JPS59132890A - プロテア−ゼの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はプロテアーゼ生産能を有する固定化微生物を用
いる改良されたプロテアーゼの製造方法に関する。

プロテアーゼは皮革工業、醸造工業、食品・水産物加工
業、洗剤工業等に広く使用されており、最近家庭用洗剤
の洗浄力向上剤として急速に需要が増大してきた。しか
し、従来のプロテアーゼの製造法はタンク培養法がほと
んどでちゃ、効率が悪く、しかも微生物菌体を使い捨て
にするという問題がある。

近年、微生物又は酵素を高分子ゲル中に閉じ込め、ある
いは高分子ゲルに化学的に結合させて固定化し、種々の
有用物質を生産させる方法が広く研究されるようになシ
、その実用化が期待されるようになりてきた。

本発明者等は微生物を用いたプロテアーゼの製造法を改
良するにあたシ、固定化微生物を応用することに着目し
鋭意研究した結果、固定化微生物は意外にも固定化し々
い微生物に比してプロテアーゼの生産量が増加すること
を見出し、本発明を完成した〇 本発明によれば、プロテアーゼ生産能を有する微生物を
天然水溶性アニオン性高分子物質水溶液中に分散させ、
該高分子物質と反応してゲルを形成する金属イオンを含
む水溶液と接触させ、生成した固定化微生物を培養して
プロテアーゼを生産させ、次いで該プロテアーゼを分離
取得する改良されたプロテアーゼの製造法が提供される
。

本発明に使用する微生物はプロテアーゼ生産能を有する
微生物（以下プロテアーゼ生産菌と略称する。）であれ
ば特に制限されるものではなく、任意に使用することが
できる。本発明に使用できる微生物の例として、バチル
ス・サブチリス、バチルス・サーモプロテオリティクス
、バチルス・ポリミキサ、バチルス・リケニホルミス、
バチルス・アミロリフファシェンス、クロストリジウム
やヒストリティクム、ストレプトマイセス・コリ、スト
レプトマイセス・フラディ、シュードモナス−フルオレ
センス、セラチア属等の細菌類及びアスパルギルス・ニ
ガー、アルパルギルス・オリザエ、ペニシリウム・クル
クロビリラム等のカビ類が挙げられる。アルカリプロテ
アーゼ生産菌としてはバチルス拳サブチリス、バチルス
・リケニホルミスが好ましく、中性プロテアーゼ生産菌
としてはクロストリジウム−ヒストリティクム及びシュ
ードモナス・フルオレセンスが好ましい。特ニ、バチル
スＩＦＯ−３０１３、バチルス・アミロリフファシェン
スＡＴＣＣ−２３８４２、バチルス・ステアロサーモプ
ロティオリティクスＡＴＣＣ−８００５及びサーマスΦ
サーモフィラスＡＴＣＣ−２７６３４が適している。こ
れらの微生物は一般によく知られた微生物であシ、所望
により公的機関などよυ容易に入手できる。

本発明においてプロテアーゼ生産菌を固定化するために
用いる高分子物質は、アニオン性の水溶性高分子物質で
あシ、微生物を固定化する際、適当な金属イオンと反応
して水不溶性のゲルを生成するものである。特に天然物
が好ましい。本発明に適した高分子物質としてに一カラ
ギナン、アルギン酸、ペクチン及びキサンタンガムが挙
ケラれ、単独又は混合物として用いられる。プロテアー
ゼ生産菌を固定化する際の高分子物質水溶液の濃度は・
生成するゲルの機械的強度に影響し、約２〜１０チが適
当である。

本発明においてアニオン性水溶性高分子物質−をゲル化
させるために使用する金属イオンは、１〜３価が適当で
あシ、高分子物質の種類によシ適宜選択される。金属イ
オンの例としてに’、Ｃｉ＋、Ｎ　ｓ　７Ｆ７＋、など
が挙げられ、塩酸塩などの水溶性塩として用いられる。

これらの金属塩は濃度１〜１０チの水溶液として用いら
れる。

プロテアーゼ生産菌の固定化は、高分子物質の水溶液又
は生理食塩水溶液に微生物を加え、厚さ数惰〜数ａｍに
薄く拡げ、金属塩溶液と接触させる方法、微生物を分散
させた高分子物質溶液を金属塩溶液中に、直径数日〜数
ｃｍの球体となるように適下する方法などにより行なう
ことができる。

