JPH09500533A

JPH09500533A - 認識障害に関するトランスジェニック動物モデル

Info

Publication number: JPH09500533A
Application number: JP7505260A
Authority: JP
Inventors: チエン，ハワード・ワイ; ホフマン，キヤサリン・ジエイ; フアン・デル・プロツグ，レオナルドス・ハー・テー; シヤウ，アラン・アール; トルンバウアー，メイルナ・イー; チヤン，フアイ
Original assignee: メルクエンドカンパニーインコーポレーテッド
Priority date: 1993-07-22
Filing date: 1994-07-19
Publication date: 1997-01-21
Also published as: EP0724628A1; WO1995003397A1; EP0724628A4; CA2167581A1

Abstract

(57)【要約】ヒトインターロイキン１β遺伝子を有するトランスジェニックマウスを提供する。このトランスジェニックマウスはアルツハイマー病その他の認識障害に作用する化合物の性能評価に用い得る。

Description

【発明の詳細な説明】発明の名称認識障害に関するトランスジェニック動物モデル発明の分野本発明は、トランスジェニックマウスの脳組織におけるヒトインターロイキン１βの発現に係わる。発明の背景アルツハイマー病（ＡＤ）は６５歳より高齢の人々が罹患する神経障害である。この疾患の発生率は、６０〜６５歳での１％未満から７５歳では５％へと上昇し、８５歳では４７％の高率に達する。その結果、６５歳より高齢の人々における痴呆の全症例の６０〜８０％はＡＤに起因する。患者は認識機能及び記憶に障害を受ける。ＡＤは急速に進行して死亡前、通常発症から５〜１０年で精神的及び肉体的不能状態をもたらす。現在、有効なＡＤ治療法は存在せず、この疾患の生化学的基礎も曖昧なままである。ＡＤそれ自体は晩年に、発症の近づいた顕著な徴候もなく発症する。ＡＤの進展にはウイルス、環境及び免疫要因の諸説が有る。ＡＤ（散発性疾患）が晩年に発症するのに対して、家族性ＡＤ（ＦＡＤ）は疾患のより急速な進行と生涯のより早い段階（早ければ３５歳）での発症とを特徴とする。ＡＤ関連痴呆はＡＤ脳の顕著な萎縮と相関し、この萎縮は新皮質、海馬、ｅｎｔｏｒｈｉｎａｌ皮質を含むパラ海馬構造物、嗅皮質及び嗅球、コリン作動性前脳基底神経節、背側セロトニン作動性核及び青斑ノルアドレナリン作動性（ｎｏｒａｄｒｅｇｅｒｇｉｃ）核を含めた脳全体に広がる。ＡＤの原因となる遺伝子を同定せんとする遺伝学的分析によって、アミロイド前駆タンパク質（ＡＰＰ）遺伝子に関連する欠陥への洞察が生まれた。加えて、生化学的傍証もニューロンで合成されるＡＰＰの関与を示唆する。ＡＤ患者の脳では、変性ニューロンに関連して異常な構造物が同定され得る。ＡＰＰのタンパク質分解開裂物であるβＡ４ペプチドを含むそれらの構造物は神経炎斑（ｎｅｕｒｉｔｉｃｐｌａｑｕｅｓ；ＮＰ）と呼称され、新皮質及び海馬内に位置する。ＮＰは数種のタンパク質を含む。最も豊富な成分は、ＡＰＰからタンパク質分解により開裂したアミノ酸４２個以下のβＡ４ペプチドである。βＡ４の存在は重要であり、このペプチドのｉｎｖｉｔｒｏでの潜在的神経毒作用が幾つかの報告に述べられている。ＡＰＰは幾つかの組織において発現される膜透過タンパク質である。ＡＰＰｍＲＮＡが別様にスプライシングされることによって数種のタンパク質が生じる。ＡＰＰの主要形態はＡＰＰ７５１、ＡＰＰ７７０及びＡＰＰ６９５として知られている。ＡＰＰ７５１及び７７０はｋｕｎｉｔｚプロテアーゼ阻害ドメインとして知られる５６アミノ酸挿入部をコードし、一方ＡＰＰ６９５はｋｕｎｉｔｚドメインを欠いている。ＡＰＰプロセッシングは広く研究されている。