JPH11504813A

JPH11504813A - アルカリプロテアーゼ及びその製造法

Info

Publication number: JPH11504813A
Application number: JP8533469A
Authority: JP
Inventors: ピー．スロマ，アラン; オーティループ，ヘレ; ダンブマン，クラウス; アニタアースリング，ドリト
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 1995-05-03
Filing date: 1996-05-01
Publication date: 1999-05-11
Also published as: WO1996034963A1; AU5721296A; US5622850A; US5622841A; US5650326A; EP0824592A1; US5621089A

Abstract

(57)【要約】本発明は、分子量約34kDを有し、かつバチルス種グループＩ菌株から入手できる、アルカリプロテアーゼをコードしている核酸配列を含む、単離された核酸構成体（複数）、更にはこのような構成体を有する、組換えベクター及び宿主細胞に関する。更に本発明は、このプロテアーゼを得る方法に関する。本発明は、更に前記アルカリプロテアーゼ由来のプロモーター及びシグナル配列、更にはこのプロモーター及びシグナル配列の、細菌における異種タンパク質をコードしている異種核酸配列の発現における使用法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】アルカリプロテアーゼ及びその製造法本出願は、ここに引用として含まれている、1994年10月23日に出願された、特許出願第08/325,386号の、一部継続出願である。１．技術分野本発明は、バチルス種グループＩ菌株に由来した新規アルカリプロテアーゼをコードしている核酸配列を含む単離された核酸構成体（複数）、並びにこのような構成体を含む、組換えベクター及び宿主細胞に関する。更に、本発明は、このプロテアーゼを得る方法に関する。本発明は、更にこのようなアルカリプロテアーゼ由来のプロモーター及びシグナル配列に、並びにこのようなプロモーター及びシグナル配列を使用し、細菌の異種タンパク質をコードしている異種核酸配列を発現する方法にも関する。２．発明の背景界面活性酵素は20年以上も注目されていて、かつ現在、世界中で、粉末及び液体の両方の洗剤における通常の界面活性成分としてよく確立されている。最近の洗濯温度が低くなる傾向に伴い、界面活性酵素の消費量が増加している。洗濯配合物において使用される酵素は、プロテアーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、更には他の酵素類、もしくはこれらの混合物を含む。市販されている最も重要なものは、プロテアーゼである。界面活性プロテアーゼは、天然に発見されたプロテアーゼを単離し、その後洗剤配合中で試験することによって、開発されてきた。ほとんどの界面活性プロテアーゼは、バチルス属の一員から得られている。現在、新しい型のプロテアーゼが、市場に出回り始め、様々な特定の条件において、より良い費用／性能比をもたらす可能性を示している。市販のプロテアーゼ製品の例は、ALCALASE（商標）、ESPERASE（商標）及びSA VINASE（商標）であり、全てNovo Nordisk A/S社（デンマーク）から提供されている。他の市販のこれら及び類似の酵素製品は、洗剤溶液、すなわちpH８〜11の範囲及び金属イオン封鎖剤、界面活性剤、及びホウ酸ナトリウムのような漂白剤の存在下において活性がある。ALCALASE（商標）プロテアーゼは、バチルス・リチェニフォルミス（Bacillus licheniformis）種の菌株によって製造される。ES PERASE（商標）及びSAVINASE（商標）プロテアーゼは、好アルカリ性バチルス菌株の培養によって得られる。基質、至適pH及び／又は温度の独自の範囲を持つ新規アルカリプロテアーゼを提供することは、利益となるであろう。更に新規プロテアーゼを単離し、もしくはプロテアーゼを高収率で製造し、その結果これらのプロテアーゼがin vitroで使用できることは利益であろう。例えば保存及び非保存領域及び活性部位、従って酵素の性能を向上し、かつ組換えDNA 技術において使用するプロテアーゼを製造することができるように突然変異誘発に適した位置を決定するために、これらのプロテアーゼのアミノ酸及び／又は核酸配列を決定することは利益であろう。全プロテアーゼ遺伝子の核酸配列を決定することによって、プロモーター及びシグナル配列の位置を決定することができる。このような配列は、異種ポリペプチドの発現において使用することができる。３．発明の要約本発明は、 SDS−PAGEによって決定された見かけの分子量が約34kD，pIがおよそ9.3 、約25℃における至適pHが約９〜11の範囲であり（基質はカゼイン）、pH 約9.5 における至適温度が約40〜55℃の範囲であり（基質はカゼイン）、かつバチルス種のグループＩ菌株から得ることができるような、プロテアーゼをコードしている核酸配列を有する、核酸構成体に関する。バチルス種グループＩとは、Ｂ．サブチリス(B ．subtilis)及びＢ．フィルムス(B ．firmus)とほとんど同じである。特定の実施態様において、本発明のプロテアーゼは、PD498 菌株、又はバチルス種PD498 由来のプロテアーゼのものと同じもしくは一部同じ免疫化学的特性を有するプロテアーゼをコードしている遺伝子を有する、別の宿主生物から得る又は由来することができる。一実施形態において、この核酸構成体は、配列番号：１に記されたアミノ酸配列を有するプロテアーゼをコードしている核酸配列を含み、これは配列番号：２の、そのプレプロ型PD498 アルカリプロテアーゼの配列を示し、これは配列番号：３の、プロ型アルカリプロテアーゼを示し、これはその成熟型PD498 アルカリプロテアーゼを示す。別の実施形態において、この核酸構成体は、配列番号：４に記された核酸配列を含み、これはPD498 アルカリプロテアーゼ遺伝子の全核酸配列を示し、これは配列番号：５のコード領域に加え、５’及び３’のフランキング領域を含み、これは配列番号：６のプレプロ型PD498 アルカリプロテアーゼをコードしている核酸配列を示し、これは配列番号：７のプロ型PD498 アルカリプロテアーゼをコードしている核酸配列を示し、これは成熟型PD498 アルカリプロテアーゼをコードしているDNA 配列を示す。前述の新規プロテアーゼの製造を促進するために、本発明は、ベクター、及びクレームされている核酸構成体を含む組換え宿主細胞も提供し、これらのベクター、構成体及び組換え宿主細胞は、このプロテアーゼの組換え製造において有用である。本発明のプロテアーゼの組換え製造は、本発明の核酸構成体又はベクター、もしくはそれらの子孫によって、このプロテアーゼの発現に適した条件下で、形質転換又はトランスフェクションされた宿主細胞を培養し、かつ培養物からプロテアーゼを回収することによって、達成される。本発明は、更に前述の新規プロテアーゼをコードしている遺伝子に由来するプロモーター配列、又はこのプロモーターが配列番号：８に記された配列を有するような配列と実質的に同じプロモーター活性を示すそれらの断片にも関する。