本発明において固定化された微生物にプロテアーゼを生
産させるにあたシ、培養液中に添加する栄養源は炭素源
としてブドウ糖、果糖、乳糖などノ糖類、デンプン、セ
ルロース、ペクチンなどの多糖類、ソルビトールなどの
アルコール類、クエン酸、コハク酸などの有機酸類等が
適宜使用され、窒素源として尿素、アミノ酸、ペプトン
、コーンステープリカー、酵母エキス等が使用され、ま
た無機塩類としてリン酸モノカリウム、リン酸ジカリウ
ム、硫醗マグネシウム等がリン、カリウム及びイオウの
供給源として使用される。これらの栄養源は例示のもの
に限定されることなく、他の物質も任意に使用すること
ができる。培養液中におけるこれら栄養源の濃度は微生
物の種類、培養条件などにより異なり、その都度適宜選
択される。

固定化微生物の培養条件は特に制限はないが、通常、Ｐ
Ｈは４〜８好ましくは５〜７、温度は１０〜６０°Ｃ好
ましくは２５〜５０″Ｃの範囲内である。

固定化微生物はその培養条件により、１３０〜２３０時
間でプロテアーゼ生産量が最大となるため、バッチ形式
で培養する場合は培養時間を１３０〜２３０時間に、連
続反応形式の場合は平均滞留時間を１３０〜２３０時間
に調節することが好ましい。培養装置は攪拌槽型培養槽
、振とう培養機、ジャーファーメンクー装置、充填カラ
ムなど任意に使用できる０ 本発明のプロテアーゼの製造方法において固定化微生物
の生産したプロテアーゼは、塩析、ＰＨ調節、分離膜に
よる分離、樹脂による吸着分離などの方法によシ単離、
精製することができる。

本発明は固定化しない微生物を用いる場合と同様に実施
することができ、さらに連続培養ができる利点を有する
。また、固定化微生物は固定化しない微生物よりもプロ
テアーゼの生産量が多いという特徴を有する。微生物が
固定化されているため、微生物と培養液の分離が容易で
あり、微生物の再使用が可能であり、プロテアーゼの分
離精製も容易である。

作は無菌室で行なった。また実験に用いた微生物及び培
養液の組成は次の通シである。

微生物の調製 微生物を４８時間スラント培養し、次いてスラント培養
液から１白金耳の微生物菌体を取シ出し、９６時間前培
養して得た前培養液１０．ｒｎｔを遠心分離し、次いで
生理食塩水１０−に分散させて菌体希釈液を調製した。

培養液の組成 ラクトース６０ｇ、コーンステープリカー１０Ｆ、ペプ
トン１７９、リン酸ジカリウム１４９、リン酸モノカリ
ウム６９、クエン酸ナトリウム３９、硫酸アンモニウム
６ｇ、炭酸カルシウム０．５ｇ及び硫酸マグネシウム１
９を水に溶解して全量を１ｔとした。

実施例１ Ｋ−カラギナ７４係水溶液３５−に、予め調製したバチ
ルス−リケニホルミスＡＴＣＣ−１４５８０の菌体希釈
液１０−と２多塩化カリウム水溶液１０〇−を混合し、
１０°Ｃで１０時間放置して微生物を固定化した。

得られたゲルを６酩角の立方体に細断し、生理食塩水で
洗浄後ゲル２０−を、予め調製した培養液５０−に加え
て坂ロフラスコ中で３７°Ｃ％　１２０ｓｐｍの条件下
で振とう培養した。

培養時間２００時間後のアルカリグロチアーゼ生産量は
１１，０００　Ｕ　／−であシ、中性プロテアーゼ生産
量は４，５００　ＴＪ／ｄであった。

一方固定化しない微生物を用いた場合は、アルカリプロ
テアーゼ生産量が７，９００　Ｕ／ｄ、中性プロテアー
ゼ生産量が３，０ＯＯＵ／−で固定化微生物を用いた場
合の約２／３と低かった。