ＡＰＰはアミノ酸位６６９（βＡ４のアミノ酸１６に相当する、即ちβＡ４産生を妨げるセクレターゼ開裂部位）において開裂し得、また（セクレターゼ開裂を阻害し得るｋｕｎｉｔｚプロテアーゼ阻害ドメインをコードする）ネキシンIIとして知られる大型分泌ペプチドを産生する。β Ａ４ペプチドの放出はアミノ酸６５３及び６９５における開裂によって実現し得る。この開裂はリソソーム内在隔室内で生起し得る。上述のようなＡＰＰの突然変異はＡＰＰプロセッシングの効率に影響し、即ちＡＰＰタンパク質の異常分解の傾向を増すと考えられる。 “インターロイキン１（ＩＬ−１）”は、一群を成す３種のサイトカインＩＬ−１α、ＩＬ−１β及びＩＬ−１ｒａを代表する呼称である。ＩＬ−１α及びＩＬ−１βは主にマクロファージによって産生され、通常慢性及び急性炎症の主要動因と認められる。ＩＬ−１αとＩＬ−１βとは遺伝子産物として遠い関連性しか有しないが、これらの特性（大きさ、立体形状、生物活性、産生細胞）のスペクトルは完全に一致する。ＩＬ−１レセプターアンタゴニスト（ＩＬ−１ｒａ）は、Ｉ型ＩＬ−１レセプターに結合してこれをブロックし、即ちＩＬ−１α及びＩＬ−１βの作用を阻害するＩＬ様分子である。ＩＬ−１は幾つかの系統の理由によってＡＤその他の神経障害に関係付けられる。第一に、ＡＤでは変性ニューロンの周囲にマクロファージ浸潤物が見出される。実験的にもたらしたニューロン変性では、マクロファージは細胞変性域に補充される最初の細胞である。第二に、興奮性アミノ酸投与または限局性永久脳虚血によるニューロン変性の実験モデルにおいてＩＬ−１ｒａを投与すると変性が減少する。第三に、歩行障害その他の神経障害体質を示す突然変異体マウスは、刺激を受けるとＩＬ−１を過剰産生するマクロファージを有する。第四に、ＡＤ脳組織にはＩＬ− １ｍＲＮＡ及びＩＬ−１活性が見出される。第五に、ＡＰＰ合成はサイトカイン、特にＩＬ−６によって誘起され得る。最後に、頭部損傷及び後の炎症はＡＤの早期発症を招きかねない。ＡＤではＡＰＰが大量に産生されることから、ＩＬ −１／ＩＬ−６媒介急性相応答がＡＤ時のアミロイド生成の原因であるかもしれないとの提言がなされている。アルツハイマー病でのヒトインターロイキン１β（ｈＩＬ−１β）の役割の実験研究は、適当な動物モデルが存在すれば容易となろう。従って本発明は、アミロイドタンパク質前駆体（ＡＰＰ）の形成を刺激するべくヒトインターロイキン１β（ＩＬ−１β）発現を増加させ得るマウスモデルの提供を目的とする。本発明はまた、ｈＩＬ−１β遺伝子に脳特異的プロモーターを連結し、それによってＩＬ−１β遺伝子の脳内のみでの発現を可能にしたマウスモデルの提供も目的とする。本発明のトランスジェニックマウスは、ＡＰＰ産生に影響する化合物、及びＩＬ−１β媒介ニューロン機能不全に影響する化合物の探索にも有用である。発明の概要ヒトインターロイキン１βを発現させるトランスジェニックマウスを提供する。本発明のトランスジェニックマウスはアルツハイマー病及び中枢神経系関連障害の研究に用い得る。発明の詳細な説明本明細書では“動物”という語を、ヒト以外のあらゆる脊椎動物を包含させて用いる。この語はまた、胚及び胎児段階を含めたあらゆる発生段階に有る個別動物を包含する。“トランスジェニック動物”とは、マイクロインジェクションや組み換えウイルスへの感染といった細胞下レベルでの計画的遺伝子操作によって直接または間接に受け取った遺伝情報を担う１種以上の細胞を有する任意の動物のことである。上記のように導入されるＤＮＡ分子は染色体中に組み込まれ得、または該ＤＮＡ分子は染色体外複製ＤＮＡであり得る。“生殖系列トランスジェニック動物”という語は、遺伝情報が生殖系列に導入され、その結果当該情報を子孫に伝える能力を有するようになったトランスジェニック動物を意味する。このような動物の子孫が実際に情報の一部または全部を有すれば、その子孫もトランスジェニック動物である。情報は、レシピエントが属する動物種にとって外来であっても、レシピエントの特定個体にとってのみ外来であっても、あるいはまたレシピエントが既に有する遺伝情報であってもよい。