このプロモーターは、このプロモーター配列、及びこの異種DNA 配列のベクターへの挿入部位を含むベクターの構築において使用することができる。用語“異種” とは、宿主細胞によって自然に発現されないDNA を含むことを意味する。更にこのプロモーターは、（ａ）細菌細胞、好ましくはグラム陽性菌を、このベクターで形質転換する工程；（ｂ）工程（ａ）の形質転換された細胞を培養する工程；及び（ｃ）工程（ｂ）の形質転換された細胞から異種ポリペプチドを回収する工程を含む、異種タンパク質の製造法において使用することができる。本発明は、更に、前述の新規プロテアーゼをコードしている遺伝子に由来するシグナル配列、又はそのシグナル配列が配列番号：９のアミノ酸配列を有するような配列と実質的に同じシグナル活性を有するそれらの断片にも関している。このシグナル配列は、配列番号：10に示されたDNA 配列によって、コードされ得る。このシグナル配列は、（ａ）前記シグナル配列；（ｂ）このシグナル配列の上流側の、プロモーター配列、及びリボソーム結合部位配列であって、前記シグナル配列が前記プロモーターの制御下であるもの；及び（ｃ）このシグナル配列の下流側の、前記シグナル配列と同じリーディングフレームの、異種DNA 配列の前記ベクターへの挿入部位を含むベクターの構築において、使用することができる。更にこのシグナル配列は、（ａ）細菌細胞、好ましくはグラム陽性菌の、前記ベクターによる形質転換工程；（ｂ）工程（ａ）の形質転換された細胞を培養する工程；及び（ｃ）工程（ｂ）の形質転換された細胞から異種ポリペプチドを回収する工程を含む、異種タンパク質の製造に使用することができる。このプロテアーゼは、洗濯加工において使用することができ、従って洗剤添加物及び／又は組成物に配合することができる。４．図面の簡単な説明本発明は、下記に説明した添付図面を参照することによって、より詳細に説明される：図１は、基質として２％カゼインを使用し、pH9.5 で、バッファー＋0.1 ％ST PP（トリポリリン酸ナトリウム）をバッファーとする、温度及びPD498 アルカリプロテアーゼのタンパク質分解活性の関係を示す；図２は、基質として１％カゼインを使用し、温度25℃で測定した、pH及びPD49 8 アルカリプロテアーゼのタンパク質分解活性の関係を示す；図３Ａ，３Ｂ及び３Ｃは、PD498 プロテアーゼの完全なアミノ酸及び核酸配列に加え、関連する上流及び下流のヌクレオチド配列を示す；図４は、PD498 プロテアーゼの構造を示す；図５は、プロモーター融合の構築を示す；図６は、プラスミドp118−498promlの略図を示す；図７は、pHP13ampの略図を示す；図８は、pLip３の略図を示す；図９は、p498−８の構築を示す；図10は、pMHan37 の略図を示す；図11は、PD498 −リポラーゼ融合の略図を示す。５．発明の詳細な説明５．１．プロテアーゼの単離５．１．１．微生物アルカリプロテアーゼを産生することができる微生物は、土壌試料から単離される。この微生物は、バチルス属グループＩに属する、好気性、胞子形成細菌である。好ましい実施態様において、形態学的には、直径 0.7〜0.9 ミクロン、及び長さ２〜３ミクロンの自動性杆体として表すことができる。胞子は、円形から楕円形であり、胞子嚢の次端から末端へと、わずかに膨潤している。増殖の至適温度は、25〜37℃であり、かつ増殖の至適pHは７〜９の範囲である。pH9.7 及び50℃ では、増殖しない。この微生物は、栄養寒天斜面培地において、円形及び滑面の黄色のコロニーを形成するが、この寒天への色素の拡散は認められない。特定の具体例において、この微生物は、バチルス種PD498 であり、NCIMB へブダペスト条約に基づき寄託されている(寄託番号は40484)。５．１．２．微生物の培養前述のアルカリプロテアーゼを産生する微生物は、他の必須栄養素と共に同化可能な炭素及び窒素を含有する栄養培地において、好気性の条件下で、培養することができ、この培地は、当該技術分野において公知の原理に従って構成される。適当な炭素源は、ショ糖、グルコース及びデンプンのような炭水化物、又は殻粒、麦芽、コメ及びモロコシのような炭水化物含有物質である。この培地中に含まれる炭水化物濃度は、例えば約25％を上限とし、かつ約１〜５％を下限として、大きく変動することができるが、通常は約８〜10％が適し、この百分率は、グルコース等量として算出される。前述の栄養培地中の窒素源は、無機及び／又は有機性のものであってよい。適した無機窒素源は、硝酸塩及びアンモニウム塩である。有機窒素源の中でかなりの数が、一般に細菌の培養に関連した発酵工程において使用される。詳細な例は、ダイズ種子粉、綿実粉、ピーナッツ粉、カゼイン、トウモロコシ、トウモロコシ浸漬夜、酵母抽出物、尿素、及びアルブミンである。更にこの栄養培地は、通常の微量元素も含有しなければならない。この微生物は、バチルス種の菌株である。このバチルス種は、わずかに好アルカリ性である。従って、培養は、わずかにアルカリ性のpH値で行われることが好ましく、これは、増殖培地の滅菌後に、pH約9.0 の炭酸水素ナトリウムのような適当なバッファーを添加することによって得ることができる。タンク発酵槽における培養のためには、人工的曝気が必要である。曝気速度は、通常のタンク発酵において使用されるものと同じである。発酵後、液体プロテアーゼ濃縮物は、このブロスから粗物質を除去し、かつ望ましい場合は、このブロスを低温蒸発又は限外ろ過により濃縮することによって産生することができる。最後に、この濃縮物に、保存剤を添加する。固形プロテアーゼ調製品は、精製及び／又は濃縮したブロスから、Na₂SO₄のような塩、もしくはエタノール又はアセトンのような水混和性溶媒で沈殿することによって調製することができる。噴霧乾燥のような適当な乾燥法による、ブロス中の水の除去も、用いることができる。５．１．３．タンパク質分解活性のアッセイタンパク質分解活性は、基質としてカゼインを用いて、測定することができる。１カゼインプロテアーゼ単位(CPU)は、標準的条件、すなわち25℃及びpH約9.5 で約30分間インキュベーションした場合の、１分間に第一級アミノ基約１μＭを遊離するプロテアーゼ量（セリン標準品との比較によって測定）と定義される。このタンパク質分解活性は、同じくこのプロテアーゼによる、スクシニル-Ala -Ala-Pro-Leu-p- ニトロアニリドの特異的加水分解の測定によって決定される。この基質は、最初は例えばDMSO中に溶解し、その後pH約9.45、約 0.035Ｍのホウ酸バッファー中で、約50倍に希釈される。プロテアーゼ試料は全て、前述のホウ酸バッファー中で、約５〜10倍に希釈される。この基質溶液及び試料を同体積、 ELISA リーダープレートのウェル中で混合し、かつ25℃で、約 405nmで測定される。全ての試料の活性及び濃度は、それぞれ、標準プロテアーゼ溶液の活性及び濃度に対し標準化される。５．２．プロテアーゼ前記プロテアーゼは、下記の特性を有す。５．２．１物理−化学的特性本発明のプロテアーゼは、 SDS−PAGEによって測定した場合、見かけの分子量約34kDを有す。約9.1 のpIが、LKB Amopholine（登録商標）PAG プレート上の等電点電気泳動法によって測定される。