JPH09501315A

JPH09501315A - ヒトｍｈｃ▲ｉｉ▼群二重トランスジーンおよび用途

Info

Publication number: JPH09501315A
Application number: JP7505017A
Authority: JP
Inventors: ホワイテイカー，ジョアン・レスリー; モーテン，ジョン・エドワード・ノリス
Original assignee: ゼネカ・リミテッド
Priority date: 1993-07-23
Filing date: 1994-07-22
Publication date: 1997-02-10
Also published as: AU7231494A; GB9414833D0; GB2280186A; GB9315303D0; WO1995003331A1; EP0710250A1

Abstract

(57)【要約】ヒトＭＨＣＩＩ群ＨＬＡα，β−ＤＲ二重トランスジーン、それらの製造、および免疫活性メディエーターの産生または放出を変調する物質の同定における使用。

Description

【発明の詳細な説明】ヒトＭＨＣＩＩ群二重トランスジーンおよび用途主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）ＩＩ群遺伝子産物は、３４キロダルトンのα−鎖および２９キロダルトンのβ−鎖からなる細胞表面ヘテロダイマー糖蛋白質である。これらの蛋白質は自己寛容、ＭＨＣ制限および抗原提供（ａｎｔｉｇｅｎｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）の免疫過程で重要な役割を果たす。これらの過程はそれぞれＭＨＣ分子と抗原、Ｔ細胞α−β受容体（ＴＣＲｓ）および補助分子、たとえばＣＤ４との相互作用を伴う。これらの相互作用と寛容誘導およびＭＨＣ制限−抗原提供の生物学的作用との関係は、まだ完全には分かっていない。ＭＨＣおよびＴＣＲ遺伝子産物はともに著しい構造の複雑さを特色とする（ＮａｔｕｒａｌＨｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙＣｏｍｐｌｅｘ，１９８６，クライン（Ｊ．Ｋｌｅｉｎ）−ワイリー・アンド・サンズ）。この複雑さの重要な機能上の結果は、抗原認識の多様性である。独立した哺乳動物種の進化に際して、ＭＨＣおよびＴＣＲ複合体は遺伝子の構造、数および調節において著しく分化した。ローランス（Ｌａｗｒａｎｃｅ）ら（Ｃｅｌｌ，１９８９，５８，５８３−５９４）は、ＭＨＣＩＩ群遺伝子複合体のヒトＤＲ−α鎖およびネズミＩＥ−α 鎖のアミノ酸配列間のかなりの相違にもかかわらず、トランスジェニックＤＲα −Ｅβマウスを構築することが可能であると報告している。そのようなマウスは免疫機能に明らかなモジュレーションを伴うことなくヒトＤＲα遺伝子を発現する。ニシムラ（Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ）ら（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９９０，１４５，３５３−３６０）は、トランスジェニックＨＬＡ−ＤＱｗ６マウスの系列を記載している。ＤＱｗ６ＡおよびＤＱｗ６ＢＤＮＡの混合物をＣ５７ＢＬ／６マウスからの４０の受精卵に注入した。４匹の新生児が得られ、そのうち１匹のマウスはＤＱｗ６ＡおよびＤＱｗ６Ｂ両方の遺伝子を保有していた。しかしさらにＭＨＣＩＩ群二重トランスジーンが望まれていたにもかかわらず、これらについてのそれ以上の報告はなかった。本発明の第１観点においては、本発明者らはＭＨＣＩＩ群ＨＬＡ−ＤＲ遺伝子複合体に関してα，β−二重トランスジェニックであるトランスジェニック非ヒト哺乳動物を提供する。好都合なＭＨＣＩＩ群ＨＬＡ−ＤＲ遺伝子複合体の例には、下記に示されるものが含まれる：カッペスおよびストロミンガー（Ｋａｐｐｅｓ，Ｓｔｒｏｍｉｎｇｅｒ）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９８８，５７，９９１−１０２８；マーシュおよびボドマー（Ｍａｒｓｈ，Ｂｏｄｍｅｒ）“ＧｅｎｅＲｅｇｉｓｔｒｙ，ＨＬＡＩＩ群ヌクレオチド配列，１９９１”；ＬａｎｃｈｂｕｒｙｉｎＣｌｉｎｉｃａｌａｎｄＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＰｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓｉｎＣｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎＴｈｅｒａｐｙ，１９９２，２（１），１５−１７；ワーズワース（Ｗｏｒｄｓｗｏｒｔｈ）ら，Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．，１９９２，５１，５８５−５９１、ならびにＰ．Ｎ．Ａ．Ｓ．，１９８９，８６，１００４９−１００５３。それらの複合体には、ＤＲ１、ＤＲｗ１０およびＤＲ４サブタイプが含まれ、これらにはＤＲ４Ｄｗ４、ＤＲ４Ｄｗ１３、ＤＲ４Ｄｗ１４．１、ＤＲ４Ｄｗ１４．２、およびＤＲ４Ｄｗ１５が含まれる。具体的な複合体はＤＲ４Ｄｗ１４である。さらに具体的な複合体はヒトＨＬＡ−ＤＲ４Ｄｗ４−α，β複合体である。哺乳動物は任意の好都合な非ヒト哺乳動物、たとえば実験室試験法に用いられるもの、たとえばげっ歯類、たとえばマウスまたはラット、より好都合にはマウスである。