JPH11510052A

JPH11510052A - ヒトのアポリポタンパク質ｅを発現するトランスジェニック「ノックアウト」マウス

Info

Publication number: JPH11510052A
Application number: JP9507601A
Authority: JP
Inventors: ロージズ，アレン・ディー; ギルバート，ジョン・アール; シュー，プー−ティン; シュミーケル，ドナルド・イー
Original assignee: デューク・ユニヴァーシティ
Priority date: 1995-07-31
Filing date: 1996-07-10
Publication date: 1999-09-07
Also published as: EP0842271A1; AU720830B2; US5767337A; WO1997005247A1; CA2227007A1; AU6485096A

Abstract

(57)【要約】ヒトリアポリポタンパク質EのイソフォームであるApo E2、Apo E3、又はApo E4を発現するが、本質的に内在性Apo Eを発現できない、ヒト以外のトランスジェニック動物。更に、これらのイソフォームを1種類以上発現する動物も、本明細書に開示されている異なる種類のApo Eのイソフォームを発現するトランスジェニック動物を選択的に交配することにより作製される。従って、本発明により、正常の脳の生物学、発達、機能、老化、および損傷に対し、ヒトApo Eのイソフォーム発現の異なる組み合わせが及ぼす影響の研究が特に可能となる。

Description

【発明の詳細な説明】ヒトのアポリポタンパク質Eを発現するトランスジェニック「ノックアウト」マウス本発明は、NIH助成金AG-07922の政府援助によりなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。技術分野本発明は、ヒトのリアポリポタンパク質Eのイソフォーム(isoform)であるApo E4、Apo E3、又はApo E2をコードするヒトDNAを含み、in vivoでこれらのヒトタンパク質を発現するヒト以外のトランスジェニック動物、およびこれらの動物においてApo E活性に影響を及ぼす能力に関して化合物をスクリーニングする方法に関する。背景技術トランスジェニック動物は、その遺伝子情報に外来のDNAが組み込まれているのが特徴である。これらの動物は外来DNAによりコードされる遺伝的特徴を発現する。外来性DNA組み込みの機序は完全には解明されていないが、トランスジェニック動物を作製する方法は幾つかあり、胚の中に外来性DNAを直接マイクロインジェクションする方法、あるいはリン酸カルシウム沈殿により細胞内に外来DN Aを導入する方法等がある。この分野の文献の概説は、Lo et al.のPCT出願番号W O90/06992号を参照。ヒトのアポリポタンパク質E(Apo E)は、よく見られる3種類のイソフォーム(is oform)であるApo E2、Apo E3、Apo E4として存在する脂質輸送タンパク質である。マウスにおける機能性Apo E遺伝子の欠失は、高コレステロール血症に関係している。(J．Piedrahita et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.89，4471(1992)参照。A po Eは、アルツハイマー病にも関係があり、Apo E4対立遺伝子はアルツハイマー病発症の危険因子であることが明らかにされているが、イソフォームApo E2の対立遺伝子はこの疾患の発症に対し防御効果又は遅延効果を有することが明らかにされている。(Roses et al．のPCT出願番号5405-75B-1号を参照。)これら3種類のイソフォームの発生頻度は米国人口のそれぞれ約8％、76％、16％である。発明の概要本発明は、Apo EのイソフォームであるApo E2、Apo E3、又はApo E4を発現するヒト以外のトランスジェニック動物である。前記動物は、本質的には内在性Ap o Eを発現できない。更に、これらイソフォームの1種類以上を発現する動物は、本明細書に開示されている種々のApo Eのイソフォームを発現するトランスジェニック動物を選択的に交配することにより作製できる。従って、本発明により、特に、正常の脳の生物学、発生、機能、老化、損傷に対するヒトApo Eのイソフォーム発現の種々の組み合わせが及ぼす影響に関する研究が可能となる。本発明の第二の点は、トランスジェニック動物に化合物を投与し、その化合物が動物の生理に及ぼす影響を分析し、その化合物の治療能力を評価することを含む、トランスジェニック動物におけるApo Eのイソフォームの活性に影響を及ぼす能力に関する化合物のスクリーニング方法である。本発明の第三の点は、異なるイソフォームに特異的なトランスジェニック動物を互いに交配することにより作製されたトランスジェニック動物であり、これによりヒト集団に見いだされるApo Eのイソフォームの異なる組み合わせによる生物学的影響の研究と特徴付けが可能となる。