JPH11513889A - タンパク質翻訳のアンチセンス阻害のための組成物および方法 - Google Patents

タンパク質翻訳のアンチセンス阻害のための組成物および方法

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JPH11513889A
JPH11513889A JP9532955A JP53295597A JPH11513889A JP H11513889 A JPH11513889 A JP H11513889A JP 9532955 A JP9532955 A JP 9532955A JP 53295597 A JP53295597 A JP 53295597A JP H11513889 A JPH11513889 A JP H11513889A
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Abstract

(57)【要約】 キャップされた標的mＲＮＡの翻訳を阻害する組成物および方法を提供する。本発明のアンチセンスオリゴマーは標的mＲＮＡの5'キャップ領域を標的とし、オリゴヌクレオシド、ＰＮＡ、または糖の2'位で修飾されたオリゴヌクレオチドを含む。好ましくは、前記オリゴマーは、リボソーム構築を妨害することを介して直接的にタンパク質翻訳を阻害する。

Description

【発明の詳細な説明】 タンパク質翻訳のアンチセンス阻害のための組成物および方法序 本出願は、1996年５月24日に出願されたアメリカ合衆国特許出願08/653,653の 一部継続出願であり、それは1995年５月12日に出願されたアメリカ合衆国特許出 願08/440,740の一部継続出願であり、それは1993年５月17日に出願され現在はア メリカ合衆国特許Ｎo.5,514,788として公布されているアメリカ合衆国特許出願0 8/063,167の一部継続出願であり、それは1993年１月21日に出願されたアメリカ 合衆国特許出願08/007,997の一部継続出願であり、それは1992年９月２日に出願 され、現在は放棄されている、アメリカ合衆国特許出願07/939,855の一部継続出 願であり、それは1990年８月14日に出願され現在は放棄されているアメリカ合衆 国特許出願07/567,286の一部継続出願である。 アメリカ合衆国特許出願08/653,653は、1992年11月19日に出願されたアメリカ 合衆国特許出願07/927,506の一部継続出願でもあり、これは1990年８月16日に出 願されたアメリカ合衆国特許出願07/568,366の一部継続出願である。発明の属する分野 本発明は、タンパク質翻訳の妨害を介して遺伝子発現を阻害する方法に関する 。本発明は一般的に、遺伝子発現のアンチセンス阻害の分野に関連する。発明の背景 古典的な治療法は概して、疾患の原因となる機能あるいは疾患を増進させる機 能を緩和しようと、タンパク質の相互作用に焦点をあてたものであった。このよ うな治療方法には多くの限界がある。最近、アンチセンス治療および診断アプロ ーチが、安全でかつ効果的であることが証明されてきた。 アンチセンス方法論は、通例オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオシドで ある比較的短いオリゴマーの、mＲＮＡあるいはＤＮＡに対する、これらの標的 核酸の正常、不可欠な機能が破壊されるような相補的ハイブリッド形成である。 ハイブリッド形成とは、ＲＮＡまたは一本鎖ＤＮＡに対するオリゴマー上の核塩 基の、ワトソン-クリック塩基対形成の法則に従った配列特異的水素結合である 。このような塩基対を構成するものは、互いに相補的であると言われる。 かなりの研究が、治療を目的としたアンチセンス剤としてのオリゴヌクレオチ ドおよび他のオリゴマーの応用を目指している。オリゴヌクレオチドは、動物お よび人間において疾患状態の治療に治療的成分としてすでに採用されている。ア ンチセンスオリゴマーの組成物はウイルス性、真菌性、および代謝性の疾患に関 与する遺伝子の発現を調節できることが示されている。さらに、アンチセンスオ リゴヌクレオチドはヒトに安全に投与され、ウイルスおよび細胞の遺伝子産物を 標的とした、１ダースあるいはそれ以上のアンチセンス薬剤の臨床試験が開始さ れている。 本発明は、新規アンチセンス化合物および組成物を、選択されたmＲＮＡ標的 の翻訳を妨害する特定のアンチセンス化合物の使用に関する方法論と併せて提供 する。 ほとんどのアンチセンスアプローチは、mＲＮＡの、ＡＵＧあるいは、頻度は 下がるが5'-非翻訳領域、5'-キャップ、3'-非翻訳領域、コーディングまたは他 の領域を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドを利用する。Ｈelene and Ｔoulme,Ｂiochem.et Ｂiophys.Ａcta 1990,1049,99-125。ＰＣＴ公開ＷＯ91/17 755(Ｂaker)およびＰＣＴ公開ＷＯ96/06621(Ａdams and Ｒeynolds)に開示され ているようにオリゴヌクレオチドに切断部分を備えることによって、あるいはＰ ＣＴ公開ＷＯ94/22488(Ｂaker)に開示されているように発生期のmＲＮＡのキャ ッピングを妨害することによって、mＲＮＡの5'-キャップを標的とするアンチセ ンスオリゴヌクレオチドをmＲＮＡ機能を妨害するのに用いることも知られてい る。 多数のアンチセンスオリゴヌクレオチドがＲＮＡse Ｈ活性を引きだすことが 見出されている。ＲＮＡse ＨとはＲＮＡ:ＤＮＡデュープレックスのＲＮＡ鎖を 切断する細胞性のエンドヌクレアーゼであり、それゆえこの酵素の活性化はＲＮ Ａ標的の切断をもたらし、従ってアンチセンス阻害の効率を大いに増強し得る。 ＲＮＡ標的の切断は、標的mＲＮＡの量の減少を示すようなゲル電気泳動または ノーザ ンブロッティング、および／または切断産物の直接的な視覚化によって、型通り に示すことができる。ホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドはＲＮＡ se Ｈの基質であるが、ＰＮＡ、オリゴヌクレオシド、および糖の2'位に一様に 修飾を受けているオリゴヌクレオチドなどのいくつかのアンチセンスオリゴマー はＲＮＡse Ｈを活性化しない。Ｋawasaki et al.,Ｊ.Ｍed Ｃhem.1993,36,831- 841。ホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドとして非常に活性な配列 は、Ｒase Ｈの基質とはならない類似体として作られた場合には不活性であるこ とがしばしばである。たとえ標的に対するオリゴヌクレオチドの親和性がこのよ うな修飾によって高まったとしても、このことはおそらく正しい。Ｈelene and Ｔoulme,Ｂiochem.et Ｂiophys.Ａcta 1990,1049,109。 本発明において、標的mＲＮＡの5'キャップ領域に特異的にハイブリッド形成 する特定の種類のアンチセンスオリゴマーに、標的mＲＮＡのタンパク質への翻 訳を妨害する驚くべき活性があることを見出した。これらのオリゴマーにはペプ チド-核酸（ＰＮＡ）オリゴマー、オリゴヌクレオシド（ＭＭＩ、アミド、ある いはモルフォリノ骨格を有するものなど）および糖の2'位に修飾を受けているオ リゴヌクレオチドが含まれる。これらのオリゴマーはＲＮＡse Ｈ非依存的な様 式で作用し、標的mＲＮＡの翻訳を直接阻害すると考えられている。これは、標 的mＲＮＡ上へのリボソームの構築の妨害を介して起こっていると考えられてい る。発明の概要 本発明は、長さが8-25塩基であって、標的mＲＮＡの5'キャップ領域に相補的 なアンチセンスオリゴマーと標的mＲＮＡを接触させることによって、選択され たキャップされた標的mＲＮＡの翻訳を阻害する方法を提供する。オリゴマーは 、2'-修飾オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド、あるいはペプチド核酸オ リゴマーであり得る。好ましい2'修飾には、2'-ＯＣＨ2ＣＨ2ＯＣＨ3、2'-ＯＣ Ｈ3、2'-ＯＣＨ2ＣＨ2ＣＨ3、2'-ＯＣＨ2ＣＨ2＝ＣＨ2および2'-Ｆ修飾が含まれ るが、2'-ＯＣＨ2ＣＨ2ＯＣＨ3がより好ましい。好ましいオリゴヌクレオチドに は、モルフォリノ、アミドあるいはＭＭＩヌクレオチド間結合を有するものが含 まれる。ペプチド-核酸オリゴマーも好ましい。 本発明において、特定の標的mＲＮＡの5'キャップ領域に特異的にハイブリッ ド形成する特定の種類のアンチセンスオリゴマーに、意外なことに標的mＲＮＡ のタンパク質への翻訳を妨害する活性があることを見出した。これらのオリゴマ ーにはペプチド-核酸（ＰＮＡ）オリゴマー、オリゴヌクレオシド（アミド、モ ルフォリノあるいはＭＭＩ骨格などの非リン骨格を有する）および2'修飾を受け ているオリゴヌクレオチドが含まれる。これらのオリゴヌクレオチドは標的mＲ ＮＡの5'キャップ領域に特異的にハイブリッド形成するように設計されている。図面の簡単な説明 図１は、ＩＣＡＭ-1の5'キャップを標的とする2'修飾オリゴマーによるＩＣＡ Ｍ-1タンパク質レベルの減少を示す一連の線グラフである。図1Ａは、ホスホジ エステル化合物の活性を示し、図1Ｂはホスホロチオエート化合物を示す。 図２は、抗ＩＣＡＭ-1オリゴヌクレオマーＩＳＩＳ11158および11159にて処理 した細胞における、比較的大量のＩＣＡＭ-1転写産物の有意な増加を示すノーザ ンブロットの棒グラフである。 図３は、Ｅ-セレクチンmＲＮＡの5'キャップ領域を標的とする2'修飾オリゴマ ーの、ＨＵＶＥＣにおけるＥ-セレクチン発現を阻害する能力を示す線グラフで ある。 図４は、ＩＣＡＭ-1の5'キャップ領域を標的とするオリゴヌクレオチドによる 、ＨＵＶＥＣにおけるＩＣＡＭ-1発現の阻害を示す線グラフである。黒四角形は ＩＳＩＳ11158；白ひし形はＩＳＩＳ-13884；黒円はＩＳＩＳ13886。 図５は、Ｅ-セレクチンの5'キャップ領域を標的とするオリゴヌクレオチドに よる、ＨＵＶＥＣにおけるＥ-セレクチン発現の阻害を示す線グラフである。白 四角形はＩＳＩＳ4764；白ひし形はＩＳＩＳ-11929；白円はＩＳＩＳ11205；白 三角形はＩＳＩＳ11928。 図６は、ＶＣＡＭ-1の5'キャップ領域を標的とするオリゴヌクレオチドによる 、ＨＵＶＥＣにおけるＶＣＡＭ-1発現の阻害を示す線グラフである。白四角形は ＩＳＩＳ-13181；白ひし形はＩＳＩＳ13182；白円はＩＳＩＳ13183；白三角形は ＩＳＩＳ5885。発明の詳細な説明 大多数の真核細胞およびウイルスのＲＮＡおよびメッセンジャーＲＮＡはその 5'末端に、成熟、安定性、および翻訳効率の程度を多様にするのに必要な独特の 化学構造を有することが認められた。一般的な構造上の特徴は、Ｓ.Ｃory and ＪＭ Ａdams,Ｊ.Ｍol.Ｂiol.1975,99,519-547に記載されている。キャップとは 、窒素７位がメチル化されているグアノシン残基である。これは、残基の5'ヒド ロキシル基間の三リン酸結合を介して、ＲＮＡの最も5'側の転写されたヌクレオ チドに結合している。 本発明に従うアンチセンスオリゴマーは、キャップされた標的mＲＮＡ転写産 物とその5'末端で特異的にハイブリッド形成する。