最後の事例の場合、導入された遺伝子は天然遺伝子とは別様に発現し得る。遺伝子は、当該遺伝子の供給源ゲノムからの単離、単離したｍＲＮＡ鋳型からのｃＤＮＡ調製、指向性合成、またはこれらの組み合わせによって取得可能である。発現させるべき構造遺伝子はプロモーターに機能的に結合させなければならない。プロモーター／調節配列は、遺伝子の発現を増加させ、減少させ、調節し、または或る一定の組織もしくは発生段階に特定するのに用い得る。プロモーターは天然プロモーターでなくともよい。本発明の好ましい一形態ではヒトＴｈｙ− １（ｈＴｈｙ−１）プロモーターを用いる。ｈＴｈｙ−１プロモーターは所期の遺伝子、ここではヒトインターロイキン１βの主として脳内での発現を優先的に可能にする（Ｊ．Ｇｏｒｄｏｎ等，Ｃｅｌｌ５０，ｐｐ．４４５−４５２，１９８７）。本発明の“ヒト以外のトランスジェニック動物”は、ヒト以外の動物の生殖系列に“トランスジーン”を導入することによって作製する。細胞へのＤＮＡ導入を可能にする方法は通常当業者に使用可能であり、かつ良く知られている。しかし、特定種類のトランスジェニック動物の発生には実験が必要である。トランスジーンの導入には様々な発生段階の胚標的細胞を用い得る。胚標的細胞の発生段階に応じて異なるトランスジーン導入方法を用いる。通常、接合体はマイクロインジェクションの最良の標的である。マウスでは雄性前核が直径で約２０μｍの大きさに達すれば、１〜２ｐｌのＤＮＡ溶液の再生性（ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｌｅ）注入が可能になる。遺伝子導入の標的として接合体を用いることには、大抵の場合注入されたＤＮＡは最初の卵割前に宿主遺伝子中に組み込まれるという大きい利点が有る（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８２，ｐｐ．４４３８−４４４２，１９８５）。従って、非ヒトトランスジェニック動物の細胞のほぼ総てが組み込まれたトランスジーンを有することになる。このことは通常、トランスジーンが創始者（ｆｏｕｎｄｅｒ）から子孫へ効率的に伝えられるという結果ももたらし、なぜなら生殖細胞の５０％がトランスジーンを保有するからである。接合体へのマイクロインジェクションは、本発明の実施において好ましいトランスジーン組み込み方法である。ヒト以外の動物へのトランスジーン導入にはレトロウイルス感染も用い得る。発生中のヒト以外の胚をｉｎｖｉｔｒｏで培養して胚盤胞段階とし得る。この時期の間、割球がレトロウイルス感染の標的となり得る（Ｒ．Ｊａｅｎｉｃｈ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７３，ｐｐ．１２６０−１２６４，１９７６）。透明帯を除去する酵素処理を行なえば割球の効率的な感染が実現する（Ｈｏｇａｎ等， “ＭａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇｔｈｅＭｏｕｓｅＥｍｂｒｙｏ，” ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８６）。トランスジーンの導入に用いるウイルスベクター系は典型的には、トランスジーンを保持する複製不全（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ）レトロウイルスである（Ｊａｈｎｅｒ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８２，ｐｐ．６９２７−６９３１，１９８５；ＶａｎｄｅｒＰｕｔｔｅｎ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８２，ｐｐ．６１４８−６１５２，１９８５）。割球をウイルス産生細胞の単層上で培養することによってトランスフェクションが容易かつ効率的に行える（ＶａｎｄｅｒＰｕｔｔｅｎ，上掲誌；Ｓｔｅｗａｒｔ等，ＥＭＢＯＪ．