JPH11341992A - Ｈｉｖ―ｉポリヌクレオチド - Google Patents

Ｈｉｖ―ｉポリヌクレオチド

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JPH11341992A
JPH11341992A JP11115582A JP11558299A JPH11341992A JP H11341992 A JPH11341992 A JP H11341992A JP 11115582 A JP11115582 A JP 11115582A JP 11558299 A JP11558299 A JP 11558299A JP H11341992 A JPH11341992 A JP H11341992A
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arv
dna
polynucleotide
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JP11115582A
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Paul A Luciw
ポール・エイ・ルシウ
Dino Dina
ディノ・ディナ
Steimer Kathelyn
キャサリン・ステイマー
Ray Sanchez Pescador
レイ・サンチェス・ペスカドール
Carlos George-Nascimento
カルロス・ジョージ−ナシメント
Deborah Parkes
デボラ・パーケス
Hallewell Rob
ロブ・ホールウェル
Philip J Barr
フィリップ・ジェイ・バー
Martha Truett
マーサ・トゥルート
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Chiron Corp
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Publication date
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 HIV-Iポリヌクレオチドを提供する。 【解決手段】 少なくとも２１ｂｐのフラグメントを含
有するポリヌクレオチドであって、該フラグメントはＡ
ＲＶ−２（７Ｄ）（ＡＴＣＣ Ｎｏ． ４０１４３）ま
たはＡＲＶ−２（８Ａ）（ＡＴＣＣ Ｎｏ． ４０１４
４）に由来し、かつ該フラグメントは特定のヌクレオチ
ド配列から得られる、ポリヌクレオチド。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、遺伝子工学分野に
属する。より詳細には、本発明はリンパ節疾患症候群
（LAS）および／または後天性免疫不全症候群（AIDS：
エイズ）に関連する組換えウィルスポリヌクレオチドに
関する。
【０００２】
【従来の技術】ヒトＴ細胞リンパ趨行性ウィルス−Ｉ
（HTLV-I）が、ヒトにおける感染作用物質であることが
発見されたことにより、レトロウィルスがヒトに感染
し、疾病の病因となり得ることが立証されるに至った。
HTLV-Iの発見後、それと同じ科に属する第２のレトロウ
ィルス、HTLV-IIが、毛状細胞白血病（hairy cell leuk
emia）の確立された株から発見された。それ以来、その
ほかにも、リンパ節疾患症候群（LAS）および／または
後天性免疫不全症候群（エイズ）罹患者に関連している
ヒト・レトロウィルス類が単離された。種々のレトロウ
ィルスが、エイズ（これらは、HTLV-IIIとも呼ばれる）
またはLAS（これらは、LAVとも呼ばれる）の患者から単
離された〔例えば、バーレ・シヌーシ（Barre-Sinouss
i）ら、サイエンス（Science）、220巻、868〜871（198
3年）；およびモンタニエル（Montagnier）ら、コール
ド・スプリング・ハーバー・シンポジウム（Cold Sprin
g Harbor Symposium）、1984年（印刷中）；ビルマー
（Vilmer）ら、ランセット（Lancet）、1984年、１、75
3；ポポビック（Popovic）ら、サイエンス（Scienc
e）、224巻、497（1984年）およびガロ（Gallo）ら、サ
イエンス（Science）、224巻、500（1984年）、参
照〕。また、フェオリノ（Feorino）らは、HTLV-IIIとL
AVとの比較を行っている（上記）。そのほか、クラッツ
マン（Klatzman）らのサイエンス（Science）、225巻、
59〜62（1984年）、およびモンタニエル（Montagnier）
らの文献（1984年（前掲））ならびにこれらの文献中で
引用されているこの分野の調査資料も参考にせよ。Ｔ細
胞白血病ウィルスに関する総説は、サイエンス誌〔マー
クス（Marx）、サイエンス（Science）、224巻、475〜4
77（1984年）〕に掲載されている。また、レビー（Lev
y）らはARV（エイズに関係しているレトロウィルス）を
単離したことを報告している〔サイエンス（Scienc
e）、225巻、840〜842（1984年）〕。
【０００３】本明細書においては、これらのウィルス類
（HTLV-III、LAVおよびARV）を、ヒト・Ｔ細胞リンパ趨
行性レトロウィルス（hTLR）と総称する。これらのhTLR
は、前記の参考諸文献を参照すればわかるように、形態
学、血清学、逆転写酵素の最適条件、および細胞病理学
上類似しているので、同一の網に属していることがわか
る。例えば、それらの逆転写酵素にはMg+2が好ましく、
その最適pHは約7.8である。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、hTLRタンパ
ク質を暗号化しているhTLR・DNA配列を提供するもので
ある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明の具体的態様は以
下の通りである。
【０００６】単細胞微生物によって認識される複製系
と、オープン・リーディング・フレーム（読取り枠）を
有する少なくとも21bpのDNA配列、を含んでいる組換え
体DNA組立物であって、該配列が、プロウィルスのhTLR
・DNAのgag、env、またはpol領域にある配列と実質的に
相補的であり、かつ、HTLV-IおよびHTLV-IIと免疫学的
に非交差反応性であってhTLRと反応し得るポリペプチ
ド、を暗号化している配列を含んでいることを特徴とす
る組換え体DNA組立物：上記のDNA組立物を含んでいる単
細胞微生物を増殖させ、それによって該DNA配列を複製
することから成るhTLRに特異的なDNAのクローン化方
法：以下の工程、（ａ）単細胞微生物宿主内で有効に機
能する転写および翻訳の開始ならびに停止調節シグナル
および、読取り枠を有する少なくとも21bpのDNA配列で
あって、プロウィルスのhTLR・DNAのgag、envまたはpol
領域に存在する配列と実質的に相補的であり、HTLV-Iお
よびHTLV-IIと免疫学的に非交差反応性であってhTLRと
は反応し得るポリペプチドをコードしている、該シグナ
ルの調節コントロール下にある配列、を含んでいるDNA
組立物を該宿主に導入し、次いで（ｂ）この宿主を栄養
培地中で増殖させ、所期の発現生産物を製造する、こと
から成るhTLRの発現生産物の製造方法：および抗原性組
換えARV-2gag、polまたはenvポリペプチドの少なくとも
１つをhTLRに対する抗体との結合に使用することを特徴
とする、該抗体の存在が疑われる試料中のhTLR抗体を検
出するための免疫測定法：組換え体ポリペプチドが
（ａ）ARV-2 p16gag、（ｂ）ARV-2 p25gag、（ｃ）ARV-
2 env、（ｄ）ARV-2 p31pol、（ｅ）ARV-2 p16gagとARV
-2 p25gagとの融合タンパク質、または（ｆ）スーパー
オキシド・ジスムターゼとARV-2 p31polとの融合タンパ
ク質であることを特徴とする組換えポリペプチド：およ
び固形支持体と結合している上記の組換え体ポリペプチ
ドを、少なくとも１つ含有していることから成るhTLR抗
体の免疫測定に用いる製造物。
【０００７】（図面の説明）図１は、プロウィルスDNA
（ARV-2）の制限酵素切断地図を示している。
【０００８】図２および図３は、ARV-2（9B）のヌクレ
オチド配列を示す。gag、polおよびenv遺伝子による生
産物のアミノ酸配列も示してある。また、LTRのU3、Ｒ
およびU5領域も示してある。キャップ（cap）部位は＋
１の位置である。LTRの終末にある３bpの逆方向反復配
列、−29位のTATAボックス、183位にあるtRNAlysの３'
−終末と相補的な配列、および9174位にあるポリアデニ
ル化シグナルには、下線を引いてある。上線はウィリオ
ン（ウィルス粒子）タンパク質から決定されたアミノ配
