JPS59109186A - 発酵反応による酪酸ｎ−ブチルの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は、発酵法による酪酸ｎ−ブチルの酵素的製造方
法に関する。

Ｃ，アセトブチリクムと略称する）によって炭水化物を
発酵せしめてブチルアルコールおよびアセトンを生成せ
しめることは、ワイズマン（Ｗｅｉｚｍａｎｎ　）　　
の米国特許第１．３１５．５８５号に開示されている。

多年、この方法がアセトンおよびブチルアルコールの製
造に用いられそして若干量のエチルアルコールが副生成
物として得られた。

アセトン／ブチルアルコール発酵からの生成物を分留す
ると、溶剤の全収量の約０．５ないし１．０％の高沸点
残留物が蒸留器内に残存する。

このものは、工業的に“ブチル油（ｙθｌｌｏｗ　ｏｉ
ｌ）　”として知られている。マーヴエル（Ｍａｒｖｓ
ｌ　）およびブローデリック（Ｂｒｏｄｅｒｉｃｋ　）
は、１ブチル油“は、アルコール類およびエステル類の
複雑彦混合物であることを見出した（　Ｊ’、　Ａｍ。

Ｏｈｅｍ、８ｏｃ、、　４７　、　３０４５−３０５１
　（１９２５）参照）。

この混合物のケン化および得られた生成物の分離によっ
て、加水分解物の最多量のアルコール成分としてｎ−ブ
チルアルコールが、そして加水分解物の最多量の酸性成
分として酪酸が得られる。これらの結果は、従来のアセ
トン／ブチルアルコール発酵においては極めて少量の酪
酸ｎ−ブチルしか生成されないことを示している。

本発明者らは、驚くべきことには、はるかに高い収量で
酪酸ｎ−ブチルを生産する発酵方法を見出した。この生
成物は、香料の成分として、また溶剤として有用である
。

発明の概要 本発明によれば、発酵反応によって酪酸ｎ−ブチルを製
造する方法において、まずＣ，アセトブチリクムの溶剤
生産細胞を含有する発酵培地を活性炭の床に通し、それ
によって酪酸ｎ−ブチルを生成させそして活性炭に吸着
させ、次いでこの活性炭から酪酸ｎ−ブチルを脱着させ
、そして最後にとの酪酸ｎ−ブチルを上記活性炭から脱
着されたその他の化合物から分離することを特徴とする
方法が提供される。

本発明の方法は、Ｏ，アセトブチリクムの菌株の細胞を
、この微生物によって発酵せしめられる１種１だはそれ
以上の炭水化物を含有する水性培地中で増殖せしめるこ
とによって行なわれる。この微生物を増殖せしめそして
炭水化物を発酵させてアセトン／ブチルアルコールを生
産させるための条件は、よく知られている。これらのこ
とは、ブレスコツト（Ｓ、Ｐ、Ｐｒｅｓｃｏｔｔ　）お
よびダン（Ｃ，Ｇ、　Ｄｕｎｎ　）　　によりインダス
トリアル・マイクロバイオロジー（工ｎｃｌｕｓｔｒｉ
ａｌ。

Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、　　３ｒｄ　ａｄ、、　　
ｐｐ、　　２５０−２８４　。

ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ　Ｂｏｏｋ　Ｃｏｍｐａｎｙ　
、　　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　、　　１９５９参照）に詳細
に記載されている。

Ｃ，アセトブチリクムの細胞の良好な発育が達成されそ
して培地中で炭水化物を発酵させることによって上記細
胞が溶剤を活溌に生産しているときに、溶剤生産細胞を
含有する培地は、酪酸ｎ−ブチルの生成が行なわれてい
る活性炭の床に通される。

本発明の方法は、Ｏ，アセトブチリクムの増殖が連続発
酵反応器中で行なわれるという連続法によって実施され
うる。この連続反応器からの流出物は、次に酪酸ブチル
が生成されそして活性炭上に吸着される吸着炭の床に通
される。他の発酵生成物もまた活性炭によって吸着され
るが、これらは、生成されるにつれて優先的に吸着され
る酪酸ｎ−ブチルによって置換されうる。