６，ｐｐ．３８３−３８８，１９８７）。あるいは他の場合には、感染はより後の段階に行ない得る。ウイルスまたはウイルス産生細胞は割腔内に注入し得る（Ｊａｈｎｅｒ等，Ｎａｔｕｒｅ２９８，ｐｐ．６２３−６２８，１９８２）。創始者動物のほとんどはトランスジーンに関してモザイクであり、なぜなら組み込みは非ヒトトランスジェニック動物を構成した細胞のサブセットにおいてしか生起しないからである。更に、創始者動物はトランスジーンのレトロウイルス挿入部をゲノム中の様々な位置に有し得、それらの位置は通常子孫において分離する。加えて、ｍｉｄｇｅｓｔａｔｉｏｎ胚の子宮内レトロウイルス感染によって低効率ながらトランスジーンを生殖系列に導入することも可能である（Ｊａｈｎｅｒ等，上掲誌，１９８２）。トランスジーン導入のための第三の種類の標的細胞は胚幹細胞（ＥＳ）である。ＥＳ細胞は、ｉｎｖｉｔｒｏで培養した着床前の胚から取得する（Ｍ．Ｊ．Ｅｖａｎｓ等，Ｎａｔｕｒｅ２９２，ｐｐ．１５４−１５６，１９８１；Ａ．Ｂｒａｄｌｅｙ等，Ｎａｔｕｒｅ３０９，ｐｐ．２５５−２５８，１９８４；Ｇｏｓｓｌｅｒ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８３，ｐｐ．９０６５−９０６９，１９８６；及びＲｏｂｅｒｔｓｏｎ等，Ｎａｔｕｒｅ３２２，ｐｐ．４４５−４４８，１９８６）。ＥＳ細胞内へのトランスジーン導入は、ＤＮＡトランスフェクションまたはレトロウイルス媒介形質導入によって効率的に行なうことができる。その後、得られた形質転換ＥＳ細胞をヒト以外の動物に由来する胚盤胞と組み合わせ得る。ＥＳ細胞は胚を転移増殖させ、得られるキメラ動物の生殖系列に寄与する（Ｒ．Ｊａｅｎｉｓｃｈ，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４０，ｐｐ．１４６８−１４７４，１９８８参照）。導入したＤＮＡの存在及びその発現を評価する方法は当業者に容易に使用可能であり、かつ良く知られている。そのような方法には、外因性ＤＮＡポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を検出するＤＮＡハイブリダイゼーション、ＩＬ−１βタンパク質を検出し、アルツハイマー病関連病態の出現を検出するポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）及びウェスタンブロットが非限定的に含まれる。本明細書中に用いた“トランスジーン”という語は、後述の方法などでヒトの手によってヒト以外の動物に導入されたＤＮＡ配列を意味する。本発明のトランスジーンには、同族（ｃｏｇｎａｔｅ）内因性対立遺伝子を抑制し得るＤＮＡ配列が含まれる。ヒトインターロイキン１βをトランスジェニック動物において発現させる試みはほとんど成功していない。これには幾つか理由が考えられる。第一に、ＩＬ− １βは比較的低濃度で有毒である。第二に、ＩＬ−１βは胚の発生及び分娩に関与する。第三に、ＩＬ−１βは特定の機構によって特定種類の細胞（例えばマクロファージ）から放出されるようにプロセッシングされる前駆体として産生される。ＩＬ−１βの過剰発現に関連する生理的問題を回避するべく、標的とされる発現系が開発された。ヒトインターロイキン１βをコードする遺伝子がヒトＴｈｙ −１プロモーターの下流に配置された。このｈＴｈｙ−１プロモーターはマウス脳組織を特異的に標的とする。人工のＴｈｙ１−ＩＬ−１β遺伝子を持ったトランスジェニックマウスは脳組織においてｈＩＬ−１βを発現させる。ＩＬ−１βの過剰発現はアミロイド前駆体タンパク質の合成及びプロセッシングを増加させ得る。潜在的なアルツハイマー病治療化合物は、上記のようなトランスジェニックマウスにおいてアミロイドタンパク質前駆体（ＡＰＰ）の産生をブロックする能力を測定することによって検出し得る。検出した化合物を公知方法に従って配合して、医薬に許容可能な組成物とする。