中，调整第1工序中得到的酸性低聚木糖的分子量。例如分子量调整工序中，优选将酸性低聚木糖进行低分子化而使重均分子量为2000以下、更优选1600以下。
分子量调整工序中，例如通过进行酸处理、碱处理、酶处理、NF膜处理、UF膜处理、RO膜处理、凝胶过滤处理、活性炭处理、离子交换处理、电透析处理等，可以得到所希望的重均分子量的多硫酸戊聚糖。另外，分子量调整工序中，可以采用通过进行膜处理等、将所希望的重均分子量的多硫酸戊聚糖选择性地回收的方法。
[分子量调整后分离纯化工序]
多硫酸戊聚糖的制造方法优选在分子量调整工序之后还包括分子量调整后分离纯化工序。作为分子量调整后分离纯化工序，可列举出例如凝胶过滤、离子交换处理、NF膜处理、UF膜处理、RO膜处理、电透析处理、活性炭处理、水溶性有机溶剂处理、色谱处理等。通过设置这种分子量调整后分离纯化工序，可以将分子量调整工序中得到的具有所希望的分子量的酸性低聚木糖选择性地回收，可以有效地得到分子量分布窄的多硫酸戊聚糖。
实施例
以下列举出制造例对于本发明的特征进行更具体说明。以下的制造例所示的材料、用量、比率、处理内容、处理步骤等只要不脱离本发明的宗旨则可以适当变更。因此，本发明的范围不应该被以下所示的具体例限定性地解释。
(实施例1～5：乙酰基含量的影响)
＜酸性低聚木糖的制造＞
对于木片(阔叶树)10质量份添加水40质量份，160℃下进行3小时加热处理。然后，利用螺杆加压机(新菱制作所制：250×1000SPH-EN)进行固液分离，回收滤液。将滤液用微米率1μm的袋滤器(ISP Filters株式会社制)过滤，添加活性炭(三仓化成株式会社制：PM-SX)5质量份在50℃下处理2小时后，进一步用微米率0.2μm的陶瓷过滤器(PallCorporation制)连同活性炭进行过滤，回收澄清的滤液。将澄清滤液用反渗透膜(日东电工株式会社制：NTR-7450)浓缩到20倍而得到浓缩糖液后，将该浓缩糖液以SV1.5通液于包含强阳离子树脂(三菱化学株式会社制：PK-218)、弱阴离子树脂(三菱化学株式会社制：WA30)、强阳离子树脂(三菱化学株式会社制：PK-218)、弱阴离子树脂(三菱化学株式会社制：WA30)的4床4塔式的离子交换树脂，在第2塔及第4塔的弱阴离子树脂吸附酸性低聚木糖，然后将50mM氯化钠水溶液以SV1.5通液于第2塔及第4塔，由此回收平均聚合度不足8的酸性低聚木糖溶液。在所得到的酸性低聚木糖溶液添加氢氧化钠以形成表中记载的pH，以表中记载的时间进行搅拌进行脱乙酰基化。在所得到的液体添加盐酸以使pH不足5，用透析膜(SPECTRUM公司制：Spectra/Por)进行脱盐。使用冷冻干燥机(EYELA公司制)将所得到的酸性低聚木糖液进行粉末化。
＜多硫酸戊聚糖钠的制造＞
在100mL可拆式烧瓶中加入N,N-二甲基甲酰胺10mL、三氧化硫·吡啶络合物2.4g和利用前述方法制造的酸性低聚木糖粉末0.3g，在40℃下进行3小时反应。冷却后，将所得到的反应混合物滴加到500mL的乙醇中，过滤得到所生成的沉淀物，加入水30mL溶解。向该液体加入氢氧化钠溶液将pH调整到10。将该液体滴加到500mL的乙醇中得到析出物，过滤得到析出物，然后加入50mL的水而溶解析出物，加入活性炭进行搅拌后过滤。滤液用蒸发器浓缩，使用冷冻干燥机(EYELA公司制)进行粉末化。
＜乙酰基含量＞
将3-三甲基甲硅烷基丙酸钠-2,2,3,3-d4(ISOTEC公司)35mg溶解于重水(关东化学株式会社)，使用25mL量瓶定容，制成内标溶液。称量实施例和比较例的戊聚糖多硫酸钠30mg，溶解于内标溶液1mL而调整NMR用溶液。将所得到的溶液转移到NMR样品管(关东化学株式会社)，通过FT-NMR(JNM-LA400：日本电子株式会社)进行1H-NMR测定。由内标物质的三甲基甲硅烷基峰和戊聚糖多硫酸钠的乙酰基峰的积分比算出乙酰基含量。
＜重均分子量＞
表1中记载的多硫酸戊聚糖的重均分子量(Mw)通过GPC(凝胶渗透色谱)测定。作为GPC色谱柱，将YMC CO.,LTD.制的YMC-Pack Diol-300和YMC-Pack Diol-60连接来使用，在下述条件下测定。
洗脱液：25mM磷酸二氢钾/25mM磷酸氢二钾/50mM氯化钾
流速：0.7mL/分钟
测定温度：40℃
检测器：差示折射率检测器
分析时间：40分钟
＜硫含量＞
利用日本药典中记载的氧瓶燃烧法测定多硫酸戊聚糖钠的硫含量。