本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、目的とするα，β−トランスジーンに関してヘテロ接合体またはホモ接合体のいずれであってもよいが、ホモ接合体が好都合である。本発明の好ましい非ヒト哺乳動物は、ヒトＨＬＡ−ＤＲ４Ｄｗ４−α，β複合体に関してトランスジェニックな、好ましくはαおよびβトランスジーンに関してホモ接合体であるマウスである。本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、目的とするＭＨＣＩＩ群ＨＬＡ−ＤＲ遺伝子複合体に関してそれぞれα−トランスジェニックおよびβ−トランスジェニックである適切な個々の非ヒト哺乳動物を交配することにより得るのが好都合である。一般的な交配および育種法を採用しうる。目的とする二重トランスジェニック子孫を、好ましくはα−またはβ−遺伝子のいずれにおいても何ら有意の欠失をもたないバックグラウンド株内へ戻し交雑育種する。これは目的外のヒト／非ヒト遺伝子対合を最小限に抑えるためであり、かつ目的とするα ，β−トランスジーンの信頼性ある発現を高めるためである。 α，β−トランスジーンの発現水準は、マウスＭＨＣＩＩ群（ｍｏｕｓｅＭＨＣｃｌａｓｓＩＩ）の発現水準の少なくとも１／１０であり、同一であることがより好都合である。本発明の他の観点においては、本発明者らはヒトβ−ＤＲ４Ｄｗ４トランスジーンを提供する。本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、ＭＨＣＩＩ群に関する免疫系の任意の観点の研究ならびにたとえば化合物とこれらの細胞表面蛋白質との相互作用を判定するための薬物およびワクチンのアッセイを含めた多数の用途をもつ。たとえば組織を摘出し、（ｉ）培養し（たとえば“ＣｕｌｔｕｒｅｏｆＡｎｉｍａｌＣｅｌｌｓ−ＡＭａｎｕａｌｏｆＢａｓｉｃＴｅｃｈｎｉｑｕｅ”−イアン・フレシュネイ（Ｒ．ＩａｎＦｒｅｓｈｎｅｙ），Ａ．Ｒ．リス・インコーポレーテッド、ニューヨーク）、（ｉｉ）アッセイに使用し、（ｉｉｉ）細胞系内でカロライン・マクドナルド（ＣａｒｏｌｉｎｅＭａｃＤｏｎａｌｄ）ＣｒｉｔｉｃａｌＲｅｖｉｅｗｓｉｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９０，１０（２），１５５−１７８に概説される方法を用いて不死化し、または（ｉｖ）“ＴｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓａｎｄＥｍｂｒｙｏｎｉｃＳｔｅｍＣｅｌｌｓ−ａｐｒａｃｔｉｃａｌａｐｐｒｏａｃｈ”，ロバートソン著，ＩＲＬプレスに概説される幹細胞の調製に使用する。本発明の他の観点においては、本発明者らはＭＨＣＩＩ群α，β−二重トランスジーンの発現に関してヘテロ接合体、ホモ接合体またはキメラである哺乳動物細胞系を提供する。好都合なＭＨＣＩＩ群α，β−二重トランスジーンの例には、ＤＲ群、特にＤＲ１の配列；Ｄｗ群、特にＤｗ４、Ｄｗ１４．１およびＤｗ１４．２の配列のα，β−二重トランスジーンが含まれる。具体的なα，β− 二重トランスジーンはＤＲ４Ｄｗ１４である。さらに具体的なトランスジーンはヒトＨＬＡ−ＤＲ４Ｄｗ４のα，β−二重トランスジーンである。任意の好都合な細胞系統（ｃｅｌｌｌｉｎｅ）を使用しうる。これらには前記のもの、たとえば不死化した細胞系統が含まれる。細胞系統は多分化能および／または全分化能であってもよい。本発明の他の観点によれば、本発明者らは本発明の前記のいずれかの観点による本発明のα,β−二重トランスジーンにより発現したポリペプチドを提供する。本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物により発現するＤＲＭＨＣＩＩ群遺伝子産物は他の因子と相互作用してヒトＴ細胞の増殖を誘発しうることが分かった。従って本発明の他の観点においては本発明者らは、免疫活性メディエーターの産生または放出を変調する（ｍｏｄｕｌａｔｅ）化合物の同定方法であって、本発明のα,β−二重トランスジーンにより発現したポリペプチド、および該ポリペプチドと結合して複合体を形成し、該複合体がＴ細胞と相互作用して免疫活性メディエーターの産生または放出をもたらす因子と、被験化合物を接触させ、そして産生または放出の変調（ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ）を検出することを含む方法を提供する。本発明者らは理論的考察により拘束されたくはないが、被験化合物は因子へのポリペプチドの結合または後続の事象を阻害することにより免疫活性メディエーターの産生または放出を変調するのであろう。免疫活性メディエーターの産生または放出の変調を検出するために利用しうる好都合な免疫事象の例には、Ｔ細胞増殖、抗体産生および炎症反応が含まれる。任意の好都合な被験化合物を使用しうる。制御のためには抗体、たとえばモノクローナル抗体を使用して、α,β−二重トランスジーンにより発現したポリペプチドを遮断することができる。因子は好都合にはペプチド、好都合には合成ペプチドである。ＨＬＡ−ＤＲ４Ｄｗ４トランスジーンと共に前記方法に使用しうる具体的ペプチドは、である。以下の図面および実施例を参照して本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されない。図１は、ＤＲαクローンＴ９Ｃの構造を示す。ボックスはＤＲα遺伝子のエキソン（ｅｘｏｎ）を表し、矢印は転写の方向を表す。５′ＳＳはシグナル配列である。α１およびα２は細胞外ドメインである。ＴＣはトランスメンブラン（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ）および細胞質ドメインである。