好ましくは、オリゴマーは、 最初のヌクレオチドが5'キャップに隣接し、上に記載の三リン酸結合を介してキ ャップのメチル化されたグアノシンにつながっている、標的mＲＮＡの5'末端の 最初の20ヌクレオチドのうち少なくとも一つを含む領域に結合するだろう。より 好ましくは、オリゴマーは標的mＲＮＡの5'末端の最初の５ヌクレオチドのうち 少なくとも一つを含む領域に結合するだろう。本発明のオリゴマーは好ましくは 長さが約５から約50塩基である。長さが約８から25塩基のオリゴマーがより好ま しい。 本発明に関しては、“オリゴマー”という用語は、オリゴヌクレオチド、オリ ゴヌクレオチド類似体、オリゴヌクレオシド、またはオリゴヌクレチドを模倣す る巨大分子を包含することを意図しており、これらのすべては、その上に位置す る、相補的な塩基配列に特異的にハイブリッド形成することができるヘテロ環式 塩基(ヌクレオ塩基)を有する。この用語には、天然に存在する塩基、糖、および 糖（骨格）間結合を含むオリゴマー、ならびに同様に機能する天然には存在しな い部分を有するオリゴマーも含まれる。このような修飾されたあるいは置換され たオリゴマーは、例えば増強された細胞取り込み、ヌクレアーゼ存在下における 上昇した安定性および／または相補的な標的配列に対する上昇した親和性などの 特性のために、しばしば天然型よりも好ましい。標的に対するオリゴマーの親和 性は、オリゴマーと標的が解離する温度である、オリゴマー／標的対のＴmを測 定することによって型通りに求められ、解離は分光光度計で検出する。Ｔmが高 いほど、標的に対するオリゴマーの親和性は大きい。 本発明に関して想定される好ましいオリゴマーの特定の例は、例えば短鎖ヘテ ロ原子あるいはヘテロ環式の糖間結合などの非リン糖間結合を含むオリゴヌクレ オチドである。最も好ましいのは、ＣＨ2-ＮＨ-Ｏ-ＣＨ2、ＣＨ2-Ｎ(ＣＨ3)-Ｏ- ＣＨ2［メチレン（メチルイミノ）あるいはＭＭＩ骨格として知られている］、 ＣＨ2-Ｏ-Ｎ(ＣＨ3)-ＣＨ2、ＣＨ2-Ｎ(ＣＨ3)-Ｎ(ＣＨ3)-ＣＨ2、およびＯ-Ｎ( ＣＨ3)-ＣＨ2-ＣＨ2骨格にこで、ホスホジエステルはＯ-Ｐ-Ｏ-ＣＨ2である）を 有するものである。これらおよび他の好ましい骨格は、ＷＯ92/20823およびアメ リカ合衆国特許5,378,825に開示されているが、両方とも本発明の譲受人に譲渡 されており、本明細書の一部としてここに引用する。他の好ましい窒素含有骨格 は、Ｄe Ｍesmaeker et al.,Ａcc.Ｃhem.Ｒes.1995,28,366-374のアミド骨格で ある。これらのうち、アミド-3とも呼ばれるＣＨ2-ＣＯ-ＮＲ-ＣＨ2、およびア ミド-4とも呼ばれるＣＨ2-ＮＨ-ＣＯ-ＣＨ2がより好ましい。モルフォリノ骨格 構造を有するオリゴマー（Ｓummerton,Ｊ.Ｅ.and Ｗeller,Ｄ.Ｄ.,アメリカ合衆 国特許5.034,506）も好ましい。ペプチド-核酸（ＰＮＡ）骨格などの他の好まし い態様においては、天然のオリゴヌクレオチドのホスホジエステル骨格は、ポリ アミド骨格に置き換えることができ、塩基はポリアミド骨格のアザ窒素原子に直 接または間接的に結合する（Ｐ.Ｅ.Ｎielsen,Ｍ.Ｅgholm,Ｒ.Ｈ.Ｂerg,Ｏ.Ｂuch ardt,Science 1991,254,1497）。 天然のホスホジエステル（Ｐ＝Ｏ）骨格および／または修飾を加えた骨格の組 み合わせを用い得る。交互Ｐ＝Ｏ/ＭＭＩまたはＰ＝Ｓ/ＭＭＩ骨格が、目下のと ころ好ましい２つの態様である。 他の好ましいオリゴマーは、１つあるいはそれ以上の糖部分に、好ましくは2' 位に修飾を有するオリゴヌクレオチドである。適した2'修飾のいくつかの例には 、Ｃ1からＣ10の低級アルキル、置換低級アルキル、アルコキシアルコキシ、ア ルカリールまたはアルアルキル；Ｆ；Ｃl；Ｂr；ＣＮ；ＣＦ3；ＯＣＦ3；Ｏ-、 Ｓ-、またはＮ-アルキル；ＳＨ、ＳＣＨ3、ＯＣＮ、ｎが１から約10であるよう なＯ(ＣＨ2)nＮＨ2などのアルキルアミン；ｎが１から約10であるようなＯ(ＣＨ2 )nＣＨ3；または、オリゴマーの薬物動態学的なあるいは薬力学的な特性または 標的に対するオリゴマーの親和性を改善するような、またはオリゴマーを安 定化するような他の基がある。現在のところ、より好ましいオリゴマーには、Ｍ ＭＩおよびモルフォリノオリゴヌクレオチド、ＰＮＡ、2'-Ｆ、2'-Ｏ-アルキル 、好ましくは2'-Ｏ-ＣＨ3および2'-Ｏ-ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ3、および2'-アルコキシ アルコキシオリゴヌクレオチド、最も好ましくは2'-ＯＣＨ2ＣＨ2ＯＣＨ3［2'- Ｏ-(2-メトキシエチル)または2'-メトキシエトキシとしても知られている］が含 まれる。オリゴマーが前記の方法で一様に修飾されている必要はない。 修飾を加えたヌクレオ塩基を少なくとも一つ有するオリゴマーも、本発明に含 まれる。 本発明に従い用いられるオリゴマーの多くは、固相合成のよく知られる手法に よって簡便に型通りに作り得る。このような合成のための機器は、Ａpplied Ｂi osystemsを含むいくつかの売手によって販売されている。固相あるいは液相合成 のための他のあらゆる手段もやはり用いることができ、オリゴマーの合成は型通 りに作業する者の能力の十分範囲内である。これらの手法を用いて2'-修飾オリ ゴヌクレオチド、骨格に修飾を加えたオリゴマーおよび他のオリゴマーを調製す ることは、よく知られている。 本発明の方法において、キャップされた標的mＲＮＡをオリゴマーと接触させ る。本発明に関しては、“標的”mＲＮＡとは、その翻訳がアンチセンス相互作 用を介して特異的に阻害されるようなmＲＮＡである。本発明のアンチセンスオ リゴマーは、そのmＲＮＡ標的上の相補的なヌクレオチド配列と特異的にハイブ リッド形成するように設計されている。“標的”または“標的領域”という用語 も、mＲＮＡのこの配列、すなわちアンチセンスオリゴマーが相補的である特定 の領域を包含する。本発明に関しては、標的mＲＮＡとオリゴマーを“接触させ る”とは、前記標的mＲＮＡを含むかあるいは含むと考えられる細胞懸濁液また は組織サンプルに、インビトロまたはエクスビボのいずれかにおいてオリゴマー を加えること、または標的mＲＮＡを含むかあるいは含むと考えられる動物中の 細胞または組織にオリゴマーを投与することを意味する。オリゴマーは通例、液 体のキャリアー内にあるかあるいは、キャリアーに加えてさらに成分を含み得る 薬剤組成物の一部である。 “ハイブリッド形成”とは、本発明に関しては、ワトソン-クリック塩基対形 成としても知られる、相補的なヌクレオ塩基間の水素結合を意味する。グアニン とシトシンは、その間で３つの水素結合を形成することが知られている相補的な 塩基の例である。アデニンとチミンは、その間で２つの水素結合を形成すること が知られている相補的な塩基の例である。三本鎖形成、またはトリプレックス形 成は、ＲＮＡ分子上のヘアピン領域など、標的の二本鎖領域に対するオリゴマー のハイブリッド形成の特定の形態である。“特異的にハイブリッド形成可能な” および“相補的な”とは、ＲＮＡ標的とオリゴマーの間に安定かつ特異的な結合 が生じるような、十分な相補性の程度を示すのに用いられる用語である。オリゴ マーは、特異的にハイブリッド形成可能であるために、その標的核酸配列と100 ％相補的である必要はない。標的に対するオリゴマー結合が標的分子の正常機能 を妨害し、有用性の喪失の原因となる場合、および、特異的な結合が望まれるよ うな条件下、すなわちインビボアッセイまたは治療的処置に関しては生理的な条 件下で、あるいはインビトロアッセイに関してはアッセイが行われる条件下で、 標的ではない配列に対するオリゴマーの非特異的な結合を避けるのに十分な程度 の相補性がある場合、オリゴマーは特異的にハイブリッド形成可能である。 本発明のオリゴマーは、キャップされた標的mＲＮＡの5'キャップ領域と特異 的にハイブリッド形成可能であるように設計される。本明細書中で定義するよう に、“5'キャップ領域”とは、前記標的mＲＮＡの5'末端の最初の20塩基のうち 少なくとも一つを含む、前記標的mＲＮＡの領域を表す。言い換えれば、ヌクレ オチド番号１がキャップ構造に隣接する場合の、ヌクレオチド1-20のうちの少な くとも一つである。 以下は、本発明の方法および組成物が効果的に用いられた実例である。本発明 はこれらの標的あるいはこれらの組成物に限定されない。ＩＣＡＭ-1 ヒト細胞間接着分子-1（ＩＣＡＭ-1）mＲＮＡ転写産物を標的とする多数のオ リゴマーが、ヒト血管内皮細胞におけるＩＣＡＭ-1発現を減少させる活性に関し て評価されている。ＩＣＡＭ-1は、血管内皮の表面に発現するいくつかの細胞接 着分子の一つであり、様々な免疫および炎症応答に関与する。ＩＣＡＭ-1は、炎 症伝達物質に応答して非内皮細胞にも発現する。ＩＣＡＭ-1の発現量の上昇は、 慢性関節リ ウマチおよび乾癬のような多数の疾患状態において観察されており、ＩＣＡＭ-1 は治療的な関心の標的となった。ヒトＩＣＡＭ-1の発現を阻害するアンチセンス オリゴヌクレオチドに関して、慢性関節リウマチ、潰瘍性大腸炎、クローン病、 乾癬および腎移植拒絶の防止といった様々な疾患状態にある患者における臨床試 験が現在進行中である。クローン病におけるこの薬剤ＩＳＩＳ2302の第２相試験 において有効性はすでに証明されている。Ｇenetic Ｅngineering Ｎews,Ｍarch 1,1997,pg.1;Ｎew Ｙork Ｔimes,Ｆriday,Ｆebruary 28,1997。 アンチセンスオリゴマーがＩＣＡＭ-1転写産物の5'キャップ領域を標的とする 場合は、よいアンチセンス活性にＲＮＡse Ｈ活性は必要でないことが今では見 出されている。驚くべきことに、ＲＮＡse Ｈを活性化しない、あるいは少なく ともＲＮＡse Ｈ非依存的であるオリゴマーが、この領域を標的とする場合に意 外なことに活性であることが見出された。ＲＮＡse Ｈの基質にはならない、完 全に2'-修飾を加えたオリゴマーに関するデータを得た。標的領域はＩＣＡＭ-1 転写産物のヌクレオチド1-20であった（この場合、ヌクレオチド１はキャップ構 造に直接隣接している）。異なる９つのオリゴマーの用量反応分析を行い、同じ 領域を標的とするホスホロチオエートデオキシオリゴヌクレオチドであるＩＳＩ Ｓ3067(配列番号1;ＴＣＴＧＡＧＴＡＧＣＡＧＡＧＧＡＧＣＴＣ)と比較して、Ｉ ＣＡＭ-1細胞表面タンパク質発現の阻害に関する有効性を決定した。この化合物 は、以前にＩＣＡＭ-1発現の阻害に非常に有効であることが示されていた。ＷＯ 92/03139(Ｂennett et al.),Ｊ.Ｉmmunol.(1994)152:3530-3540。 研究したオリゴマーは、ホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）あるいはホスホジエス テル(Ｐ＝Ｏ)骨格のいずれかを有する、この配列の2'-メトキシ（2'-Ｏ-メチル とも称される）、2'-プロポキシ（2'-Ｏ-プロピルとも称される）、2'-Ｏ-アリ ル、2'-メトキシエトキシおよび2'-フルオロ類似体であった。表１に挙げるこれ らの化合物を、ＨＵＶＥＣ細胞におけるＩＣＡＭ-1タンパク質量を減少させる能 力に関して分析した。表１のすべての化合物が同じ配列の配列番号１を有する。 