本発明の前記およびその他の目的と側面は以下の図と明細書に詳細に説明されている。図面の簡単な説明図1は、マイクロインジェクションのためのApo EゲノムDNAを単離するために選択されたApo Eに特異的なコスミドクローンを示す。k、c、sの文字は、それぞれ制限酵素Kpn I、Cla I、Sca Iの略語を示す。Apo E3はクローンは、COS-3および COS-17と、Apo E4クローンは、COS-23およびCOS-28と、Apo E2クローンはCOS-45 とそれぞれ表示されている。発明の詳細な説明ヌクレオチド配列は、本明細書では左から右に5'から3'末端の方向に一本鎖だけで表されている。本発明の実施に適した動物は、一般にサル、イヌ、ネコ、ラット、マウス等のヒト以外の哺乳動物である。ラットとマウスのような齧歯目動物が好ましく、マウスが最も好ましい種である。若年から成熟段階を含む発育の全段階の動物が本発明の説明に含まれる。本発明に記述されているトランスジェニック動物の交配による子孫は、特定のイソフォームに関してホモ接合体、あるいはヘテロ接合体に関わらず、あらゆる多様な組み合わせで(例えば、Apo E2/Apo E2、Apo E3/Apo E3、Apo E4/Apo E4、Apo E2/Apo E3、Apo E2/Apo E4、Apo E3/Apo E4)ヒトApo Eのイソフォームを発現するトランスジェニック動物と呼ばれる。本発明に利用されるApo E「ノックアウト」動物は、相同組換えにより内在性A po Eが不活化され、その動物自身の機能を有するApo Eを産生しないマウスを指す。Apo Eノックアウトマウスは公知であり、脂質代謝異常におけるApo Eの役割を研究するために、チャペルヒル、ノースカロライナ大学のN．Maeda博士により作製された。(Piedrahita et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．83，4471(1992)参照。)マウス以外の種のApo Eノックアウト動物は、Apo Eノックアウトマウス作製方法の変法により作製でき、これは本技術に精通する者にとって公知である。 Apo Eノックアウト動物は、適切などの様な技術によっても、Apo EのイソフォームのヒトDNAをコードするDNAを含み、かつ、発現する様に変更することが可能である。ヒトApo EのイソフォームをコードするDNAは、DNAを発現するためのどの様な適切な調節要素によっても制御されるが、好ましくは、哺乳動物のApo Eプロモーターと機能的に関連しており、最も好ましくは、ヒトApo Eプロモーターに機能的に関連している。一実施例において、本発明の実施に使用されるApo E のイソフォームヒトDNAは30,000塩基対(bp)の配列で、Apo E遺伝子の近位(5')約 5,000bpとApo C1'偽遺伝子に伸びており、後者はApo E遺伝子の約15,000bp遠位( 3')にある。その配列は、マウスの脳における遺伝子の正常な転写に必要な全ての遺伝子調節要素を含んでいる。(例えば、W．Simonet，J．Biol．Chem．268，8 221(1993)を参照)。本発明の一実施例において、利用される遺伝子はApo E4、Ap o E3、又はApo E2対立遺伝子に関してホモ接合体のヒトリンパ芽球から単離された。 Supercos1およびpWE 15 コスミドベクター(Stratagene から発売されている) を本発明を実施するために利用することができる。 Supercos1ベクター内にクローニングされたApo EのイソフォームのヒトDNAを利用して、Apo Eのイソフォームに特異的なコスミドライブラリーを作製することができ、これはApo EのcDNAを用いて、ヒトApo Eのイソフォームを発現するコスミドに関してスクリーニングされる。次に、「ノックアウト」マウスによって受精されたマウス卵母細胞の前核にマイクロインジェクションするために、選択されたコスミドクローンからApo EゲノムDNAを単離、精製する。得られたマウスの子はファウンダー(F0)と呼ばれる。 F0マウスと「ノックアウト」マウスの交配により、トランスジェニックマウスの集団が引き続き確立される。この交配の子孫(F1)は、ヒトApo E遺伝子を含むが機能を有するマウスApo E遺伝子は含まない。次に、F1マウスを「ノックアウト」マウスと交配することにより、機能を有するマウスApo E遺伝子は持たないが、ヒトApo E遺伝子に関してヘテロ接合体であるマウスを作成する。一旦トランスジェニックマウスの集団が確立されたなら、数匹のマウスを屠殺し、ヒトApo E遺伝子の組み込み効率と転写発現に関する分析を行う。機能を有するヒトApo E遺伝子を発現するこれらのトランスジェニックファンダーラインは増殖され、増殖された子孫は動物の生理学に及ぼすヒトApo E遺伝子の影響を研究するために使用される。本発明の動物は、好ましくは、少なくとも脳組織および/または血清においてヒトApo Eを発現し、また心臓、腎臓、脾臓、筋肉、腸、肝臓の組織細胞でもヒトApo Eを発現する。