＜抗Xa活性的测定＞
使用Testzym(注册商标)肝素S(SEKISUI MEDICAL CO.,LTD制)测定多硫酸戊聚糖钠的抗Xa活性。
＜抗IIa活性的测定＞
使用Biophen heparin anti-IIa(Hyphen Biomed公司制)测定多硫酸戊聚糖钠的抗IIa活性。
[表1]
Figure BDA0002179024730000211
表1中的抗IIa活性和抗Xa活性也示于图中(图1)。
由表1及图1所示结果可知，低乙酰基含量的实施例的多硫酸戊聚糖钠表现出优选的抗Xa/抗IIa活性比的同时、抗Xa活性比没有经过脱乙酰基化处理的比较例的多硫酸戊聚糖钠高。
比较例1及实施例5的条件下由酸性低聚木糖粉末得到多硫酸戊聚糖钠粉末时的收率分别如表2所示。
[表2]
Figure BDA0002179024730000212
(实施例6～8：分子量的影响)
(实施例6)
＜酸性低聚木糖的制造＞
对于木片(阔叶树)10质量份添加水40质量份，160℃下进行3小时加热处理。然后，利用螺杆加压机(新菱制作所制：250×1000SPH-EN)进行固液分离，回收滤液。将滤液用微米率1μm的袋滤器(ISP Filters株式会社制)过滤，添加活性炭(三仓化成株式会社制：PM-SX)5质量份在50℃下处理2小时后，进一步用微米率0.2μm的陶瓷过滤器(PallCorporation制)连同活性炭进行过滤，回收澄清的滤液。将澄清滤液用反渗透膜(日东电工株式会社制：NTR-7450)浓缩到20倍而得到浓缩糖液后，将该浓缩糖液以SV1.5通液于包含强阳离子树脂(三菱化学株式会社制：PK-218)、弱阴离子树脂(三菱化学株式会社制：WA30)、强阳离子树脂(三菱化学株式会社制：PK-218)、弱阴离子树脂(三菱化学株式会社制：WA30)的4床4塔式的离子交换树脂，在第2塔及第4塔的弱阴离子树脂吸附酸性低聚木糖，然后将50mM氯化钠水溶液以SV1.5通液于第2塔及第4塔，由此回收酸性低聚木糖溶液。向所得到的酸性低聚木糖溶液添加氢氧化钠以使pH为13，搅拌3小时进行脱乙酰基化。在所得到的液体中添加盐酸以使pH不足5，用透析膜(SPECTRUM公司制：Spectra/Por)进行脱盐。使用冷冻干燥机(EYELA公司制)将所得到的酸性低聚木糖液进行粉末化。
＜多硫酸戊聚糖钠的制造＞
在100mL可拆式烧瓶中加入N,N-二甲基甲酰胺25mL、三氧化硫·吡啶络合物10g和利用前述方法制造的酸性低聚木糖粉末2g，在40℃下进行3小时反应。冷却后，将所得到的反应混合物滴加到200mL的乙醇中，过滤得到所生成的沉淀物，加入水10mL溶解。向该液体加入氢氧化钠溶液将pH调整到10。将该液体滴加到200mL的乙醇中得到析出物，过滤得到析出物。然后向析出物加入10mL的水进行溶解，加入活性炭进行搅拌后过滤。将所得到的滤液滴加到200mL的乙醇中、过滤得到析出物这种操作重复3次进行纯化。如此得到实施例6的多硫酸戊聚糖钠。
(实施例7)
＜酸性低聚木糖的制造＞中，对于木片(阔叶树)10质量份添加水40质量份，160℃下进行2小时加热处理，除此之外与实施例6同样地得到多硫酸戊聚糖钠。
(实施例8)
＜酸性低聚木糖的制造＞中，对于木片(阔叶树)10质量份添加水40质量份，150℃下进行2小时加热处理，除此之外与实施例6同样地得到多硫酸戊聚糖钠。
(比较例2)
使用市售品(源自山毛榉)的多硫酸戊聚糖钠作为多硫酸戊聚糖钠。
(比较例3)
对于木片(阔叶树)10质量份添加3N氢氧化钠50重量份，155℃下进行2小时加热处理。然后，利用螺杆加压机(新菱制作所制：250×1000SPH-EN)进行固液分离。将在此得到的固体残留物用离子交换水洗涤3次。对于所得到的固体残留物10重量份添加1N氢氧化钠100质量份，70℃下进行3小时加热处理。然后利用螺杆加压机(新菱制作所制：250×1000SPH-EN)进行固液分离，回收滤液。向该滤液加入1N盐酸进行中和，过滤获得所得到的析出物。所得到的析出物用离子交换水充分洗涤后，减压干燥，除此之外与实施例6同样地得到多硫酸戊聚糖钠。
(比较例4)
由市售品的Cartrophen vet(注册商标)(DS Pharma Animal Health Co.,Ltd.制)利用透析膜(SPECTRUM公司制：Spectra/Por)进行脱盐后，使用冷冻干燥机(EYELA公司制)进行粉末化而得到多硫酸戊聚糖钠。