溶剤生産細胞をカラムに供給するという、連続発酵を実
施するための有利な方法が、「連続発酵法によるブタノ
ールの製造方法」なる発明の名称の下に本願と同じ出願
人により同時に出願された特許出願において開示されて
いる。

本発明による発酵方法は、微生物Ｃ，アセトブチリクム
の菌株を使用して行なわれる。この微生物の溶剤生産細
胞を含有する発酵培地を活性炭床に通すことにより、酪
酸ｎ−ブチルを生産する上記微生物のいかなる菌株でも
好適に使用することができる１、特に有用な菌株は、Ａ
ＴＣＣ４２５９としてアメリカン・タイプ・カルチュア
・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１
ｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　）　　から入手しうる
ワイズマン（Ｗｅｉｚｍａｎ、ｎ　）　　による菌株で
ある。

本発明の発酵方法は、溶解された炭水化物、栄養素およ
び微生物の生長にとって必要な生長因子を含有する水溶
液からなる発酵培地中で行かわれる。この培地は、使用
前に熱またはその他のこの技術分野においてよく知られ
た手段によって滅菌される。

本発明の実施において使用される炭水化物は、Ｃ，アセ
ドブチリウムによって発酵されるいかなる炭水化物でも
よい。そのような炭水化物の例ニハ、グルコース、マル
トース、サッカロース、キシロース、および澱粉壕だは
澱粉加水分解物がある。本発明による方法に特に適した
低廉な炭水化物は、細菌性α−アミラーゼを用いる澱粉
の部分的加水分解によって調製された低デキストロース
・イクイバレント（Ｄ、　Ｅ、　）の澱粉加水分解物で
ある。微生物の生長に必要な栄養素および生長因子は、
発酵培地に添加される。そのような栄養素および生長因
子は、発酵技術における専門技術者にとってよく知られ
ている。

発酵がＣ，アセドブチリウムのワイズマン菌株を用いて
実施される場合には、とうもろこしの湿式製粉から容易
に得られる低廉なコーン・ステイープ・リカーが必要と
されるだけである。これは、所望ならば、とうもろこし
グルテンで補充されうる。

培地のｐＨは、微生物の増殖および溶剤の生産に適した
範囲に保たれる。本方法による発酵は、約４．０ないし
約７０の範囲内で実施されうる。発酵のｐＨ調整は、ｐ
Ｈを所望の範囲に保つのに必要なアンモニアを自動的に
添加するｐＨ調節器を使用して、アンモニアを添加する
ことによって達成されうる。

発酵は、約６４℃ないし約４１℃の温度範囲において行
なわれる。好ましい温度範囲は、約り５℃〜約５７℃で
ある。発酵の温度は、ジャケット内の水を所望の温度に
維持するジャケット付き発酵容器あるいは発酵培地中に
浸漬された加熱または冷却コイルのような周知の方法に
よって、所望の範囲に維持される。

本発明による方法は、活性な溶剤生産段階にある微生物
の細胞を含有する発酵培地を、活性炭の床に通すことを
包含する。活性な発酵は、次に培地および細胞が活性炭
を通過するに従って継続される。カラム内に入れられた
活性炭を貫いて混合物を上方に通過させることが好まし
い。伺故ならばそのよう寿方法はガスの発生を容易にす
るからである。

ブチルアルコールおよび酪酸ｎ−ブチルを吸着すること
ができそして培地の所望の流量で活性炭を通過せしめる
のに十分な大きさの粒径を有するいかなる活性炭でも本
発明の方法に満足的に使用することができる。米国ペン
シルベニア州ピッツバーグのカルボン社（Ｏａｌｇｏｎ
　０ｏｒ−ｐｏｒａｔｉｏｎ　、　Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇ
ｈ　、　Ｐｅｎｎ５ｙｌｖａｎｉａ　）から入手されう
るＰＣＢピッツバーグ活性炭として市販されているココ
ヤシの実から製造された活性炭が上記の目的に適してい
る。