ホスホジエステル系列（図1Ａ）では、2'-メトキシエトキシ（ＩＳＩＳ11158） が最も効力があり、最も効力がないのは2'-Ｏ-アリル（ＩＳＩＳ12461）であっ た。ホスホロチオエート系列では（図1Ｂ）、最も効力のあるオリゴマーはやは り2'-メトキシエトキシ類似体（ＩＳＩＳ11159）であり、最も効力がないのは、 比較の目的で含めた2'-デオキシＩＳＩＳ3067であった。スクランブル対照は、 ＩＳＩＳ10588(Ｐ＝Ｓデオキシ)、ＩＳＩＳ12344(Ｐ＝Ｏ、2'-メトキシエトキシ )およびＩＳＩＳ12345(Ｐ＝Ｓ、2'-メトキシエトキシ)であった。 ＩＣ50（ＩＣＡＭ-1量の50％阻害に必要な濃度）を、これらの化合物のいくつ かに関して計算した。ＩＳＩＳ3067(Ｐ＝Ｓ、デオキシ)はおよそ20nＭのＩＣ50 を有することがわかった。2'-修飾を加えた化合物では、ＩＳＩＳ3224(Ｐ＝Ｓ、 2'-メトキシ)がおよそ24nＭのＩＣ50を有し、ＩＳＩＳ11665(Ｐ＝Ｓ、2'-Ｆ)が およそ10nＭのＩＣ50を有し、ＩＳＩＳ11159(Ｐ＝Ｓ、2'-メトキシエトキシ)が およそ３nＭのＩＣ50を有していた。これらの化合物が好ましい。ホスホジエス テル2'-メトキシエトキシ化合物ＩＳＩＳ11158はおよそ９nＭのＩＣ50を有して いた。この化合物も好ましい。 オリゴマー処理したＨＵＶＥＣから全細胞ＲＮＡを単離し、分析して、ＩＣＡ Ｍ-1 タンパク質発現の阻害が、アンチセンスが促進する標的転写産物の分解に起因す るかどうか決定した。驚くべきことに、ノーザンブロット分析は、抗ＩＣＡＭ-1 オリゴヌクレオチド（ＩＳＩＳ11158および11159）にて処理した細胞における、 比較的大量のＩＣＡＭ-1転写産物の有意な増加を示した。これは図２に示してあ る。ＩＣＡＭ-1タンパク質発現は、これらのオリゴヌクレオチド濃度で完全に阻 害された。 ＩＳＩＳ11929は、別の細胞接着分子であるＥ-セレクチンを標的としたアンチ センスオリゴヌクレオチドであり、本実験に対照として含めた。ＩＳＩＳ11929 にて細胞を処理してもＩＣＡＭ-1 mＲＮＡ量の増加をもたらさなかったが、Ｅ- セレクチンmＲＮＡ量の増加をもたらした。 標的ＩＣＡＭ-1転写産物の翻訳に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド処理 の効果を決定するために、ポリソームプロファイルを利用した。ＩＣＡＭ-1タン パク質およびmＲＮＡ量を、ＩＳＩＳ11159またはＩＳＩＳ12345（対照）にて処 理した後に測定した。ＩＣＡＭ-1タンパク質の細胞表面発現を、処理細胞の小部 分のＦＡＣＳ分析によって求めたところ、ＩＳＩＳ11159は無処理の対照と比較 して、ＩＣＡＭ-1量を84％減少させることがわかった。スクランブル対照オリゴ マーＩＳＩＳ12345はＩＣＡＭ発現をわずか3％減少させただけであった。残った 細胞の細胞質ゾル抽出物を調製し、ショ糖勾配遠心にて沈殿させた。勾配を分取 し、ＲＮＡを各画分から単離し1％変性アガロースゲル上で分析して、サブポリ ソームおよびポリソームプールの満足の行く分離を示した。ノーザンブロッティ ングによるＩＣＡＭ-1転写産物の分布決定は、対照オリゴマ-ＩＳＩＳ12345にて 処理した細胞あるいは無処理の対照細胞と比較して、ＩＳＩＳ11159にて処理し た細胞にっいてのポリソームプロファイルにおいて有意な違いを示した。ＩＳＩ Ｓ11159が、大多数（67％）の全長ＩＣＡＭ-1転写産物がサブポリソーム画分（4 0Ｓ、60Ｓおよび80Ｓリボソーム画分）に局在するのを示したのに対し、対照の ＩＳＩＳ12345処理、および無処理の細胞は、ポリソーム画分に大多数（それぞ れ73％および69％）の全長ＩＣＡＭ-1転写産物を示した。これは、ＩＳＩＳ1115 9が標的ｍＲＮＡ上へのリボソームの構築を妨害することによって、翻訳を直接 妨害することを証明している。 5'キャップを標的とするペプチド-核酸（ＰＮＡ）オリゴマーも、ＩＣＡＭ-1 発現を阻害することが示された。アルギニン３つを5'末端に加え、リジン１つを 3'末端に加えたＰＮＡとして作った、配列番号１を短くした型であるＰＮＡオリ ゴマーＩＳＩＳ10535（配列番号２）を合成した。このオリゴマーをＵ937細胞に エレクトロポレーションし、強力な用量-反応を得た。ＩＳＩＳ10535高用量では ＩＣＡＭ-1はベースラインレベルより下にまで減少した。これらのエレクトロポ レーション条件下では、ＩＳＩＳ10535は５μＭ以下のＩＣ50を有し、ＩＳＩＳ3 067は20μＭを越えるＩＣ50を有していた。従って、ＩＳＩＳ10535が好ましい。Ｅ-セレクチン 白血球の血管内皮への接着および続く脈管外への移動に関与する、別の接着分 子が同定されている。これらの一つがＥ-セレクチンであり、内皮白血球接着分 子-1（ＥＬＡＭ-1）としても知られている。 ヒトＥ-セレクチンを標的とする2'-フルオロホスホロチオエートオリゴヌクレ オチドの系列を合成し、Ｅ-セレクチンタンパク質発現を阻害する能力について 分析した。Ｅ-セレクチンメッセージの様々な領域（5'キャップ、5'ＵＴＲ、Ａ ＵＧ、コーディング領域、イントロン、3'ＵＴＲ）に相補的な、30を越えるオリ ゴヌクレオチド配列の中では、飛び抜けて活性があるのは、ヒトＥ-セレクチン ｍＲＮＡの5'キャップ領域（ヌクレオチド1-20）を標的とするＩＳＩＳ9984（配 列番号3;ＧＡＡＧＴＣＡＧＣＣＡＡＧＡＡＣＡＧＣＴ）であった。 これらの配列の類似体を、2'-デオキシ、2'-プロポキシ、あるいは2'-メトキ シエトキシ修飾を施して合成した。これらの化合物を、ＨＵＶＥＣにおけるＥ- セレクチン発現を阻害する能力に関して分析した。図３に示すように、この実験 においてはデオキシホスホロチオエート化合物ＩＳＩＳ4764が10nＭ以下のＩＣ5 0を有していた。2'Ｆホスホロチオエート類似体ＩＳＩＳ9984および2'-メトキシ エトキシホスホジエステル類似体ＩＳＩＳ11929の両者は、これより十分下のＩ Ｃ50を有しており、これら２つの化合物が好ましい。ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ） ヒトＣＭＶゲノムは、ヘルペスウイルスのうちそのゲノム構造の点で最も複雑 である。ヒトＣＭＶの複製不全変異体が、２つのウイルス遺伝子、前初期複合体 （ＩＥ1/ＩＥ2）およびＤＮＡポリメラーゼに関して単離されているのみである 。これらの遺伝子はヒトＣＭＶ遺伝子発現において主要な役割を持つことが知ら れている。アンチセンス化合物設計の第１の標的としてこれらを選択した。 ＣＭＶにおける前初期転写の分子生物学は、真核細胞におけるあらゆる転写単 位のものと同様に十分解明されている。手短に言うと、主要な前初期転写産物（ ＩＥ1）の合成は、細胞特異的かつ分化特異的方法で作用すると知られている多 数の転写応答分子によって制御されている。ＩＥ1/ＩＥ2 mＲＮＡは、mＲＮＡの 異なるスプライシングによってＩＥ1およびＩＥ2タンパク質の両者をコードする 、豊富なキャップされたＲＮＡである。ＩＥ1は、ＩＥ2遺伝子産物の発現と同様 にそれ自身の発現も制御している。前初期転写の開始段階では、ＩＥ1 mＲＮＡ だけが細胞のＲＮＡポリメラーゼによって合成される。ＩＥ2 mＲＮＡは、この 感染初期の間にＩＥ1 mＲＮＡをプロセッシングすることによって作られる。Ｉ Ｅ2タンパク質は、細胞およびウイルス起源の他の既知のトランス活性化タンパ ク質と同様の方法で、多くのＣＭＶ早期および後期遺伝子を転写活性化すること ができる。したがって、ＩＥ2タンパク質はＣＭＶ遺伝子発現の元スイッチの一 つであると考えられている。ＣＭＶ ＩＥ2 mＲＮＡを標的としたアンチセンス薬 剤が現在のところ臨床試験中で、ＡＩＤＳ患者におけるＣＭＶ網膜炎に対して活 性であることが示されている。 ＣＭＶ ＩＥ1/ＩＥ2 mＲＮＡ転写産物の配列は既知である（Ｓtenberg,Ｒ.Ｍ. ,Ｗitte,Ｐ.Ｒ.and Ｓtinski,Ｍ.Ｆ.,Ｊ.Ｖirol.1985,56,665-675;Ｓtenberg,Ｒ .Ｍ.,Ｔhomsen,Ｄ.Ｒ.,and Ｓtinski.Ｍ.Ｆ.,Ｊ.Ｖirol.1984,49:190-199）。m ＲＮＡの5'末端は“Ｇ”で終わることが今では知られている（オリゴヌクレオチ ド1-21を示す）： ＣＭＶ ＩＥ1/ＩＥ2 mＲＮＡ 5'末端 5' pppＧＵＣＡＧＡＵＣＧＣＣＵＧＧＡＧＡＣＧＣＣ 配列番号４ 用量-作用実験を行い、ＣＭＶ複製の阻害に関して活性なアンチセンス化合物 を同定した。完全な2'-メトキシのホスホロチオエートオリゴヌクレオチドであ るＩＳＩＳ3300が活性であることがわかった。この化合物（配列番号５：ＴＧＧ ＣＧＴＣＴＣＣＡＧＧＣＧＡＴＣＴＧＡ）はＩＥ1/ＩＥ2転写産物の5'キャップ 領域（ヌ クレオチド2-22）に相補的で、好ましい。配列番号５の類似体も、ＣＭＶに対す る活性に関して分析した。これらのオリゴマーに関する修飾およびＩＣ50を、対 応する対照と合わせて表２に示す： 表２において１μＭまたはそれ以下のＩＣ50を有するオリゴヌクレオチドが好ま しい。 単一のＣＭＶタンパク質を発現する、安定にトランスフェクトしたＵ373神経 芽腫細胞において、ＩＥ1およびＩＥ2タンパク質産物の発現を阻害する能力に関 して、オリゴヌクレオチドを直接分析した。ＩＥ1は72kＤのポリペプチド産物に 翻訳される。ＩＥ2は、55kＤ産物および86kd産物の２つのポリペプチド産物に異 なってスプライスされる。 ホスホロチオエート2'-メトキシ修飾をしたオリゴヌクレオチドの系列を、55k Ｄ ＩＥ2産物を阻害する能力に関して分析した。5'キャップ領域を標的とするオ リゴヌクレオチド（75nＭ、５μg/ml リポフェクチン）は、mＲＮＡ上の他の場 所を標的とするオリゴヌクレオチドよりも活性があることがわかった。 ＩＥ1/ＩＥ2 mＲＮＡのヌクレオチド2-22を標的とするＩＳＩＳ3300は、この濃 度で55kＤ産物の合成を50％以上阻害した。ヌクレオチド1-21を標的とする、Ｉ ＳＩＳ6871（ＧＧＣＧＴＣＴＣＣＡＧＧＣＧＡＴＣＴＧＡＣ、配列番号6）は、 この産物の合成を65％以上阻害した。mＲＮＡのヌクレオチド2-21を標的とする 、ＩＳＩＳ12659（ＧＧＣＧＴＣＴＣＣＡＧＧＣＧＡＴＣＴＧＡ、配列番号7）は 、55kＤの量をおよそ90％阻害し、さらに、ヌクレオチド7-26を標的とする、Ｉ ＳＩＳ12660（ＴＧＧＡＴＧＧＣＧＴＣＴＣＣＡＧＧＣＧＡ、配列番号8）は55k Ｄの合成を75％以上阻害した。 72kＤ ＩＥ1タンパク質産物を発現する安定トランスフェクタントにおいて、 ＩＳＩＳ3300（配列番号5）は72kＤタンパク質の発現をおよそ75nＭのＩＣ50に て阻害することがわかった。このオリゴマーのメトキシエトキシ類似体であるＩ ＳＩＳ11938は、およそ25nＭのＩＣ50を有していた。 このように、ＣＭＶ ＩＥ1/ＩＥ2 mＲＮＡの5'末端を標的とするアンチセンス オリゴマーは、この転写産物の複数のタンパク質産物の合成を効果的に阻害し得 る。ＩＣＡＭ-1を標的とする別のオリゴマー ヒトＩＣＡＭ-1の5'キャップ領域を標的とする別のオリゴマーを設計し、ＩＣ ＡＭ-1発現を減少させる能力について分析した。これらのオリゴマーを表３に示 す。標的領域は標的とするＩＣＡＭ-1 mＲＮＡ上のヌクレオチド番号として与え たが、この場合ヌクレオチド１（n.t.1）は5'キャップに直接に隣接する。