実施例２ 実施例１と同様の方法で固定化微生物を７２時間培養し
た後、プロテアーゼ生産量を測定した。

次いで培養液からゲルを分離し、生理食塩水で洗浄後新
しい培養液５０−を加えて上記と同じ条件で培養を繰返
した。同様にして計１０回培養を繰り返した。

一方、対照として同条件で固定化しない微生物を用いて
繰返し培養を行なった０この時、培養後の微生物は８．
００Ｏｒｐｍで遠心分離して培養液から分離した。

プロテアーゼの生産量の測定結果を次表に示す。

実施例３ アニオン性水溶性高分子物質としてアルギン酸を、ゲル
化剤として塩化カルシウムを用いて、実施ｆ〆と同様の
方法で実験を行なった０アルカリプロテアーゼの生産量
は１０，３００　Ｕ／ｇＬｔであり、中性プロテアーゼ
の生産量は４，３００　Ｕ／ｍであった。

実施例４ 微生物の固定化材料としてペクチン及び塩化カルシウム
を用いて、実施例１と同様の方法で実験を行なった。塩
化カルシウムは５％水溶液として用いた。

アルカリプロテアーゼの生産量は１０，２０００７ｍで
あり、中性プロテアーゼの生産量は４，１００　Ｕ／ｌ
ｎｔであった。

実施例５ アニオン性水溶性高分子物質としてキサンタンガムを、
ゲル化剤として塩化第二鉄の５％水溶液を用いて、実施
例１と同様の方法で実験を行なったＯ アルカリプロテアーゼの生産量は１０，４００Ｕ／ｍで
あり、中性プロテアーゼの生産量は４，３００Ｕ／ｌｎ
ｔでおった。

実施例６ プロテアーゼ生産菌としてバチルスΦアミロリクファシ
エンスＡＴＣＣ−２３８４２を用いて、実施塩 例１７繰返した。

アルカリグロチアーゼの生産量は９．．８０００〜であ
り、中性プロテアーゼの生産量は５．５００　Ｕ／−で
あった。一方固定化しない微生物を用いた場合は、アル
カリグロチアーゼの生産量が８，２００Ｕ／ｇＩＬｔで
あシ、中性プロテアーゼの生産量が３，１００Ｕ、ろ−
であ・つた。

特許出願人　ライオン株式会社 手続補正書 昭和５８年６月７０日 特許庁長官若杉和失敗 １、事件の表示　　昭和５８年特許願第６８７４号２、
発明の名称　　プロテアーゼの製造方法３、補正をする
者 事件との関係　　特許出願人 住　所　　　　　東京都墨田区本所−丁目３番７号４、
補正命令の日付　　自発 ５、　補正により増加する発明の数　　０６、補正の対
象　　明細書の発明の詳細な説明の欄７、補正の内容 （１）明細書第４頁第３行「特に、」の次にｒバチルス
・リケニホルミスＡＴＯＯ−１４５８０Ｊを加入する。

（２）同第４頁第４行ｒ　ＩＦＯ−３０１３，Ｊ　（７
）前にｒ−サブチリス」を加入する。

（３）同第４貫第５〜６行「バチルス・ステアロサーモ
プロティオリティクス」を「バチルス−ステアロサーモ
フィラス」に訂正する。

（４）同第６頁第１２行「６０°Ｃ」を「７５℃」に訂
正する。

（５）同第６頁第１３行ｒ１３０Ｊを「５０」に訂正す
る。

（６）同第６頁第１５行ｒ１３０Ｊを「５０」に訂正す
る。

（７）同第６頁第１７行「１３０」を「５０」に訂正す
る。

（８）同第７頁下から２行目「培養液」を「培地１に訂
正する。

（９）同第８頁第１２〜１４行を以下のとおシ訂正する
。

「菌体希釈液３ｆｒＬｔを混合した後、２％塩化カリウ
ム水溶液１０〇−中に浸漬し、１０℃で１０時間放置し
て微生物を固定化した。」

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １、　プロテアーゼ生産能を有する微生物を天然水溶性
   アニオン性高分子物質水溶液中に分散させ、該高分子物
   質と反応してゲルを形成する金属イオンを含む水溶液と
   接触させ、生成した固定化微生物を培養してプロテアー
   ゼを生産させ、次いで該プロテアーゼを分離取得するこ
   とを特徴とするプロテアーゼの製造方法。