このプロテアーゼ活性は、PMSF、セリンプロテイナーゼ阻害剤によって阻害される。EDTA及びダイズ種子−プロテアーゼ阻害剤は、このプロテアーゼ活性には影響を及ぼさない。温度−活性の関係を、図１に示した。この活性は、 0.1％のトリポリリン酸ナトリウム（STPP、市販の多くの洗剤中の通常の成分）の存在（白四角）及び非存在下（黒四角）で、基質として２％カゼイン、pH約9.5 で測定される。前述のタンパク質分解活性のアッセイが、インキュベーション温度を、約15 ℃から約70℃に間隔を置いて変動するように変更して使用される。この図から、このプロテアーゼは、約15℃から約70℃で、タンパク質分解活性を有し、かつ至適温度は約40〜45℃の範囲であることが明らかである。 pHへの活性の依存性は、pH約６〜11の範囲のあらかじめ決定されたpH値に調節されたバッファーを用いて、同じ方法で測定される。この結果は、図２に示す。この図から、このプロテアーゼが、pH約６を下限とし、pH約11を上限とするような、非常に広範なpH範囲で、タンパク質分解活性を有し、見かけの至適pHが、pH 約９〜11であることが明らかである。更に、本発明のプロテアーゼが、欧州型及び米国型洗剤で測定したところ、洗濯条件下、約25℃で、約60分間、安定であることがわかっている。５．２．２．免疫化学的特性前記プロテアーゼは、バチルス種PD498，NCIMB No．40484に由来するプロテアーゼの特性と、実質的に同等、もしくは少なくとも部分的に同等の免疫化学的特性を有す。免疫化学的特性は、交差反応同定試験によって免疫学的に測定することができる。この同定試験は、周知のオクタロニー二重免疫拡散法、又はN.H.Axelsen のタンデム交差免疫電気泳動法（ゲル内免疫沈降法のハンドブック；Blackwell Sc inetific Publications(1983)、第５及び14章に記載）によって実行することができる。用語“抗原同一性”及び“部分的抗原同一性”は、前述の本の第５，９及び20章に記載されている。単一特異性抗血清は、前述の方法に従って、本発明の精製したプロテアーゼで免疫感作したウサギから製造される。この免疫原は、フロイントのアジュバントと混合され、かつ２週毎にウサギの皮下に注射される。抗血清を、全部で８週の免疫感作期間以降に得、これから、免疫グロブリンが、前述のN.H.Axelsen の方法で調製される。オクタロニー二重免疫拡散法試験は、本発明のプロテアーゼ、及び公知のバチルス種由来のアルカリセリンプロテアーゼ、例えばALCALASE（商標）、SAVINASE （商標）、ESPERASE（商標）、ズブチリシンNovo（Novo Nordisk，A/S 社（デンマーク）から入手）及びKAZUSASE（商標）（昭和電工社（日本）から入手）の間で、交差反応が無いことを示している。５．３．核酸構成体ここで使用される用語“核酸構成体”とは、ゲノムDNA 、合成DNA 又はRNA 起源のあらゆる核酸分子を意味することが意図されている。用語“構成体”は、一本鎖又は二本鎖であり得る核酸セグメントを意味することが意図され、かつこれは該プロテアーゼをコードしている完全又は部分的に天然に生じるヌクレオチド配列を基にすることができる。この構成体は、他の核酸セグメントを任意に含むことができる。前記プロテアーゼをコードしている本発明の核酸構成体は、例えばゲノムライブラリーを調製し、かつ標準的方法に従い、合成オリゴヌクレオチドプローブを用いてハイブリダイゼーションし、該プロテアーゼの全て又は一部をコードしているDNA 配列をスクリーニングすることによって得られた、ゲノム起源のものが適している（Sambrookらの論文、Molecular Cloning，A Laboratory Mannual，C old Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N．Y.，198 9 と比較）。本発明の目的のために、このプロテアーゼをコードしているDNA 配列は、前述の５．１．項に記載されたバチルス種菌株から、染色体DNA を単離し、かつゲノムDNA ライブラリーをスクリーニングすることによって、得ることができる。このプロテアーゼをコードしている本発明の核酸構成体は、確立された標準的方法、例えばBeaucage及びCaruthers の論文（Tetrahedron Letters 22：1859-1 869（1981））に記載されたホスホルアミダイト法、又はMatthes らの論文（EMB O Journal，3 ：801-805(1984)）に記載された方法によっても、合成的に調製される。ホスホルアミダイト法に従って、オリゴヌクレオチドが、例えば自動DNA 合成装置により合成され、精製され、アニーリングされ、連結され、かつ適当なベクターとクローニングされる。更に、この核酸構成体は、合成及びゲノム起源のものと混合することができ、かつ合成又はゲノムDNA(適当な)の断片の連結によって調製することができ、これらの断片は、標準的方法に従って、核酸構成体全体の様々な部分に対応している。この核酸構成体は、更に例えば米国特許第 4,683,202号に開示された、もしくはSaiki らの論文（Science，239：487-491（1988））に記載されたような、特異的プライマーを用いる、ポリメラーゼ連鎖反応によって調製することができる。現在の好ましい実施形態において、本発明の核酸構成体は、配列番号：４に記されたDNA 配列；更には配列番号：１，２又は３に記されたアミノ酸配列をコードしている核酸配列、例えばそれぞれ配列番号：５，６又は７に記されているDN A 配列を有している。本発明は更に、配列番号：１，２又は３に記されたアミノ酸配列をコードしている、核酸分子（ゲノム又は合成のいずれか）と、下記の条件でハイブリッド形成した核酸配列を包含している：５×SSC への前浸漬、及び20％ホルムアルデヒド、50mMリン酸ナトリウム、pH6.8 、及び50μ ｇ超音波処理した変性ウシ胸腺DNA の溶液中での、約40℃，１時間の前ハイブリダイゼーション、それに引き続いての同じ溶液中での、約40℃，18時間の、ハイブリダイゼーション、その後の温度約45℃での、 0.4×SSC での洗浄である。先に定義された範疇の有用な変異体は、例えば、アミノ酸の同種置換が行われ、この置換がそのタンパク質の活性には著しくは影響しないような変化を、DNA がコードしているものを含む。同種置換は、同じ種類のアミノ酸が、その種類の別のものと置換されることを意味する。例えば、非極性脂肪族残基Ala，Val，Le u 及びIle は、相互交換され、かつ塩基性残基Lys 及びArg 、又は酸性残基Asp 及びGlu も同じである。同様に、Ser 及びThr は互いに同種置換され、Asn 及び Gln も同様である。当業者にとって、このような置換が、分子の機能に決定的な領域の外側で行われることができ、かつ依然活性プロテアーゼを生じることは、明らかである。望ましい活性の保持は、前述のアッセイ法を用いて、容易に測定することができる。この核酸構成体は、下記で専ら使用される用語であるDNA 構成体であることが好ましい。５．４．組換えベクター別の態様において、本発明は、本発明のDNA 構成体を含む組換えベクターに関する。