３′ＵＴは３′側非翻訳領域である。β１はＤＲβ遺伝子のエキソンである。ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩおよびＳａｌＩ制限酵素についての制限地図をも示す。５ＤＲαエキソンを含む２２ｋｂＢａｍＨＩ−ＳａｌＩフラグメントをマウス卵母細胞にマイクロインジェクションして、ＤＲαトランスジェニックを形成した。図２は、ＤＲβ構築体の形成を示す。ボックスはマウスＩＥα構築体のエキソンを表し、矢印は転写の方向を示す。Ｌはリーダーペプチドである。１および２は細胞外ドメインである。ＴＣはトランスメンブランおよび細胞質ドメインである。３′ＵＴは３′側非翻訳領域である。ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩ制限酵素についての制限地図をも示す。ヒトＤＲβ ｃＤＮＡを、マウスＩＥα遺伝子の第１エキソン内の転写開始部位と翻訳開始コドンとの間にクローニングした。図３（ａ）は、ＤＲα ｃＤＮＡにハイブリダイズされた、Ｔ９ＣＤＮＡ、非トランスジェニックマウスからの肝臓ＤＮＡ、ＢＭＳＤＮＡ、ならびにトランスジェニックおよび非トランスジェニック子孫の尾からのＤＮＡを含むサザンブロットのオートラジオグラフを示す。図３（ｂ）は、ＤＲβ ｃＤＮＡにハイブリダイズされた、ＷＥ３２β ＤＮＡ、非トランスジェニックマウスからの肝臓ＤＮＡ、ならびにトランスジェニックおよび非トランスジェニック子孫からのＤＮＡを含むサザンブロットのオートラジオグラフを示す。図４（ａ）は、ＤＲα ｃＤＮＡにハイブリダイズされた、ＤＲαトランスジェニック１５３０の肝臓、脾臓、肺臓および腎臓からのＲＮＡ、ならびにＢＭＳ細胞系統からのＲＮＡを含むノーザンブロットのオートラジオグラフを示す。図４（ｂ）は、ＤＲβオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされた、ＤＲβトランスジェニック１４９９からの肝臓、肺臓、脾臓および脳ＲＮＡ；ＤＲβトランスジェニック１５０２からの肝臓、肺臓および心臓ＲＮＡ、ならびにＢＭＳ細胞系統からのＲＮＡを含むノーザンブロットのオートラジオグラフを示す。図５は、ＨＬＡ−ＤＲ（ＭＡｂＬ２４３）およびマウスＭＨＣＩＩ群蛋白質（ＭＡｂ１０−３．６．２）に対する抗体で染色した、ＨＬＡ−ＤＲ４Ｄｗ４およびトランスジーンを含むマウスからの血液細胞のＦＡＣＳプロフィールを示す。図６は、ＭＡｂＬ２４３およびフィコエリトリン結合したヤギ抗−マウスＩｇＧ（Ｆｃ）ＦＩＴＣで、次いでＦＩＴＣ結合したラット抗−ＩＡ（セロテック（Ｓｅｒｏｔｅｃ）クローン）ＭＡｂまたはＦＩＴＣ結合したラット抗−Ｔｈｙ −１（セロテッククローン）ＭＡｂで染色した脾臓細胞のＦＡＣＳヒストグラム２種類を示す。発現性Ｉ−Ａ分子はＨＬＡ−ＤＲ４Ｄｗ４分子をも発現し（図６ａの集団Ｂ）、一方ＨＬＡ−ＤＲ４Ｄｗ４陰性細胞はＩ−Ａ分子も発現しない。さらにマウスＭＨＣＩＩ群分子を発現しないマウスＴ細胞（ＣＤ３陽性脾臓細胞）は、ＨＬＡ−ＤＲ４Ｄｗ４分子をも発現しない（図６ｂの集団Ｂ）。図７は、ＦＨＡ３０７−３２０で免疫化した１０匹の個々のマウス（５匹のＨＬＡ−ＤＲ４Ｄｗ４トランスジェニックマウス；５匹の非トランスジェニック同腹子）から得たＬＮＴ細胞の応答を示す。ＦＨＡ３０７−３２０をＨＬＡ−ＤＲ４Ｄｗ４トランスジェニックマウスからの感作ＬＮＴ細胞に添加すると用量依存性の増殖応答を生じ、これに対し非トランスジェニック同腹子からの感作ＬＮＴ細胞はＦＨＡ３０７−３２０を添加しても増殖しないことが分かる。図８は、抗ＨＬＡ−ＤＲモノクローナル抗体がＨＬＡ−ＤＲ４Ｄｗ４トランスジェニックマウスからの感作ＬＮＴ細胞によるＦＨＡ３０７−３２０認識に及ぼす影響を示す。脾臓細胞および感作ＬＮＴ細胞は実施例４に関して記載したものに従って調製され、かつ刺激濃度のＦＨＡ３０７−３２０（１０μＭ）が添加された。ＨＬＡ−ＤＲ４Ｄｗ４分子に結合するが、マウスＭＨＣＩＩ群分子には結合しないモノクローナル抗体Ｌ２４３をも添加し、記載に従って培養物をインキュベートし、採集し、そして計数した。ＭＡｂＬ２４３の添加はトランスジェニックマウスからの感作ＬＮＴ細胞の増殖を完全に阻害することが分かる。これに対しＨＬＡ−ＤＲ４Ｄｗ４分子と反応しない対照モノクローナル抗体（ＭＫＤ６）は阻害活性をもたず、これはその作用がＨＬＡ−ＤＲ４Ｄｗ４に対して特異的であることを示す。図９は、ＨＬＡ−ＤＲ４Ｄｗ４トランスジェニックマウスがＨＬＡ−ＤＲ４Ｄｗ４結合性ペプチドＦＨＡ３０７−３２０に対してリコール遅延型（ｒｅｃａｌｌｄｅｌａｙｅｄｔｙｐｅ）過敏応答を生じることを示す。ＨＬＡ−ＤＲ４Ｄｗ４結合性アンタゴニストペプチドをＨＬＡ−ＤＲ４Ｄｗ４トランスジェニックマウスに投与すると測定可能な程度のリコール遅延型過敏反応阻害が生じることが分かる。これに対しマウスＭＨＣＩＩ群分子のアンタゴニスト（ＳＮａｓｅ６１−８０）は阻害活性を示さなかった。これらの結果は、この応答がＨＬＡ −ＤＲ４Ｄｗ４制限されたものであること、およびこの方法をＨＬＡ−ＤＲ４アンタゴニストペプチドの検出に利用しうることを確認する。ヒトＨＬＡ−ＤＲ４Ｄｗ４を発現するトランスジェニックマウスの形成ヒトＨＬＡ−ＤＲ４Ｄｗ４を発現するトランスジェニックマウスの形成には２種類のヒト遺伝子、非多型性α遺伝子および多型性β遺伝子を添加することが必要である。ヒトＤＲα遺伝子の供給源ヒトＤＲ４α遺伝子全体を含有するコスミドクローン、Ｔ９Ｃは、スピース（Ｔ．Ｓｐｉｅｓら，Ｐｒｏ．Ｎａｔl．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８２：５１６５１９８５）により得られた。