列を示す。各列毎の最初にヌクレオチド番号を付し、ま
た各列の終わりにアミノ酸番号を示した。
【０００９】図４は、プラスミドpGAG25-10の製造方法
を示した工程系統図である。
【００１０】図５は、プラスミドpGAG25-10にクローン
したp25gag遺伝子のヌクレオチド配列と、この遺伝子に
よって暗号化されているアミノ酸配列を示す。
【００１１】図６は、融合タンパク質p41gagを生産する
ためのpGAG41-10にクローンしたヌクレオチド配列の暗
号鎖と、それに対応するアミノ酸を示す。
【００１２】図７は、ARV-2 p16gagタンパク質を暗号化
しているヌクレオチド配列を示している。このものをプ
ラスミドptac5にクローンし、細菌内中でp16gagタンパ
ク質を生産するための発現プラスミドを作成する。
【００１３】図８は、プラスミドpDPC303を調製するた
めに使用されたARV-2 envタンパク質を暗号化している
ヌクレオチド配列を示している。
【００１４】図９および図１０は、ARV-2 p31タンパク
質を暗号化しており、プラスミドpTP31に含まれている
ヌクレオチド配列を示している。
【００１５】
【発明の実施の形態】hTLR・DNA配列は、プロウィルスD
NAまたはそのcDNAから分離し、クローンしたものであっ
ても、もしくは合成したものでも、いずれも、切断によ
ってさらに操作する前駆体タンパク質の形の、または完
全な成熟タンパク質またはその断片の形のポリペプチド
の発現に用いることができる。受容体、例えば免疫グロ
ブリンと特異的結合を行うことが可能なアミノ酸配列を
暗号化している配列を得るための最も小さい配列は、開
始コドンを除けば21bpであり、通常、少なくとも45bpで
ある。その配列は完全なポリペプチドまたはそれより大
きい部分をコードしていてもよく、また、２個またはそ
れ以上の異なった成熟ポリペプチドを暗号化している配
列の一部または全配列を含むように、その配列は前駆体
ポリペプチドの周辺領域を含んでいてもよい。通常、配
列は約５kbpを超えることはなく、さらに、約３kbpを超
えないのが普通である。
【００１６】読取り枠（図６）を有する特に重要な配列
は、gagタンパク質（p16およびp25）、envタンパク質お
よびpolタンパク質（p31）の構造遺伝子である。上記の
配列は、その配列の５'−終末が発現生産物のＮ−末端
アミノ酸を暗号化しないようにレトロウィルスに存在し
ている他の配列にスプライス（接合）できるということ
を理解すべきである。スプライス部位は読取り枠の５'
−末端であってもよく、または読取り枠の内側にあって
もよい。上に挙げた全配列を使用すると伸張したタンパ
ク質が得られるので、タンパク質に対する開始コドンは
最初のメチオニンに対するコドンではなく、次のメチオ
ニンまたは３番目のメチオニンに対するコドンであるこ
ともある。ところが、哺乳類細胞にはgagまたはenv遺伝
子に関してタンパク質分解的プロセシングがあるらし
い。このプロセシングには、余分なアミノ酸の除去が含
まれる。
【００１７】種々のドメインを単離するには、プロウィ
ルスを制限エンドヌクレアーゼで消化し、断片を電気泳
動して、適切な大きさを有し、プローブが使用できる場
合にはこのプローブで２本鎖とした断片を単離し、クロ
ーニングベクターでクローンし、ベクターからこれを切
り取る。次いで、この断片を発現用に手術する。余分な
ヌクレオチドは、Bal31の消化によって一方または両末
端から除去する。制限酵素切断地図を作成することによ
り、都合のよい制限部位を暗号化領域の外側または内側
に位置付ける。アミノ酸を変化させたり、あるいは変え
ることなく（隠れた変化）、コドンを変化させ得る場
合、制限部位を導入したり除去するために、末端を決め
たり、挿入、欠失、点または多重突然変異等を行うため
にプライマー修復、または試験管内突然変異誘発を行う
ことができる。遺伝子を先端切断（truncate）した場
合、アダプターを用いて失われたヌクレオチドと置き換
える。暗号化領域を結合して好適な読取り枠を確保する
のにアダプターは特に有用である。
【００１８】hTLRゲノムのenv領域は、プロウィルスをE
coRIおよびKpnIで消化し、3300塩基対（bp）断片を精製
することによって得ることができる。この断片には、約
400bpの５'−非暗号化領域と約200bpの３'−非暗号化領
域が含まれている。読取り枠の５'−末端の配列によっ
て暗号化されている３個のメチオニンは、翻訳開始部位
として役立つ。
【００１９】プロウィルス配列をSacIおよびEcoRVで消
化すると、gagドメイン（領域）と、gag領域の３'−末
端側に第２の小さい読取り枠を含んでいる約2300bpの断
片が得られる。このgagドメインは約1500bpであって、
プロセシングにより約25,000（p25）、16,000（p16）お
よび12,000（p12）ダルトンのタンパク質を与える大き
い前駆体タンパク質を暗号化している。また、SacIおよ
びBglIIで消化を行ってもよく、この場合はp12およびp2
5ならびにp16の一部を含んでいるgagドメインのみが得
られる。
【００２０】上記のものをKpnIおよびSstIにより消化す
ると、p31を暗号化しているpolドメイン部分を含んでい
る断片が得られる。
【００２１】上記のDNA配列群によって発現されるポリ
ペプチド類は、多方面にわたって利用できる。これらの
ポリペプチドまたは免疫的活性を有するその断片は、標
識し、または標識していない形で、または固定化（即
ち、固体表面と結合させて）して診断試薬として使用で
き、また、例えば阻止抗体等のモノクローナル抗体の生
産により、ワクチンとして使用することができる。
【００２２】DNA配列を、ウィルスのような他の配列
（例えば、ワクチニアウィルスやアデノウィルス等）と
結合させて、ワクチン化に使用することができる。具体
的に言うと、宿主によって免疫原として認識されるhTLR
抗原を与えるように、ワクチニアウィルスに該ウィルス
抗原のDNA配列を、それが発現され得る部位へと挿入す
る。gag、polまたはenv遺伝子、免疫原性を暗号化して
いるそれら遺伝子の断片が使用できる。
【００２３】もう１つの別法は、gag、envまたはpol領
域またはそれらの一部を、HBsAg遺伝子、またはpre-S H
BsAg遺伝子、または免疫原性を有し、例えば酵母のよう
な単細胞微生物宿主または哺乳動物中で粒子を形成し得
るそれらの一部分と結合させる方法である。このように
して、組立てられた粒子を宿主に接種すると宿主にとっ
てhTLR免疫原となる粒子が生成する。
【００２４】該免疫原は、ワクチンとして種々の形で、
経口、非経口、静脈内、動脈内、皮下等、様々の経路で
投与することができる。通常、これらは生理学的に許容
し得る担体、即ち一般に、蒸留水、リン酸緩衝食塩液、
生理食塩液等に加えて投与する。水酸化アルミニウムの
ような種々のアジュバントを加えることができ、投与
量、投与回数および投与方法は経験的に決定する。
【００２５】hTLR配列を得るために、感染宿主細胞の上
清からウィルスをペレット化することができる。低融点
アガロースゲル中で、ウィルスRNAの電気泳動を行った
後、フェノール抽出により、９kbのRNA種を精製する。
次に、この精製RNAを鋳型として使用し、ランダム・プ
ライヤーと共に逆転写酵素反応にかける。次いで、得ら
れたcDNAを、感染細胞および非感染細胞からのポリA＋R
NAとのハイブリダイゼーションによってスクリーニング
する。感染細胞のものとはハイブリダイゼーションする
非感染細胞からのものとはハイブリダイズしないものが
hTLRに関係している。
【００２６】感染細胞から得られるゲノムDNAを制限酵
素で消化し、これを使用してバクテリオファージ・ライ
ブラリーを作成することができる。先に得られたレトロ
ウィルス断片の制限分析に基づいて、ウィルス・ゲノム
をEcoRIで部分消化し、９kb〜15kb DNA断片を単離し、
ライブラリーの作成に使用する。得られた組換え体ファ
ージを、ウィルスcDNAプローブを使用する二重リフト・
スクリーニング法によってスクリーニングし、次いでこ
れを、例えばプラーク精製などによりさらに精製し、大
型液体培養により増殖させる。このライブラリーから、
ウィルスの完全配列を得ることができ、前記のプローブ
で検出できる。
【００２７】hTLR・DNA（それがプロウィルスであって
も、cDNAであっても）は、都合よい任意のベクターでク
ローンすることができる。hTLR・DNAは、それが完全なh
TLRであっても、あるいはその断片であっても、微生物
宿主内で（それは哺乳類、酵母、節足動物、植物等、原
核細胞または真核細胞の何れであってもよい）機能し得
る複製系に連結できる場合であれば、組立物は、環状ま
たは線状の何れにも調製することができる。微生物宿主
には、イー・コリ（E.coli）、バチラス・サブチリス
（B.subtilis）、シュードモナス・アエルギノーザ（P.