この組成物は患者に、様々な標準的手段で投与可能である。以下の実施例は一例として示してあり、本発明の範囲の限定と解釈されるべきではない。実施例１プラスミドｐ１２８４９−５７−２の構築ｐＢＳＨＴ１は、ｐＢＳＶ中にヒトＴｈｙ−１遺伝子（ｈＴｈｙ−１）の８ｋｂＥｃｏＲＩ断片を有する（ＶａｎＲｉｊｓ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８２，ｐｐ．５８３２−５８３５，１９８５）。ｈＴｈｙ−１プロモーター及びＡＴＧ翻訳開始コドンを有するｐＢＳＨＴ１の３．７ｋｂＥｃｏＲＩ−ＢｇｌII 断片をプラスミドｐＴＺ１８ｕのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ部位にクローニングし、得られたプラスミドをｐＨＺ０２０と名付けた。ＡＴＧ開始コドンを有するｐＢＳＨＴ１の１．６ｋｂＢａｍＨＩ−ＢｇｌII断片をｐＴＺ１８ｕのＢａｍＨＩ部位にクローニングした（ｐＨＺ０２１ａ）。鋳型としてｐＨＺ０２１ａを用い、かつプライマーとして（ｐＴＺ１８ｕバックボーン中の）オリゴＴ７と（ＡＴＧ開始コドンの位置に有る）オリゴｏＨＺ００２とを用いてＰＣＲ増幅を行ない、１．３ｋｂの生成物を得た。Ｔ７プライマーの配列はである。ｏＨＺ００２の配列はである。ｏＨＺ００２ヌクレオチドはＡＴＧコドンを破壊して、ＰＣＲ生成物中に次のようなポリリンカークローニング部位を導入した。下流部位のみでの切断物が得られるように、ｐＨＺ０２０にＮｃｏＩ部分消化を行なった。その後、ＸｂａＩ完全消化を行なって、ＡＴＧコドンを有するＮｃｏＩ−ＸｂａＩ断片を切り取った。１．３ｋｂＰＣＲ生成物をＮｃｏＩ−ＸｂａＩで消化し、ＮｃｏＩ−ＸｂａＩで消化したｐＨＺ０２０に挿入した（ｐＨＺ０２２）。ｐＳＶ２ｎｅｏのＳＶ４０小型Ｔイントロンの上流に位置するＳｍａＩ部位にＢｇｌIIリンカーｄ（ＣＡＧＡＴＣＴＧ）を挿入した（ｐＨＺ０２３）。（Ｐ．Ｊ．Ｓｏｕｔｈｅｒｎ及びＰ．Ｊ．Ｂｅｒｇ，Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１，ｐ．３２７，１９８２）。ｐＨＺ０２３のＢｇｌII及びＢａｍＨＩ消化によって１．０ｋｂＳＶ４０小型Ｔイントロン及びポリＡを単離し、これをＢｇｌIIで消化したｐＨＺ０２２に連結した。得られたプラスミド（ｐＨＺ０２４）は２種の調節要素、即ち脳特異的発現のためのヒトＴｈｙ−１プロモーターと、トランスジーンの適正発現のためのＳＶ４０小型Ｔイントロン及びポリＡ配列とを有する。加えて、ｈＴｈｙ−１遺伝子のＡＴＧ開始コドンを突然変異させて、ｈＴｈｙ −１プロモーターの下流にポリリンカークローニング部位を導入した。この導入はトランスジェニックマウスにおいて発現させるべき遺伝子の挿入を可能にした。プラスミドｐＨＺ０２４を、ｈＴｈｙ−１プロモーター配列とＳＶ４０小型Ｔ及びポリＡ配列との間に位置するポリリンカー中を切断するＣｌａＩ及びＢｇｌ IIで消化した。６．３ｋｂＣｌａＩ−ＢｇｌIIベクター断片をゲル単離した。２種の合成オリゴデオキシヌクレオチドをアニーリングして、次の構造を有する８６ｂｐリンカーを形成した。８６塩基対（ｂｐ）リンカーはＣｌａＩ粘着末端と、ｈＴｈｙ−１遺伝子に由来する５ｂｐの翻訳されない先導配列（Ｓｅｋｉ等，ＰＮＡＳ８２，ｐｐ．６６５７−６６６１，１９８５）と、ＡＴＧコドン（下線部）と、１７ｂｐのラットＩＬ−１レセプターアンタゴニスト（ＩＬ−１ｒａ）シグナルペプチド配列と、マウスに由来する残り５８ｂｐのＩＬ−１ｒａシグナルペプチド配列とを有する。キメララット／マウスのＩＬ−１ｒａシグナルペプチド配列を用いたが、なぜならマウス配列の最初の１７ｂｐは不明だったからである。成熟形態のｈＩＬ−１βをコードする遺伝子を、ＰＣＲを用いて構築した。ＰＣＲ用の鋳型ＤＮＡはプラスミドｐＧＥＭ−Ｂｌｕｅ／ヒトＩＬ−１β （ＡｎｄｒｅｗＨｏｗａｒｄ，ＭｅｒｃｋＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｒａｈｗａｙ，ＮＪからの贈与）とした。