本発明のDNA 構成体が挿入された組換えベクターは、都合よく組換えDNA 法を施すことができるいずれかのベクターであって良く、かつこのベクターの選択は、これが導入される宿主細胞によって決まることが多い。従って、このベクターは、自律複製ベクター、すなわち染色体外存在として存在するベクターであり、この複製は、例えばプラスミドのように、染色体の複製からは独立している。あるいは、このベクターは、宿主細胞に導入する際に、宿主細胞ゲノムに組込まれ、かつ組込まれた染色体と共に複製されるようなものであってよい。このベクターは、本発明のプロテアーゼをコードしているDNA 配列が、DNA の転写に必要な追加のセグメントに、操作できるように連結しているような発現ベクターであることが好ましい。一般に、この発現ベクターは、プラスミド又はウイルス性DNA に由来し、もしくは両方の要素を含むことができる。用語“作用的に連結”とは、セグメントが、例えば転写がプロモーターで開始し、及び本発明のプロテアーゼをコードしているDNA 配列を通じて進行するような、意図された目的に合わせて機能するように配列されることを意味する。このプロモーターは、選択された宿主細胞において転写活性を示す、いずれかのDNA 配列であって良く、かつ宿主細胞に対して同種又は異種のタンパク質をコードしている遺伝子に由来することができる。特に、細菌宿主細胞において使用するのに適したプロモーターの例は、バチルス・ステアロテルモフィラス(Bacil lus stearothermophilus )・マルトース性（maltogenic）アミラーゼ遺伝子、バチルス・アミロリキファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）(BAN)アミラーゼ遺伝子、バチルス・サブチリス(Bacillus subtilis)アルカリプロテアーゼ遺伝子、バチルス・プミラス（Bacillus pumilus）・キシロシダーゼ遺伝子、バチルス・スリギエンシス（Bacillus thuringiensis）cryIIIA 、又はバチルス・リチエニフォルミス（Bacillus licheniformis）α−アミラーゼ遺伝子のプロモーターを含むが、これらに限定されるものではない。他の使用できるプロモーターは、λファージＰ_R又はＰ_Lプロモーター、もしくはE ．coli のlac，trp又はta c プロモーターを含むが、これらに限定されるものではない。このプロモーターは、前記プロテアーゼ、又はこの配列と実質的に同じプロモーター活性を有するそれらの断片をコードしている遺伝子に由来している。このプロモーターの配列は、配列番号：８に示されている。本発明は更に、配列番号：８で示されたプロモーターに、下記の条件でハイブリッド形成された核酸配列：５×SSC への前浸漬、及び20％ホルムアルデヒド、50mMリン酸ナトリウム、pH 6.8 、及び50μｇ超音波処理した変性ウシ胸腺DNA の溶液中での、約40℃、１時間の前ハイブリダイゼーション、それに引き続いての同じ溶液中での、約40℃、 18時間のハイブリダイゼーション、その後の温度約45℃での、 0.4×SSC での洗浄であるか、もしくは、配列番号：８と少なくとも約90％の相同性、及び好ましくは95％の相同性を有するが、この配列と実質的には同じプロモーター活性を有する核酸配列を、包含している。このプロモーターは、このプロテアーゼ又は異種DNA 配列、例えばリポラーゼ（登録商標）、これは１，３−特異的リパーゼであり、以後Lipolase（登録商標）と称するもののいずれかの発現を促進するために使用することができる。この酵素は、配列番号：11に示されたDNA 配列によって、コードすることができ、かつ配列番号：12に示されたアミノ酸配列を有する。この酵素は、更にLipolase（登録商標）変異体、例えばD96L，E210K，E210L（国際特許第WO92／5249号参照）であることができる。本発明の組換えベクターは、更に問題の宿主細胞においてベクターを複製できるようなDNA 配列を含むことができる。この宿主細胞が細菌細胞であるならば、このベクターを複製できる配列は、各種ori 配列である。このベクターは、更に選択マーカー、例えばその産物が、アンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ネオマイシン、ハイグロマイシン又はメトトレキサンのような薬剤への耐性をもたらすような遺伝子を含む。宿主細胞の分泌経路に本発明のプロテアーゼを示すための、分泌シグナル配列（リーダー配列又はプレ配列としても公知である。）は、前述の組換えベクターにおいて提供される。この分泌シグナル配列は、正確なリーディングフレームの中でプロ未成熟（pro immature）プロテアーゼをコードしているDNA 配列に結合される（例えば図４参照）。プロ配列とは、プレ配列及びプロテアーゼの分泌に必要な成熟プロテアーゼの間のアミノ酸配列である。このプロ配列の切断は、成熟活性プロテアーゼを生じるであろう。分泌シグナル配列は、通常核プロテアーゼをコードしているDNA の５’側に位置する。この分泌シグナル配列は、通常このプロテアーゼに関連しているか、もしくは他の分泌されたタンパク質をコードしている遺伝子に由来する。細菌細胞からの分泌に関して、このシグナルペプチドは、天然に生じるシグナルペプチド、又はその機能的一部であることができ、もしくは合成ペプチドであることができる。適当なシグナルペプチドは、バチルス・リチェニフォルミスα −アミラーゼ、バチルス・レンタス(Bacillus lentus)・アルカリプロテアーゼ、及びバチルス・アミロリキファシエンス・アミラーゼを含むが、これに限定されるものではない。細菌細胞からの分泌に関して、このシグナルペプチドは、本出願において開示されたプロテアーゼ由来のシグナルペプチドであっても良い。このシグナル配列のアミノ酸配列は、配列番号：９に示される。このシグナル配列は、配列番号： 10に記載された核酸配列によって、コードされ得る。更に本発明は、配列番号： 10に示された核酸配列と、下記の条件でハイブリッド形成した核酸配列：５×SS C への前浸漬、及び20％ホルムアルデヒド、50mMリン酸ナトリウム、pH6.8 、及び50μｇ超音波処理した変性ウシ胸腺DNA の溶液中での、約40℃、１時間の前ハイブリダイゼーション、それに引き続いての同じ溶液中での、約40℃、18時間の、ハイブリダイゼーション、その後の温度約45℃での、 0.4×SSC での洗浄であるか、もしくは、配列番号：５と少なくとも約90％の相同性、及び好ましくは約 95％の相同性を有するが、この配列と実質的には同じシグナル活性を有する核酸配列を、包含している。このシグナルは、前述のプロテアーゼ又は異種DNA 配列、例えばリポラーゼ（登録商標）、これは１，３−特異的リパーゼで、以後Lipo lase（登録商標）と称すもののいずれかの分泌を促進するために使用することができる。この酵素は、配列番号：11に示されたDNA 配列によって、コードすることができ、かつ配列番号：12に示されたアミノ酸配列を有する。この酵素は、更に、Lipolase（登録商標）変異体、例えばD96L，E210K，E210L（国際特許第WO92 /05249号参照）であることができる。