aerugenosa）、エス・セレビシアエ（S.cerevisiae）、
エヌ・クラッサ（N.crassa）等が含まれる。複製系は、
Col E１、２mμ、プラスミド、λ、SV40、ウシ乳頭腫ウ
ィルス等、即ち、プラスミドおよびウィルスの何れのも
のであってもよい。組立物は、複製系およびhTLR・DNA
以外に、形質転換またはトランスフェクトされた宿主を
選択し得る、通常、１またはそれ以上のマーカーを含ん
でいる。マーカーとしては、例えば抗生物質、重金属に
対する耐性のような微生物殺滅剤に対する抵抗性、栄養
素要求性宿主（オークソトロフィー）に原栄養体（プロ
トトロフィー）を与える相補性等が含まれる。
【００２８】発現のためには、発現ベクターが使用され
る。微生物における発現では、発現ベクターはクローニ
ングベクターと異なり、転写および翻訳の開始および停
止の調節シグナルを有しており、発現宿主において機能
し得る複製系を含むこともあり、含んでいないこともあ
る。暗号配列は、調節コントロールを受けるように開始
および停止の両調節シグナルの間に挿入する。さらに発
現ベクターは、例えば、温度に鋭敏な、または化学薬品
により誘導される調節可能なプロモーター、または、t
k、dhfr、金属チオネイン等のような、ベクターとhTLR
・DNAの組込みおよび増幅を可能にする遺伝子等を含ん
でいることもある。
【００２９】発現ベクターは、調節機能が宿主内で機能
する適切な宿主へ導入する。発現宿主を好適な栄養培地
中で増殖させ、所望のポリペプチドを生産させる。ポリ
ペプチドが分泌されたら、細胞または培地からこれを単
離する。
【００３０】転写および翻訳の調節シグナルが機能し得
る宿主を使用する場合、hTLR・DNAを操作し、調節シグ
ナルに並置させて所望のポリペプチドが発現されるよう
にする。
【００３１】ポリペプチド生産物は、特にヒト細胞に由
来する残渣を含まない、実質的に純粋な形で得ることが
できる。この残渣は、タンパク質、多糖類、脂質、核
酸、ウィルス、細菌類、真菌類等、およびその組合せの
ような汚染物から成っている。一般に、該ポリペプチド
生産物の有する発現宿主からの夾雑物は0.1(重量)％よ
り少なく、通常は0.01％より少ない。所望のポリペプチ
ドが、細胞質内で生産されたか、または分泌されたかに
よって、単離の方法は変わってくる。生産物が細胞質内
にある場合は、細胞を回収し、酸素分解し、生産物を抽
出し、溶媒抽出、クロマトグラフィー、ゲル排除、電気
泳動等によって精製する。分泌されている場合は、所望
の生産物を栄養培地から抽出し、上記の方法に従って精
製する。
【００３２】env、gagおよびpol遺伝子、および免疫原
性部位を有するそれらの免疫原性断片の発現生産物は、
hTLR抗原に結合する抗体存在の有無を測定する患者血液
の抗血清スクリーニングに使用することができる。１ま
たはそれ以上の組換え体抗原が、この血清学的測定に使
用できる。好ましい測定の態様は、gag、envおよびpol
抗原の組合せを使用する。p25、p31およびenv組換え体
抗原の組合せが特に好ましい。標識した、または標識し
ない抗原、または固定化抗原を含め、極めて多様な免疫
測定手法を使用することができる。標識物としては、蛍
光体、放射性核種酵素、化学発光体、磁気粒子、酵素基
質、補助因子または阻害物質、配位子(リガンド)等を挙
げることができる。
【００３３】特に都合のよい手法は、測定管の表面また
は測定板のウェル(井戸)、またはニトロセルロースまた
はナイロンのような物質のようにタンパク質を結合する
支持体に抗原を結合し、試料をこの固定化抗原と接触さ
せる方法である。支持体を洗浄して、非特異的結合抗血
清を除去した後、標識したヒトＩg（免疫グロブリン）
抗体を加える。次いで、支持体をもう一度洗浄して、結
合していない標識抗ヒトＩgを除去する。次いで、標識
物を検出することにより、結合している被検物質の存在
量を測定する。
【００３４】イライサ法（ELISA）および「ドット・ブ
ロット（dot-blot）」測定法は、抗hTLR抗体について血
液または血清試料をスクリーニングするのに特に有用で
ある。イライサ測定法は、抗原性hTLRポリペプチドで被
覆してあるウェル(井戸)を有する微量滴定皿を使用す
る。ウェルはまた、試料中の抗体がウェル表面と非特異
的結合をすることを避けるため、上からさらに非抗原性
タンパク質で被覆してある。試料をウェルに加え、抗原
−抗体結合に好ましい条件下で、好適な時間、インキュ
ベートする。
【００３５】試料中に存在している抗hTLR抗体は、ウェ
ル壁の抗原または抗原群と結合する。次いで、試料を除
き、ウェルを洗浄して残っている未結合試料を除く。酵
素標識をしてあるヒト免疫グロブリンを含有している試
薬をウェルに加え、標識した抗ヒトＩg抗体と、ウェル
壁に結合しているhTLR抗原−ヒト抗体複合体との間に結
合が生じるように、インキュベートする。インキュベー
ション完了後、試薬を除去し、ウェルを洗浄して未結合
の標識試薬を除く。次いで、基質試薬をウェルに加え、
インキュベートする。基質に対する酵素活性を、肉眼的
または分光学的に測定し、ウェル表面に結合している抗
hTLR抗体含有免疫複合体の存在および量の測定値（indi
cation）とする。
【００３６】「ドット・ブロット」法は、抗原被覆した
微量滴定皿を使うより、むしろニトロセルロース濾紙ま
たはナイロン膜のような吸水性の支持材料小片の１個ま
たは１枚に固定化したhTLR抗原を使用する。支持体はま
た、抗体と支持体との非特異的結合を防ぐため、さらに
非抗原性タンパク質で処理しておく。抗原を保有してい
る支持体を試料中に浸し、そのままインキュベートす
る。この場合も、試料中にある抗hTLR抗体は、支持体に
固定化してある抗原と結合する。好適なインキュベーシ
ョン時間を経過した後、支持体を試料から取り出し、こ
れを洗浄用緩衝液に繰り返し浸して、結合しなかった試
料を濾紙から除く。次いで、支持体を酵素標識ヒトＩg