７Ｋｂ遺伝子ならびに５′および３′側フランキング配列を含む２２ＫｂのＢａｍＨＩ−ＳａｌＩフラグメントをＴ９Ｃ（図１）から形成し、濃度２ｎｇ／μｌでのマイクロインジェクション（参照：ホーガン（Ｈｏｇａｎ）ら，Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇｔｈｅｍｏｕｓｅｅｍｂｒｙｏ−Ａｌａｂｏｒａｔｏｒｙｍａｎｕａｌ，コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス，１９８６）用としてアガロースゲルから単離した。ヒトＤＲ４Ｄｗ４ β ｃＤＮＡ構築体の構築ヒトＤＲ４Ｄｗ４ β鎖ｃＤＮＡをヒトβ−類リンパ芽球系（ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｏｉｄ）細胞系統（ＢＳＭ−形質転換したエプスタイン・バールウイルス、Ｒ．ボルヒューズ、ＥＴＮＯ，ライスバイク，ＮＬより入手）。全ＲＮＡをＢＳＭ細胞から調製し、５０μｇの全ＲＮＡをオリゴヌクレオチドｄＴセルロースカラムに導通することによりポリＡ＋ＲＮＡを選択した。５μｇのポリＡ＋ＲＮＡを鋳型として用いて、二本鎖ｃＤＮＡを形成した。次いでこのｃＤＮＡをオリゴヌクレオチドとのＰＣＲ反応に用いて、８２０ｂｐの生成物を形成した。次いでこれをバクテリオファージクローニングベクターＭ１３ｍｐ１８およびＭ１３ｍｐ１９（ベーリンガー・マンハイム）のＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩ部位間にクローニングし、配列決定した。二本鎖（ＲＦ）ＤＮＡをｍｐ１８クローンから調製し、この挿入配列を真核細胞発現ベクターｐＭＳＧＣＭＶα中へサブクローニングした［ｐＭＳＧ−ファルマシア、下記により修飾（ｉ）ＭＭＴＶ−ＬＴＲを除去し、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）即時型プロモーター／エンハンサー（シャフナー（Ｗ．Ｓｃｈａｆｆｎｅｒ），Ｃｅｌｌ，４１，５２１−５３に記載、６１９ｂｐＴｈａＩフラグメント上にｐｃｍ５０２９から単離−Ｇｅｎｅ，４５，１０１− １０５）と置換し、そして（ｉｉ）ｇｐｔをバーグ（Ｐ．Ｂｅｒｇ）により得られるｐＳＶ２ｎｅｏ（Ｊ．ｏｆＭｏｌ．ａｎｄＡｐｐ．Ｇｅｎｅｔｉｃs ，１９８２，１，３２７−３４１）で置換する］。次いで下記のリンカーをｃＤＮＡの５′側のＥｃｏＲＩ部位にリゲート（ｌｉｇａｔｅ）した：ＡＡＴＴＡＧＡＴＣＴ従ってＴＣＴＡＧＡＴＴＡＡがＢｇｌＩＩ部位を形成する。ＤＲβ ｃＤＮＡ、ＳＶ４０スプライス部位、およびポリＡ認識配列を含む構築体をＢｇｌＩＩ−ＢａｍＨＩフラグメント上に精製し、次いでスタンフォード大学マチス（Ｄ．Ｍａｔｈｉｓ）により提供されたプラスミドｐＷＥ３２のＢａｍＨＩ部位中へサブクローニングした（ドーン（Ｄｏｒｎ）ら，Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８７，８４，６２４９−６２５３）。ｐＷＥ３２は、クローニングの目的で第１イントロンからＢａｍＨＩ部位を除去し、そして第１エキソンの非翻訳領域にＢａｍＨＩ部位を導入することにより修飾されたマウスＩＥα遺伝子を含む。ＩＥα調節配列および遺伝子（この時点でＤＲβ ｃＤＮＡを第１エキソン中に含む）（図２）をＢｇｌＩＩ消化により単離した。次いで９．４Ｋｂのフラグメントをゲル精製し、マイクロインジェクション用としてＴＥ（０．５ｍＭトリス−ｐＨ７．５，０．１ｍＭＥＤＴＡ）中に２ｎｇ／μ１で再懸濁した。トランスジェニックマウスの形成すべての操作をホーガン（Ｈｏｇａｎ）ら，Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇｔｈｅｍｏｕｓｅｅｍｂｒｙｏ−ａｌａｂｏｒａｔｏｒｙｍａｎｕａｌ，コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス，１９８６の記載に従って実施した。ＣＢＡ−ＣａｘＣ５７Ｂ１／６（Ｆ１）雌マウス（ゼネカーアルダーリー・パーク）を過剰排卵させ、Ｆ１雄と交配させた。受精卵に２２ＫｂのＢａｍＨＩ− ＳａｌＩフラグメント（ＤＲα遺伝子を含む）、または９．４ＫｂＢｇｌＩフラグメント（ＤＲβ遺伝子を含む）をマイクロインジェクションし、一夜インキュベートした。生存胚を擬妊娠Ｆ１雌（精管切除した雄と交配）の卵管へ移し、出産まで発育させた。トランスジェニックマウスの分析得られた子孫を分析して、トランスジーンが存在するか否かを判定した。各動物から約０．５ｃｍの尾を採取し、メスでスライスし、０．５ｍｌの細胞溶解用緩衝液（１００ｍＭトリスＨＣｌ−ｐＨ８．５，５ｍＭＥＤＴＡ，０．２％ＳＤＳ，２００ｍＭＮａＣｌ，１００μｇプロテイナーゼＫ／ｍｌ）中で４５℃ において一夜消化した。溶液をフェノール／クロロホルムで抽出し、ＤＮＡを沈殿させた。ＤＮＡを等容量のイソプロパノールで沈殿させ、７０％エタノール中で洗浄し、５００μｌのＴＥ（０．１Ｍトリス−ｐＨ８，０．０１ＭＥＤＴＡ）中に５５℃で再懸濁した。ＤＲαまたはＤＲβ特異性プライマーを用いるＰＣＲ分析を採用して、トランスジェニック動物を同定した。約１００ｎｇの尾ＤＮＡを、ＰＣＲにおいてテクネ（Ｔｅｃｈｎｅ）温度循環機につき製造業者（パーキン−エルマー・シータス）が記載する条件を採用したＴａｑポリメラーゼ（シータス−アンプリタク（Ｃｅｔｕｓ−Ａｍｐｌｉｔａｑ））との反応に使用した。使用したアンプリマー（ａｍｐｌｉｍｅｒ）は下記のものであった：９２℃で２分間、６５℃で２分間、および７２℃で２分間、３５サイクル、１０１８ｂｐの生成物を得た。