上述のように、本発明の方法による酪酸ｎ−ブチルの製
造は、溶剤生産細胞を含有する発酵培地が活性炭の床に
通される場合に行なわれる。

活性炭を通過する流量は、酪酸ｎ−ブチルが生産されそ
して活性炭上に吸着されるように調整される。０．０６
床容量／　ｈｒ（ｂｖｈ　）の流量がこの目的に適して
いる。

本発明の方法で生成された酪酸ｎ−ブチルは、公知の方
法で活性炭から除去されそして精製される。活性炭から
酪酸ｎ−ブチルを溶出させる有利な方法は、アセトンの
蒸気をカラム中を下方に通し、それによって酪酸ｎ−ブ
チル、ブチルアルコールおよび発酵中に生成した少量の
他の化合物をカラムから除去することを包含する。

この一般的手法は、１９８１年１２月７日に出願された
米国特許用ｉｓθｒｉａｌ　Ｎｕ　３２ス８４９に記載
されている。

酪酸ｎ−ブチルは、抽出および蒸留のような手段によっ
て、活性炭から溶出された他の物質から分離するのが好
都合である。

本発明の方法を以下の実施例によって更に詳細に説明す
る。各例中、すべての部および百分率は、特記しない限
り重量基準である。

例１ Ｃ，アセトブチリクムの菌株ＡＴＯＯ４２５９を使用し
て連続発酵を実施しだ。発酵培地は、米国アイオワ州マ
スカチンのグレイン・プロセシング社（Ｇｒａｉｎ　Ｐ
ｒｏｃｅｓｓｉｎｇＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ　、　Ｍｕ
ｓｃａｔｉ　−ｎｅ、　　工ｏｗａ　）から入手できる
１０Ｄ、Ｅ、（デキストロース・イクイバレント）のと
うもろこしの澱粉加水分解物でおるマルトリン（Ｍａｌ
ｔｒｉｎ　）Ｍ−１００の１０チ水溶液であった。この
培地はまた０、　７５　％乾物基準のコーン・ステイー
プ・リカーをも含有していた。コーン・ステイープ・リ
カーは、米国ニューシャーシー州イングルウッド・クリ
ツクのシー・ピー・シー・インターナショナル・インコ
ーポレーテツ）”　（ＯＰＯ■ｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａ
ｌ　　Ｉｎｃ、、　Ｅｎｇｌｅｗｏｏｄ　　Ｃ１１ｆｆ
ｓ　、　　ＮｅｗＪｅｒｓｅｙ　）　　社のコーン・プ
ロダクツ・ユニット（Ｃ！ｏｒｎ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ　
Ｕｎｉｔ　）　　からコード（Ｃｏｄｅ　）Ｅ８０１と
して入手することができる。発酵は、［連続発酵法によ
るブタノールの製造方法］なる発明の名称の下に本願と
同じ出願人によシ同　　・時に出願された特許出願にお
いて詳細に記述されている連続的方法に従って実施され
た。

培地および微生物の細胞の混合物を３１５ｒｎｔ／ｈｒ
　の割合で反応器からポンプで送った。この混合物を、
長さ１２２ｃＩｎ１内径７．２９　ｃｍの、ジャケット
付きステンレス鋼製の円筒形カラムに充填された２、　
１３７　ｔの活性炭を上方に向けて通過せしめた。これ
によってこのカラムに約［１０６ｂｖｈの流量を与えた
。使用された活性炭は、カルボン社（Ｏａｌｇｏｎ　Ｃ
ｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ　。

Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ　、　　Ｐｅｎｎ５ｙｌｖａｎｉ
ａ　）から入手できるＰＯＢ　ピッツバーグ活性炭の１
２−５０メツシユ（１，６８ｍ＋〜０．５９−のふるい
目の開きを有する米国標準ふるい）のものであった。

カラムの頂部から溶出された物質は廃棄された。溶出液
５５．３１がカラムを通過した後に、流れを中断し、そ
して重力によυカラムから排出せしめた。液体と固体の
物質の排出混合物（９８０ｄ）を１時間採取した。次に
、カラムの温度をカラムを取巻いたジャケットに５４℃
の温度に保った水を通すことによって５４℃に維持しな
がら、アセトン蒸気をカラムを貫いて下方に通した。最
初に溶出されたフラクション（ａ　ｏ　ｏｙ）は、大部
分水であった。第２のフラクション（８８０ｄ）は、２
つの層に分けられた。次の複数のフラクションは、均質
な溶液であった。これらの溶液の組成は、高分解能の陶
子核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光分析によって測定された。