本発明のプロテアーゼ、プロモーター及び／又は分泌シグナル配列をそれぞれコードしているDNA 配列を連結するために、及びこれらを複製に必要な情報を有する適当なベクターに挿入するために使用される方法は、当該技術分野において公知である（例えば、前述のSambrookらの論文参照）。５．５．宿主細胞宿主細胞に導入された本発明のアルカリプロテアーゼをコードしているDNA 配列は、問題の宿主細胞と同種又は異種であることができる。宿主細胞に対して同種である、すなわち天然に宿主細胞によって産生されるならば、これは他のプロモーター配列か、もしくは適用できるならば、その天然の環境以外の、別の分泌シグナル配列及び／又はターミネーター配列に操作できるように結合することができる。用語“同種”とは、問題の宿主微生物の天然のプロテアーゼをコードしている核酸配列を含むことを意図し；この核酸配列は、多コピー型で宿主微生物に導入され得る。用語“異種”とは、天然には宿主細胞によって発現されないDN A 配列を含むことを意図する。従って、このDNA 配列は、別の微生物から産生されるか、もしくは合成配列である。本発明のDNA 構成体又は組換えベクターが導入される宿主細胞は、本発明のアリカリプロテアーゼ産生することができるいずれかの細胞であって良く、細菌、酵母、真菌及びより高級な真核生物細胞を含むが、これらに限定されるものではない。培養時に、本発明のプロテアーゼを産生及び分泌することができる細菌宿主細胞の例は、バチルス菌株のようなグラム陽性菌、例えばＢ．サブチリス、Ｂ．リチェニフォルミス、Ｂ．レンタス、Ｂ．ブレビス(B ．brevis)、Ｂ．ステアロテルモフィラス(B ．stearothermophilus)、Ｂ．アルカロフィラス(B ．alkalophilu s )、Ｂ．アミロリキファシエンス（B ．amyloliquefaciens）、Ｂ．コアグランス（B ．coagulans）、Ｂ．サーキュランス（B ．circulans）、Ｂ．ラウタス(B ．la utus )、Ｂ．メガテリウム(B ．megaterium)又はＢ．スリギエンシス（B ．thuring iensis ）など、もしくはエシェリキア・コリ（Escherichia coli）のようなグラム陰性細菌である。これらの細菌の形質転換は、原形質形質転換、又はそれ自身公知の方法であるコンピテント細胞を用いて（前述のSambrookらの論文参照）もたらされる。 E．coli のような細菌においてこのプロテアーゼが発現する場合、このプロテアーゼは、典型的には不溶性顆粒（封入体として公知）として細胞質に保持されるか、もしくは細菌の分泌配列によって、細胞周辺腔に向けられる。前者の場合、これらの細胞は溶解され、かつ顆粒が回収され、変性され、その後該プロテアーゼが変性剤の希釈され、再生される。後者の場合、このプロテアーゼは、細胞の崩壊、例えば超音波処理又は浸透圧ショックによって、細胞周辺腔の内容物を放出し、該プロテアーゼを回収することによって、細胞周辺腔から回収される。前述の形質転換された宿主細胞は、その後適当な栄養培地において、本発明のプロテアーゼの発現をもたらす条件下で培養され、その後得られたプロテアーゼが培地から回収される。細胞の培養に使用した培地は、その宿主細胞の増殖に適した通常の培地のいずれか、例えば適当な補充物を含有する最小培地又は複合培地であって良い。適当な培地は、市販の供給業者から入手するか、もしくは公表された調製法（例えばATCCのカタログ）に従って調製することができる。その後、これらの細胞によって産生されたプロテアーゼは、遠心分離又はろ過による宿主細胞の培地からの分離、上清又はろ液中のタンパク質成分の、硫酸アンモニウムなどの塩による沈殿、問題のプロテアーゼの種類によって決まる様々なクロマトグラフィー法、例えばイオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどによる精製を含む常法で、培地から回収される。本発明は、更に下記の実施例によって詳細に説明されるが、これらは特許請求された本発明の範囲を限定することを意図するものではない。６．実施例６．１．PD498 プロテアーゼの単離バチルス種PD498 は、下記の組成（／リットル）の培地 100mlを含む、 500ml に仕切ったエーレンマイヤーフラスコ中で、回転振盪テーブル上で（300rpm）、 25℃で培養した：ジャガイモデンプン 100ｇ粉砕したオオムギ 50ｇダイズ種子粉 20ｇ Na₂HPO₄×12H₂O 9ｇプルロニック54Ｒ（BASF） 0.1ｇカゼインナトリウム 10ｇ。この培地中のデンプンは、α−アミラーゼで液化し、かつこの培地は 120℃で、45分間加熱して、滅菌した。滅菌後、この培地のpHを、１Ｍ炭酸水素ナトリウム溶液10mlを添加することによって、9.0 に調節した。４日間インキュベーションした後、この培養物のタンパク質分解活性を、前述の方法を用いて測定した。このブロスのプロテアーゼ活性は、５ CPU/ｌであった。固形物質を分離した後、このプロテアーゼを通常のクロマトグラフィー法で精製した。培養ブロス3.51からの収量は、31mlで、120CPU／ｌを示した。 SDS−PA GE及び等電点焦点化電気泳動法の両方により、純度は90％以上であると判断した。この実施例に従って調製した調製品の特徴は、本願明細書において既述し、ここに参照とする。６．２．PD498 プロテアーゼのクローニング及び発現６．２．１．方法及び材料６．２．１．１．菌株エシェリキア・コリDH5F−Φ80dlacZ ΔＭ15 Δ（lacZYA-argF）U169 deoR r ecA1 endA1 hsdR17（Ik^-,mk⁺）supE44-thi-1 gyrA96 relA1（BRL）を、製造者(B RL)の指示に従って、全てのE ．coliの形質転換に使用した。Ｂ．サブチリス・プロテアーゼ欠損菌株を、Anagnostopolis及びSpizizenの論文の方法（J．Bacteri ol.，81 ：741-746(1961)）によって、コンピテントとした。６．２．１．２．DNA 単離及び遺伝子ライブラリーの構築 PD498 染色体DNA を、Pitcher らの論文（Letters in Applied Micro.，８：1 51-156（1989））に記載されるように単離した。DNA 100μｇを、EcoRＩで切断し、アガロースゲル上を流した。５−８kD DNAが、Qiaex システム（Qiagen）を用いて単離された。このDNA は、EcoRＩ−切断CIP(仔ウシ腸ホスファターゼ)処理したpUC19(BRL)と、それぞれ比４：１で連結した。その後この連結混合物を、 E．coli 菌株DH５α(BRL)に形質転換した。６．２．１．３．180bp断片のPCR 増幅このプロテアーゼ遺伝子の 180bp断片の増幅は、このプロテアーゼの部分的アミノ酸配列を基にした、２種の混合プライマー、グループＡ及びＢを用いて行った。これらのアミノ酸配列は、配列Ａ：AYQYGPQNT(配列番号：13)であり、配列Ｂ：YDFIDYDNNPMD（配列番号：14）であった。これらのプライマー及び全PD498 DNA を、Ericomp PCR 装置において、95℃／５分間反応し、その後95℃／１分間、55℃／１分間、72℃／１分間を30サイクルの反応を行った。