９２℃で２分間、６４℃で２分間、および７２℃で２分間、３５サイクル、８８６ｂｐの生成物を得た。トランスジェニック動物をＥｃｏＲＩ消化した尾ＤＮＡのサザン分析により確認した。ＤＮＡ（１００μｇ）を２０×ＳＳＣ（３ＭＮａＣｌ，０．３Ｍクエン酸トリナトリウム−Ｎａ₃Ｃ₆Ｈ₅Ｏ₇・２Ｈ₂Ｏ）によりハイボンド（Ｈｙｂｏｎｄ）メンブレン（アメルシャム）に移し、ＵＶ固定し、プレハイブリダイズし、製造業者の推奨に従って標準プロトコールによりＤＲαまたはＤＲβ ｃＤＮＡの³²Ｐ標識プローブを用いてハイブリダイズした。結果を図３および４に示す。本発明者らの動物 “本発明者らの”ＤＲα動物６匹を同定し、２匹はトランスジーンを高頻度で伝達し（ＤＲα０８およびＤＲα１０）、３匹目の動物（ＤＲα１２）はトランスジェニック子孫を産んだが、同腹子のサイズは小さかった。他の３匹の“本発明者らの”動物のうち２匹は伝達せず（ＤＲα１９およびＤＲα９３）、１匹は転位した配列を含むと思われる子孫を産んだ（ＤＲα２１）。ＤＲα０８を選んでトランスジェニック系を樹立し、以下のＤＲαについての記述はＤＲα０８に関するものである。ＤＲβ構築体のマイクロインジェクションにより“本発明者らの”動物３匹、β３２５、β３８０およびβ３５６が得られた。β３２５およびβ３８０はトランスジーンをそれらの子孫に伝達しなかった。従ってマウス／ヒトハイブリッドβ３５６から系を樹立し、以下のＤＲβについての記述はこの系に関するものである。ノーザン分析マウス組織から全ＲＮＡをシルギン（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ）ら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１９７９，１８Ｎｏ．２４：５２９４の方法により抽出した。１０μｇのＲＮＡをホルムアルデヒドゲルに装填し、１００ボルトで４時間、電気泳動を実施した。ＲＮＡをハイボンドメンブレンに２０×ＳＳＣを用いてブロットし、ＵＶ固定した。プレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションは、０．５Ｍリン酸ナトリウムｐＨ７．２，７％ＳＤＳ，１ｍＭＥＤＴＡ（ＤＲα ｃＤＮＡプローブにつき）、または０．１４４ＭＮａ₂ＨＰＯ₄，０．０５６ＭＮａＨ₂ＰＯ₄，１ｍＭＥＤＴＡ，１％ＢＳＡ，７．２％ＳＤＳ，１５％脱イオンホルムアミド（ＤＲβオリゴヌクレオチドプローブにつき、プローブ最高水準のＤＲαおよびＤＲβ発現は脾臓および肺臓に見られた。蛍光ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）マウスゲノム中のトランスジーンの組み込みを蛍光ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）により観察した。ｐＷＥ３２のいずれかのコスミドＴ９ＣＤＮＡをビオチノール化した（ＢＲＬ−バイオニック・キット、製造業者の指示に従った）。トランスジェニック動物の繊維芽細胞からの中期染色体スプレッドをＲＮａｓｅ（１００μｇ／ｍｌ、２×ＳＳＣ中）で３７℃において６０分間処理し、洗浄し、アルコール濃度勾配を通して脱水し、７０％ホルムアミド、２×ＳＳＣ中で７５℃において３−５分間変性させ、そして脱水した（変性を９０℃で５分間実施してもよい）。１００ｎｇの標識ＤＮＡを２５μｌのハイブリダイゼーションミックス（１０％デキストラン硫酸，５０％ホルミアミド，２ ×ＳＳＣ，０．１ｍＭＥＤＴＡ，０．０５ｍＭトリスｐＨ７．５，１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ）に溶解し、８０℃で１０分間変性させた。変性プローブをスライドにカバーガラス下で３７℃において４８時間ハイブリダイズさせた。スライドを５０％ホルミアミド／２×ＳＳＣｐＨ７．０中で３×５分間、および２×ＳＳＣ中で３×５分間洗浄し、そして４×ＳＳＣ，０．０５％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ１００中で５％脱脂粉乳（マーベル（Ｍａｒｖｅｌ）−フレミアー・ブランズＵＫリミテッド）により６０分間遮断した。検出はフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ−ベクター・ラボラトリーズ）−アビジン（ＤＳＣ−Ｄ細胞ソーター用）、次いでビオチニル化抗アビジン（ベクター・ラボラトリーズ）中での連続インキュベーションにより行い：両者とも５μｇ／ｍ１，４×ＳＳＣｐＨ７．０，０．０５％トリトンＸ１００，３％ＢＳＡ中、３７℃で２０分間；各層間を４×ＳＳＣ／０．０５％トリグトン（ＴＲｉｇｔｏｎ）中で３×３分間洗浄した。３０４層のアビジン後にスライドをリン酸緩衝液食塩水（１×ＰＢＳ−０．１３７ｍＭＮａＣｌ，２．７ｍＭＫＣｌ，８．１ｍＭＮａ₂ＨＰＯ₄・２Ｈ₂Ｏ，１．５ｍＭＫＨ₂ＰＯ₄−ｐＨ７．４）中で洗浄し、ヨウ化フロピジウムで対比染色し、９０％グリセリン，２０ｍＭトリスｐＨ８．０，２．３％１，４−ジアザビシクロー［２．２．２］オクタン（ＤＡＢＣＯ）中で固定した。ＤＲβトランスジーンは、マウス染色体のうちの１つの単一部位に組み込まれていると思われた。しかしＤＲαは２つの異なるマウス染色体中に検出された：１つは動原体に対して近位（ｐｒｏｘｉｍａｌ）であり、１つは遠位（ｄｉｓｔａｌ）であった。ＤＲαトランスジェニック動物をＣＢＡと交雑させて、２つの組み込み事象を別個の系に分離させた。それぞれを蛍光抗体細胞ソーター（ＦＡＣＳ）分析により試験した。