これらの分析の結果は、第１表に示されている。酪酸ｎ
−ブチルの同定は、炭素−１５ＮＭＲ分光分析計を用い
、このエステルの証明された試料のスペクトルと比較す
ることによってなされた。全量で１Ｂ６ｔのアセトン溶
出液から、ブチルアルコール３５１．４　ｆおよび酪酸
ｎ−ブチル１６１．６　ｔが得られた。約３１ｒの同定
されていないリビド物質もまたカラムから溶出された。

第　　Ｉ　　表 （排出物）　　　９８０　　　　ｏ３ｏ、ａ　　　　−
−９７６１８００Ｇ、４　１．０　−−９＆８ ２　（上層）　　　５１０　　　１２．６　　　　１α
４　　　−−　　７１．５（下層）　　　３７０　　　
１ａ７３７．７　　　１２．１　　３ＣＬ９５　　９８
０　５１．２　１５．４　８［２５，４４ａ）９８０　
　７ａ４　　　４．９　　　５．６　　７．９５ａ）　
　　　　２２０　　８α５　　　３．４　　　６．２　
　６．７ａ）　フラクション４および５は、同定されて
いないリピド物質約５チを含有していた。

例２ カラムの中に入れたＰＣＢピッツバーグ活性炭の新鮮な
試料を用いて例１の手順に従って操作した。この実験に
おいては、とうもろとしの湿式製粉から得られた２５２
乾物基準のグルテンスラリーを、連続発酵器中の他の栄
養素に毎日加えた。実験１におけると同様にしてアセト
ン蒸気を用いてカラムを溶出させると、’５．５１の溶
出液からブチルアルコール３７２２およヒ酪酸ｎ−ブチ
ル１３１ｆが得られた。全反応生成物の分析から、酪酸
ｎ−ブチルは生産された溶剤の約１２係を包含している
ことが判った。

これらの例は、澱粉加水分解物およびコーン・ステイー
プ・リカーを含有しグルテンを添加しまたは添加してい
ない培地を連続発酵器においてＣ，アセトブチリクムを
用いて発酵せしめ、そして溶出液を緩やかに吸着炭に通
しだ場合には、そのような発酵反応によって通常生産さ
れるブチルアルコールおよびアセトンのほかに、か彦り
の量の酪酸ｎ−ブチルが生成されることを示している。

比較試験１ この試験は、活性炭と極めて短時間しか接触せしめない
発酵反応において生成される酪酸ｎ−ブチルの量を測定
するために行なった。培地が例１のように０７５重量係
の乾物基準のコーン・ステイープ・リカーではなくて１
重量係の乾物基準のそれを含有していたことを除いては
例１と同様にして連続発酵反応を実施した。発酵器から
の溶出液は、例１においてなされたように活性炭のカラ
ムを緩やかに通されることなく、容器内に約１００時間
貯蔵された。全部で５１ｔの培地が回収され、これは分
析によりブチルアルコール５７１　Ｆ、アセトン１３６
１、酪酸２００１、酢酸１２５ｖおよびエチルアルコー
ル５０９を含有することが示された。発酵混合物中の酪
酸ｎ−ブチルの濃度は、非常に低いので、直接に測定す
ることができなかった。

このエステルは、長さ５８ｃｒｎ、内径４．５備のカラ
ムに入れた１２−３０メツシユのＰＣＢビッッパーグ活
性炭４０５ｆを充填したカラムに全部で５１ｔの発酵培
地を急速に（１ｏ　ｂｖｈ　）通すことによって濃縮さ
れた。前の実験は、酪酸ｎ−ブチルが好ましくはこれら
の条件下で活性炭上に吸着されるであろうことを示して
いる。例１におけると同様にアセトン蒸気を用いて活性
炭のカラムから溶剤を溶出すると、溶出液中に酪酸ｎ−
ブチル５．６５　？およびブチルアルコール７０１が得
られた。このことは、発酵中に生産された中性の溶剤の
約０７６重量係が酪酸ｎ−ブチルであることを示してい
る。この実験は、明らかに発酵培地が活性炭のカラムに
緩やかに通されたことにより、予想外に多割合の酪酸ｎ
−ブチルが例１および例２において生成されたことを示
している。