これ らのオリゴマーにおいて、オリゴマーの3'末端のヌクレオチドは、合成が容易で あるため2'-デオキシヌクレオチドであった。オリゴマーの3'末端にない各シト シン残基は、5-メチルシトシン残基であった。3'末端のヌクレオシドがシトシン であれば、5-メチル化しなかった。表において、2'ＭＯＥ＝2'メトキシエトキシ （2'-Ｏ-ＣＨ2ＣＨ2Ｏ-ＣＨ3）、ＭＭＩ＝メチレン（メチルイミノ）骨格である 。 ヒトＩＣＡＭ-1モノクローン性抗体mＡb84Ｈ10（ＡＭＡＣ Ｉnc.,Ｗestbrook ＭＥ）を用いたこと以外は実施例７に記載のように、ヒト臍帯脈内皮細胞（ＨＵ ＶＥＣ）におけるヒトＩＣＡＭ-1タンパク質発現を阻害する能力に関して、表３ に示すオリゴマーを分析した。Ｂennett et al.,(1990)Ｊ.Ｉmmunol.152:3530-3 540。 このアッセイにてホスホジエステル/2'-メトキシエトキシ（ＰＯ/2'ＭＯＥ） オリゴマーＩＳＩＳ13884および13886を分析した際には、ＩＳＩＳ13884はおよ そ40nＭのＩＣ50を有することがわかった。ＩＳＩＳ13886は50nＭの濃度までし か分析しておらず、この低用量ではＩＣ50は得られなかった。しかし、用量-反 応曲線を外挿法で推定すると、およそ60nＭの推定ＩＣ50が得られた。これは図 ４に示してある。ＩＳＩＳ13384および13886の両者ともに、本発明の好ましい態 様である。比較のために、ＩＣＡＭ-1メッセージの5'最末端を標的とする、ホス ホジエステル2'-メトキシエトキシ化合物であるＩＳＩＳ11158は、同じ実験にお いておよそ５nＭのＩＣ50を有していた。 ＩＳＩＳ14289-14292は、交互のＭＭＩ/Ｐ＝Ｏ骨格を持つオリゴマーである。 ＩＳＩＳ14289（配列番号1）は20merで、ＩＳＩＳ14290、14291および14292はこ の配列を漸次短くした型である。ＩＳＩＳ14293-14296は、交互のＭＭＩ/Ｐ＝Ｓ 骨格を持つ対応するオリゴマーである。Ｕ937細胞内へのエレクトロポレーショ ンによる輸送については４から40μＭの、そしてＨＵＶＥＣ内へのリポフェクチ ンによる輸送については6.2から200nＭの範囲にある６つの濃度の各オリゴマー にて処理した後、ＩＣＡＭ-1タンパク質の細胞表面発現を測定することによって 、これらのオリゴマーのアンチセンス活性（ＩＣ50）を求めた。“Ｎ.Ａ.”は、 与えられた用量範囲ではＩＣ50が得られなかったことを示す。結果を表４に示す 。 これらの結果は、ＭＭＩオリゴマーの取り込み条件は依然として最適化されてい ないが、ＭＭＩオリゴマーはＩＣＡＭ-1発現を阻害することができるということ を示唆している。この予備的データに基づくと、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮTM存在下 で得られたＩＣ50に基づいて、ＩＳＩＳ14293、14294および14295が現在は好ま しい。Ｅ-セレクチンを標的とする別のオリゴマー ヒトＥ-セレクチンの5'キャップ領域を標的とする別のオリゴマーを設計し、 Ｅ-セレクチン発現を減少させる能力について分析した。これらのオリゴマーを 表５に示す。 実施例７に記載のＥＬＡＳＡアッセイを用いてＨＵＶＥＣにおけるヒトＥ-セレ クチン発現を減少させる能力に関して、これらのオリゴマーを分析した。このア ッセイにおいて、ホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドＩＳＩＳ4764 はおよそ10nＭのＩＣ50を示した。同じ実験において、いずれも2'-メトキシエト キシオリゴヌクレオチドであるＩＳＩＳ11929および11928は、2'-フルオロオリ ゴヌクレオチドであるＩＳＩＳ11205と同様に、測定するには小さすぎる、すな わち３nＭより十分小さいＩＣ50を与えた。50nＭのオリゴマー濃度において、こ れらの３つの化合物はＥ-セレクチン発現の事実上100％の阻害を与えた。これを 図５に示す。これらの化合物は、それゆえ非常に好ましい。同等の実験において 、ＩＳＩＳ4764は再度10nＭのＩＣ50を示した。Ｐ＝Ｓ/2'Ｏメチルオリゴヌクレ オチドＩＳＩＳ14043もまた、10nＭのＩＣ50を有していた。Ｐ＝Ｓ/2'-Ｏ-プロ ピル化合物のＩＳＩＳ9218は、25nＭのＩＣ50を示し、スクランブル対照のＩＳ ＩＳ14044は不活性であった。ＩＳＩＳ11929、11928、および11205は、測定する には小さすぎる、すなわち３nＭより十分小さいＩＣ50を再度与えた。ＶＣＡＭ-1 血管細胞接着分子-1（ＶＣＡＭ-1）は、ＩＣＡＭ-1と同様に免疫グロブリン遺 伝子スーパーファミリーの一員である。ＩＣＡＭ-1およびＥ-セレクチンとも同 様に、ＶＣＡＭ-1は炎症刺激に応答して血管内皮細胞の管腔表面に誘導される。 Ｃybulsky et al.(1991)Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.,ＵＳＡ,88:7859-7863によ って発表されたＶＣＡＭ-1配列を用い、ヒトＶＣＡＭ-1の5'キャップ領域を標的 とするオリゴマーの系列を設計し合成した。これらのオリゴマーを表７に示す。 これらのオリゴマーの中で、オリゴマーの3'末端のヌクレオチドは、合成を容易 にするために2'-デオキシヌクレオチドとした。 実施例７に記載のＥＬＡＳＡアッセイおよびマウス抗ヒトＶＣＡＭ-1モノクロー ン性抗体（Ｇenzyme Ｃorp,Ｃambridge ＭＡ）を用い、ＨＵＶＥＣにおけるＶＣ ＡＭ-1発現を阻害する能力に関して、これらのオリゴマーを分析した。Ｂennett et al.,(1990)Ｊ.Ｉmmunol.152:3530-3540。このアッセイにおいて、ＩＳＩＳ1 3181、13182および12183はいずれも10nＭより小さいＩＣ50を示し、それゆえ非 常に好ましい。ホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチド、ＩＳＩＳ5884 は、およそ10-12nＭのＩＣ50を示した。これを図６に示す。続く実験では、これ らの化合物を再び分析し、ＩＳＩＳ14040および14041も分析した。再度、すべて の化合物はおよそ10nＭより小さいＩＣ50を有しており、それゆえＩＳＩＳ14040 および14041は非常に好ましい。分析した６つすべての化合物が、100nＭという 、試した最も高い用量で約85％以上のＶＣＡＭ-1発現阻害を与えた。ＩＳＩＳ13 181は、この用量で一貫して100％のＶＣＡＭ-1発現阻害をもたらした。 特定の好ましい態様に従い、特異性をもって本発明を記載したが、以下の実施 例は本発明を単に例証するのに役立つものであって、本発明をこれらの例に限定 することを意図するものではない。実施例 実施例１： オリゴヌクレオチド合成 修飾していないオリゴデオキシヌクレオチドを、ヨウ素による酸化を伴う標準 的なホスホルアミダイト化学を用い、自動ＤＮＡ合成機（Ａpplied Ｂiosystems model 380Ｂ）にて合成する。β-シアノエチルジイソプロピル-ホスホルアミダ イトはＡpplied Ｂiosystems（Ｆoster Ｃity,ＣＡ）より購入する。ホスホロチ オエートオリゴヌクレオチドに関しては、リン酸結合の炭素を段階的に硫黄置換 （thiation）するために、標準酸化ボトルを3Ｈ-1,2-ベンゾジチオール-3-オン1 ,1-ジオキサイドの0.2Ｍアセトニトリル溶液で置換する。炭素の硫黄置換サイク ルの待機段階を68秒に増やし、続けてキャッピング段階に進める。 2'-メトキシβ-シアノエチルジイソプロピル-ホスホルアミダイト（Ｃhemgene s,Ｎeedham ＭＡ）と、テトラゾールおよび塩基のパルス輸送後の待機段階を360 秒に増やすこと以外は非修飾オリゴヌクレオチド用の標準的なサイクルを用い、 2'-メトキシオリゴヌクレオヒドを合成する。Ｃlen Ｒesearch, Ｉnc.,sterling,ＶＡなどの適切な2'-修飾アミダイトを用いるこの方法の修飾に より、他の2'-アルコキシオリゴヌクレオチドを合成する。 2'-フルオロオリゴヌクレオチドを、Ｋawasaki et al.,Ｊ.Ｍed.Ｃhem.1993,3 6,831-841に記載のように合成する。手短に言うと、商業的に入手可能な9-β-Ｄ -アラビノフラノシルアデニンを出発物質として利用し、2'-β-Ｏ-トリファイル 基のＳN2置換によって2'-α-フルオロ原子を導入するという文献の手順を修飾し て、保護したヌクレオシドＮ6-ベンゾイル-2'-デオキシ-2'-フルオロアデノシン を合成した。このようにして、3',5'-ジテトラヒドロピラニル（ＴＨＰ）中間体 として並みの収量で、Ｎ6-ベンゾイル-9-β-Ｄ-アラビノフラノシルアデニンを 選択的に保護した。標準的な方法論を用いてＴＨＰおよびＮ6-ベンゾイル基の脱 保護を達成し、標準的な方法を用いて5'-ジメトキシトリチル-（ＤＭＴ）および 5'-ＤＭＴ-3'-ホスホルアミダイト中間体を得た。 テトライソプロピルジシロキサニル（ＴＰＤＳ）保護した9-β-Ｄ-アラビノフ ラノシルグアニンを出発物質として、さらに中間体ジイソブチリルアラビノフラ ノシルグアノシンへの変換を用い、2'-デオキシ-2'-フルオログアノシンの合成 を達成した。ヒドロキシル基をＴＨＰで保護した後、ＴＰＤＳ基の脱保護を行っ てジイソブチリル ジ-ＴＨＰ保護したアラビノフラノシルグアノシンを作った。 粗生成物をフッ素にて処理した後、選択的なＯ-脱アシル化およびトリフル化を 行い、それからＴＨＰ基の脱保護を行った。標準的な方法論を用いて5'-ＤＭＴ- および5'-ＤＭＴ-3'-ホスホルアミダイトを得た。 2',2'-アンヒドロ-1-β-Ｄ-アラビノフラノシルウラシルを70％フッ化水素-ピ リジンにて処理するという文献の手順の修飾により、2'-デオキシ-2'-フルオロ ウリジンの合成を達成した。標準的な手順を用いて5'-ＤＭＴ-および5'-ＤＭＴ- 3'-ホスホルアミダイトを得た。 2'-デオキシ-2'-フルオロウリジンのアミノ化によって2'-デオキシ-2'-フルオ ロシチジンを合成し、続いて選択的な保護を行ってＮ4-ベンゾイル-2'-デオキシ -2'-フルオロシチジンを作った。標準的な手順を用いて5'-ＤＭＴ-および5'-Ｄ ＭＴ-3'-ホスホルアミダイトを得た。 制御孔ガラスカラム（Ａpplied Ｂiosystem）から切り出し、濃塩化アンモニ ウ ム中、55℃で18時間脱ブロッキングしたあと、2.5倍量のエタノールと0.5ＭＮa Ｃlから２回沈殿させることにより、オリゴヌクレオチドを精製する。 Ｍartin,Ｐ.,Ｈelv.Ｃhim.Ａcta 1995,78,486-504に従い、2'-(2-メトキシエ トキシル)-修飾したアミダイトを合成する。合成を容易にするために、最後のヌ クレオチドはデオキシヌクレオチドとした。すべての2'-Ｏ-ＣＨ2ＣＨ2ＯＣＨ3 シトシンは5-メチルシトシンとした。 5-メチルシトシンモノマーの合成：2,2'- アンヒドロ［1-(β-Ｄ-アラビノフラノシル)-5-メチルウリジン］： 5-メチルウリジン（リボシルチミン、Ｙamasa,Ｃhoshi,Ｊapanから商業的に入 手可能）（72.0g、0.279Ｍ）、ジフェニル-炭酸塩（90.0g、0.420Ｍ）および炭 酸水素ナトリウム（2.0g、0.024Ｍ）をＤＭＦ（300mＬ）に加えた。