このプラスミドは成熟形態のｈＩＬ−１βをコードするｃＤＮＡを有する。ｐＧＥＭ−Ｂｌｕｅ／ヒトＩＬ−１βは、ｐＫＫ２２３−３／ｈＩＬ−１β（Ｍ．Ｊ．Ｔｏｃｃｉ等，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ１３８，ｐｐ．１１０９−１１１４，１９８７）由来のＥｃｏＲＩ−ＡｃｃＩＩＬ−１β ＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩ−ＡｃｃＩで消化したｐＧＥＭ−Ｂｌｕｅベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｉｎｃ．）中にサブクローニングすることによって構築された。ｐＫＫ２２３−３／ｈＩＬ−１βをＰＣＲ用の鋳型ＤＮＡとしても用い得ることは、当業者には明らかである。ＰＣＲプライマーは次の配列を有した。ＰＣＲ後、０．５ｋｂｈＩＬ−１β遺伝子断片にＴ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端を形成し、これを（終結コドンの後を切断する）ＢｇｌIIで消化し、ゲル単離し、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化した。６．３ｋｂＣｌａＩ−ＢｇｌII ｐＨＺ０２４ベクター断片を８６ｂｐＩＬ−１ｒａＣｌａ−平滑末端リンカー及び０．５ｋｂ平滑末端−ＢｇｌII成熟ｈＩＬ−１β遺伝子と三者連結式に連結した。得られたプラスミドｐ１２８４９ −５７−２を、ジデオキシヌクレオチド配列決定法を用いて配列決定した。マイクロインジェクション用のＤＮＡカセットを調製するべく、ｐ１２８４９ −５７−２の大量ＣｓＣｌプラスミド調製物を調製した。上記プラスミドをＥｃｏＲＩ及びＸｂａＩで消化し、１０ｎｇ／ｍβの臭化エチジウムを含有する１％低融点アガロースゲル中での電気泳動に掛けた。ＤＮＡを短波ＵＶ光への最小限の曝露によって可視化し、５．１ｋｂＤＮＡバンドを切り取り、６５〜７０℃で融解させ、フェノール／クロロホルムで３回、クロロホルムで１回抽出し、エタノールで０．２ＭＮａＣｌ中に沈澱させた。７０％エタノールで数回洗浄後、ＤＮＡを１０ｍＭトリス、０．２５ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ７．５中に再懸濁させ、予め濯いだ０．２μｍ酢酸セルロースフィルターで濾過した。ｈＴｈｙ−１プロモーターと、ラット／マウスＩＬ−１ｒａシグナル配列と、成熟ｈＩＬ−１β遺伝子と、ＳＶ４０イントロン及びポリＡとを有する５．１ｋｂの線状ＤＮＡ断片１２８４９−１１２−２を後でマイクロインジェクションに用いた。宿主大腸菌に導入したプラスミドｐ１２８４９−５７−２の標本を、ブダペスト条約に従い付でＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，１２３０１ＰａｒｋｌａｗｎＤｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ２０８５２，ＵＳＡに寄託した。この標本には受託番号が付された。制限エンドヌクレアーゼ及びＤＮＡ修飾酵素は総てＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｃ．から入手した。ＤＮＡ配列決定はＳｅｑｕｅｎａｓｅ（Ｕ．Ｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｉｎｃ．）またはｄｓＤＮＡＣｙｃｌｅＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＫｉｔ（ＢＲＬ，Ｉｎｃ．）を用いて行なった。オリゴデオキシヌクレオチドはＡＢＩＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒｍｏｄｅ１＃３８１Ａで合成した。ＰＣＲはＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，Ｃｏｒｐ．に従った。実施例２ヒトＴｈｙ−１プロモーターの調節下での、ヒトＩＬ−１βを有するトランスジェニックマウスの作製ヒトＴｈｙ−１（ｈＴｈｙ−１）プロモーターによって支配されるヒトＩＬ− １βを有する実施例１のＤＮＡ構築物ｐ１２８４９−５７−２を、過剰排卵したＢ６ＳＪＬ雌から得た一細胞受精マウス胚の前核にマイクロインジェクションによって注入した。マイクロインジェクションに用いたＤＮＡの最適濃度は、マイクロインジェクションによりマウス胚に注入した遺伝子構築物の数種の稀釈液を用いる毒性試験実験から経験的に得られたＬＤ₅₀値とし、この値は７．５×１０^-9μｇであった。７．５× １０^-9μｇのＤＮＡを注入した胚を偽妊娠レシピエントマウスの輸卵管内に外科的に再移植し、そのまま出産させた。出生の３〜４週間後、約１ｃｍの尾を切り取ることによって、トランスジーンの存在を確認するＤＮＡドットブロットアッセイのための尾試料を採取した。幼体を病的症状に関して、ＰＮ１（出生後１日目）から毎日子細に観察した。剖検及び／または生検を行ない、組織研究及び発現研究用の組織標本を採集した。実施例３トランスジェニックマウスの解析ＤＮＡ解析マイクロインジェクションを行なった卵子から生じた実施例２の幼体は約４週齢で離乳する。この時点で尾の遠位端から小片（約１ｃｍ長）を取り、これをＤＮＡ解析に用いた。尾試料からゲノムＤＮＡを抽出し、ドットブロット装置を用いてＧｅｎｅＳｃｒｅｅｎＰｌｕｓ（登録商標）メンブランフィルターに適用した。フィルターを、トランスジーンの３′領域に存在するＳＶ４０配列を有する³²Ｐ標識プローブでハイブリダイズした。マウス内在ＤＮＡはこのＳＶ４０配列を有しないので、上記プローブはトランスジーンに特異的であり、マウスゲノム中の０．１コピーといった僅少量のトランスジーンが有ってもこれを検出できる。ＤＮＡドットブロット操作によって同定したトランスジェニック創始者を繁殖させて、更に行なう研究用の子孫を生産する。ＲＮＡ解析トランスジェニック動物組織を、ＲＮＡポリメラーゼ連鎖反応（ＲＮＡ−ＰＣＲ）を用いて特異的ｍＲＮＡ転写に関し解析する。解剖後、マウス組織を直ちにドライアイス上で凍結させ、−７０℃で保存する。凍結試料を液体窒素中で、予冷した乳鉢内に移し、粉砕し、ドライアイス上の管内に移す。全ＲＮＡを先に述べたように抽出する（ＲＮＡＩｓｏｌａｔｉｏｎＫｉｔ，ｐｒｏｄｕｃｔ＃２００３４５；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｉｎｃ．）。ＰＣＲ用にオリゴデオキシヌクレオチドプライマー対を合成する。オリゴヌクレオチドはエキソン中に位置するＤＮＡ配列と相補的になるよう設計する。各オリゴヌクレオチド対を１個以上のイントロンで分離し、それによってゲノムＤＮＡとｍＲＮＡとを区別する。先に述べたＲＮＡ−ＰＣＲでは１回の反応毎に１μｇの全ＲＮＡ（２６０ｎｍでの吸光度によって決定）を用いる［ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）ＲＮＡＰＣＲＫｉｔ，ｐｒｏｄｕｃｔ＃Ｎ８０８−００１７；ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒＣｅｔｕｓ，Ｃｏｒｐ．］。ＰＣＲは、１サイクル当たり次のパラメーターで３５サイクル実施する：９５℃で１分間、４８℃で２分間、７２℃で２分間。０．５μｇ／ｍｌの臭化エチジウムを含有する１．２％アガロースゲル上で適当な大きさのＤＮＡバンドを可視化する。トランスジェニック動物及びトランスジェニックでない対照動物の組織の（ＲＮＡ−ＰＣＲで決定される）相対的ｍＲＮＡレベルを決定する。ヒトＩＬ−１β ｍＲＮＡはＲＮアーゼ保護アッセイによっても検出可能である。