比較試験２ 下記の試験は、微生物の不存在下で活性炭のカラム上で
エステル化が起るか否かが測定された。内径２．２　ｃ
ｍのジャケット付きカラム内に例１および２において使
用されたものと類似のＰＣＢピッツバーグ活性炭７ｏ１
（床容積１８０−）を充填した。この活性炭を引続いて
水、０．１ＮのＨａｔ溶液および再び水で、流出液のｐ
Ｈが４．８になるまで洗滌した。この洗滌された活性炭
を、水２を中ブチルアルコール３０９の溶液を４０℃に
保ったカラムに通すことによって、上記の洗滌された活
性炭をブチルアルコールで飽和せしめた。次に、水２を
中ブチルアルコール５０？および酪酸３０ｆの溶液を、
全部で１０時間に亘って毎時３床容積／ｈｒ　の割合で
カラム中の循環せしめた。次に、カラムから液体を排出
せしめ、そして例１において記載された一般的手法を使
用し、アセトン蒸気を用いてカラム上に吸着された有機
物質を溶出せしめた。

カラムからのアセトン溶出液中には酪酸ｎ−ブチルは検
出されず、また出発溶液中に使用されたほとんどすべて
の酪酸は、水溶液およびアセトン溶出液の分析によって
説明された。これらの結果は、微生物の不存在では活性
炭のカラム上で酪酸ｎ−ブチルの生成が起らないことを
示している。

かくして、本発明に従えば、発酵反応にょる酪酸ｎ−ブ
チルの改善された製造方法が提供されたことは明らかで
ある、本発明をその特定の具体化例との関連において記
述したが、この技術分野に属する専門技術者にとって多
くの選択、修正および改変が可能であることは、以上の
詳細な説明に徴して明らかである。

（１−；”・１ 代理人　　江　崎　光　好、’、ｊ、、、、。

代理人　　江　崎　九　史ｊ゛−−−−−］□

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　発酵反応によって酪酸ｎ−ブチルを製造する方法に
   おいて、まずＣ，アセトブチリクムの溶剤生産細胞を含
   有する発酵培地を活性炭の床に通し、それによって酪酸
   ｎ−ブチルを生成させそして上記活性炭に吸着させ、次
   いでこの活性炭から酪酸ｎ−ブチルを脱着させ、そして
   最後にこの酪酸ｎ−ブチルを上記活性炭から脱着された
   その他の化合物から分離することを特徴とする前記酪酸
   ｎ−ブチルの製造方法。 λ　使用されるＣ、アセトプチリクムの菌株がＡＴＣＣ
   ４２５９である特許請求の範囲第１項記載の方法。 ５　発酵培地が澱粉の部分的加水分解によって調製され
   た低デキストロース−イクイバレントの澱粉加水分解物
   の水溶液を含む特許請求の範囲第１項記載の方法。 ４　発酵培地が更にコーン・ステイープ・リカーおよび
   とうもろこしグルテンを含む特許請求の範囲第３項記載
   の方法。 ５、　発酵反応を連続法において実施する特許請求の範
   囲第１項記載の方法。 ＆　発酵を約４．　Ｑ〜約７．０のｐＨにおいて行なう
   特許請求の範囲第１項記載の方法。 ２　発酵を約り４℃〜約４１℃の温度において行なう特
   許請求の範囲第１項記載の方法。 ＆　発酵を約り５℃〜約３７℃に温度において行なう特
   許請求の範囲第１項記載の方法。 ９　活性炭が約１２−５０メツシユ（１，６８ｗ〜１５
   ９ｍのふるい目の開きを有する米国標準ふるい）のもの
   である特許請求の範囲第１項記載の方法。 １［ｌＬ　　溶剤生産細胞を含有する発酵培地を約０．
   ０６ｂｖｈの割合で活性炭の床に通す特許請求の範囲第
   １項記載の方法。