(分析和评价)
实施例6～8、比较例2～4中得到的多硫酸戊聚糖钠的重均分子量(Mw)利用GPC(凝胶渗透色谱)测定。作为GPC色谱柱，使用TOSOH CORPORATION制的TSKgel G2000SWXL，在下述条件下测定。
洗脱液：300mM氯化钠/50mM乙酸钠缓冲液(pH 4.0)
流速：1mL/分钟
测定温度：40℃
检测器：差示折射率检测器
分析时间：15分钟
乙酰基含量、硫含量、抗Xa活性、和抗IIa活性与实施例1～5同样地测定。
[表3]
实施例6 实施例7 实施例8 比较例2 比较例3 比较例4
重均分子量(Mw) 3705 3553 4364 7344 25487 7279
乙酰基含量(质量％) 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.307
分散度 1.16 1.18 1.19 1.43 1.31 1.46
硫含量(质量％) 18.8 16.7 16.3 15.3 15.3 15.4
抗Xa活性(IU/mg) 0.67 0.15 0.22 1.69 16.61 0.73
抗IIa活性(IU/mg) 0.15 0.12 0.43 15.52 62.12 6.80
抗Xa/抗IIa活性比 4.29 1.25 0.51 0.11 0.15 0.11
如表3所示，任意一实施例、比较例的多硫酸戊聚糖钠的乙酰基含量都低、抗Xa活性都充分高。并且对于重均分子量5000以下的实施例6～8的多硫酸戊聚糖钠而言，可得到高的抗Xa/抗IIa活性比。

Claims (14)

1.一种多硫酸戊聚糖或其可药用盐或者它们的可药用溶剂化物，其中，所述多硫酸戊聚糖或其可药用盐或者它们的可药用溶剂化物的重均分子量为1000～5000、并且乙酰基含量为0～0.3质量％。
2.根据权利要求1所述的多硫酸戊聚糖或其可药用盐或者它们的可药用溶剂化物，其中，所述多硫酸戊聚糖或其可药用盐或者它们的可药用溶剂化物的乙酰基含量为0质量％。
3.根据权利要求1所述的多硫酸戊聚糖或其可药用盐或者它们的可药用溶剂化物，其中，所述多硫酸戊聚糖或其可药用盐或者它们的可药用溶剂化物的重均分子量为4000以下。
4.根据权利要求2所述的多硫酸戊聚糖或其可药用盐或者它们的可药用溶剂化物，其中，所述多硫酸戊聚糖或其可药用盐或者它们的可药用溶剂化物的重均分子量为4000以下。
5.根据权利要求1或2所述的多硫酸戊聚糖或其可药用盐或者它们的可药用溶剂化物，其具有以下的通式所示的结构，
Figure FDA0003002281550000011
所述通式中，R各自独立地为氢原子、-SO3X1，至少1个R为-SO3X1，X1为氢原子或者一价或二价的金属，X为氢原子或者一价或二价的金属，n1和n2各自独立地表示0以上且15以下的整数，n1和n2中的至少一者为1以上的整数。
6.根据权利要求5所述的多硫酸戊聚糖或其可药用盐或者它们的可药用溶剂化物，其中，所述结构式中，X和/或X1为钠。
7.根据权利要求1或2所述的多硫酸戊聚糖或其可药用盐或者它们的可药用溶剂化物，其中，所述多硫酸戊聚糖或其可药用盐或者它们的可药用溶剂化物的分散度为1.00以上且1.20以下。
8.根据权利要求5所述的多硫酸戊聚糖或其可药用盐或者它们的可药用溶剂化物，其中，所述多硫酸戊聚糖或其可药用盐或者它们的可药用溶剂化物的分散度为1.00以上且1.20以下。
9.一种药物组合物，其含有权利要求1～8中任一项所述的多硫酸戊聚糖或其可药用盐或者它们的可药用溶剂化物作为有效成分。
10.一种抗凝血剂，其含有权利要求1～8中任一项所述的多硫酸戊聚糖或其可药用盐或者它们的可药用溶剂化物作为有效成分。
11.一种Xa因子和/或IIa因子抑制剂，其含有权利要求1～8中任一项所述的多硫酸戊聚糖或其可药用盐或者它们的可药用溶剂化物作为有效成分。
12.一种权利要求1～8中任一项所述的多硫酸戊聚糖或其可药用盐或者它们的可药用溶剂化物在用于制造药物组合物中的应用。
13.一种权利要求1～8中任一项所述的多硫酸戊聚糖或其可药用盐或者它们的可药用溶剂化物在用于制造抗凝血剂中的应用。
14.一种权利要求1～8中任一项所述的多硫酸戊聚糖或其可药用盐或者它们的可药用溶剂化物在用于制造Xa因子和/或IIa因子抑制剂中的应用。
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