プライマーグループＡ：GCNTAYCARTAYGGNCCNCARAAYAC （配列番号：15）プライマーグループＢ：TCCATNGGRTTRTTRTCRTARTCDATRAARTCRTA （配列番号：16）６．２．１．４． PCR反応生成物のサブクローニング前述のPCR 生成物を、TAクローニングベクター pCRII（Invitrogen，サンディエゴ，CA）を用いて、製造業者の指示に従い、配列決定のためにクローニングした。挿入DNA は、Engler-Blum によって変更（Anal．Biochemistry，210：235-2 44(1993)）されたBoehringer Mannheim 社のDIG Geniusシステムを用い、DIG(ジゴキシゲニン)で標識し、かつサザンハイブリダイゼーションを行い、コロニーブロッティングを行った。６．２．１．５．DNA 配列決定 DNA 配列は、蛍光標識したジデオキシヌクレオチドで、Taq ポリメラーゼサイクル配列決定法を用い、決定した。この配列決定反応は、Applied Biosystems自動DNA シークエンサー（モデル373A、バージョン１．２．０）で行った。６．２．１．６．amyLプロモーターでもたらされたPD498 プロテアーゼを含むベクターの構築 α−アミラーゼ（amyL）プロモーター（配列番号：17）、バチルス・リチェニフォルミス由来の“アップ”変異体プロモーターは、下記のプライマーを用いて、Ｂ．リチェニフォルミスDNA からPCR 増幅して得た： 5'-AAGGCATGCGTCCTTC-3'（配列番号：18） 5'-CTTTCAATGTGTAACATA-3'（配列番号：19）。得られた 630bp断片は、 pCRIIベクター（Invitrogen）にクローニングし、クローニングされた断片を得、EcoRＩ断片として容易に単離した。このプロテアーゼ遺伝子は、1.9kb EcoRＩ−EcoRＶ断片として、EcoRＩ， Sma Ｉ−切断 pUC19にサブクローニングし、その後1.9kb EcoRＩ−HindIII断片として取り除き、EcoRＩ−HindIIIで切断したpHP 13amp にクローニングし、E．coli −Ｂ．サブチリスシャトルベクターとした（図８）。得られたプラスミドp498 −４は、EcoRＩで切断し、仔ウシ腸ホスファターゼ(CIP)で処理し、かつ前述のa myLプロモーター断片に連結し、プラスミドp498−５を産生した（図５）。PD498 コード領域に対して正しく配向したプロモーターを有するＢ．サブチリスコロニーを、適当な抗生物質及び１％ミルクを含有する寒天プレート上にかさ(halos)を形成する能力によって選択した。６．２．１．７．cryIIIA プロモーターでもたらされたPD498 プロテアーゼを含有するベクターの構築バチルス・スリギエンシス変異体テネブリオニス由来のcryIIIAプロモーター（配列番号：20）は、下記のプライマーを用いて、PCR 増幅により得た： 5'-GAGACCCGGGAGCTTTCAGTGAAGTACGTG-3'（配列番号：21） 5'-CATAAATCCATTAGACGGTGC-3'（配列番号：22）。得られた1500bpの断片は、再度 pCRIIベクター（Invitrogen）にクローニングし、EcoRＩ断片として取り出し、かつEcoRＩで消化されたp498−４プラスミドに連結し、プラスミドp498−６を産生し、ここでPD498 プロテアーゼ発現は、cryI IIA プロモーターによってもたらされた（図５）。PD498 コード領域に対して正しく配向したプロモーターを有するＢ．サブチリスコロニーを、適当な抗生物質及び１％ミルクを含有する寒天プレート上にかさを形成する能力によって選択した。６．２．１．８．BAN プロモーターでもたらされたPD498 プロテアーゼを含有するベクターの構築バチルス・アミロリキファシエンス・アミラーゼ(BAN)プロモーターは、下記の更に SphＩリンカーを含む上流側プライマーを用いて、プラスミド（pSX222）（配列番号：23）からPCR 増幅した： 5'-GCATGCAATCGATTGTTTGAGAAAAGAAG-3'（配列番号：24）下線のヌクレオチド配列の最初のセットは、前述の SphＩ部位であり、下線のヌクレオチドの第二のセットは、天然の ClaＩ部位であり；かつ下流側プライマーは下記のものである： 5'-CATTTTCTTATACAAATTATATTTTACATATCAG-3'（配列番号：25）。得られた 168bp断片は、 pCRIIベクター（Invitrogen）にクローニングし、Ec oRＩ断片として取り出し、かつEcoRＩで消化されたp498−４プラスミドに連結し、プラスミドp498−７を産生し、ここでPD498 プロテアーゼ発現は、BAN プロモーターによってもたらされた（図５）。PD498 コード領域に対して正しく配向したプロモーターを有するＢ．サブチリスコロニーを、適当な抗生物質及び１％ミルクを含有する寒天プレート上にかさを形成する能力によって選択した。 PD498 プロテアーゼに対して逆配向したBAN プロモーターを含むＢ．サブチリス形質転換体を、適当な抗生物質及び１％ミルクを含有する寒天プレート上にかさを形成しない能力によって選択した。６．２．２．PD498 遺伝子の配列解析 PD498 プロテアーゼの部分的アミノ酸配列を基にしたオリゴヌクレオチドの２群を用いて、正確に 180bpの大きさの断片を、PCR で増幅し、かつE．coli ベクター pCRIIにクローニングした。180bpインサートの配列決定は、正確な断片がクローニングされたことを明らかにした。この 180bpインサートをプローブとして用いて、サザンハイブリダイゼーションを行い、6.5kb EcoRＩ断片を、該プローブにハイブリダイズ形成したPD498 染色体DNA から同定した。PD498 由来の染色体DNA を、EcoRＩで切断し、かつ５−８kb断片を、大きさで選択し、EcoRＩで切断し、かつCIP で処理したpUC19 に連結した。Amp 及びＸ−gal を含有するLB プレートで選択された、E．coli 菌株DH５αへの形質転換後に、1000個の白色コロニーを得た。スクリーニングした600 コロニー中の２個は、プローブとして標識した 180bp断片を用いるコロニーハイブリダイゼーションによって陽性であった。制限分析は、両方のコロニーが、6.5kb EcoRＩインサートを伴う同じプラスミドを有することを示した。 DNA 配列決定は、５’側EcoRＩ制限部位が、リボソーム結合部位遺伝子のすぐ上流であり（図３；配列番号：26）、それにこのタンパク質のATG 開始コドンが続くことを示した。最初の27アミノ酸は、３種の正に帯電した残基を含む短い配列、それに続く疎水性の延伸末端Ser-Leu-Ala を伴う、典型的バチルスシグナルペプチドを表している。この制限部位の後ろに、90アミノ酸のプロペプチドがあり、これに分子量29270 と予想される280 アミノ酸の成熟タンパク質が続き、これは SDS−PAGEで認められた分子量34,000（図４）良く一致する。６．３．