本発明の動物は、ヒトApo E3、Apo E2、またはApo E4の供給源としても利用可能で、これらは標準技術にしたがって動物の血清から収集できる。次に、ヒトAp o E2、Apo E3、またはApo E4を免疫原として被験動物に投与し、その動物の中で抗ヒトApo E抗体を作製することができる。この抗体は、ヒトApo E診断分析に有用である。更に、この動物を用いて、脳の発達、生物学、機能、老化、損傷におけるApo Eのイソフォーム固有の差が果たす役割の特徴を明らかにすることができる。この動物を用いて、脂質代謝の調節にApo Eのイソフォームが果たす役割を研究することができる。アルツハイマー病の様な神経疾患の病因におけるApo Eの役割と種々のイソフォームの重要性を、本発明の動物を使用することにより、明らかにすることができる。異なるApo Eのイソフォームを発現するトランスジェニックマウスを交配することにより、完全なアルツハイマー病の症状を呈するトランスジェニックマウスモデルを作製することもでき、これはこの病気の病理学の研究に極めて有用と思われる。これらのイソフォームを発現するトランスジェニックマウスにおいて、Apo E のイソフォームの活性に対する治療効果の研究方法も本明細書に開示されている。この様な方法は、トランスジェニック動物に化合物を投与し、その化合物の動物の生理学(例えば、痴呆の進行、アミロイド斑形成の進行、その他)に及ぼす影響を分析または検出することを含む。この動物は、Apo Eのイソフォームの分子生化学と細胞生化学のin vivoにおける研究、およびApo Eのイソフォームとその他の目的のタンパク質の相互作用のin vivoにおける研究が可能なモデルとして有用である。この動物は、動物のin viv oにおいて神経以外の組織におけるApo Eのイソフォームの活性を同定できるモデルとして有用である。この動物は、異なるイソフォームを有するトランスジェニックマウスを互いに交配することにより、ヒト集団に見いだされるApo Eのイソフォームの種々の組み合わせによる生物学的作用を研究し、子孫に生じたイソフォームの組み合わせによる生物学的作用の特徴を明らかにするために有用である。本技術に精通する者にとって、本発明を実施するために前記に関して多くの変更が可能であることは明らかであり、これらはトランスジェニック動物に関する文献から明らかとなるであろう。例えば、H．Chen et al.，PCT出願番号WO 95/0 3397号、H．Chen et al.，PCT出願番号WO 95/03402号、C．Wood et al.，PCT出願番号91/00906号、C．Lo et al.，PCT出願番号WO 90/06992号、P．Leder et al .，米国特許番号4,736,866号およびT．Wagner et al.，米国特許番号4,873,191 を参照。本発明は、以下の具体例により更に詳細に説明される。これらの具体例は、本発明を説明するためのものであり、本発明を制限することを目的とするものではない。例１ Apo E のイソフォームに特異的なコスミドライブラリーの作製高分子量ゲノムDNAの単離：コスミドライブラリーの作製に使用されるヒトゲノムDNAを、Apo E2/2、3/3、4/4対立遺伝子に関してホモ接合体を有することが確認されたヒトのリンパ芽球から単離、精製した。リンパ芽球は、本技術において公知の標準方法を用いて、10％胎児ウシ血清(FCS)を補足したDMEM(GIBCO-BR L)において増殖させた。5×10⁷個の培養リンパ芽球を収集し、冷たい燐酸緩衝食塩水(PBS)で1回洗浄し、20mMのトリス塩酸(pH8.0)、10mMのNaCl、1mMのエチレンジアミン四酢酸を含む溶液15mlに再懸濁し、0.5％ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)を含む100mg/mlのプロテイナーゼK(ベーリンガーマンハイム、BMB)を用いて50℃にて 6時間または一晩消化した。フェノール/クロロホルムを飽和させた同量のトリス塩酸(pH8.0)を用いて、室温で10分間、静かに反転してDNAを抽出した。混合物を、室温で15分間、5000rpm で遠心分離して分離した。粘性の水相を注意深く収集し、同量のクロロホルムで1回抽出した。透明な水相を、4リットルの50mMトリス塩酸(pH8.0)、10mM EDTA溶液に対し、4℃で4回透析した。精製DNAの濃度を、26 0および280nm の波長で吸光度を測定し、本技術に精通する者にとって公知の数式を用いて計算した。 35 〜50キロベース(kb)のゲノムDNA断片の調製：ゲノムDNA断片をSupercos1 ベクター(Stratagene)のBam HI部位の中にクローニングするために、150〜200kb の高分子量ゲノムDNAを制限エンドヌクレアーゼMbo I(GIBCO-BRL)を用いて部分消化し、35〜50kbの断片を作製した。消化に使用されるMbo I酵素の至適時間間隔と量は、一連の部分消化試験により決定した。