抗体試薬に浸し、好適な時間、インキュベートする。標
識試薬で処理した後、支持体を洗浄用緩衝液に浸し、次
いで、基質液中でインキュベートする。支持体上の抗hT
LR抗体含有複合体の存在を示す酵素活性によって支持体
上に色の変化が起こり、これは光学的に検出できる。
【００３７】これらの手法の何れの場合でも、酵素以外
の標識を用いて修飾することができる。それに伴って読
取り相または検出相を変える。
【００３８】また、hTLRの抗原性ポリペプチド類は、そ
れ自体または他のポリペプチドと結合させることによ
り、免疫原として、治療または診断に使用し得る抗血清
またはモノ・クローナル抗体の生産に使用することがで
きる。免疫グロブリンは、任意のの哺乳類供給源、例え
ば、ラットまたはマウスのようなゲッ歯類、ヒヒ、サ
ル、またはヒトのような霊長類等から得ることができ
る。診断のためには、臨床試料中のhTLRを通常の方法で
検出するのに、この抗体を使用できる。
【００３９】また、hTLR、DNA配列を、同位元素または
非同位元素の標識またはマーカーで標識し、天然のhTLR
ヌクレオチド配列を含有していることが予測される試料
中の該ヌクレオチド配列を検出するDNAプローブとして
使用することができる。
【００４０】本発明より詳細に説明するため、以下に実
施例を挙げる。但し、本発明はこれらの実施例に限定さ
れるものではない。
【００４１】
【実施例】１．エイズ関連ウィルス−２（ARV-2）の精
製およびウィルスRNAの作成 ARV-2に感染させたHUT-78細胞（ATCC受理番号、CRL857
9、1984年8月7日、寄託）は、カリホルニア大学（サン
フランシスコ）のジェイ・レビー（Jay Levy）博士から
入手した。培養は、10％ウシ胎児血清を含んでいるRPMI
培地で２週間、増殖させた。SW-28ローターを使用し
て、２Krpmで１時間、４℃で培養を遠心した。ウィルス
を含有している得られたペレットを、氷上で、10mMトリ
ス−HCl（pH7.5）に再浮遊させた。再浮遊させた該ペレ
ットを10μg DNAエース〔ベーリンガー・マンハイム（B
oehringer-Mannheim）〕で処理し、直線状ショ糖勾配
（15〜50％、10mMトリス−HCl（pH7.5）、１mM EDTA、2
0mM NaCl中〕で層化した。ショ糖勾配をSW-41ローター
で、４℃で４時間、34Krpmで回転した。2.5mlづつの５
画分を採取し、それぞれその一部を、１％アガロース＋
５mM水酸化メチル水銀ゲルで電気泳動し〔ベイリー（Ba
iley）およびダビッドソン（Davidson）、アナリティカ
ル・バイオケミストリー（Anal. Biochem.)、70巻、75
〜85（1976年）〕、９kbのウィルスRNAが含まれている
ことを測定した。ウィルスRNAを含有している画分を10m
Mトリス−HCl（pH7.5）、１mM EDTAで10mlに希釈し34Kr
pmで、２時間４℃で遠心した。ペレットを20mMトリス−
HCl（pH7.6）、10mM EDTA、0.1％SDSおよび200μ/mlの
プロティナーゼＫに再び浮遊した。室温で15分間インキ
ュベートした。混合物をフェノールで抽出し、水相にNa
Clを加えて400mM濃度とし、エタノールで沈澱させた。
ペレットを再び水に浮遊し、−70℃で貯蔵した。上記の
ごとくして得られた核酸ペレットに含まれているウィル
スRNAを精製するため、試料を５mM水酸化メチル水銀を
含有している低融点１％アガロースゲルで電気泳動し
た。電気泳動後、ゲルを0.1％臭化エチジウムで染色
し、核酸バンドを紫外光下で観察した。９kbに対応する
領域をゲルから切り出し、アガロースを３容量の0.3M N
aCl、10mMトリス（pH7.5）、１mM EDTA中で、70℃で２
〜３分間溶融した。混合物を等量のフェノールで抽出し
た。もう一度、水相をフェノールで抽出し、エタノール
で沈澱させた。ペレットを95％冷エタノールで洗浄し、
空気乾燥し、もう一度水に浮遊させ、使用時まで−70℃
で貯蔵した。100mlの培地から0.5〜１μgの精製RNAが得
られた。
【００４２】２．標識したホモローガス（相同）ウィル
ス・プローブの合成 マニアチス（Maniatis）ら〔ア・ラボラトリー・マニュ
アル（A Laboratory Manual）、コールド・スプリング
・ハーバー（Cold Spring Harbor、NY）、1982年〕の記
載のごとく作成したランダム・プライマー（ウシ胸線プ
ライマー）を使用して、ゲル精製を行ったウィルスRNA
に対して32Ｐ−標識cDNAを作成した。反応混合物は、50
μlの反応容量中に、0.5M MgCl2 ２μl、0.1Mジチオス
レイトール５μl、各2.5μlづつの10mM dATP、10mM dGT
Pおよび10mM dTTP、2.5μlウシ胸線プライマー（100A
260/ml）、0.5μlウィルスRNA、５μlアクチノマイシン
Ｄ（200μg/ml）、10μl 32Ｐ−dCTP（＞3000Ci/ミリモ
ル、１mCi/ml）および１μlANV逆転写酵素（17単位/μ
l）を含有していた。反応を37℃で１時間インキュベー
トした。プローブを、遊離ヌクレオチド類からセファデ
ックス（Sephadex）G50カラムを用いるゲル濾過により
分離精製した。ボイド（空）容量をプールし、NaClの最
終濃度が400mM、またはキャリアー１本鎖濃度が100μg/
mlとなるように加え、エタノールでcDNAを沈澱させた。
ペレットを水に再浮遊させ、取り込まれた。32Ｐのカウ
ントを測定した。
【００４３】３．感染HUT-78細胞から作成したポリA＋R
NA中のARV配列の検出 ARV-2、ARV-3またはARV-4（３人の異なるエイズ患者か
ら、それぞれ単離した３種の異株）で感染させたHUT-78
細胞と、非感染HUT-78細胞から、それぞれポリA＋RNAを
作成した。ポリA＋RNAを、５mM水酸化メチル水銀含有0.