撹拌し、発 生した二酸化炭素ガスが制御されたやり方で放出されるようにしながら、混合液 を熱して還流させた。１時間後、わずかに黒ずんだ溶液を減圧下で濃縮した。そ の結果得られたシロップを、撹拌しながらジエチルエタノール（2.5Ｌ）に注ぎ 込んだ。生成物はガムを形成した。エーテルをデカントし、残渣を最少量のメタ ノール（約400mＬ）に溶解した。溶液を新しいエーテル（2.5Ｌ）に注ぎ込み、 硬いガムを得た。エーテルをデカントし、ガムを真空乾燥機中で乾燥させ（1mm Ｈgで60℃、24時間）、明るい黄褐色の粉末にまで粉々になった固体を得た（57g 、85％の粗収率）。この物質をそのまま、さらに続く反応に用いた。2'- Ｏ-メトキシエチル-5-メチルウリジン： 2,2'-アンヒドロ-5-メチルウリジン（195g、0.81Ｍ）、トリス(2-メトキシエ チル)ほう酸塩（231g、0.98Ｍ）および2-メトキシエタノール（1.2Ｌ）を２Ｌの ステンレススチール圧力容器に加え、あらかじめ熱しておいた160℃の油浴中に 置いた。155-160℃で48時間熱した後、容器を開け、乾燥し粉々になるまでＭeＯ Ｈ（200mＬ）と一緒に溶液を蒸発させた。熱したアセトン（1Ｌ）に残渣を懸濁 させた。不溶性の塩を濾別し、アセトン（150mＬ）で洗い、濾別物を蒸発させた 。残渣（280g）をＣＨ3ＣＮ（600mＬ）に溶解し、蒸発させる。シリカゲルカラ ム（3kg）をＣＨ2Ｃl2/アセトン/ＭeＯＨ（20:5:3）含有0.5％ Ｅt3ＮＨ中に パックした。残渣をＣＨ2Ｃl2（250mＬ）に溶解し、カラムにのせる前にシリカ （150g）に吸着させた。生成物をパッキング溶媒にて溶出し、160g（63％）の生 成物を得た。2'- Ｏ-メトキシエチル-5'-Ｏ-ジメトキシトリチル-5-メチルウリジン： 2'-Ｏ-メトキシエチル-5-メチルウリジン（160g、0.506Ｍ）をピリジン（250m Ｌ）と一緒に蒸発させ、乾燥した残渣をピリジン（1.3Ｌ）に溶解した。塩化ジ メトキシトリチル（94.3g、0.278Ｍ）の最初のアリコートを加え、混合液を室温 で１時間撹拌した。塩化ジメトキシトリチル（94.3g、0.278Ｍ）の２番目のアリ コートを加え、反応液をさらに１時間撹拌した。それからメタノール（170mＬ） を加えて反応を止めた。ＨＰＬＣにより、およそ70％の生成物が存在することが 示された。ＣＨ3ＣＮ（200mＬ）にて溶媒を蒸発させ、粉々にした。残渣をＣＨ Ｃl3（1.5Ｌ）に溶解し、2x500mＬの飽和ＮaＨＣＯ3および2x500mＬの飽和Ｎａ Ｃlにて抽出した。有機相をＮa2ＳＯ4で乾燥し、濾過して蒸発させた。275gの残 渣が得られた。0.5％Ｅt3ＮＨを含むＥtＯＡc/ヘキサン/アセトン（5:5:1）にて パックし溶出した3.5kgのシリカゲルカラムにて、残渣を精製した。純粋な画分 を蒸発させ、164gの生成物を得た。純粋でない画分からおよそ20g追加で得られ 、183g（57％）の総収量を得た。3'- Ｏ-アセチル-2'-Ｏ-メトキシエチル-5'-Ｏ-ジメトキシトリチル-5-メチルウ リジン： 2'-Ｏ-メトキシエチル-5'-Ｏ-ジメトキシトリチル-5-メチルウリジン（106g、 0.167Ｍ）、ＤＭＦ/ピリジン（562mＬのＤＭＦと188mＬのピリジンから調製した 3:1混合液750mＬ）および無水酢酸（24.38mＬ、0.258Ｍ）を合わせ、室温で24時 間撹拌した。反応は、まずtlcサンプルをＭeＯＨ添加で冷やし、tlcにてチェッ クした。tlcで判断して反応が終了した時に、ＭeＯＨ（50mＬ）を加え、混合液 を35℃で蒸発させた。残渣をＣＨＣl3（800mＬ）に溶解し、2x200mＬの飽和炭酸 水素ナトリウムおよび2x200mＬの飽和ＮaＣlにて抽出した。水相を200mＬのＣＨ Ｃl3にて逆抽出した。合わせた有機相を硫酸ナトリウムにて乾燥し、蒸発させて 122gの残渣（およそ90％の生成物）を得た。残渣を3.5kgのシリカゲルカラムに て精製し、ＥtＯＡc/ヘキサン（4:1）を用いて溶出した。 純粋な生成物画分を蒸発させて96g（84％）を得た。3'- Ｏ-アセチル-2'-Ｏ-メトキシエチル-5'-Ｏ-ジメトキシトリチル-5-メチル-4- トリアゾールウリジン： 3'-Ｏ-アセチル-2'-Ｏ-メトキシエチル-5'-Ｏ-ジメトキシトリチル-5-メチル ウリジン（96g、0.144Ｍ）をＣＨ3ＣＮ（700m）に溶解して最初の溶液を調製し 、とっておいた。トリエチルアミン（189mＬ、1.44Ｍ）をトリアゾール（90g、1 .3Ｍ）のＣＨ3ＣＮ（1Ｌ）溶液に加え、-5℃まで冷却し、高架式スターラーを用 いて0.5時間撹拌した。0-10℃に保った撹拌溶液にＰＯＣl3を一滴ずつ、30分以 上の時間で加え、その結果得られた混合液をさらに２時間撹拌した。あとの溶液 に最初の溶液を一滴ずつ、45分以上の時間で加えた。その結果得られた反応混合 液を一晩、低温室に保管した。塩を反応混合液から濾別し、溶液を蒸発させた。 残渣をＥtＯＨ（1Ｌ）に溶解し、不溶性の固体を濾過で取り除いた。濾別したも のを1x300mＬのＮaＨＣＯ3および2x300mＬの飽和ＮaＣlにて洗い、硫酸ナトリウ ムにて乾燥し、蒸発させた。残渣をＥtＯＡcにて粉々にして、表題化合物を得た 。2'- Ｏ-メトキシエチル-5'-Ｏ-ジメトキシトリチル-5-メチルシチジン： 3'-Ｏ-アセチル-2'-Ｏ-メトキシエチル-5'-Ｏ-ジメトキシトリチル-5-メチル- 4-トリアゾールウリジン（103g、0.141Ｍ）のジオキサン（500mＬ）およびＮＨ4 ＯＨ（30mＬ）溶液を、室温で２時間撹拌した。ジオキサン溶液を蒸発させ、残 渣をＭeＯＨ（2x200mＬ）と共沸させた。残渣をＭeＯＨ（300mＬ）に溶解し、２ リットルのステンレススチール圧力容器に移した。ＮＨ3ガスで飽和させたＭeＯ Ｈ（400mＬ）を加え、容器を２時間、100℃に熱した（tlcは完全な変換を示した ）。容器の内容物を乾燥するまで蒸発させ、残渣をＥtＯＡc（500mＬ）に溶解し 、飽和ＮaＣl（200mＬ）で１回洗った。有機物を硫酸ナトリウム上で乾燥し、溶 媒を蒸発させて、85g（95％）の表題化合物を得た。Ｎ4-ベンゾイル-2'-Ｏ-メトキシエチル-5'-Ｏ-ジメトキシトリチル-5-メチルシ チジン： 2'-Ｏ-メトキシエチル-5'-Ｏ-ジメトキシトリチル-5-メチルシチジン（85g、0 .134Ｍ）をＤＭＦ（800mＬ）に溶解し、撹拌しながら無水安息香酸（37.2g、 0.165Ｍ）を加えた。３時間撹拌した後、tlcは反応がおよそ95％終了しているこ とを示した。溶媒を蒸発させ、残渣をＭeＯＨ（200mＬ）と共沸させた。残渣を ＣＨＣl3（700mＬ）に溶解し、飽和ＮaＨＣＯ3（2x300mＬ）および飽和ＮaＣl（ 2x300mＬ）にて抽出し、ＭgＳＯ4上で乾燥し、蒸発させて残渣（96g）を得た。0 .5％Ｅt3ＮＨを含むＥtＯＡc/ヘキサン（1:1）を溶出溶媒として用いる1.5kgの シリカカラムにて、残渣をクロマトグラフィー分離した。純粋な生成物画分を蒸 発させて90g（90％）の表題化合物を得た。Ｎ4-ベンゾイル-2'-Ｏ-メトキシエチル-5'-Ｏ-ジメトキシトリチル-5-メチルシ チジン-3'-アミダイト： Ｎ4-ベンゾイル-2'-Ｏ-メトキシエチル-5'-Ｏ-ジメトキシトリチル-5-メチル シチジン（74g、0.10Ｍ）をＣＨ2Ｃl2（1Ｌ）に溶解した。撹拌しながら、窒素 雰囲気下で、テトラゾールジイソプロピルアミン（7.1g）および2-シアノエトキ シ-テトラ-（イソプロピル）亜リン酸塩（40.5mＬ、0.123Ｍ）を加えた。その結 果得られた混合液を室温で20時間撹拌した（tlcは反応が95％終了していること を示した）。反応混合液を飽和ＮaＨＣＯ3（1x300mＬ）および飽和ＮaＣl（3x30 0mＬ）にて抽出した。水性の洗液をＣＨ2Ｃl2（300mＬ）にて逆抽出し、抽出液 を合わせてＭgＳＯ4上で乾燥させ、濃縮した。ＥtＯＡc/ヘキサン（3:1）を溶出 溶媒として用いる1.5kgのシリカカラムにて、得られた残渣をクロマトグラフィ ー分離した。純粋な画分を合わせ、90.6g（87％）の表題化合物を得た。 本発明の譲受人に譲渡されており、本明細書中でそっくりそのまま援用されて いるアメリカ合衆国特許5,378,825に従って、メチレン（メチルイミノ）骨格を 有するオリゴマーを合成する。合成は以下のように行う：（3'-ＣＨ＝Ｎ-Ｏ-ＣＨ2-5'）結合したオリゴヌクレオチド（オキシム結合した ダイマー）の合成 3'- デ(オキシホスフィニコ)-3'-(メチリジンニトリロ)-チミジリル-(3'→5')- チミジン 乾燥ＣＨ2Ｃl2中の3'-デオキシ-3'-Ｃ-フォルミル-5'-Ｏ-トリチルチミン（0. 99g、２mmol）およびＡcＯＨ（0.3ml）を室温で１時間撹拌した。溶媒を真空で 蒸発させ、保護された粗3'-デ(オキシホスフィニコ)-3'-(メチルイダイネニトリ ロ)-チ ミジリル-(3'→5')-3'-(t-ブチルジフェニル-シリル)チミジン生成物をＴＨＦ（ 20ml）に溶解した。撹拌した溶液に室温でnＢu4ＮＦのＴＨＦ溶液（1Ｍ、５ml） を加えた。１時間後、溶液をシリカゲルクロマトグラフィー（ＣＨ2Ｃl2:ＭeＯ Ｈ;99:4、v/vで溶出）で精製し、3'-脱保護されたダイマーを得た。ダイマーを 無水ＭeＯＨ（50ml）に溶解し、これにＭeＯＨ/Ｈcl溶液（0.14Ｍ、2.5ml）を加 えた。反応混合液を室温で15時間撹拌した。無水ピリジン（10ml）を上の溶液に 加え、溶媒を乾燥するまで蒸発させて粗オキシムダイマーを得た。粗生成物をシ リカゲルクロマトグラフィー（ＣＨ2Ｃl2:ＭeＯＨ;92:8、v/vで溶出）で精製し 、表題化合物3'-デ(オキシホスフィニコ)-3'-(メチルイダイネニトリロ)-チミジ リル-(3'→5')-チミジン（0.87g、89％）をＥ/Ｚ異性体の混合物として得た。２ つの幾何異性体を、逆相ＨＰＬＣ（Ｓupelcosil ＬＣ18、5μ、Ｈ2Ｏ:ＣＨ3ＣＮ 勾配）で分離した。（表題化合物のＺ-異性体）1Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ-d6）δ11 .28（brs、2、2ＮＨ）、7.39および7.78（2s、2、2Ｃ6 Ｈ）、6.92（d、1、Ｔ1Ｈ 3" 、Ｊ3',3"＝6.7Ｈz）、6.15（偽t、1、Ｔ2Ｈ 1'、Ｊ1',2'＝7.1Ｈz、Ｊ1',2"＝ 6.3Ｈz）、5.34（d、1、Ｔ2ＯＨ）、4.11-4.25（m、3、Ｔ2Ｈ 5',5"、Ｔ2-Ｈ 3'） 。3.96（m、1、Ｔ2Ｈ 4'）、3.90（m、1、Ｔ1Ｈ 4'）、3.49-3.69（m、3、Ｔ1Ｈ 5' ,5" 、Ｔ1Ｈ 3'）、2.06-2.31（m、3、Ｔ1Ｈ 2',2"、Ｔ2Ｈ 2',2"）、1.73（s、6、2 ＣＨ 3）。Ｃ21Ｈ27Ｎ5Ｏ9・Ｈ2Ｏに関する分析予測されたもの：Ｃ、49.31；Ｈ、 5.72；Ｎ、13.69。判明したもの：Ｃ、49.32；Ｈ、5.57；Ｎ、13.59。