100μlの反応物に含まれるゲノムDNA10μgの消化物試料を、1単位のMbo I酵素を添加して切断した。15μlのアリコートを0分、5分、10分、15分、20分、25分、30分の時点で消化反応物から取り出した。3μlの6×DNAゲルロード用緩衝液(水中に調製された0.25％ブロモフェノールブルー、0.25％キシレンシアノールFFおよび30％グリセロール)を直ちに加えて、反応を止め、消化されたDNAを0.5％アガロースゲルで電気泳動にかけて、チェックした。試験消化に最もよく似た条件で、総容量1.0ml中の100μgのゲノムDNAをMbo Iにより部分消化した。消化後、18μlの0.5mM EDTA(pH8.0)を加えて反応を止めた。試料を同容量のフェノール/クロロホルムで1回抽出した。上層の水相を0.3MのNaOAc、pH5.2に調整し、2倍量のエタノールで沈殿させた。遠心分離後、ペレットを70％エタノールで1回洗浄し、凍結乾燥し、水に再懸濁した。次いで、Mbo-Iで消化されたDNAを5単位の子牛腸アルカリホスファターゼ(CI AP)(BMB)を用いて、 37℃にて60分間脱燐酸化した。0.5MのEDTAを3μl加えて反応を停止させ、56℃で 15分間、インキュベートした。試料を同容量のフェノール/クロロホルムで1回抽出した。上の水相を0.3M NaOAcに調整し、2倍量のエタノールで沈殿させた。乾燥させたペレットを1mg/mlの濃度になるように水に再懸濁した。 Supercos 1 ベクターの調製：総量200mlの標準緩衝液の中で、10μgのSuperc os1ベクターを50単位のXbaI酵素(GIBCO-BRL)を用いて、37℃にて2時間消化した。消化されたベクターDNAを、フェノール/クロロホルムで1回抽出し、エタノールで沈殿させ、凍結乾燥し、50mlの水に再懸濁した。上記の様に、XbaIで消化されたDNAを5単位のCIAPで脱燐酸化し、精製した。次いで、Xba I/CIAPで処理されたベクターDNAを、総量200μl中37℃で2時間、50単位のBam HI酵素を用いて消化した。上記の様に、このDNAをフェノール/クロロホルムにより精製し、エタノールを用いて沈殿させた。 DNA の結合とパッケージング：総量20μgにおいて2単位のT4 DNAリガーゼ(B MB)を用いて、16℃にて24時間、2.5μgのMbo Iで消化されたゲノムDNAを、1μg のXbaI/CIAP/Bam HIで処理されたSupercos1ベクターDNAに結合させた。効率の高いGigapack II Packaging抽出物(Stratagene)を用いて、結合されたDNAをコスミドの中にパッケージングした。4mlの結合されたDNAを素早く解凍されたFreeze/T haw抽出物のそれぞれに加え、氷上におき、15mlのSonic抽出物をその抽出物に素早く加えた。室温で2時間インキュベートした後、500mgのSM緩衝液(100mMのNaCl 、10mMのMgSO₄、50mMのトリス塩酸(pH7.5)および0.01％ゼラチン)と20mlのクロロホルムを各パッケージング反応物に加えた。この溶液を静かに混合し、短時間軽い遠心をかけて細胞片を沈殿させると、上清はいつでも力価測定とスクリーニングできる状態となった。例２イソフォームに特異的なApo EゲノムDNAの単離コスミドライブラリーのスクリーニング：イソフォームに特異的なApo E遺伝子を単離するために、Apo E2、E3、E4イソフォームに特異的なコスミドライブラリーをまずApo EcDNAでスクリーニングし、ポジティブクローンをApo C1 cDNA で再スクリーニングした。Apo EcDNAの遺伝子は、Apo E遺伝子の約5.3 kb下流に位置する。DH5a-MCR(GIBCO-BRL)細胞系を宿主細胞として使用した。パッケージされたコスミドライブラリー全てを、Stratageneプロトコールに従ってスクリーニングした。各コスミドライブラリーの100万から200万のパッケージされた組換え体を137mmのColony/PlaqueScreenディスク(デュポン)に広げた。各ディスクは 40〜50,000個のコスミドクローンを含んでいた。ディスクを150 mm LB/カナマイシンプレート(1.0％Bacto-トリプシン、0.5％ Bacto-酵母抽出物、150 mM NaCl 、1.5％Difco-寒天および50mg/mlカナマイシン)で37℃にて一晩インキュベートした。次に、マスターフィルターから2つのレプリカフィルターを作製し、LB/カナマイシンプレートで37℃にて一晩インキュベートした。複製された2つのフィルターを0.5N NaOH溶液で2回変性させ、1Mのトリス塩酸(pH7.5)で室温にて5分間ずつ2回中和した。フィルターの水分をペーパータオルで吸い取り、真空オーブン内で80℃にて2時間焼いた。プレハイブリッド形成を、2×SSC(150mMのNaCl、1 5mMのクエン酸ナトリウム)、1.0％のSDS、10％の硫酸デキストランおよび50％の脱イオン化ホルムアミドの中で1時間から一晩実施した。