1％ゲルで電気泳動し（ベイリーおよびダビッドソン、
前掲）、これをニトロセルロース・フィルターヘ移し、
第２項に記載した相同プローブを用いてハイブリダイズ
した。ハイブリダイゼーションは、50％ホルムアミド、
３×SSC中で、42℃で行った。洗浄は0.2×SSC中で、50
℃で行った。感染HUT-78細胞の３つの試料すべてに、９
kbバンドが存在した。非感染細胞から得たポリA＋に
は、このバンドは存在していなかった。
【００４４】４．感染、および非感染HUT-78細胞内のAR
V配列の検出 ルシウ（Luciw）らの方法〔モレキュラー・アンド・セ
ルラー・バイオロジー（Molec and Cell Biol）、４
巻、1260〜1269（1984年）〕に従って、ARV-2感染HUT細
胞の培養、および非感染HUT-78細胞から高分子量DNA
（染色体性）を作成した。このDNAを、サザーンの記載
の方法（1975年、前掲）に従って、制限酵素で消化し、
１％アガロースゲルで電気泳動し、ニトロセルロースに
ブロットした。ブロットを32Ｐ−標識プローブ（106cpm
/ブロット）と共に、50％ホルムアミド、３×SSC、10mM
ヘペス (Hepes) (pH7.0) 100μg/mlの変性したキャリア
ーDNA、100μg/ml酵母RNAおよび１×デンハート液（Den
hardt's）を含有する混合液中で、42℃で36時間、ハイ
ブリッド化した。フィルターを室温で１回、２×SSCで
洗浄し、次いで、２回42℃で0.2×SSC、0.1％SDSで洗浄
した。フィルターを空気乾燥し、増感スクリーンを用
い、Ｘ−オーマット（X-Omat）、フィルムに露出した。
【００４５】ARV-2と相同である32Ｐ−プローブは、Sac
Iで制限消化した感染細胞から、２本のバンドを特異的
にDNAにハイブリッド化した。非感染細胞のDNAを使用し
た場合、これらのバンドは存在しなかった。このことか
ら、プローブは染色体DNAに組み込まれて、特異的に感
染細胞にハイブリッド化し、結局プロウィルスにハイブ
リッド化されることが分かる。これらのバンドの分子量
は、ほぼ５kbおよび３kbである。
【００４６】プロウィルスの配列を別の酵素で切断した
場合を検討するため、EcoRI、SphIまたはKpnIまたはそ
れらの２つを使用する二重消化を用い、細胞DNAのいろ
いろな制限消化を行った。サザーン・ハイブリダイゼー
ションの成績から、感染細胞のDNAを使用した場合は、
特異的なバンドがハイブリッド化されることが分かる。
図１はプロウィルス配列における制限酵素部位の位置を
示した模式的地図であり、断片部位を示している。
【００４７】５．プロウィルスARV-2 DNAのクローン化 ルシウらの方法（前掲）に従って、感染HUT-78細胞から
高分子量細胞DNAを作成した。このDNAをEcoRI（これは
プロウィルスを１回切断する）で消化して、ショ糖勾配
で遠心し、８〜15kbに対応する画分をプールし、これを
透析し、エタノール沈澱によって濃縮した。バクテリオ
ファージλ誘導体をクローン化したベクターEMBL-4〔カ
ーン（Karn）ら、メソッズ・オブ・エンザイモロジー
（MethodsEnzymol）、101巻、３〜19（1983年）〕を、E
coRI、BamHIおよびSalI制限酵素の混合物で完全に消化
し、次いで、フェノール−クロロホルム抽出によって該
DNAを除タンパクし、冷エタノールで沈澱させ、ライゲ
ーション緩衝液に再浮遊させた。このEMPL-4ファージDN
Aと、細胞DNAのEcoRI消化物を混合し、連結（ライゲー
ト）し、得られた組換え体ファージゲノムをイン・ビト
ロ（試験管内）でパッケージした。λ−感受性イー・コ
リ（E.coli）(DP50−SupF）にファージを感染した後、
約500,000個のファージ・プラックをニトロセルロース
上に移入し、DNAを固定して、第２項の記載のごとく作
成した相再32Ｐ−プローブで該フィルターをスクリーニ
ングした。500,000ファージの中から選ばれた11個の組
換え体ファージを最初の二重リフト・スクリーニング法
〔マニアティス（Maniatis）ら、モレキュラー・クロー
ニング、ア・ラボラトリー・マニュアル（Molecular Cl
oning, A Laboratory Manual）、1982年〕によって、ウ
ィルスcDNAプローブにアニーリングし、これらをさらに
プラック精製し、次いで、組換え体DNAを作成するた
め、大型液体培養で増殖させた。プラック精製したARV
・DNAを含んでいるファージは、液体培養で、イー・コ
リ（E.coli）DP50−supFに繁殖させた。ファージ粒子を
回収し、CsCl勾配中でバンドをとり、フェノール抽出
後、エタノール沈澱によって組換え体ファージDNAを作
成した（マニアティスら、前掲）。精製ファージDNA１
μgを制限酵素で消化し、１％アガロースゲルで電気泳
動し、臭化エチジウムで紫外光下に視覚化した。これら
のゲルから得られたDNAをニトロセルロースに移し、ウ
ィルスのcDNAプローブとアニーリングした。
【００４８】11個のファージのうち、λARV-2（9B）と
命名された１つは、1985年１月25日にATCCに寄託され、
受入れ番号40158が与えられた。λARV-2（9B）は周辺細
胞配列と共にプロウィルスDNAの完全鎖長の挿入を含ん
でいた。λARV-2（9B）をSacIで消化すると、3.8kbおよ
び5.7kbウィルスDNA断片が得られた。λARV-2（9B）のE
coRI消化では、6.4kbおよび8.0kbに、DNA種（species）
を含んでいるウィルスを生成した。SacIおよびEcoRIの
二重消化では、3.8kbおよび5.4kbにウィルスDNA断片が
得られた。このパターンは、細胞DNAと連結しているプ
ロウィルスのパターンとよく一致している。
【００４９】λARV-2（9B）以外にも、（１）周辺細胞D
NAへ伸長しているウィルスDNAのEcoRI部位から左半分の
ウィルス・ゲノムを有するファージ（λARV-2（8
A））、および周辺細胞DNAへ伸長しているウィルスDNA
のEcoRI部位から右半分のウィルス・ゲノムを有するフ
ァージ（λARV-2（7D））が得られた。バクテリオファ
ージλARV-2（7D）(右側）およびλARV-2（8A）(左側）
は、1984年10月26日に共にATCCに寄託され、それぞれ、
受入れ番号40143および40144が与えられた。
【００５０】６．多形現象 独立したARV分離体の関連度を調べるため、ARV-3および
ARV-4で感染させたHUT-78細胞から制限酵素で消化して
得たDNA消化物を、クローンしたARV-2 DNAから作成した
プローブで分析した。ARV-3 DNAのSacI消化物はARV-2の
同様の消化物と相似しているが、一方、HindIIIの消化
物は異なったパターンを示していた。ARV-4 DNAのSacI
消化物およびPstI消化物は、ARV-2 DNAの対応する消化
物と異なっている。ARV-3およびARV-4試料で得られたア
ニーリング・シグナル強度は、ARV-2 DNAの場合よりも
はるかに低い（約10倍低い）多分、このことはARV-3お
よびARV-4培養において感染した細胞が、比較的少ない
事実によるものであろう。ARV-3およびARV-4のDNAをSac
Iで処理することによって生成したウィルス特異性DNA
は、総計して9.0〜9.5kbpであり、これはARV-2の値と相
似した値であり、該RNAゲノムの大きさとよく一致して
いる。
【００５１】７．プロウィルスDNAの配列決定 λファージ9BからのARV-2の断片および下位断片（サブ
フラグメント）を作成し、通常の方法（マニアティス
ら、前掲）によりM13へとクローンした。配列決定は、
サンガー（Sanger）ら〔プロシーディング・オブ・ナシ
ョナル・アカデミー・オブ・サイエンシズUSA（Proc. N
atl. Acad. Sci. USA）、74巻、5463（1977年）〕に従
い、共通のM13プライマー、または化学的に合成したARV
-2配列に相補的なプライマーを使用して実施した。その
配列を図２および図３に示す。
【００５２】８．p25およびp16gagが暗号化しているタ
ンパク質のアミノ酸配列 第１項に記載のごとく、ARV-2を作成し、精製した。ウ