（表題化 合物のＥ-異性体）1Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ-d6）δ11.3（2brs、2、2ＮＨ）、7.81 （s、1、Ｃ6 Ｈ）、7.52（d、1、Ｔ1Ｈ 3"、Ｊ3',3"＝6.7Ｈz）、7.45（s、1、Ｃ6 Ｈ ）、6.10（偽t、1、Ｔ2Ｈ 1'、Ｊ1',2'＝7.6Ｈz、Ｊ1',2"＝6.4Ｈz）、6.04（d d、1、Ｔ1Ｈ 1'、Ｊ1',2'＝7.3Ｈz、Ｊ1',2"＝3.4Ｈz）、5.36（d、1、Ｔ2ＯＨ） 、5.16（t、1、Ｔ1ＯＨ）、4.07-4.22（m、3、Ｔ2Ｈ 3',5',5"'）、3.91（m、2、 Ｔ1Ｔ2Ｈ 4'）、3.50-3.73（m、2、Ｔ1Ｈ 5',5",）、3.12（m、1、Ｔ1Ｈ 3'）、2.0 5-2.44（m、4、Ｔ1Ｔ2Ｈ 2',2"）、および1.76（s、6、2ＣＨ 3）。ＭＳ ＦＡＢ： Ｍ/z 494(Ｍ+Ｈ)+。ホスホルアミダイトを含む（3'-ＣＨ=Ｎ-Ｏ-ＣＨ2-5'）結合したオリゴヌクレオ チドの合成 3'- デ(オキシホスフィニコ)-3'-(メチリジンニトリロ)-5'-Ｏ-(ジ-メトキシト リフ ェニルメチル)-チミジリル-(3'→5')-3'-Ｏ-(β-シアノエチルジイソプロピルア ミノホスフィリル)チミジン Ｏligonucleotides Ｓynthesis: a practial approach,Ｅd.Ｍ.Ｊ.Ｇait,ＩＲ Ｌ Ｐress,1984に記載の手順に従い、異性体ダイマーを5'末端ヌクレオチドのヒ ドロキシル基でさらにジメチルオキシトリチル化し、続いてダイマーの3'末端の ヒドロキシル基で3'-Ｏ-β-シアノエチルジイソプロピルホスホルアミダイト誘 導体に変換して、表題化合物を得た。1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣl3）δ8.77（br s、2 、2ＮＨ）、7.68（s、0.77、Ｔ1 Ｃ6 Ｈ Ｅ-異性体）、7.59（s、0.23、Ｔ1 Ｃ6 Ｈ Ｅ-異性体）、6.3（ps t、1、Ｔ2ＣＨ 1'）、6.14（m、0.77、Ｔ1 ＣＨ 1 Ｅ- 異性体）、6.08（m、0.23、Ｔ1ＣＨ 1 Ｚ-異性体）、1.80および1.50（2S、6、2 、ＣＨ 3）および他のプロトン。31Ｐ ＮＭＲ（ＣＤＣl3）150.77および150.38（ Ｚ-異性体）；150.57および150.38（Ｅ-異性体）。 治療上の価値をオリゴマーに特別に組み入れることが必要なので、そしてまた そういう時には、保護してあるダイマーは簡便に保管し、自動ＤＮＡ合成機（Ａ ＢＩ380Ｂ）を利用したカップリングに用いることができる。さらに、本明細書 の実施例に従い、オキシム結合ダイマーを、対応するヒドロキシルアミン結合を 持つダイマーに還元し、そしてこれは同様に、ヒドロキシルメチルアミンあるい は他のヒドロキシアルキルアミン結合にアルキル化することができる。（3'-ＣＨ2-ＮＨ-Ｏ-ＣＨ2-5'）結合したオリゴヌクレオチドの合成 3'- デ(オキシホスフィニコ)-3'-(メチレンイミノ)チミジリル-(3'→5')-チミ ジン 保護してあるダイマー3''-デ(オキシホスフィニコ)-3'-(メチルイダイネニト リロ)チミジリル-(3'→5')-3'-Ｏ-(t-ブチルジフェニルシリル)チミジン（0.49g 、1mmol）の撹拌済み氷ＡcＯＨ（5ml）溶液に、ＮaＢＨ3ＣＮ（0.19g、３mmol） をアルゴン下、室温で３つに分割して加えた。溶液の発泡が終わるまで、懸濁液 を１時間撹拌した。さらにＮaＢＨ3ＣＮ（0.19g、３mmol）を同様の方法で加え 、１時間撹拌し続けた。ＡcＯＨを減圧下で除いて3''-デ(オキシホスフィニコ)- 3'-(メチレンイミノ)チミジリル-(3'→5')-3'-Ｏ-(t-ブチルジフェニルシリル) チミジンを得た。以前記載したようにnＢu4ＮＦ/ＴＨＦおよびＨＣl/ＭeＯＨを 用いてこのダイマーを脱保護することにより、表題化合物である、3-デ(オキシ ホスフィニコ)-3'- (メチレンイミノ)チミジリル-(3'→5')-チミジン(0.44g、90％)を白色粉末とし て得た。このダイマーをＨＰＬＣでさらに精製（3-デ(オキシホスフィニコ)-3-( メチルイダイネニトリロ)チミジリル-(3'→5')-チミジンダイマーについて記載 したのと同様に）して、分析上純粋なサンプルを得た。1Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ-d6 ）δ11.23（br s、2、2ＮＨ）、7.83および7.49（2s、2、2Ｃ6 Ｈ）、6.82（t、 1、ＮＨＯ）、6.14（偽t、1、Ｔ2Ｈ 1'、Ｊ1',2'＝7.6Ｈz、Ｊ1',2"＝6.5Ｈz）、 5.96（dd、1、Ｔ1Ｈ 1'、Ｊ1',2'＝6.9Ｈz、J1',2"＝4.3Ｈz）、5.28（s、1、Ｔ2 ＯＨ）、5.08（s、1、Ｔ1ＯＨ）、4.18（m、1、Ｔ2Ｈ 3'）、3.89（m、1、Ｔ1Ｈ 4 ' ）、3.54-3.78（m、5、Ｔ1Ｔ2Ｈ 5',5"、Ｔ2Ｈ 4'）、2.76-2.94（m、2、Ｔ1Ｈ 3" ）、2.42（m、1、Ｔ1Ｈ 3'）、2.0-2.17（m、4、Ｔ1、Ｔ2Ｈ 2',2"）、1.77および 1.74（2s、6、2ＣＨ 3）。ＭＳ ＦＡＢ：Ｍ/z496(Ｍ+Ｈ)+。Ｃ21Ｈ29Ｎ5Ｏ9・Ｈ2 Ｏに関する分析予測されたもの：Ｃ、49.12；Ｈ、6.09；Ｎ、13.64。判明したも の：Ｃ、48.99；Ｈ、5.96；Ｎ、13.49。メチル化［3'-ＣＨ2-Ｎ(ＣＨ3)-Ｏ-ＣＨ2-5'］結合したオリゴヌクレオチドの合 成 3'- デ(オキシホスフィニコ)-3-［メチレン(メチルイミノ)］チミジリル-(3'→ 5')-チミジン 3''-デ(オキシホスフィニコ)-3'-(メチルエネイミノ)チミジリル-(3'→5')-3' -Ｏ-(t-ブチルジフェニルシリル)チミジンダイマー（0.99g、１mmol）の撹拌済 み氷ＡcＯＨ（10ml）溶液に水性ＨＣＨＯ（20％、３ml）を加えた。溶液を５分 間、室温で撹拌し、これにＮaＢＨ3ＣＮ（0.19g、３mmol）をアルゴン下、室温 で３つに分割して加えた。ＮaＢＨ3ＣＮ（0.19g）の添加をもう一度繰返し、溶 液をさらに１時間撹拌した。反応混合液を濃縮して粗3'-デ(オキシホスフィニコ )-3'-［メチレン(メチルイミノ)］チミジリル-(3'→5')-3'-Ｏ-(t-ブチルジフェ ニルシリル)チミジンダイマーを得たが、これを（nＢu4ＮＦ/ＴＨＦ、ＨＣl/Ｍe ＯＨ）脱保護することにより、表題化合物である、3'-デ(オキシホスフィニコ)- 3'-［メチレン(メチルイミノ)］チミジリル-(3'→5')チミジン（0.44g、87％） を白色粉末として得た。3'-デ(オキシホスフィニコ)-3'-［メチレン(メチルイミ ノ)］チミジリル-(3'→5')チミジンダイマーを分離用ＨＰＬＣでさらに精製し、 分析上純粋なサンプルを得た。1Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ-d6）δ11.30および11.24 （2s、2、2ＮＨ)、7.82および7.50（2s、2、2Ｃ6 Ｈ)、6.15（偽t、1、Ｔ2Ｈ 1'、 Ｊ1',2'＝6.3Ｈz、Ｊ1',2"＝7.3Ｈz）、 6.00（偽t、1、Ｔ1Ｈ 1'、Ｊ1',2'＝4.2Ｈz、Ｊ1',2"＝6.1Ｈz）、5.31（m、1、 Ｔ2ＯＨ）、5.08（m、1、Ｔ1ＯＨ）、4.17（m、1、Ｔ2Ｈ 3'）、3.88（m、1、Ｔ1Ｈ 4 ）、3.57-3.83（m、5、Ｔ1Ｔ2Ｈ 5',5"、Ｔ2Ｈ 4'）、2.69（m、2、Ｔ1Ｈ3"） 、2.57（s、3、Ｎ-ＣＨ 3'）、2.50（m、1、Ｔ1Ｈ 3'）、2.05-2.14（m、4、Ｔ1Ｔ 2Ｈ 2',2"）、1.79および1.76（2s、6、2ＣＨ 3）。ＭＳ ＦＡＢ：Ｍ/z510(Ｍ+Ｈ)+ 。 Ｃ23Ｈ31Ｎ5Ｏ9.Ｈ2Ｏに関する分析予測されたもの：Ｃ、50.09；Ｈ、6.31；Ｎ 、13.28。判明したもの：Ｃ、50.05；Ｈ、6.21；Ｎ、13.08。ホスホルアミダイト含有［3'-ＣＨ2-Ｎ(ＣＨ3)-Ｏ-ＣＨ2-5'］結合したオリゴヌ クレオチドの合成 3'- デ(オキシホスフィニコ)-3'-［メチレン(メチルイミノ)］-5'-Ｏ-(ジメト キシトリフェニルメチル)チミジリル-(3'→5')-3'-Ｏ-(β-シアノエチルジイソ プロピルアミノホスフィリル)チミジン Ｏligonucleotide Ｓynthesis: a practial approach,Ｅd.Ｍ.Ｊ.Ｇait,ＩＲ Ｌ Ｐress,1984に記載されているように、全体の収率82％で、3'-デ(オキシホス フィニコ)-3'-［メチレン(メチルイミノ)］チミジリル-(3'→5')チミジンダイマ ーをトリチル化し、ホスフィチル化した。保護されているダイマーを、シリカゲ ルカラムクロマトグラフィー（ＣＨ2Ｃl2:ＭeＯＨ:Ｅt3Ｎ;9:1:0.1、v/v）で精 製し、同質の画分をプールし、蒸発させて純粋な3'-デ(オキシホスフィニコ)-3' -［メチレン(メチルイミノ)］チミジリル-5'-Ｏ-(ジメトキシトリフェニルメチ ル)-(3'→5')-3'-Ｏ-(β-シアノエチルジイソプロピルアミノホスフィリル)チミ ジンを、白色型として得た（それ自体でＤＮＡ合成に用いた）。生成物をジアス テレオマーの混合物として単離した：31Ｐ ＮＭＲ（ＣＤＣl3）δ149.62および1 49.11ppm；1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣl3）δ6.22（偽t、1、Ｔ2Ｈ 1'、Ｊ1',2'＝Ｊ1',2 " ＝6.7Ｈz）、6.16（偽t、1、Ｔ1Ｈ 1'、Ｊ1',2'＝Ｊ1',2"＝5.8Ｈz）、2.58、2. 56（2s、3、Ｎ-ＣＨ 3）、1.82、1.49（2s、6、２ＣＨ 3）、および他のプロトン 。 上の保護されているホスホルアミダイトを有するダイマーは、治療上の価値を オリゴマーに特別に組み入れることが必要なので、そしてまたそういう時には、 上の保護されているホスホルアミダイトを有するダイマーは、自動ＤＮＡ合成機 （ＡＢＩ380Ｂ）を利用したカップリングに用いることができる。上記のメチル イ ダイネニトリロすなわちオキシム、およびメチレンイミノすなわちアミノヒドロ キシダイマーを例とする、しかしそれらに限定はされない、本発明の他のダイマ ーは、本実施例と同様に、対応するホスホルアミダイト誘導体に変換され、下記 の様な標準的な方法でオリゴヌクレオチドと合わせられる。オキシム結合ヌクレ オチドダイマーを有するオリゴマーを、対応するヒドロキシルアミン結合ヌクレ オシドダイマーを有するオリゴマーに還元する。他の実施例に記すように、ＣＰ Ｇに結合したオリゴマーとして、あるいはＣＰＧから取り外した後に還元は達成 される。 やはり本発明の譲受人に譲渡されており、本明細書中でそっくりそのまま援用 されているＷＯ92/20823に従って、窒素を含む他の骨格を合成する。 アミド骨格を有するオリゴマーは、Ｄe Ｍesmaeker et al.,Ａcc.Ｃhem.Ｒes. 1995,28,366-374に従って合成する。アミド部分は、単純で有名な合成方法によ って容易に入手でき、オリゴヌクレオチドの固相合成に必要な条件に適合する。 モルフォリノ骨格を有するオリゴマーは、アメリカ合衆国特許5,034,506（Ｓu mmerton and Ｗeller）に従って合成する。 ペプチド-核酸（ＰＮＡ）オリゴマーは、Ｐ.Ｅ.Ｎielsen et al.,Ｓcience 19 91,254,1497に従って合成する。実施例２： 細胞および細胞培養 ＨＵＶＥＣはＣlonetics Ｃorp．（Ｓan Ｄiego ＣＡ）から購入し、10％ウシ 胎児血清（ＨyＣlone,Ｌogan ＵＴから）を補った、推奨されているＥＢＭ培地 にて培養した。