遠位組み込み部位は近位組み込み部位より高い水準で発現した。αβ交雑ＤＲα０８トランスジェニック動物をＤＲβ３５６動物と交配させて、両方のトランスジーンを保有する子孫を形成した。実施例２ＨＬＡ−ＤＲ４Ｄｗ４トランスジェニックマウスからの血球により発現するＨＬＡ−ＤＲ４Ｄｗ４蛋白質の検出尾の切断により得た血液を１００μｌのヘパリン処理試験管（ＢＤＨ）中に採取し、直ちに１ｍｌの氷冷ＰＢＳ中に吹き込んだ。次いで試料を遠心分離し（２０００ｒｐｍで５分間）、２０％正常ウサギ血清＋０．２％ナトリウムアジドを含有する氷冷ＰＢＳ２００μｌ中にペレットを再懸濁し、５０μｌずつをＬＰ４試験管（ラッカム）にピペットで分注した。冷蔵庫内で１５分間のインキュベーション後に、５０μｌの予め滴定したモノクローナル抗体含有上清（ＰＢＳ＋２０％正常ウサギ血清＋０．２％ナトリウムアジド中に希釈したもの（一般に１：５））を細胞懸濁液に添加した。低温でさらに２０−４５分間のインキュベーション後に、細胞を４５０μｌの冷ＰＢＳ＋２％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）＋０．２％ナトリウムアジドで洗浄し、次いで４℃で遠心分離した（２０００ｒｐｍで５分間）。次いで上清を吸引によりデカントし、ペレットを２−３秒間、渦流撹拌により再懸濁した。５０μｌのＦＩＴＣ−結合ヤギ抗マウスＩｇＧＦ（ｃ）抗体（セロテック）（予め５０％マウス脾臓細胞懸濁液を３０分間吸収させたもの）（ＰＢＳ＋２０％ウサギ血清＋０．２％ナトリウムアジド中に１：７５に希釈）を添加し、ペレットを渦流撹拌により再懸濁した。低温で２０分間のインキュベーション後に、細胞をＰＢＳ＋２％ＦＣＳ＋０．２％ナトリウムアジドで２回洗浄した。ＦＡＣＳ細胞溶解用緩衝液（ベクトン・ディッキンソン−製造業者の指示に従った）の添加により赤血球を取り出し、蛍光発光細胞をＦＡＣＳ−ＳＣＡＮサイトメーター（ベクトン・ディッキンソン）により計数した。図５は、ＨＬＡ−ＤＲ４Ｄｗ４およびトランスジーンを含むマウスからの血球を、ＨＬＡ−ＤＲ（ＭＡｂＬ２４３−ＡＴＣＣＨＢ５５）およびマウスＭＨＣＩＩ群蛋白質（ＭＡｂ１０−３．６．２−ＡＴＣＣＴＩＢ９２）に対する抗体で染色したもののＦＡＣＳプロフィールを示す。ＨＬＡ−ＤＲ４Ｄｗ４トランスジェニックマウスからの同様な数の細胞が、それぞれマウスおよびヒトＭＨＣＩＩ群蛋白質で染色されていることが分かる。実施例３トランスジェニックマウスからの脾臓細胞により発現したＨＬＡ−ＤＲ４Ｄｗ４蛋白質の検出トランスジェニックマウスから脾臓を切除し、３ｍｌの低温無菌ＰＢＳを入れた直径５０ｍｍの無菌プラスチック製ペトリ皿に入れ、小片（約３ｍｍ）に切断した。小片を２ｍｌプラスチック注射器（アシク）のプランジャーで圧壊して、脾臓細胞を放出させ、さらに７ｍｌの氷冷ＰＢＳを１０ｍｌのピペットで添加した。懸濁液をピペットで１０回、激しく吸引排出し、混合物をセル・ストレーナー（ＣｅｌｌＳｔｒａｉｎｅｒ）（ベクトン・ディッキンソン）により２５ｍｌの無菌ガラスビーカーへ濾過して残屑を除去した。細胞懸濁液を１５ｍｌの無菌プラスチック円錐管（ファルコン）に注入し、室温で遠心分離した（１４００ｒｐｍで５分間）。次いで細胞ペレットを３ｍｌのＰＢＳに再懸濁し、２ｍｌのリンフォライト（Ｌｙｍｐｈｏｌｙｔｅ）Ｍ（ジャクソン・ラボズ）を下に積層した。細胞を室温において２０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、次いで界面の細胞（単核細胞集団である）を採取し、１５ｍｌの無菌三角フラスコ内で１０ｍｌの氷冷ＰＢＳ中に希釈した。計数する前に細胞をＰＢＳ中で２回洗浄した。染色のために細胞をＰＢＳ＋２０％ウサギ血清＋０．２％ナトリウムアジド中に再懸濁し（１０−２０×１０⁶／ｍｌ）、実施例２の記載に従って処理し、ただしＦＡＣＳ細胞溶解緩衝液による処理を除外した。図６に示したプロフィールから、同様な数の脾臓単核細胞がＨＬＡ−ＤＲ分子およびマウスＩ−Ａ分子を発現していることが分かる。ＨＬＡ−ＤＲ分子を発現する細胞の特性をさらに解明するために、脾臓細胞をＭＡｂＬ２４３＋フィコエリトリン結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｆｃ）抗体、次いでＦＩＴＣ結合ラット抗Ｉ−Ａ（セロテック、クローンＭＣＡ４６Ｆ）またはＦＩＴＣ結合ラット抗ＣＤ３（セロテック、ＭＣＡ５００Ｆ）ＭＡｂで染色した。この２色ＦＡＣＳヒストグラムは、Ｉ−Ａ分子はＨＬＡ−ＤＲ４Ｄｗ４分子をも発現し（図６ａの集団Ｂ）、一方ＨＬＡ−ＤＲ４Ｄｗ４陰性細胞はＩ−Ａ分子も発現しないことを示す。さらにマウスＭＨＣＩＩ群分子を発現しないマウスＴ細胞（ＣＤ３陽性脾臓細胞）は、ＨＬＡ−ＤＲ４Ｄｗ４分子をも発現しない（図６ｂの集団Ａ）。従って脾臓のリンパ系細胞（ｌｙｍｐｈｏｉｄｃｅｌｌ）におけるＨＬＡ− ＤＲ４Ｄｗ４トランスジーンの発現パターンは、内因性ＭＨＣＩＩ群産物のものと類似する。実施例４ペプチド免疫化トランスジェニックマウスからのＴ細胞のインビトロ応答ＨＬＡ−ＤＲ４Ｄｗ４トランスジーン産物の機能を調べるために、１０ｎｍｏｌのペプチドＦＨＡ３０７−３２０（配列：を完全フロイントアジュバント（ディフコ・ラボズ）と１：１で混合したものによりマウスを免疫化した。ペプチドによる免疫化の７−１０日後にマウスを屠殺し、肥大したドレーン用（ｄｒａｉｎｉｎｇ）鼠径リンパ節および脾臓を各マウスから切除した。リンパ節（ＬＮ）細胞懸濁液を、実施例３に脾臓細胞につき示したと同様に細胞ストレーナーに導通することにより調製した。