プロモーター活性を伴うPD498 オープンリーディングフレームの上流の DNA 配列の単離 PD498 コード領域のDNA 配列決定は、Asp718（同じく KpnＩによって認められた部位）、PstＩ，BglII及び他の独自の制限部位の存在を示した。PD498 ゲノムDNA のAsp718及び各種他の酵素による消化、これらの断片のナイロンへのサザン法の転移、及び 180bp DIGで標識したDNA プローブによる検出（６．２．１．３．及び６．２．１．４．に記載）は、1.4kb HindIII−Asp718断片の存在を示した。公知のPD498 コード領域におけるAsp718制限部位の位置から、この1.4kb HindIII−Asp718断片は、PD498 プロテアーゼのATG 翻訳開始の上流およそ 750 −850ntsを含有するはずである。大きさで選択した１−２kb HindIII−Asp718 断片のライブラリーは、pUC118にクローニングし（Vieira及びMessing の論文、 Methods Enzymol.，153：3-11（1987））、かつE．coli XL１−Blue MRF’細胞（Stratagene，サンディエゴ，CA）に形質転換した。コロニーは、前述のSambro okらの（1989）ハイブリダイゼーション法によって、180bp DIGで標識したPCR 断片でスクリーニングした。６コロニーを、プローブで検出し、かつプラスミド DNA を、アルカリ溶解法（前述の Sambrookらの論文（1989））により、４コロニーから単離した。全部で４種のプラスミド調製品は、1.4kb HindIII−Asp718断片を含んだ。この断片の配列は、A BI373A シークエンサーで、蛍光標識したジデオキシヌクレオチドを用いる、Taq ポリメラーゼサイクル配列決定法により決定した（配列番号４）。この断片を含有するプラスミドを、p118−498promlと称した（図６）。６．４．PD498 コード配列によるPD498 プロモーターの再構築上流側HindIII−Asp718断片を、３工程において、その天然のPD498 コード配列で再構築した（図９参照）。第一に、p118−498promlからのHindIII−Asp718 断片を、pHP13ampにクローニングした。その後、プラスミドp498−５を、MscＩ及びBamHＩで切断し、PD498 プロテアーゼのコード領域を含む 1.0kb MscＩ−Ba mHＩ断片を得た。第三に、この MscＩ−BamHＩ断片を、第一工程の MscＩ及びBa mHＩ断片のプラスミドに連結した。その後連結混合物を、E．coli DH５α細胞に形質転換した。望ましい構成体p498−８（図９参照）を、形質転換体から、アルカリ溶解“ミニプレッピング”により単離した。その後このプラスミドは、Ｂ．サブチリスプロテアーゼ欠損菌株に形質転換し、かつ１％非脂肪乾燥ミルク及び 10μｇ／mlクロラムフェニコールを含有するTBABプレート上に配置した。この天然のプロモーターからの該プロテアーゼの発現は、各形質転換されたＢ．サブチリスコロニーの周囲に透明なゾーン（かさ）が形成されたことによって、示された。６．５．PD498 振盪フラスコ実験を、p498−５，６，７，８及び“７Ｒ”で形質転換されたＢ．サブチリスプロテアーゼ欠損菌株について、ショ糖／ダイズ種子粉培地において行った。これらのプラスミド構成体は、それぞれ、amyL，cryIIIA ，BAN，498 及びリバースBAN(逆配向の BAN プロモーター)を含むpHP13ampベクターからなる。cryIIIA，BAN、及びPD498 プロモーターの制御下では、Ｂ．リチェニフォルミスα−アミラーゼは、４日後に産生された。６．６．バチルス・サブチリスにおけるLipolase発現下記の構成体を、Ｂ．サブチリスプロテアーゼ欠損のバックグラウンドにおいて試験した：（プロモーター／シグナル配列／Lipolase（登録商標）） Lipolase（登録商標）活性 pHP13amp ０ pLip３５ pHP13ampの概略を、図７に示し、かつpLip３の概略を、図８に示した。下記の方法は、構成体pLip３に使用した。プロLipolase（登録商標）コード配列を産生する、このpMHan37 の MscＩ−BamHＩ断片（図10参照）は、p118−498promlからのPD498 のHindIII−MscＩ断片（プロモーター及びシグナルペプチドコード配列を含む）、及びHindIII BamHＩで切断したpHP13ampと連結され、pLip３を産生する。Ｂ．サブチリスプロテアーゼ欠損菌株を、この構成体で形質転換した。形質転換体は、５μｇクロラムフェニコール／ml及び１％トリブチリンを含有する TBABプレート上に置いた場合、pHP13ampのみを有するＢ．サブチリスプロテアーゼ欠損菌株よりも、透明なより大きいゾーンを作成した。この融合の概略は、図 11に示した。これらの結果は、ショ糖−ダイズ培地を用いる振盪フラスコから得た。これらのデータは、pD498 プロモーター／シグナル配列を、異種タンパク質をＢ．サブチリスにおいて発現するために使用することができることを示している。７．微生物の寄託下記の微生物材料は、Agricultural Research Service Patent C ulture Collection(NRRL)、Nerthern Regional Research Center，1815，Univer sity Street，Peoria，Illinois，61604，USAに、寄託した。これらの菌株は、本出願の係属中に、第37連邦法施行規則（37Ｃ．Ｆ．Ｒ．）の１．14項及び第35米国成文法（35Ｕ．Ｓ．Ｃ．）122項及びブダペスト条約規約の基で権利を与えられた米国特許局長が、培養物の取得を保証する条件下で寄託した。この寄託は、各寄託菌株の生物学的に純粋な培養物を表している。この寄託物は、従属する出願又はその所産の対応が出願された国における外国特許法に従い、必要な際には入手できる。しかし、寄託物の利用可能性は、政府指令により付与された特許権の減損において、発明の内容の実施許諾を構成すると理解されなければならない。ここで明らかにされた特定の実施態様は本発明のいくつかの態様を詳細に説明することを意図するので、ここに記載されかつ特許請求された発明は、これらの実施態様によって範囲が限定されるものではない。あらゆる相当する実施態様は、本発明の範囲内であることが意図されている。実際、ここで記載されかつ説明されたものに加え、本発明の様々な変更が、前述の説明から、当業者には明らかになるであろう。このような変更は、添付されたクレームの範囲内であることも意図する。各種の参照を、ここに列記し、その内容は、そのまま参照として引用される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者オーティループ，ヘレデンマーク国，デーコー−2750 バレループ，シベンデフースバイ 46 (72)発明者ダンブマン，クラウスデンマーク国，デーコー−2860 セーボルグ，テー．ホー．７，ヘイエグラドサクセ 61 (72)発明者アースリング，ドリトアニタデンマーク国，デーコー−4000 ロスキルデ，スボゲースレウ，フィレン８

Claims