細胞は継代２から10、80-90％コンフルエントで実験に用いた。実施例３： ＨＵＶＥＣのオリゴヌクレオチド処理 ２ｘ105cells/mlを、37℃にあらかじめ温めておいたＯＰＴＩ-ＭＥＭ（Ｇibco -ＢＲＬ,Ｇrand Ｉsland,ＮＹ）にて３回洗った。オリゴマーは、10μg/mlＬＩ ＰＯＦＥＣＴＩＮ試薬（Ｇibco-ＢＲＬ）とあらかじめＯＰＴＩ-ＭＥＭ中で混ぜ ておき、望ましい温度に連続的に希釈し、洗った細胞に加えた。基底および無処 理（オリゴマーなし）の対照細胞もＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮにて処理した。細胞を ４時間、37℃でインキュベートし、この時点で培地を、ＴＮＦ-αを添加したあ るいは添加していない標準的な増殖培地と交換した。いくつかの実験では、サイ トカイン培地を １時間後に除き、標準培地と交換した。37℃でのインキュベーションは、表示し てある時間まで続けた。実施例４： 蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）によるＩＣＡＭ-1タンパク質 発現の定量 0.25％トリプシンのＰＢＳ溶液にて短時間トリプシン処理することにより、細 胞をプレート表面から除いた。トリプシンの活性は2％ウシ血清アルブミン溶液 および0.2％アジ化ナトリウムのＰＢＳ溶液（+Ｍg/Ｃa）にて失活させた。細胞 を1000rpmで遠心して沈殿させ（Ｂeckman ＧＰＲ遠心機）、ＰＢＳに再懸濁し、 ３μl/105cellsのＩＣＡＭ-1特異的抗体、ＣＤ54-ＰＥ（Ｂecton Ｄickinson,Ｍ ansfield ＭＡ）および0.1μgの対照共役抗体、ＩgＧ2b-ＰＥ（Ｐharmingen,Ｓa n Ｄiego ＣＡ）にて染色した。抗体を細胞と、暗所で穏やかにかき混ぜながら4 ℃で30分間インキュベートした。細胞を洗い、それから0.5％ホルムアルデヒド が入った0.3mlのＦＡＣＳＦＬＯＷバッファー（Ｂecton Ｄickinson）に再懸濁 した。それから、細胞表面ＩＣＡＭ-1の発現を、Ｂecton Ｄickinson ＦＡＣＳc an（Ｓan Ｊose,ＣＡ）を用いたフローサイトメトリーにて求めた。ＩＣＡＭ-1 発現は、対照の発現に占めるパーセントとして算出した。実施例５： 全ＲＮＡ単離およびノーザン解析 全細胞ＲＮＡを、ＣＡＴＲＩＭＯＸ-14界面活性剤（Ｉowa Ｂiotechnology Ｇ roup,Ｏakdale ＩＡ）を用いた細胞可溶化にて単離した。単離したＲＮＡを、1. 1％ホルムアルデヒドを含む1.2％アガロースゲル上で分離し、それからナイロン 膜にトランスファーし、Ｓtratagene ＵＶ crosslinker 2400（Ｌa Ｊolla ＣＡ ）を用いて膜にＵＶ架橋させた。ブロットしたものを、ＱＵＩＣＫＨＹＢ溶液（ Ｓtradagene）中でcＤＮＡプローブとハイブリッド形成させた。ブロットしたも のを、0.1％ＳＤＳが入った２ｘＳＳＣにて室温でそれぞれ10分間、２回洗い、 それから0.1％ＳＤＳが入った0.1xＳＳＣにて65℃で30分間、１回洗った。実施例６： ポリソームプロファイル解析 ＰＢＳで洗った、およそ106個の沈殿した細胞を、0.3mlの冷やした可溶化バッ ファー（0.5％ＮＰ-40、10mＭ Ｔris-Ｃl、pＨ7.4、140mＭ ＫＣl、５mＭ ＭgＣ l2、１mＭ ＤＴＴ、100μg/mlシクロヘキシミド、およびＰrime Ｒnase阻害剤） 中 に混和し、５分間、4℃でインキュベートした。核を1000xgで沈殿させ、その結 果得られた上清を、勾配バッファー（10mＭ Ｔris pＨ8.0、50mＭ ＫＯＡc、1m Ｍ ＭgＯＡc、１mＭ ＤＴＴ）に入った状態の、50％cushion（0.75ml）入り10か ら35％（wt/vol）ショ糖直線勾配（4ml）の上に重層した。勾配をかけたものを 、Ｂeckman ＳＷ55Ｔiローターを用いて35,000rpmで３時間、5℃で遠心した。25 0μlの画分を、Ｐharmacia ＵＶモニターおよび画分収集機につないだＩsco mod el185密度勾配分取機を用いて集めた。集めた画分を、0.2％ＳＤＳでプロテイナ ーゼＫ（0.2mg/ml）にて42℃、20分間処理し、フェノール抽出し、エタノール沈 殿した。沈殿させる前に、５から10μgのtＲＮＡを各画分に加えた。沈殿したＲ ＮＡを1.2％変性アガロースゲルにのせ、標準的な臭化エチジウム染色およびノ ーザンブロッティングの手法によって解析した。実施例７： Ｅ-セレクチン遺伝子発現に対する活性に関する、オリゴマーのＥ ＬＩＳＡスクリーニング 継代２から５の初代ヒト臍帯脈内皮（ＨＵＶＥＣ）細胞を96穴プレートにまき 、コンフルエントに達するようにした。細胞をＯpti-ＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ、Ｇra nd Ｉsland ＮＹ）で３回洗った。Ｏpti-ＭＥＭを含む10μg/ml ＤＯＴＭＡ溶液 （Ｂethesda Ｒesearch Ｌabs、Ｂethesda ＭＤ）で希釈した、増加する濃度の オリゴマーにて、４時間、37℃で処理した。培地を除き、ＥＧＭ-ＵＶ（Ｃlonet ics,ＳanＤiego ＣＡ）とオリゴマーで置き換えた。腫瘍壊死因子αを培地に加 え（2.5ng/ml）、細胞をさらに４時間、37℃でインキュベートした。 Ｅ-セレクチン発現をＥＬＩＳＡで求めた。細胞を、あらかじめ37℃に温めて おいたＤulbeccoリン酸緩衝生理食塩水（Ｄ-ＰＢＳ）にて穏やかに３回洗った。 細胞を95％エタノールにて4℃で20分間固定し、Ｄ-ＰＢＳで３回洗い、2％ＢＳ ＡのＤ-ＰＢＳ溶液でブロックした。細胞を、2％ＢＳＡを含むＤ-ＰＢＳで0.5μ g/mlに希釈したＥ-セレクチンモノクローン性抗体ＢＢＡ-1（Ｒ＆Ｄ Ｓystems, Ｍinneapolis ＭＮ）にて１時間、37℃でインキュベートした。細胞をＤ-ＰＢＳ で３回洗い、結合したＥ-セレクチン抗体を、ビオチン化ヤギ抗マウスＩgＧ（Ｂ ethesda Ｒesearch Ｌaboratories,Ｇaithersberg、ＭＤ）をブロッキング溶液 で1:1000希釈したものと１時間、37℃でインキュベートすることにより検出す る。細胞をＤ-ＰＢＳで３回洗い、それからβ-ガラクトシダーゼに共役したスト レプトアビジン（Ｂethesda Ｒesearch Ｌaboratories）をブロッキング溶液で1 :1000希釈したものと１時間、37℃でインキュベートした。細胞をＤ-ＰＢＳで５ 分間ずつ３回洗った。特異的なモノクローン性抗体に結合したβ-ガラクトシダ ーゼの量を、プレートを3.3mＭクロロフェノールレッド-β-Ｄ-ガラクトピラノ シド、50mＭリン酸ナトリウム、1.5mＭ ＭgＣl2；pＨ＝7.2の溶液中で２から15 分間、37℃で展開させることにより求めた。生成物の濃度を、ＥＬＩＳＡマイク ロタイタープレート読み取り機にて575nmにおける吸光度を測定することにより 求めた。実施例８： アンチセンスオリゴヌクレオチドによるＨＣＭＶ複製阻害に関する ＥＬＩＳＡアッセイ ヒトサイトメガロウイルスmＲＮＡに相補的なオリゴヌクレオチドを、ＨＣＭ Ｖ複製のＥＬＩＳＡを基本とするアッセイにおいて抗ウイルス活性に関して分析 した。正常ヒト真皮の繊維芽細胞（Ｃlonetics Ｃorp.,Ｓan Ｄiego ＣＡ）を無 血清培地（Ｃlonetics）で培養し、96穴プレートにまくのに用いた。細胞がおよ そ80％コンフルエントになったとき、オリゴヌクレオチドで前処理した。前処理 のおよそ20時間後に、培地（オリゴヌクレオチドを含む）を注意深く注ぎ捨て、 温めておいた繊維芽細胞基本培地（ＦＢＭ、Ｃlonetics）で細胞を２回洗った。 それからＦＢＭで希釈した100μl/wellのＣＭＶストックを細胞に感染させた。 プレートを37℃で２時間インキュベーとした。それから培地（ウイルスを含む） を注意深く注ぎ捨て、新しい、あらかじめ温めておいたＦＢＭ培地、１穴あたり 100μlで置換した。プレートを37℃でしばらくインキュベートし、それからＦＢ Ｍで希釈した５μlのオリゴヌクレオチドを、各穴の培地に再び導入した。２日 後、細胞を再びオリゴヌクレオチドで同様に後処理した。６日目にプレートをＥ ＬＩＳＡ用に調製した。 ＥＬＩＳＡ用の調製の際、培地を注意深く注ぎ捨て、１穴あたり200μlの純粋 なエタノールで細胞を固定した。細胞を室温で30分間固定し、それからエタノー ルを除き、プレートを風乾した。ＥＬＩＳＡの前にプレートを１時間、2％ＢＳ Ａを含むＰＢＳでブロックした。ブロッキング溶液を除き、1％ＢＳＡを含むＰ ＢＳで 1:2000に希釈した100μlの抗ＣＭＶ抗体を加えた。細胞を抗体中、１時間、37℃ でインキュベートし、ＰＢＳで３回洗った。２次抗体であるビオチン化ヤギ抗マ ウスＩgＧ（Ｂethesda Ｒesearch Ｌabs、ＭＤ）を、1％ＢＳＡを含むＰＢＳで1 :1000に希釈し、細胞と37℃で１時間、インキュベートした。それから細胞を洗 い、37℃で１時間、ストレプトアビジン-β-Ｄ-ガラクトシダーゼ中でインキュ ベートした。10mlの50mＭリン酸ナトリウム、1.5mＭ ＭgＣl2に溶かした20mgの クロロフェノールレッド-β-Ｄ-ガラクトピラノシドで色を展開した；プレート を10分間震盪し、575nmにおける吸光度を読んだ。実施例９： Ｕ937細胞へのＰＮＡのエレクトロポレーション 細胞をＰＢＳで洗い、１ｘ106cells/mlでＰＢＳに再懸濁した。0.4mlの懸濁液 を、1200μＦ、140ＶにセットしたＢＴＸエレクトロポレーター（Ｓan Ｄiego ＣＡ）でエレクトロポレーションした。細胞を氷上で冷やし、オリゴマーを加え た。エレクトロポレーションの10分後に、あらかじめ温めておいた培地に細胞を まき、５ng/mlのＴＮＦαを用いて一晩、ＩＣＡＭ-1発現を誘導した。ＩＣＡＭ- 1発現を、実施例４と同様にＦＡＣＳで定量した。実施例10： ＩＥ1およびＩＥ2タンパク質産物の発現阻害のウエスタンブロット 解析 安定にトランスフェクトされたＵ373神経芽腫細胞を用いたが、それぞれ単一 のＣＭＶタンパク質産物を発現する。細胞を６穴プレートに4.5ｘ105cells/well でまき、次の日に55-70％コンフルエントになるようにした。5μg/mlリポフェク チンと一緒に75nＭの濃度のオリゴヌクレオチドにて細胞をＯＰＴＩＭＥＭ中で ４時間処理した。細胞をオリゴヌクレオチドなしの培地でまき直し、一晩回復さ せた。細胞を処理後16-20時間後に回収し、ＰＢＳで１回洗い、Ｌaemmliバッフ ァー（100μl/well）に懸濁し、５分間煮て、16％ＳＤＳ-ＰＡＧＥゲルにのせた 。ゲルを150Ｖで1.5時間流し、ウエスタンブロッティング用の膜にトランスファ ーした。１次抗体は1:1000に希釈したＩＥ55-72-86抗体（Ｖirostat）で、２次 抗体は放射標識したヤギ抗マウスであった。バンドをＰＨＯＳＰＨＯＲＩＭＡＧ ＥＲ（Ｍolecular Ｄynamics、Ｓunnyvale ＣＡ）を用いて視覚化した。実施例11： ＭＭＩオリゴマーを用いたＵ937細胞へのエレクトロポレーション Ｕ937細胞を冷やしたＯpti-ＭＥＭ（Ｇibco-ＢＲＬ、Ｇrand Ｉsland、ＮＹ） で１回洗い、４ｘ106cells/mlで再懸濁した。オリゴマーを0.1mlの細胞に加え、 氷上で10分間インキュベートした。細胞を１mm間隔の電極（ＢＴＸ、Ｓan Ｄieg o、ＣＡ）に移し、0.75kＶ/cmでエレクトロポレーションした。細胞を室温で10 分間インキュベートし、あらかじめ温めておいた培地に移した。ＩＣＡＭ-1発現 を５ng/ml ＴＮＦ-αで一晩誘導する前に、細胞を1.5時間休ませた。翌日、細胞 を抗ＩＣＡＭ-1-ＰＥ抗体（Ｐharmingen、Ｓan Ｄiego ＣＡ）で染色した。