最終懸濁液を、５％熱不活性化ＦＣＳ＋２ｍＭグルタミン＋１００Ｕ／ｍｌペニシリン／１００ｇ／ｍｌストレプトマイシン＋５０μＭ２−メルカプトエタノールを補充した１ｍｌの加温した組織培養培地（以下“培地”と呼ぶ）に懸濁し、次いで懸濁液をナイロンウールカラムに付与した。ナイロンウールカラムは、１０ｍ１プラスチック製注射器の筒に０．６ｇのナイロンウールを入れ、カラムをオートクレーブ滅菌することにより調製された。無菌カラムを使用前に２０ｍｌの加温培地で約１時間洗浄し、細胞を添加するまで３７℃でインキュベートした。ＬＮ細胞懸濁液をカラムの頂部に滴加し、ＣＯ₂インキュベーター中で４５分間インキュベートした。次いで付着していない細胞を２０ｍｌの加温培地の滴加により溶離し、溶出液を無菌の３０ｍｌプラスチック製ユニバーサル容器内へ採取した。得られた細胞（“ＬＮＴ細胞”）をペレット化し、１ｍｌの加温培地に再懸濁し、計数し、さらに４ ×１０⁶／ｍｌの密度に調整した。脾臓単核細胞懸濁液を実施例３の記載に従って調製した。若干の実験においては、脾臓細胞を抗−Ｔｈｙ−１プラス補体で処理して、Ｔ細胞を枯渇させた。詳細には、脾臓単核細胞を抗−Ｔｈｙ−１ＭＡｂ（セロテック）の１：１０，０００希釈液を含有する培地に３０分間懸濁し（５×１０⁶／ｍｌ）、低温のＰＢＳで１回洗浄し、Ｌｏｗ−ｔｏｘウサギ補体（セロテック）に３７℃で４５分間、再懸濁した（５×１０⁶／ｍｌ）。細胞を加温培地で２回洗浄し、２ｍｌの加温培地に再懸濁し、計数し、さらに４×１０⁶／ｍｌの密度に調整した。Ｔ細胞の応答度を評価するために、ＬＮＴ細胞（５０μｌ／ウェル）および脾臓細胞（５０μｌ／ウェル）を、９６ウェルミクロタイタープレート内において指示された濃度でペプチドを含有する培地１００μｌに添加し、３７℃で空気中５％ＣＯ₂の加湿雰囲気内において４日間インキュベートする。５μｌＣｉ／ｍｌ３Ｈ−チミジン（アマーシャム）を６時間添加し、プレートを採集し、ベータプレート計数計（ＬＫＢ）で計数することにより応答Ｔ細胞を定量する。結果を３回の培養の平均（±ＳＥＭ）として表す。ペプチドＦＨＡ３０７−３２０は、ＨＬＡ−ＤＲ４Ｄｗ４に結合して適宜な特異性の感作ヒトＴ細胞の増殖を誘発することが知られている。図７は、ＦＨＡ３０７−３２０で免疫化した１０匹の個々のマウス（５匹のＨＬＡ−ＤＲ４Ｄｗ４トランスジェニックマウス;５匹の非トランスジェニック同腹子）から得たＬＮＴ細胞の応答を示す。ＦＨＡ３０７−３２０をＨＬＡ−ＤＲ４Ｄｗ４トランスジェニックマウスからの感作ＬＮＴ細胞に添加すると用量依存性の増殖応答を生じ、これに対し非トランスジェニック同腹子からの感作ＬＮＴ細胞はＦＨＡ３０７ −３２０を添加しても増殖しないことが分かる。実施例５抗ＨＬＡ−ＤＲモノクローナル抗体がＨＬＡ−ＤＲ４Ｄｗ４トランスジェニックマウスからの感作Ｔ細胞によるＦＨＡ３０７−３２０の認識に及ぼす影響ＦＨＡ３０７−３２０の添加に際して観察されたトランスジェニックマウスからの感作ＬＮＴ細胞の増殖がＨＬＡ−ＤＲ４Ｄｗ４により刺激されることを確認するために、Ｔ細胞とＨＬＡ−ＤＲ４Ｄｗ４の相互作用を遮断しうるモノクローナル抗体を添加した。脾臓細胞および感作ＬＮＴ細胞を実施例４につき記載したと同様に調製し、刺激濃度のＦＨＡ３０７−３２０（１０μＭ）を添加した。ＨＬＡ−ＤＲ４Ｄｗ４分子には結合するが、マウスＭＨＣＩＩ群分子には結合しないモノクローナル抗体Ｌ２４３をも添加し、培養物をインキュベートし、採集し、前記に従って計数した。結果を図８に示す。これからＭＡｂＬ２４３の添加はトランスジェニックマウスからの感作ＬＮＴ細胞の増殖を完全に阻害することが分かる。これに対しＨＬＡ−ＤＲ４Ｄｗ４分子と反応しない対照モノクローナル抗体（ＭＫＤ６−ＡＴＣＣＨＢ３）は阻害活性をもたず、これはその作用がＨＬＡ−ＤＲ４Ｄｗ４に対して特異的であることを示す。実施例６ＨＬＡ−ＤＲ４Ｄｗ４特異性遮断ペプチドがＨＬＡ−ＤＲ４Ｄｗ４トランスジェニックマウスからの感作Ｔ細胞によるＦＨＡ３０７−３２０の認識に及ぼす影響ＦＨＡ３０７−３２０に対する感作ＬＮＴ細胞の増殖応答がトランスジェニックマウス内のＨＬＡ−ＤＲ４Ｄｗ４の存在によるものである証拠はさらに、ＨＬＡ−ＤＲ４Ｄｗ４に結合し、かつ刺激作用性ＦＨＡ３０７−３２０ペプチドを排除しうるペプチドによりその応答が遮断されることを証明することである。感作ＬＮＴ細胞は実施例４につき記載したものに従って調製された。これらの実験においては、脾臓細胞を実施例４と同様に調製し、ペプチド添加前にグルタルアルデヒドで“固定”した。詳細には、抗−Ｔｈｙ−１プラス補体で処理した脾臓細胞（前記実施例４の場合と同様に調製）をＰＢＳ中で洗浄し、０．５％グルタルアルデヒド中に３０秒間、５×１０⁶細胞／ｍｌで再懸濁した。等容量のＰＢＳ中０．４ｍＭリシンを３分間添加し、細胞をペレット化し、培地で２回洗浄した。固定した細胞を無血清組織培養培地（ＲＭＰＩ−１６３０培地、ジブコ）中に４×１０⁶／ｍｌとなるように再懸濁し、１００μｌを９６ウェルミクロタイタープレート内において、１μＭのＦＨＡ３０７−３２０および０．１−１００μＭの濃度の遮断ペプチドを含有する１００μｌの無血清ＲＭＰＩ −１６３０培地に添加した。２時間のインキュベーション後に細胞をペレット化し、培地を吸引により除去し、さらに２００μｌの培地を添加した。細胞をペレット化し、培地を再度除去したのち、２×１０⁵の感作ＬＮＴ細胞を２００μ ｌの加温培地中において添加した。次いで培地を実施例４の記載に従って処理した。多数のＨＬＡ−ＤＲ４Ｄｗ４結合性ペプチドが、トランスジェニックマウスからの感作ＬＮＴ細胞へのＦＨＡ３０７−３２０の提供を阻害しうる。これに対し、マウスＭＨＣＩＩ群分子への結合に対して競合しうるペプチド（Ｉ−Ａｋ；Ｉ−Ｅｋ）は、ＦＨＡ３０７−３２０による感作ＬＮＴ細胞の活性化を阻害しない。