プレハイブリッド形成後、Multiprimer DNA ラベリングシステム(Amersham)を用いて調製された5×10⁶ cpmのApo E cDNAプローブをプレハイブリッド形成溶液に加え、42℃で一晩インキュベートした。次に、フィルターを、2〜4時間にわたり3ないし4回交換しながら、55〜60℃の0.1×SSC、0.1％SDSの中で洗浄し、ペーパータオルで吸い取り、 X線フィルムに一晩感光させた。オートラジオグラムをマスターフィルターに並べた。ハイブリッド形成シグナルの周囲1〜5mmの領域を滅菌爪楊枝でこすり取り、50mgのアンピシリンを含む100mlのLB培地に入れた。この細菌を希釈し、150 m m LB/カナマイシンプレート上の137mmフィルターで再度平板培養し、プレートあたり500〜1000のクローンを得た。レプリカフィルターを³²P標識Apo C1プローブと再びハイブリッド形成させた。単一のポジティブクローンが単離され、3.0mlの培養に接種された。微量溶菌液からのコスミドDNAの調製：細菌細胞を1.5mlの培養からミクロ遠心分離器で2分間遠心分離することにより収集した。ペレットを300μlのSTET(8 ％のスクロース、0.5％のトリトンX-100、50mMのトリス塩酸(pH8.0)、50mMのEDT A)に再懸濁した。20μlの新鮮なリゾチーム(10mg/ml)を懸濁液に加えて、沸騰水浴で1分間インキュベートし、次に4℃で10分間遠心分離した。ゼラチン状のペレットを除去し、廃棄した。残りの上清を300mlのイソプロパノールで沈殿させた。ペレットを70％エタノールで洗浄し、凍結乾燥し、50mlの水に再懸濁した。例３トランスジェニックマウスの作製マイクロインジェクションに使用されるマウス：チャペルヒル、ノースカロライナ大学のN．Maeda博士により提供されたApo E「ノックアウト」マウスラインをヒトApo Eトランスジェニックマウスの作製に使用した。「ノックアウト」マウスは、胚幹細胞において遺伝子ターゲッティングにより作製された不活化された内在性Apo E遺伝子を持つ。(Piedrahita et al.，Proc．Natl．Acad．Sci． 83，4471(1992)を参照。)。簡単に述べると、エキソン3の成分とイントロン3の部分を含むXho I/Bam HI 断片を除去し、それをネオマイシン耐性遺伝子と置換することにより、正常なマウスApo E遺伝子が不活化された。内在性Apo E遺伝子座とターゲッティングプラスミド間の相同組換え後、Apo Eプローブにハイブリッド形成させたHind IIIで消化されたDNA断片の大きさは6.5kbから7.5kbに増大した。従って、ターゲッティングマウスから得られたHind IIIで消化されたDNA 断片のサザンブロッティングは、マウスゲノムDNAから増幅されたマウスApo Eエキソン4のDNA断片を用いてプローブされると、正常対立遺伝子と改変された対立遺伝子をそれぞれ受け継いだことを示す、6.5および/または7.5kbのバンドを示した。マイクロインジェクション用Apo EゲノムDNA断片の精製： 28〜30kbのApo E ゲノムDNA断片は、適切な制限酵素(KpnI、ClaI、ScaI、前記から続く)による消化により、選択されたコスミドクローンから精製された。20μgのコスミドDNAを、総量300μlの中で50〜100単位の選択された酵素を用いて、37℃で2時間消化した。消化されたDNAを6×DNAロード用緩衝液と混合し、0.7％アガロースゲル上で単離した。特異的DNAバンドをゲルから切断し、余分なアガロースを切り取り、D NAを300Vで30分間透析バッグの中に電気溶出した。DNAを洗浄し、透析バッグから収集し、それぞれ同量のフェノール、フェノール/クロロホルム、クロロホルムを用いて抽出することにより精製し、次いで沈殿させ、50μlの注入用緩衝液( 10mMのトリス塩酸(pH7.5)、0.1mMのEDTA)に再懸濁した。 Apo E ゲノムDNAのマイクロインジェクション：単一の細胞にされた胚のマイクロインジェクションによるトランスジェニック動物の作製は、十分認められた以下の4つのステップを含む。すなわち、妊娠動物から受精卵を単離するステップと、単一の細胞とされた受精卵前核に導入遺伝子を注入するステップと、偽妊娠雌の卵管内にDNAを注入された胚を移植するステップと、最後に作製された動物を分析するステップである。卵ドナーの雌マウスは、卵胞の成長を刺激する妊娠雌の血清(PMS)5国際単位(I U)を腹腔内注射することにより、より高収量を得るためにホルモンによって刺激された。この注射に続いて48時間後に、卵母細胞の細胞分裂と排卵の回収を促進するヒト絨毛性ゴナドトロピン(hCG)5 IUの2回目の腹腔内注射を行なった。ホルモン刺激に十分反応しない系においてさえも、ホルモンによって刺激された雌は自然交配における雌よりも高いパーセンテージで交尾する。更に、ホルモン刺激による交配は、自然交配よりも異常卵の数がより多いが、これは雌あたりの注入可能な卵の数の増加によって、十分以上に補償される(刺激されたドナーに関しては、平均15〜40個であるのに対し、刺激されないドナーに関しては8〜12個)。