【手続補正書】 【提出日】１９９８年１１月２７日 【補正内容】 請求の範囲 １．インビトロでまたはヒトを除く動物においてキャップされた標的ｍＲＮＡの 翻訳を阻害する方法であって、 キャップされた標的ｍＲＮＡを、８−２５塩基の長さであり、修飾された２’− 位を含むオリゴヌクレオチド；オリゴヌクレオシド；またはペプチド−核酸オリ ゴマーからなる群から選択されるオリゴマーと接触させ；ここで前記オリゴマー は、前記標的ｍＲＮＡの５’末端の最初の２０ヌクレオチドのうち少なくとも一 つを含む、前記標的ｍＲＮＡの５’キャップ領域と特異的にハイブリッド形成す ることができ；そして 標的ｍＲＮＡの翻訳が阻害されるようにｍＲＮＡ上へのリボソームの構築を妨害 する、 ことを含む方法。 ２．修飾された２’位が２’−ＯＣＨ2ＣＨ2ＯＣＨ3、２’−ＯＣＨ3、２’−Ｏ ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ3、２’−ＯＣＨ2ＣＨ2＝ＣＨ2、または２’−Ｆである、請求項 １記載の方法。 ３．修飾された２’位が２’−ＯＣＨ2ＣＨ2ＯＣＨ3である、請求項２記載の方 法。 ４．前記オリゴヌクレオシドがモルフォリノ、アミド−３、アミド−４、または メチレン（メチルイミノ）ヌクレオシド間結合を少なくとも一つ含む、請求項１ 記載の方法。 ５．前記キャップされた標的ｍＲＮＡがヒトＩＣＡＭ−１をコードする、請求項 １記載の方法。 ６．前記キャップされた標的ｍＲＮＡがヒトＥ−セレクチンをコードする、請求 項１記載の方法。 ７．前記キャップされた標的ｍＲＮＡがサイトメガロウイルスタンパク質をコー ドする、請求項１記載の方法。 ８．前記サイトメガロウイルスタンパク質がＩＥ１またはＩＥ２遺伝子産物であ る、請求項７記載の方法。 ９．前記オリゴマーが、前記標的ｍＲＮＡの５’末端の最初の５ヌクレオチドの うち少なくとも１つを含む前記標的ｍＲＮＡの領域と特異的にハイブリッド形成 しうる、請求項１記載の方法。 １０．ＲＮＡｓｅＨ非依存的である、請求項１記載の方法。 １１．キャップされた標的ｍＲＮＡの翻訳を阻害する組成物であって、 ８−２５塩基の長さであり、修飾された２’−位を含むオリゴヌクレオチド；オ リゴヌクレオシド；またはペプチド−核酸オリゴマーからなる群から選択される オリゴマーを含み；前記オリゴマーは、前記標的ｍＲＮＡの５’末端の最初の２ ０ヌクレオチドのうち少なくとも一つを含むキャップされた標的ｍＲＮＡの５’ キャップ領域と特異的にハイブリッド形成することができ、かつｍＲＮＡ上にお けるリボソームの構築を妨害することができることを特徴とする組成物。 １２．前記オリゴヌクレオチドがモルフォリノ、アミド−３、アミド−４、また はメチレン（メチルイミノ）ヌクレオシド間結合を少なくとも一つ含む、請求項 １１の組成物。 １３．オリゴマーが各３’−デオキシ糖部分上に２’−ＯＣＨ2ＯＣＨ2ＣＨ3修 飾を有する、請求項１１記載の組成物。 １４．キャップされた標的ｍＲＮＡがＩＣＡＭ−１をコードし、かつオリゴマー が配列番号１または配列番号２を有する、請求項１３記載の組成物。 １５．キャップされた標的ｍＲＮＡがＥ−セレクチンをコードし、かつオリゴマ ーが配列番号３を有する、請求項１３記載の組成物。 １６．キャップされた標的ｍＲＮＡがＣＭＶＩＥ１／ＩＥ２ｍＲＮＡであり、か つオリゴマーが配列番号５、配列番号６、配列番号７または配列番号８を有する 、請求項１３記載の組成物。 １７．前記キャップされた標的ｍＲＡＮがヒトＶＣＡＭ−１をコードする、請求 項１記載の方法。 １８．前記オリゴヌクレオシドがメチレン（メチルイミノ）ヌクレオシド間結合 を少なくとも１つ含む、請求項４記載の方法。 １９．オリゴマーが、各３’−デオキシ糖部分上に２’−ＯＣＨ2ＣＨ2ＯＣＨ3 、 ２’−ＯＣＨ3、２’−ＯＣＨ2ＣＨ2ＣＨ3、２’−ＯＣＨ2ＣＨ2＝ＣＨ2、また は２’−Ｆ修飾を有する、請求項１１記載の組成物。 ２０．キャップされた標的ｍＲＮＡがＩＣＡＭ−１をコードし、かつオリゴマー が配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３また は配列番号１４を有する、請求項１１記載の組成物。 ２１．キャップされた標的ｍＲＮＡがＶＣＡＭ−１をコードし、オリゴマーが配 列番号１５を有する、請求項１１記載の組成物。 ２２．前記オリゴヌクレオチドがメチレン（メチルイミノ）ヌクレオシド間結合 を少なくとも１つ含む、請求項１２記載の組成物。 ２３．８−２５塩基の長さの、修飾された２’−位を含むオリゴヌクレオチド； オリゴヌクレオシド；またはペプチド−核酸オリゴマーからなる群から選択され るオリゴマーを含む細胞であって、 前記オリゴマーは、前記標的ｍＲＮＡの５’末端の最初の２０ヌクレオチドのう ち少なくとも一つを含むキャップされた標的ｍＲＮＡの５’キャップ領域と特異 的にハイブリッド形成することができ、かつｍＲＮＡ上におけるリボソームの構 築を妨害することができることを特徴とする細胞。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 31/70 ６２７ Ａ６１Ｋ 31/70 ６２７ 48/00 48/00 // Ｃ０７Ｈ 21/00 Ｃ０７Ｈ 21/00 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＵ，ＢＡ，ＢＢ ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ， ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＣ，Ｌ Ｋ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＲ，ＴＴ， ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ (72)発明者 アンダーソン，ケビン・ピー アメリカ合衆国カリフォルニア州92009, カールズバッド，ラ・グラン・ヴィア 2772 (72)発明者 コンドン，トーマス・ピー アメリカ合衆国カリフォルニア州92009, カールズバッド，クサナ・ウェイ 6756

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １．キャップされた標的mＲＮＡの翻訳を阻害する方法であって、 キャップされた標的mＲＮＡを、8-25塩基の長さであり、修飾された2'-位を含む オリゴヌクレオチド；オリゴヌクレオシド；またはペプチド-核酸オリゴマーか らなる群から選択されるオリゴマーと接触させ；ここで前記オリゴマーは、前記 標的mＲＮＡの5'末端の最初の20ヌクレオチドのうち少なくとも一つを含む、前 記標的mＲＮＡの5'キャップ領域と特異的にハイブリッド形成することができ； そして 標的mＲＮＡの翻訳が阻害されるようにmＲＮＡ上へのリボソームの構築を妨害す る、 ことを含む方法。 ２．修飾された2'位が2'-ＯＣＨ2ＣＨ2ＯＣＨ3、2'-ＯＣＨ3、2'-ＯＣＨ2ＣＨ2 ＣＨ3、2'-ＯＣＨ2ＣＨ2＝ＣＨ2、または2'-Ｆである、請求項１記載の方法。 ３．修飾された2'位が2'-ＯＣＨ2ＣＨ2ＯＣＨ3である、請求項２記載の方法。 ４．前記オリゴヌクレオシドがモルフォリノ、アミド-3、アミド-4、またはメ チレン（メチルイミノ）ヌクレオシド間結合を少なくとも一つ含む、請求項１記 載の方法。 ５．前記キャップされた標的mＲＮＡがヒトＩＣＡＭ-1をコードする、請求項 １記載の方法。 ６．前記キャップされた標的mＲＮＡがヒトＥ-セレクチンをコードする、請求 項１記載の方法。 ７．前記キャップされた標的mＲＮＡがサイトメガロウイルスタンパク質をコ ードする、請求項１記載の方法。 ８．前記サイトメガロウイルスタンパク質がＩＥ1またはＩＥ2遺伝子産物であ る、請求項７記載の方法。 ９．前記オリゴマーが、前記標的mＲＮＡの5'末端の最初の５ヌクレオチドの うち少なくとも１つを含む前記標的mＲＮＡの領域と特異的にハイブリッド形成 しうる、請求項１記載の方法。 10．ＲＮＡseＨ非依存的である、請求項１記載の方法。 11．インビトロで行われる、請求項１記載の方法。 12．インビボで行われる、請求項１記載の方法。 13．エクスビボで行われる、請求項１記載の方法。 14．キャップされた標的mＲＮＡの翻訳を阻害する組成物であって、8-25塩基 の長さであり、修飾された2'-位を含むオリゴヌクレオチド；オリゴヌクレオシ ド；またはペプチド-核酸オリゴマーからなる群から選択されるオリゴマーを含 み；前記オリゴマーは、前記標的mＲＮＡの5'末端の最初の20ヌクレオチドのう ち少なくとも一つを含むキャップされた標的mＲＮＡの5'キャップ領域と特異的 にハイブリッド形成することができ、かつmＲＮＡ上におけるリボソームの構築 を妨害することができることを特徴とする組成物。 15．前記オリゴヌクレオチドがモルフォリノ、アミド-3、アミド-4、またはメ チレン（メチルイミノ）ヌクレオシド間結合を少なくとも一つ含む、請求項14の 組成物。 16．オリゴマーが各3'-デオキシ糖部分上に2'-ＯＣＨ2ＯＣＨ2ＣＨ3修飾を有 する、請求項14記載の組成物。 17．キャップされた標的mＲＮＡがＩＣＡＭ-1をコードし、かつオリゴマーが 配列番号１または配列番号２を有する、請求項16記載の組成物。 18．キャップされた標的mＲＮＡがＥ-セレクチンをコードし、かつオリゴマー が配列番号３を有する、請求項16記載の組成物。 19．キャップされた標的mＲＮＡがＣＭＶ ＩＥ1/ＩＥ2 mＲＮＡであり、かつ オリゴマーが配列番号５、配列番号６、配列番号７または配列番号８を有する、 請求項16記載の組成物。 20．前記キャップされた標的ｍＲＡＮがヒトＶＣＡＭ-1をコードする、請求項 １記載の方法。 21．前記オリゴヌクレオシドがメチレン（メチルイミノ）ヌクレオシド間結合 を少なくとも１つ含む、請求項４記載の方法。 22．オリゴマーが、各3'-デオキシ糖部分上に2'-ＯＣＨ2ＣＨ2ＯＣＨ3、2'-Ｏ ＣＨ3、2'-ＯＣＨ2ＣＨ2ＣＨ3、2'-ＯＣＨ2ＣＨ2＝ＣＨ2、または2'-Ｆ修飾を有 する、請求項14 記載の組成物。 23．キャップされた標的mＲＮＡがＩＣＡＭ-1をコードし、かつオリゴマーが 配列番号９、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13または配列番号 14を有する、請求項14記載の組成物。 24．キャップされた標的mＲＮＡがＶＣＡＭ-1をコードし、オリゴマーが配列 番号15を有する、請求項14記載の組成物。 25．前記オリゴヌクレオチドがメチレン（メチルイミノ）ヌクレオシド間結合 を少なくとも１つ含む、請求項15記載の組成物。
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