これは、ＦＨＡ３０７−３２０の提供が単にトランスジェニックマウスにおけるＨＬＡ−ＤＲ４Ｄｗ４への結合により仲介されるということを確認するであろう。実施例６ＨＬＡ−ＤＲアンタゴニストペプチドによるＨＬＡ−ＤＲ４Ｄｗ４トランスジェニックマウスのインビボ応答の阻害アンタゴニストペプチドがインビボでＨＬＡ−ＤＲ４Ｄｗ４への刺激ペプチドの結合を阻害し、次いでＴ細胞を活性化する効力は、ＨＬＡ−ＤＲ４Ｄｗ４トランスジェニックマウスにおいて本質的にアドリニ（Ａｄｏｒｉｎｉ）ら（１９８８；Ｎａｔｕｒｅ３３４：６２３）の方法に従って試験することができる。１０ｎｍｏｌのＦＨＡ３０７−３２０を有効量（たとえば１−５００ｎｍｏｌ）のアンタゴニストペプチドと混合した混合物（完全フロイントアジュバントとＰＢＳの１：１混合物１００μｌ中）でマウスを免疫化した。７−１４日後にマウスを屠殺し、脾臓およびＬＮＴ細胞懸濁液を調製し、実施例４の記載に従って１ＭＦＨＡ３０７−３２０に対する反応性につきアッセイした。ＨＬＡ−ＤＲ４Ｄｗ４アンタゴニストペプチドはトランスジェニックマウスにおいてＬＮＴ細胞の感作を阻害することができ、これはそれらがインビボでＨＬＡ−ＤＲ４Ｄｗ４の機能と拮抗しうることを証明する。ＨＬＡ−ＤＲアンタゴニストペプチドによるＨＬＡ−ＤＲ４Ｄｗ４トランスジェニックマウスのインビボ遅延型過敏応答の阻害アンタゴニストペプチドおよび非ペプチドがＨＬＡ−ＤＲ４Ｄｗ４トランスジェニックマウスにおいてＨＬＡ−ＤＲ４Ｄｗ４への刺激ペプチドの結合を阻害し、次いでＴ細胞を活性化する効力も下記の方法により試験することができる。有効量のＦＨＡ３０７−３２０（この例では１０ｎｇ）の、完全フロイントアジュバントとＰＢＳの１：１混合物１０９μｌ中における混合物で、ＨＬＡ−ＤＲトランスジェニックマウスを免疫化する。７−１４日後にＦＨＡ３０７−３２０の１００μＭ溶液約３０μｌを一方の後フットパッド内へ足底に注入し、生じた免疫応答を、足の腫脹をミクロカリパスで測定することにより判定する。足底攻撃注入と混合することにより、もしくは他の標準的経路により投与した、または徐放性デポ製剤、たとえば浸透ミニポンプにより投与したＨＬＡ−ＤＲ４Ｄｗ４結合性ペプチドはＦＨＡ３０７−３２０により誘発された腫脹を阻害するのを示すことができ、これはそれらがインビボでＨＬＡ−ＤＲ４Ｄｗ４の機能と拮抗しうることを証明する（図８）。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．ヒトＭＨＣＩＩ群ＨＬＡα，β−ＤＲ二重トランスジーン。２．ＤＲ１、ＤＲ１０およびＤＲ１４サブタイプから選ばれる、請求項１に記載のヒトα，β二重トランスジーン。３．ＤＲ４Ｄｗ４である、請求項２に記載のヒトα，β二重トランスジーン。４．請求項１−３のいずれか１項に記載のヒトα，β二重トランスジーンを含む非ヒト哺乳動物。５．マウスである、請求項４に記載の非ヒト哺乳動物。６．ヒトα，β二重トランスジーンの遺伝子産物の発現水準が対応する哺乳動物遺伝子の発現水準の少なくとも１０％である、請求項４または５に記載の非ヒト哺乳動物。７．請求項１−３のいずれか１項に記載のヒトα，β二重トランスジーンを発現しうる哺乳動物細胞系統。８．請求項１−３のいずれか1項に記載のヒトα，β二重トランスジーンの遺伝子産物であるポリペプチド。９．免疫活性メディエーターの産生または放出を変調する化合物の同定方法であって、請求項８に記載のポリペプチド、および結合して複合体を形成し、該複合体がＴ細胞と相互作用して免疫活性メディエーターの産生または放出をもたらす因子と、被験化合物を接触させ、そして当該メディエーターの産生または放出の変調を検出することを含む方法。１０．請求項１−３のいずれか１項に記載のヒトトランスジーンを、当該トランスジーンとの相互作用により免疫活性を変調し、かつＭＨＣＩＩ群分子が病態生理学的役割をもつ疾患の処置に有用である化合物の同定に使用する用途。１１．請求項１−３のいずれか１項に記載のヒトトランスジーンを、そのヒトＨＬＡ−ＤＲ遺伝子のペプチドアンタゴニストの同定に使用する用途。１２．請求項１−３のいずれか１項に記載のヒトトランスジーンを、そのヒトＨＬＡ−ＤＲ遺伝子の非ペプチド−アンタゴニストの同定に使用する用途。１３．ヒトβＨＬＡ−ＤＲ４Ｄｗ４トランスジーン。１４．請求項１３に記載のヒトトランスジーンを含む非ヒト哺乳動物。１５．組織特異性プロモーターの制御下にヒトβＤＲ４Ｄｗ４を発現するためのＤＮＡを含む、請求項１３に記載のヒトトランスジーンを発現するための構築体。１６．ヒトβＤＲ４Ｄｗ４を発現するためのＤＮＡがプラスミドｐＷＥ３２中へ挿入された、請求項１５に記載の構築体。１７．非ヒト哺乳動物においてトランスジーンの染色体組み込み部位（１または２以上）を判定するためのｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーションにおける蛍光の使用。１８．請求項１７に記載の方法を使用してその染色体組み込み部位（１または２以上）がトランスジーンの発現を高めるように選ばれたＨＬＡ−ＤＲトランスジーンを含む非ヒト哺乳動物。１９．トランスジーンがαＨＬＡ−ＤＲ４Ｄｗ４である、請求項１８に記載の非ヒト哺乳動物。２０．ヒトＨＬＡ−ＤＲα，β二重トランスジーンの製造方法であって、少なくとも一方が請求項１７または１８に記載のものである適切なα非ヒト哺乳動物とβ非ヒト哺乳動物を交配させ、そして得られた子孫から二重トランスジーンを単離することを含む方法。２１．請求項１９に記載の非ヒト哺乳動物を請求項１４に記載の非ヒト哺乳動物と交配させて請求項３に記載のトランスジーンを得る、請求項２０に記載の方法。