【特許請求の範囲】１．プロテアーゼをコードしている核酸配列を含む、核酸構成体であって、該プロテアーゼが下記の特性：（ａ） SDS−PAGEで決定された分子量が約34kDであり；（ｂ）pIがほぼ9.3 であり；（ｃ）至適pHの範囲が、温度約25℃で、及びカゼインを基質として、pH９〜11であり；（ｄ）至適温度範囲が、pH約9.5 で、及びカゼインを基質として、約40〜55℃であり；及び（ｅ）バチルス種グループＩから得られうるを有する核酸構成体２．前記プロテアーゼが、バチルス種PD498 から得られうる、請求項１の核酸構成体。３．バチルス種PD498 から得られ得るプロテアーゼとしての免疫化学的特性を実質的に全て有するプロテアーゼをコードしている核酸配列を含む、核酸構成体であって、該プロテアーゼが、次の特性：（ａ） SDS−PAGEで決定された分子量が約34kDであり；（ｂ）pIがほぼ9.3 であり；（ｃ）至適pHの範囲が、温度約25℃で、及びカゼインを基質として、pH約９〜11 であり；（ｄ）至適温度範囲が、pH約9.5 で、及びカゼインを基質として、約40〜55℃であるを有する核酸構成体。４．配列番号：１に記載されたアミノ酸配列を有するプロテアーゼをコードしている核酸配列を含む、核酸構成体。５．配列番号：２に記載されたアミノ酸配列を有するプロテアーゼをコードしている核酸配列を含む、核酸構成体。６．配列番号：３に記載されたアミノ酸配列を有するプロテアーゼをコードしている核酸配列を含む、核酸構成体。７．配列番号：４に記載された核酸配列を含む、核酸構成体。８．前記プロテアーゼが、配列番号：５に記載された核酸配列によってコードされた、請求項４記載の核酸構成体。９．前記プロテアーゼが、配列番号：６に記載された核酸配列によってコードされた、請求項５記載の核酸構成体。 10．前記プロテアーゼが、配列番号：７に記載された核酸配列によってコードされた、請求項５記載の核酸構成体。 11．請求項１記載の核酸構成体を含む、組換え宿主細胞。 12．請求項４記載の核酸構成体を含む、組換え宿主細胞。 13．請求項５記載の核酸構成体を含む、組換え宿主細胞。 14．請求項６記載の核酸構成体を含む、組換え宿主細胞。 15．請求項７記載の核酸構成体を含む、組換え宿主細胞。 16．（ａ）請求項１記載の核酸構成体；（ｂ）（ａ）の核酸配列に作用的に結合したプロモーター配列；及び（ｃ）選択マーカーを含む、組換えベクター。 17．（ａ）請求項４記載の核酸構成体；（ｂ）（ａ）の核酸配列に作用的に結合したプロモーター配列；及び（ｃ）選択マーカーを含む、組換えベクター。 18．（ａ）請求項５記載の核酸構成体；（ｂ）（ａ）の核酸配列に作用的に結合したプロモーター配列；及び（ｃ）選択マーカーを含む、組換えベクター。 19．（ａ）請求項６記載の核酸構成体；（ｂ）（ａ）の核酸配列に作用的に結合したプロモーター配列；及び（ｃ）選択マーカーを含む、組換えベクター。 20．（ａ）請求項７記載の核酸構成体；（ｂ）（ａ）の核酸配列に作用的に結合したプロモーター配列；及び（ｃ）選択マーカーを含む、組換えベクター。 21．前記プロモーター配列が、cryIIIA プロモーター、バチルス・リチェニフォルミス（Bacillus licheniformis）α−アミラーゼプロモーター、バチルス・アミロリキファシエンス（Bacillus amyloliquifaciens）α−アミラーゼプロモーター、及び配列番号：８記載の核酸配列を有するバチルス・アルカリプロテアーゼをコードしている遺伝子に由来するプロモーター配列からなる群から選択される、請求項16記載の組換えベクター。 22．前記ベクターが、更にシグナル配列を有する、請求項16記載の組換えベクター。 23．前記シグナル配列が、バチルス・リチェニフォルミスα−アミラーゼプロモーター、バチルス・アミロリキファシエンスα−アミラーゼプロモーター、及び配列番号：４記載の核酸配列を有するバチルス・アルカリプロテアーゼをコードしている遺伝子に由来するシグナル配列からなる群から選択される、請求項22 記載の組換えベクター。 24．下記の特性：（ｉ） SDS−PAGEで決定された分子量が約34kDであり；（ii）pIがほぼ9.3 であり；（iii）至適pHの範囲が、温度約25℃で、及びカゼインを基質として、pH約９〜1 1であり；（iv）至適温度範囲が、pH約9.5 で、及びカゼインを基質として、約40〜55℃であり；及び（ｖ）バチルス種グループＩから得られうる；を有するプロテアーゼの製造法であって、請求項11〜15のいずれか記載の組換え宿主細胞を、前記プロテアーゼの発現を実行できる条件下で培養するステップと、この培養物からプロテアーゼを回収するステップと、を含む、製造法。 25．下記の特性：（ｉ） SDS−PAGEで決定された分子量が約34kDであり；（ii ）pIがほぼ9.3 であり；（iii）至適pHの範囲が、温度25℃で、及びカゼインを基質として、約９〜11であり；（iv）至適温度範囲が、pH約9.5 で、及びカゼインを基質として、約40〜55℃であり；及び（ｖ）バチルス種グループＩから得られうるプロテアーゼをコードする遺伝子から得られるプロモーター配列、又は該プロモーターが配列番号：８の配列を有するような配列と、実質的に同じプロモーター活性を有するフラグメント。 26．請求項25記載のプロモーター配列、及び異種DNA 配列のベクターへの挿入部位を含む、ベクター。 27．前記ベクターが、更に異種ポリペプチドをコードしているDNA 配列を含む、請求項26記載のベクター。 28．細菌細胞における、異種ポリペプチドの製造法であって：（ａ）前記細胞を、請求項26記載のベクターで形質転換するステップと；（ｂ）ステップ（ａ）の形質転換された細胞を培養するステップと；（ｃ）ステップ（ｂ）の形質転換された細胞から、異種ポリペプチドを回収するステップと、を含む製造法。 29．下記の特性：（ｉ） SDS−PAGEで決定された分子量が約34kDであり；（ii ）pIがほぼ9.3 であり；（iii）至適pHの範囲が、温度25℃で、及びカゼインを基質として、pH約９〜11であり；（iv）至適温度範囲が、pH約9.5 で、及びカゼインを基質として、約40〜55℃であり；及び（ｖ）バチルス種グループＩから得られうる；を有するプロテアーゼをコードする遺伝子から得られるシグナル配列、又はその該シグナル配列が配列番号：９のアミノ酸配列を有するような配列と実質的に同じシグナル活性を有するフラグメント。 30．前記シグナル配列が、配列番号：10の核酸配列によってコードされている、請求項29記載のシグナル配列。 31．（ａ）請求項29記載のシグナル配列と；（ｂ）前記シグナル配列の上流側のプロモーター配列及びリボソーム結合部位配列であって、前記シグナル配列の転写が前記プロモーター配列の制御下にあるものと；（ｃ）前記シグナル配列の下流側の異種DNA 配列のベクターへの挿入部位で前記シグナル配列と同じリーディングフレームを有する部位と、を含むベクター。 32．前記ベクターが更に、異種ポリペプチドをコードしているDNA 配列を含む、請求項29記載のベクター。 33．細菌細胞における、異種ポリペプチドの製造法であって：（ａ）前記細胞を、請求項31記載のベクターで形質転換するステップと；（ｂ）ステップ（ａ）の形質転換された細胞を、培養するステップと；（ｃ）ステップ（ｂ）の形質転換された細胞から、異種ポリペプチドを回収するステップとを含む製造法。