ｍＲＮＡ単離用に、トランスジェニックマウスから脳その他の組織を得る。³² Ｐ標識アンチセンスＲＮＡを用いてｈＩＬ−１β ｍＲＮＡを、溶液ハイブリダイゼーション反応においてハイブリダイズする。得られる２本鎖分子はＲＮアーゼ消化に対して耐性であり、一方ハイブリダイズしなかったＲＮＡはＲＮアーゼ処理によって消化される。保護されたバンドは、ポリアクリルアミドゲル上で分離した後のオートラジオグラフィーによって可視化し得る。直接ハイブリダイゼーションのために、凍結脳から組織片を調製し、これをｈＩＬ−１β ｍＲＮＡに特異的な標識オリゴヌクレオチドプローブでハイブリダイズした後オートラジオグラフィーに掛ける。タンパク質測定のためには、血液、血漿、または脳組織のホモジネートをＥｎｚｙｍｅＬｉｎｋｅｄＩｍｍｕｎｏａｂｓｏｒｂａｎｔＡｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）に用いて組織のｈＩＬ−１β濃度を測定する。組織研究では、トランスジェニックマウスを剖検して脳その他の組織を得る。組織試料は典型的には、リン酸緩衝食塩液中の１０％ホルマリン中で固定する。固定した組織を切断し、スライドガラスに載せ、観察する。実施例４細胞培養本発明のトランスジェニック動物は、細胞培養用の細胞の供給源として用い得る。ＤＮＡまたはＲＮＡを直接解析することによってか、または脳組織を遺伝子が発現するタンパク質に関してアッセイすることにより、トランスジェニックマウスの脳組織をヒトインターロイキン１βの存在に関して解析する。遺伝子を有する脳組織の細胞は、当業者に良く知られた標準的な培養技術によって培養可能である。実施例５スクリーニングアッセイ本発明の動物は、ヒトインターロイキン１βまたはアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）の発現を妨げる能力に関して化合物を試験するのに用い得る。動物を当該化合物で処理し、これに並行して対照動物を処理せずに置く。処理した動物においてＩＬ−１βまたはＡＰＰの産生が比較的低いレベルになれば、試験化合物に阻害活性があることになる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者フアン・デル・プロツグ，レオナルドス・ハー・テーアメリカ合衆国、ニユージヤージー・ 07076、スコツチ・プレインス、ローウエイ・ロード・1501 (72)発明者シヤウ，アラン・アールアメリカ合衆国、ペンシルバニア・18901、ドイルズタウン、セコンドウツズ・ロード・3805 (72)発明者トルンバウアー，メイルナ・イーアメリカ合衆国、ペンシルバニア・19067、イエールデリイ、ロビン・フツド・ドライブ・318 (72)発明者チヤン，フアイアメリカ合衆国、ニユージヤージー・ 08320、エジソン、クリントン・アベニユー・２

Claims

【特許請求の範囲】１．ヒトインターロイキン１βタンパク質をコードする遺伝子を含む細胞を有するヒト以外のトランスジェニック動物。２．哺乳動物であることを特徴とする請求項１に記載の動物。３．齧歯類であることを特徴とする請求項２に記載の動物。４．マウスであることを特徴とする請求項３に記載の動物。５．ヒトインターロイキン１βをコードする遺伝子がヒトチミジン−１プロモーターの下流に位置することを特徴とする請求項１に記載の動物。６．マウスであることを特徴とする請求項５に記載の動物。７．トランスジーンがｐ１２８４９−５７−２（ＡＴＣＣ）であることを特徴とする請求項６に記載のマウス。８．請求項４に記載の動物に由来するヒトインターロイキン１β保有細胞系。９．ヒトインターロイキン１βの発現またはアミロイド前駆タンパク質発現を妨害する化合物の能力を判定する方法であって、（ａ）請求項１に記載のトランスジェニック動物を当該化合物で処理し、（ｂ）処理した動物におけるヒトインターロイキン１βまたはアミロイド前駆タンパク質の発現を測定することを含む方法。