ィルスのタンパク質をアクリルアミドゲルで電気泳動
し、24,000ダルトンおよび16,000ダルトンのタンパク質
に対応しているバンドをゲルから切り取り、配列決定に
使用した。アプライド・バイオシステム（Applied Bios
ystem）470A型タンパク質アミノ酸配列分析装置を使用
し、ヒューイック（Hewick）ら〔ジャーナル・オブ・バ
イオケミストリー（J. Biol. Chem.）、256巻、7990〜7
997（1981年）〕の記載と同様にして、微量配列分析を
行った。フェニルチオヒダントイン・アミノ酸は、ホー
ケ（Hawke）ら〔アナリティカル・バイオケミストリー
（Anal. Biochem.）、120巻、302〜311（1982年）〕の
報告のごとく、ベックマン・ウルトラスフェア・ODS・
カラム（Beckman ultrasphere ODS column）を使用し、
トリフルオロ酢酸−アセトニトリル・バッファー系を使
用するHPLCにより、同定した。表１はp25-gagタンパク
質について測定したアミノ末端からの最初の20アミノ酸
を示しており、表２はp16-gagの最初の30アミノ酸を示
している。
【００５３】
【表１】
【００５４】
【表２】
【００５５】表１のアミノ酸配列は、表２のARV-2 DNA
配列から予見される。従って、これらの結果から、提示
されたgagの読取り枠が実際に翻訳されているというこ
と、およびそれがp25およびp16のＮ−末端を確定してい
るということが確かめられた。
【００５６】９．細菌内ARV-2のp25gagタンパク質の発
現 Ａ．宿主ベクター系 p25タンパク質はプラスミドpGAG25-10を導入したイー・
コリ（E.coli）のD1210株によって合成する。
【００５７】プラスミドpGAG25-10はpBR322誘導体であ
って、trpとlac UV5プロモーター配列から誘導されたハ
イブリッドtacプロモーター〔デ・ボア（DeBoer）ら、
プロシーティングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・
オブ・サイエンシズUSA（PNAS）、80巻、21〜55（1983
年）〕の転写コントロールの支配下にあるp25暗号配列
を含んでいる。p25gagの発現は、イソプロピルチオガラ
クシド（IPTG)によって細菌性形質転換株に誘発され
る。
【００５８】イー・コリD1210は、ラクトースリプレッ
サー過剰生産株で、染色体にlacIqおよびlacY+の対立遺
伝子を持っているが、それ以外は、その誘導されたもと
のイー・コリ（E.coli）HB101（F-lacI+、lacO+、lac
Z+、lacY-、gal-、pro-、leu-、thi-、end-、hsm-、hsr
-、recA-、rpsL-）と同一である。
【００５９】Ｂ．pGAG25-10の組立て プラスミドpGAG25-10は、図４の模式図に示したよう
に、p25gagを暗号化している699bpのDNAをプラスミドpt
ac5へクローンすることにより組立てられる。ベクターp
tac5は、tacプロモーター、シャイン・ダルガルノの配
列、およびEcoRIおよびPvuIIの制限部位の間にもとのpB
R322の置換物として含まれているポリリンカーを含んで
いるpBR322の誘導体である。
【００６０】699bp断片は、完全なp25gagタンパク質を
含んでいるが（図２および図３、139番から369番までの
アミノ酸残基）、但し、翻訳開始を行わせるため、メチ
オニンを最初のアミノ酸としてpGAG25-10に付け加えて
いる点だけが異なっている。この変更だけでなく、下記
に示したヌクレオチド配列における他の変化も、該DNA
断片の各部分の化学合成を用いることによって達成し
た。また、該DNAは配列の３'末端に２つの停止コドンを
含んでいる。
【００６１】図５は、pGAG25-10にクローンしたヌクレ
オチドと、それから誘導されるアミノ酸配列を示してい
る。DNAは、この図では下線を引いて示してないが、ARV
-2（9B）cDNAから直接誘導した。その他の配列は、すべ
て化学的に合成するか、ベクターptac5から誘導した。
もとになるcDNAに関連して、制限部位を新たに設け、ま
たは欠失し、プロリンの前にメチオニンを加え（p25の
最初の残基）、またはp25の最終コドンの後に停止コド
ンを含める等の変化を、このDNA配列に導入した。但
し、予め示したように、最初のコドンの場合を除き、該
DNA配列におけるすべての変化はp25gagのアミノ酸配列
を変化させるものではない。
【００６２】Ｃ．D1210（pGAG25-10）株の作成と、形質
転換株によって発現されるp25gagタンパク質の形質決定 イー・コリ（E.coli）D1210細胞は、標準プロトコール
に照らして形質転換に適格なものを作成する〔コーエン
（Cohen）ら、プロシーディングズ・オブ・ナショナル
・アカデミー・オブ・サイエンシズUSA（PNAS）、69
巻、2110（1972年）〕。形質転換は、pGAG-25-10の25〜
50ngを用い、プロトコールの指示のごとく遂行する。10
0μg/mlアンピシリンを含有しているＬ−ブロス内で調
製した寒天平板上に形質転換混合物を置く。平板を37℃
で12時間、インキュベートする。
【００６３】単集落アンピシリン耐性コロニーを100μg
/mlアンピシリン含有Ｌ−ブロス１mlに移し、37℃で増
殖させる。100mM IPTG〔シグマ（Sigma）〕10μlを最終
濃度１mMとなるように加え、37℃で２時間インキュベー
トすることにより、p25gagタンパク質の発現を誘導す
る。
【００６４】誘導培養の１mlから細胞をペレットとし、
これをラエムリ（Laemmli）サンプル・バッファー100μ
lに再浮遊させる。煮沸と凍結を３回反復した後、得ら
れた分解物の一部を標準変性アクリルアミドゲル上で分
析する。タンパク質はクーマシー・ブルーで染色するこ
とによって視覚化する。
【００６５】発現の程度はまず、誘導検体試料によって
新しく出現するタンパク質バンドを、対照と比較するこ
とにより測定する。
【００６６】発現した遺伝子から予想される分子量のタ
ンパク質は、既知量の標準タンパク質を対照とする肉眼
的検査による測定で、最高に発現している組換え体の場
合でも、細胞タンパク質合計の２％〜５％であった。
【００６７】発現されたタンパク質の信頼性は、標準的
ウェスタン法によってタンパク質をニトロセルロースに
移し、好適なヒトまたは家兎の免疫血清、またはマウス
の単クローン性抗体で分析するか（下記のＥ．４．ａを
参照）、またはエイズ患者から得られたヒト免疫血清を
使用する。易溶性イー・コリ（E.coli）タンパク質のイ
ライサ（ELISA）測定法（下記のＥ．４．ｂ）により測
定した。
【００６８】Ｄ．発酵工程 Ｄ．１．形質転換されたマスター・シード・ストックの
調製 p25gagを高レベル（３％）に発現している培養物から得
た形質転換細胞をアンピシリン100μg/mlを含んだＬ−
ブロス平板上に画線接種し、この平板を一夜、37℃でイ
ンキュベートする。単一のコロニーをアンピシリン100
μg/mlを含んだＬ−ブロス10mlに接触し、37℃で一夜増
殖させる。その一部を用い、SalIおよびPstIによる制限
マッピングによってプラスミド構造を確かめる。さらに
培養物の一部を用いてp25gagの発現を誘導し、残りの培
養物に１/４容量の75％滅菌グリセリンを加えて15％グ
リセリン濃度に調製する。グリセリン細胞ストックを１
mlづつに分けて、液体窒素またはドライアイス−エタノ
ール浴中で素早く凍結させる。これらのマスター・シー
ド・ストックを−70℃で保存する。
【００６９】Ｄ．２．マスタープレート／単一コロニー
およびその一夜培養物 マスター・シード・ストックを滅菌したアプリケーター
で削り取り、これをアンピシリン100μg/mlを含んだＬ
−ブロス平板に画線接種する。この平板から得た単一の
コロニーを20〜50mlのＬ−ブロス／アンピシリンに接重
し、37℃で一夜インキュベートする。
【００７０】Ｄ．３．発酵槽接種 一夜培養物の一部を、より多量（１〜６リットル）のＬ
−ブロス／アンピシリンに接種する。細胞を37℃で、O.