マウスは、12時間明所、その後12時間暗所の１日サイクルで飼育した。暗所の期間は午後4時から午前4時に維持したので、受精は真夜中頃に起こり、胚を翌朝単離した。公知の技術に従って、卵管を摘出し、M2培養培地に入れた。10〜20倍の倍率の解剖顕微鏡を用いて、卵を回収し、ピペットを用いて0.1％ヒアルロニダーゼ溶液の中に加え、卵丘細胞を除去した。次に、公知の技術に従って、卵を M2培地内で洗浄し、パラフィン油下のM16培地の小滴内に入れ、注入まで5％CO₂ の中でインキュベートした。使用されるDNAは、不純物を除去するためにマイクロインジェクションの前に徹底的に精製しなくてはならない。不純物は卵に有害で、注射針を閉塞する可能性がある。これらの実験に使用されるDNAは、2通りの方法で調製した。第一の方法は、制限酵素Kpn I とCla Iによる制限消化してから、アガロースゲル上で単離する。Apo Eを含む導入遺伝子を電気的に溶出により単離し、透析し、ブタノールで十分に抽出し、沈殿させる。第二の方法は、DNA断片の単離にelutrapシステム(Scheleicher & Schell，S&S)を使用する。マイクロインジェクションには、ノマルスキー微分干渉コントラスト光学レンズ(Nomarski differential interference contrast optics)を備えた倒立Olympu s顕微鏡を利用した。前核への注入は、振動しない実験台上で、倍率200倍で1ピコリットルのDNA溶液とマイクロ操作器を使用して行った。注入後、卵を油下のM 16倍に戻し、5％CO₂の中で37℃で一晩インキュベートした。翌日までに分裂して 2細胞期なった胚を、偽妊娠雌の卵管に移した。卵を直ちに卵管に移すことは可能かも知れないが、胚を一晩インキュベートできれば、生存可能な2細胞期の胚だけを確実に移植できる。注入後に生存できた胚を、漏斗により偽妊娠雌の卵管膨大部に移した。偽妊娠雌は、移植前夜に精管切除した雄をその雌と交配させることにより作製した。15 〜20個の卵が雌あたり1本の卵管に移植された。卵は反対側の子宮角にも移動し、従って両側に移植された。例４導入遺伝子の特徴付けと分析ポリメラーゼ連鎖反応によるトランスジェニックマウスのスクリーニング：トランスジェニックマウスの子におけるヒトApo E遺伝子の存在を検出し、その遺伝子型を同定するために、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を実施した。ヒトApo E エキソン3に特異的なプライマーは、ヒトApo E遺伝子のエキソン3の両端に隣接するイントロン配列から得られた。使用されたフォワードプライマーの配列は、 5'-GGTAGCTAGATGCCTGGACGG-3'(配列番号１)であり、使用されたリバースプライマーの配列は、5'-GCTAGAACCAGCAGAGACCC-3'(配列番号２)であった。マウスノックアウトプライマーは、不活化(ノックアウト)領域にかかるマウスDNA配列から合成された。使用されたノックアウトプライマーの前進配列は、5'-GTCTCGGCTCT GAACTACTATG-3'(配列番号３)で、使用されたリバースプライマーは、5'-GCAAGAG GTGATGGTACTCG-3'(配列番号４)であった。各PCR反応には、最終容量50μl中に、 250〜500ngのマウス尾部DNA、100ngの各プライマー、200mMの各dNTP、0.5単位の Taq DNAポリメラーゼ(GIBCO-BRL)が含まれた。94℃にて5分間の最初の変性後に、65℃にて0.5分間のアニーリング、70℃にて1.5分間の伸長、94℃にて0.5分間の変性、70℃10分間の最終伸長からなる35サイクルが行われた。サザンブロッティング分析：サザンブロッティング分析により、トランスジェニックマウスの導入遺伝子の存在、組み込み様式、コピー数を更に確認した。 20μgのマウスゲノムDNAと16μgのヒトゲノムDNAを、100単位の適切な酵素を用いて総量300μlの溶液中37℃で一晩消化した。消化されたDNAを、2倍容量のエタノールで沈殿させ、ペレットを70％エタノールで洗浄し、凍結乾燥し、20単位の酵素を用いて総量30μl中で37℃で2時間再消化した。DNAを0.7％アガロースゲルでで単離し、製造者のプロトコールに従って、Posiblot30-30(Stratagene)を用いてGeneScreen膜(DU PONT)にブロッティングした。結果： PCRとサザンブロッティング分析の結果から、ヒトApo E4遺伝子を含む5匹のトランスジェニックファウンダー動物が作製された。3匹のファウンダー動物がヒトApo E3遺伝子に関して作製され、5匹がヒトApo E3に関して作製された。Hind III制限酵素により切断され、ヒトApo EおよびApo C1 cDNAによりプローブされたトランスジェニックマウスゲノムDNAのサザンブロッティングとヒトに特異的な導入遺伝子のPCR分析から、Apo E4およびApo E2トランスジェニック動物のコスミド28(Apo E4)およびコスミド45(Apo E2)の存在にそれぞれ関連する、ヒト11.1kb Hind IIIバンドの存在が示された(データは示されていない)。データより、E2-267と表示されたファウンダー系は、11.1kb Hind III断片を持っているが（Cos-222から得られたSca I-Sca I断片が挿入されていることを示す）、E2-222と表示されたApo E2ファウンダー系は11.1kbの断片を持たず、より大きなハイブリッド形成断片を持つことも明らかにされた。ヒトApo C1プローブを用いて同じブロットをプローブすると、ヒトに特異的な12.3kbおよび4.8kbのバンドが、コスミド23と番号づけられたApo E4コスミドから得られたKpn I-Cla I 断片の存在と関連していることが実証された。しかし、267系から得られたApo E2 トランスジェニック動物には、12.3kbのバンドも4.8kbのバンドも認められなかった。これにより、コスミド45から得られたSca I-Sca Iゲノム断片(特徴的なAp o E11.1 kb断片は含むが、12.3kbおよび4.8kb断片を含まなかった)だけが267ラインに組み込まれたことが証明された。従って、Apo E2-222系は、Apo EおよびA po C1遺伝子の両方を含み、267ラインは含んでいなかった。PCR分析では、ヒトに特異的なプライマーが利用され、マウスにおけるヒト導入遺伝子の存在に特異的な、特徴的な377 bpのPCR産物が作製された。ヒトApo E4遺伝子の存在に関するApo E4の子孫のルーチンの分析法により、42、43、44および45と番号づけられた動物は、ヒト377 bpのPC R産物を持ち、40および41と番号づけられた動物はヒト導入遺伝子を受け継がなかったことが示された。ヒトApo E転写のノーザンブロッティング分析： TRIzol試薬(GIBCO-BRL)を用いて、マウスの脳、肝臓および腎臓から総RNAを単離した。50〜100mg の組織を1 mlのTRIzol試薬にホモジェナイズして、室温で5分間インキュベートした後、0.2 mlのクロロホルムを加え、激しく振とうして十分混合した。4℃で15分間遠心分離することにより混合物を分離し、上層の水相を収集し、0.5mlのイソプロパノールを加えRNAを沈殿させた。次にRNAのペレットを75％エタノールで洗浄し、一時的に凍結乾燥し、50μlの水に再懸濁した。olig-dTセルロースタイプ7カラム( Pharmacia)を用いて、総RNAからmRNAを精製した。mRNAを1.0％ホルムアルデヒド -アガロースゲル上の電気泳動により分画し、次いでGeneScreen膜に移した。この膜を42℃にて50％ホルムアミド/6×SSCの中でApo EのcDNAを用いてプローブし、50℃にて0.1×SSCで洗浄した。結果：トランスジェニックマウスの脳から単離されたRNAのノーザンブロッティング分析により、Apo E4-20と番号づけられたApo E4トランスジェニックマウスの脳において転写された1163bpのヒトApo E転写物の存在が示されたが、対照「ノックアウト」マウスの脳には存在しなかった。ヒトApo Eタンパク質のウェスタンイムノブロッティング分折：マウスタンパク質は、1mMフェノールメチルスルホニルフルオリド(PMSF)を含むTMN緩衝液(2 5mMのトリス塩酸(pH7.6)、3mMのMgCl₂、100mMのNaCl)中で、マウス組織をDounce ホモジェナイゼーションを行うことにより調製した。20μgのホモジェネートを同量の2×Laemm1iロード用緩衝液(100mMのトリス塩酸[pH6.8]、4％のSDS、10％の2-メルカプトエタノール[2-ME]、25％のグリセロール、0.02％のブロモフェノールブルー)と混合し、100℃で3分間加熱した。溶解物中のタンパク質を、0.1％ SDSを含む不連続ポリアクリルアミドゲルにおいて電気泳動(SDS-PAGE)することにより分析した。SDS-PAGEにより単離されたタンパク質を、製造者のプロトコールに従って、セミドライトランスブロット(Bio-Rad)転移細胞を用いて、Immunobilon膜(M illipore)に移した。膜を、100mMのトリス塩酸(pH7.5)、150mMのNaCl、0.1％のT ween-20(TBS-T)中に調製された1.0％の牛血清アルブミン(BSA)中で、4℃で一晩ブロッキングし、次に1:10,000の希釈率でヒトApo Eに対する多価ヤギ抗血清(Ca lbiochem)を用いて室温で30分間プローブした。TBS-Tで3回洗浄した後、室温で3 0分間、1:10,000の希釈率で、ホースラディッシュペルオキシダーゼと結合したウマ抗ヤギ二次抗体に膜を浸した。次にTBS-Tにおいて室温で5〜7回洗浄した。強化された化学発光検出キット(Amersham)を用いてホースラディッシュペルオキシダーゼを可視化し、ECLハイパーフィルムに感光された。結果：ウェスタンブロッティング分析により、Apo E4およびApo E2トランスジェニックマウスが、対照「ノックアウト」マウスには存在しないApo Eタンパク質を発現することが明らかにされた。