D.650が約５になるまで一夜培養した後、発酵用の接種
物として使用する。
【００７１】Ｄ．４．発酵および収穫 Ｌ−ブロス10リットルと消泡剤１mlとを含有する発酵槽
（容量：1.6リットル）に、接種培養物100〜500mlを接
種する。37℃で、O.D.が約１になるまで細胞を培養す
る。発酵槽に最終濃度が１mMになるよう、IPTG溶液（10
0mM）100mlを加えて、p25gagの発現を誘導する。さらに
３時間、細胞を増殖させ、次いで、連続的な浮遊遠心法
（flow centrifugation）によって収穫する。この段階
で細胞を凍結し、p25gagの純化が進行するまで−20℃に
保持する。あるいは、接種培養物１〜５リットルを250
リットルの発酵槽に接種する。増殖、誘導および発酵は
先に記載したようにして行う。
【００７２】Ｅ．p25gagの精製および特性化 Ｅ．１．細胞の破壊 凍結大腸菌（E.coli）細胞を解凍し、2.5容量の溶菌バ
ッファー〔0.1Mリン酸ナトリウム（NaPi）、pH7.5、１m
M EDTA、0.1M NaCl〕に懸濁する。ダイノ・ミル（Dyno
Mill）の300mlガラス・ユニット（3000rpm）と、酸で洗
浄したガラスビーズ140mlを用いて細胞を非連続的な系
で破壊する。ジャケットでくるんだ容器を、−20℃のエ
チレングリコール溶液で冷やしてやく。破壊された細胞
を27,000xgで25分間遠心し、残骸とガラスビーズを除
く。上清を回収し、４℃に保つ。
【００７３】Ｅ．２．タンパク質の選択沈澱 ４℃で硫酸アンモニウムをゆっくり加えることにより、
細胞抽出物（エキス）を30％(NH4)2SO4に調製する。こ
の最終濃度に達した後、該抽出物を27,000xgで20分間遠
心する。得られたペレットを、１M NaCl、１mM EDTA、
１％トリトンX-100および５％SDSに再懸濁した後、５分
間煮沸する。
【００７４】Ｅ．３．ゲル濾過 選択沈澱で得たフラクションを、0.03M NaPi（pH6.8）
で平衡化したG50セファデックスカラムを用いてゲル濾
過する。同じ溶液中でクロマトグラフィーを展開させ
る。フラクションを集め、280nmにおける吸収を測定す
る。タンパク質含有フラクションをプールし、タンパク
質ゲル電気泳動（ウェスタン・アナリシス）およびELIS
A法によって特性化する。
【００７５】Ｅ．４．組換えp25gagの特性化 ａ．タンパク質ゲル電気泳動 pGAG25含有細胞と対照細胞から得られるタンパク質をSD
S-ポリアクリルアミドゲル分析（10％〜20％のグラディ
エントゲル）にかけたところ、分析結果は、tacIプロモ
ーターをIPTGで脱抑制した後のp25gag発現プラスミド含
有細胞において、分子量約25,000の様々なレベルのタン
パク質が明確に誘導されていることを示していた。p25g
ag遺伝子産物の同定は、いずれも、AIDS患者の血清およ
びウィルス性p25gagに対するモノクローナル抗体を用い
た、酵素−結合イムノアブソーバント・アッセイ（ELIS
A、Ｅ．４．ｃ．参照）およびウェスタン・イムノブロ
ット・アナリシス（Ｅ．４．ｂ．参照）で行った。
【００７６】ｂ．ウェスタン分析 試料を、10％〜20％ポリアクリルアミドグラディエント
ゲル上、変性条件下で電気泳動させた。試料をニトロセ
ルロース上に電気的にブロットした。このニトロセルロ
ースペーパーを、AIDS患者の標準血清〔EW5111、P.フェ
オリノ（P.Feorino）、センターズ・フォ・ディディー
ズ・コントロール（Centers for DiseaseControl）、ア
トランタ、ジョージア〕の１：250希釈液、次いで、HRP
と、ヒト−イムノグロブリンに対するヤギ抗血清との複
合物（コンジュゲート）〔カペル（cappel）、No. 3201
-0081〕の１：500希釈液で洗浄した。別法として、ニト
ロセルロースを、76C、即ち、ARV-2 p25gagに対するネ
ズミ−モノクローナル抗体の希釈されていない培養上
清、次いでHRPと、マウス−イムノグロブリンに対する
ヤギ抗血清とのコンジュゲート（TAGO No. 6450）の
１：500希釈液で洗浄してもよい。このイムノブロット
の基質は4-クロロ-1-ナフトールを含有する、HRP発色剤
であった。
【００７７】p25gagタンパク質はAIDS患者の標準血清お
よびモノクローナル抗体のいずれとも反応したが、非−
免疫血清との反応性は示さなかった。
【００７８】ｃ．ELISA 前記のごとくにして細菌抽出物からp25gagを精製した。
精製（純化）タンパク質と血清との反応性を、微量力価
検定用プレートの凹み（ウェル）を0.25μg/mlでコート
し、試験血清（ヒト−負血清の正標準血清EW5111）の希
釈液を加え、次いで、HRPとヒト−イムノグロブリンに
対するヤギ抗血清とのコンジュゲートの１：1000希釈液
を加えることにより、分析した。p25gagタンパク質は正
血清と反応し、その滴定曲線の中点は約１：800であっ
た。健常人からの血清とは反応性を示さなかった。
【００７９】１０．ELISAにおける天然のp25gagタンパ
ク質と組換えp25gagタンパク質との比較 精製した、組換えp25gagの様々な血清に対する反応性
を、プレパラティブ・ポリアクリルアミドゲル電気泳動
法によって精製された天然のp25gagタンパク質のそれ
と、ELISA法により、比較した。破壊し、グラディエン
ト精製したウィルス（５μg/ml）を用いて分析し、対照
とした。
【００８０】PVC微量力価検定用プレートを、ネズミ抗
−p25gagモノクローナル抗体76Cから導かれた腹水のＩg
フラクション10μg/ml、（0.1Mホウ酸ナトリウム（pH9.