コレステロールの測定：一晩絶食後、約250μlの血液を尾部から出血させて採血するか、あるいは屠殺したマウスの心臓から採血した。製造者のプロトコールに従って、Sigma社のコレステリン検出キットを用いて、酵素法によりコレステロールを測定した。コレステロール検査結果の信頼性を、既知の高値、正常値、低値のコレステロール濃度の対照血清(Sigma)をルーチン使用することにより監視した。5μlのマウス血清を500μlの予め温めておいたコレステロール試薬と混合し、37℃で5分間インキュベートした。500nmの波長で吸光度を測定し、本技術において公知の計算式を用いて、コレステロール濃度を計算した。結果：マウス尾部から出血させて得たバックグラウンド血清の血中コレステロール濃度を分析した。コレステロールを輸送するApo E遺伝子を持たない「ノックアウト」マウスにおいて、血中コレステロール濃度は正常マウスに認められる濃度の通常平均5倍であり、マウス用普通食餌で飼育された場合、それぞれ400 〜 600mg/dlと約100mg/dlであった。ヒト遺伝子がマウスゲノムに組み込まれ、発現されたならば、マウスにおけるヒト遺伝子のコレステロール輸送能により、「ノックアウト」マウスの高コレステロール濃度は矯正されるか、少なくとも大きく低下するであろう。Apo E4導入遺伝子の結果を表1に示す。ヒトApo E4トランスジェニック動物は大幅に低いコレステロール濃度を示した。しかし、Apo E2トランスジェニック動物のコレステロール濃度は、兄弟間においてさえ大きな変動があった。ヒト遺伝子が存在し、かつ発現していたことは既に証明されていたため、この変動は動物がどの位前に食餌を摂取したかを反映しているものと考えられる。ホモ接合体であるApo E2は、他のApo Eのイソフォームよりもゆっくりとコレステロールを除去することが知られており、その理由は完全に解明されていないが、ヒトにおける高コレステロール濃度に関係していることが明らかにされている。従って、コレステロール濃度の変動が非常に大きいApo E2トランスジェニック動物は、脳におけるApo E2遺伝子の研究モデルとしてだけでなく、食事中のコレステロール濃度(高濃度と低濃度)が脂質輸送と脂質代謝に及ぼす影響の研究にも非常に有用と思われる。例５スクリーニング分析本発明の動物は、Apo Eのイソフォームの活性に影響を及ぼす能力に関して化合物をスクリーニングするために使用される。上記の様に作製されたトランスジェニックマウス(例えば、Apo E4/Apo E4動物)に試験化合物を投与し(例えば、経口投与または皮下注射により)、化合物のApo E活性と動物の生理学(例えば、寿命、脳萎縮、アミノロイド斑形成)に及ぼす影響を、対照動物(例えば、同様に投与されたApo E2/Apo E2動物、または偽薬を投与された同じ動物)におけるこの様な活性と生理学と比較した。前記具体例は本発明を説明するためのものであり、限定することを目的とする者ではない。本発明は、以下の請求項により定義され、請求項と同等物もその中に含まれる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者シュー，プー−ティンアメリカ合衆国、27705 ノース・キャロライナ、ダーラム、コットンウッド・ドライヴ 4102 (72)発明者シュミーケル，ドナルド・イーアメリカ合衆国、27705 ノース・キャロライナ、ダーラム、フレンドシップ・ロード 2965

Claims

【特許請求の範囲】１．ヒトのアポリポタンパク質E(Apo E)をコードする導入遺伝子を含み、かつ該遺伝子を発現するが、内在性Apo Eを実質的に発現できない細胞を含んでなるヒト以外のトランスジェニック哺乳動物。２．前記哺乳動物が、囓歯目の動物である請求項１に記載の哺乳動物。３．前記哺乳動物が、マウスである請求項１に記載の哺乳動物。４．前記ヒトApo Eが、Apo E4である請求項１に記載の哺乳動物。５．前記ヒトApo Eが、Apo E3である請求項１に記載の哺乳動物。６．前記ヒトApo Eが、Apo E2である請求項１に記載の哺乳動物。７．前記細胞が、脳組織細胞を含む請求項１に記載の哺乳動物。８．前記細胞が、脳、心臓、腎臓、脾臓、筋肉、腸、および肝臓の組織細胞を含む請求項１に記載の哺乳動物。９．前記導入遺伝子が、ヒトApo Eプロモーターの下流に位置し、かつ、該プロモーターと機能的に関連していることを特徴とする請求項１に記載の哺乳動物。１０．前記哺乳動物が、マウスである請求項９に記載の哺乳動物。１１．前記導入遺伝子が、Apo E2である請求項９に記載のマウス。１２．前記導入遺伝子が、Apo E3である請求項９に記載のマウス。１３．前記導入遺伝子が、Apo E4である請求項９に記載のマウス。１４．(a)トランスジェニック動物に試験化合物を投与するステップと、 (b)前記動物に対する前記試験化合物の影響を検出するステップとを含んでなるヒトApo Eのイソフォームを発現するトランスジェニック動物におけるApo Eのイソフォームの活性に影響を及ぼす能力に関する化合物のスクリーニング方法。