0）中、50μl/ウェル）と共に37℃で２時間インキュベ
ートした。プレートをPBSで洗浄した後、各ウェルを、P
BS中に入れた10％正常ヤギ血清で満たした。室温で30分
間インキュベートした後、プレートを0.05％トリトン(T
riton)X-100（ST）を含有する通常の食塩水で洗浄し、
ウェルに、被検ARVタンパク質（10％ヤギ血清を含有す
るST〔STGS〕中、50μl/ウェル）を加えた。プレートを
37℃で２時間インキュベートし、STで洗浄した後、破壊
されたARVに対して惹起されたウサギ抗血清（STGS中、
１：1000希釈液）50μl/ウェルと共に37℃で１時間イン
キュベートした。ウェルを洗浄し、HRPとウサギ−イム
ノグロブリンに対する抗血清とのコンジュゲートのSTGS
中、１：1500希釈液50μlと１時間インキュベートし、
洗浄し、次いで、ウェルに基質溶液（2,2'-アジノ-ジ-
〔3-エチルベンズチアゾレンスルホン酸〕150μg/ml、
0.001％ H2O2、0.1Mクエン酸pH４）を50μg/ウェルの割
合で加えた。37℃で30分間インキュベートした後、10％
SDSを50μl/ウェルの割合で加えることにより、反応を
止めた。414nmにおける吸収は、フロー・タイターテク
（Flow Titertech）ELISAリーダーにより、測定した。
試料は、まず最初１：10に希釈して始め、以後、連続的
に２倍希釈する方法で、２回、測定した。以下の表は、
破壊ウィルスを用いた分析で正に採点された８人からの
AIDS血清、および破壊ウィルス分析で負に採点された６
人の健常人の血清に関する測定結果を示すものである。
【００８１】
【表３】
【００８２】ａ．最大値の50％と同等なシグナルを与え
る血清希釈率の逆数で示してある。 ｂ．前記のごとく、イムノフルオレスセインおよびイム
ノブロッテングにより、結果を確認した。 ｃ．血液希釈率１：25では、シグナルを検出しなかっ
た。
【００８３】以上の結果は、細菌から精製されたp25gag
が、AIDSウィルスから同様に精製されたp25gagと、８人
のAIDS患者の血清のELISAにおいて同様な作用を表すこ
とを示している。ELISAの結果は、抗−p25gag抗体のレ
ベルには広範な変動があること、さらに、いくつかの、
ウィルスにコードされているタンパク質は、従来からの
ウィルスに基づく分析系によっては検出されないことを
示している。
【００８４】１１．細菌内でのARV-2のp41gagタンパク
質の発現 ARV-2のp25gagタンパク質とp16gagタンパク質との融合
物（p41gagと命名）を、プラスミドpGAG41-10で形質転
換された大腸菌株D1210形質転換体中で合成した。pGAG4
1-10は、図４に示すごとく、p53gag前駆体ポリタンパク
質のＣ末端p16gag部分の配列と、p25gagタンパク質の配
列の一部を含む、ARV-2ゲノムのSphI−HpaIフラグメン
トを、pGAG25-10のSphI部位とBamHI部位との間に挿入す
ることにより、プラスミドpGAG25-10から組立てられ
た。pGAG41-10にクローンされたDNA配列の暗号鎖を図６
に示す。形質転換および発現の誘導は、上記の方法で行
われた。細胞を処理し、上記のごとく、クーマシー（Co
omassie）染色ゲル上で観察した。観察されたタンパク
質の分子量の概略値は41,000ダルトンであった。このタ
ンパク質は、上記のごとくにして行ったウェスタン分析
およびELISA分析において、AIDS血清および、p25gagに
対するモノクローナル抗体と反応した。
【００８５】１２．細菌内での、ARV-2のp16gagタンパ
ク質の発現 図７に示した、p16gagタンパク質をコードしている配列
は、酵母にとって好ましいコドンを用いて化学合成され
た。平滑末端SalIフラグメント（321bp）を、PvuII−Sa
lIで消化し、ゲルで単離したptac５にクローンした（上
記９および１１参照）。得られたプラスミドを用いて上
記９のごとくにしてD1210細胞を形質転換した。IPTGに
よって発現を誘導し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動
およびウェスタン分析法により、タンパク質を分析し
た。約16,000ダルトンのバンドは、形質転換細胞中で、
IPTGにより誘導されたものである。このタンパク質は、
ウェスタンブロット法において、AIDS患者の免疫血清と
反応性を有することが分かった。健常人からの血清とは
反応をしなかった。組換えgagタンパク質はCos（哺乳
類）細胞内でも発現した。
【００８６】１３．酵母によるARV-2 envタンパク質の
生産 Ａ．宿主−ベクター系 プラスミドpDPC303で形質転換されたS.セレビシエ（S.c
erevisiae）2150-2-3により、envタンパク質の一部を合
成した。プラスミドpDPC303は、envタンパク質の２/３
に関する暗号配列と、酵母leu2-04遺伝子を含んでいる2
-ミクロン配列およびampR遺伝子を含んでいるpBR322配
列を含有している。envの発現は、酵母のピルビン酸キ
ナーゼプロモーターおよび終止配列の制御下で行われ
る。酵母S.セレビシエ2150-2-3株は、以下の遺伝子型を
有する：Met a、ade 1、leu 2-112、cirO。この菌株
は、Dr.レランド・ハートウェル（Leland Hart well、
ワシントン大学）から入手した。
【００８７】Ｂ．envタンパク質のための酵母発現ベク
ター、pDPC303の組立て プラスミドpDPC303は、ベクターpC１/１のBamHI部位に
クローンされた、envのための「発現カセット（express
ion cassette、下記）」を含有している。ベクターpC１
/１はampRマーカーと酵母leu2-04マーカーとを含む、pB
R322および２ミクロン配列を含有している。これは、pJ
DB219d〔ベッグス（Beggs）、ネイチャー（Nature）(19
78)、275：104〕のpMB９領域をpBR322配列で置き換える
ことにより導かれた。
【００８８】envのための「発現カセット」は、以下の
配列をこの順序（５'から３'ヘ）で融合している：酵母
のピルビン酸キナーゼ（PYK）プロモーター、env cDNA
およびPYKターミネーター。PYKプロモーターおよびター
ミネーター領域は、バーク（Burke）らが記載したごと
くにして単離されたcDNAから導かれた〔ジャーナル・オ
ブ・ザ・バイオロジカル・ケミストリィ（J. Biol. Che
m.）(1983)258：2193〜2201〕。
【００８９】発現カセットにクローンされているenvフ
ラグメントはARV-2 cDNAから導かれており、該フラグメ
ントは、nt 5857からnt 7251のヌクレオチドによってコ
ードされているenvアミノ酸残基をコードしている1395b
pのcDNAフラグメントから成る（図２および図３）。さ
らに、リーディングフレーム内で、メチオニンに相当す
る、５'末端の最初のコドンに５個の余分な（エキスト
ラ）コドンが、また、終止コドンが後続している、リー
ディングフレーム（解読相）内の３'末端に４個の余分
のコドンが融合している。余分なコドンは、もっぱら、
クローニング工程を容易にするために挿入されたもので
ある。
【００９０】図８はpDPC303にクローンされているヌク
レオチド配列の暗号鎖、ならびにそれから導かれるアミ
ノ酸配列を示している。図中、下線の付されていないDN
A配列は上記のARV-2（9B）cDNAから直接導かれた。その
他の配列は全て、化学合成されたか、またはPYKベクタ
ーに由来する。
【００９１】Ｃ．2150（pDPC303）鎖の調製 ハイネン（Hinnen）らの記載〔PNAS（1978）75：1929〜
1933〕に従って酵母細胞S.セレビシエ2150-2-3（Mat
a、ade 1、leu2-04、cirO ）を形質転換し、leu-選択プ
レート上で平板培養した。単一のコロニーをleu-選択培
地に接種し、飽和するまで増殖させた。細胞を収穫し、
下記のごとく、envタンパク質の精製および特性化を行
った。
【００９２】Ｄ．envタンパク質の精製および特性化 Ｄ．１．細胞の破壊 凍結S.セレビシエ2150-2-3（pDPC303）を解凍し、１容
量の溶菌バッファー（１μg/mlペプスタチン、0.01M PM
SF、0.001M EDTA、0.15M NaCl、0.05Mトリス−HCl pH8.
0）に懸濁し、１容量の酸で洗浄したガラスビーズを加
える。ダイノ・ミルの300mlガラスユニット（3000rpm）
内で3000rpmで10分間処理することからなる非連続的な
系で細胞を破壊する。ジャケットを、−20℃のエチレン
グリコール溶液中で保冷する。この混合物を氷上に３分
間放置することにより、ガラスビーズをデカントする。
細胞抽出物を回収し、18,000rpm（39,200xg）で35分間
遠心する。上清を捨て、沈澱（ペレット１）を、以下に
示すごとく、引き続いて処理する。
【００９３】Ｄ．２．不溶性物質のSDS抽出 ペレット１を４容量のトリス−HClバッファー（0.01Mト
リス−HCl pH8.0、0.01M NaCl、0.001M PMSF、１μg/ml
ペプスタチン、0.001M EDTA、0.1％SDS）に再懸濁し、
撹拌下、４℃で２時間抽出する。この溶液を6,300xgで1
5分間遠心する。不溶性のフラクション（ペレット２）
を４容量（360ml）のPBS（１リットル当たり、0.2g KC
l、0.2g KH2PO4、8.0g NaCl、2.9g Na2HPO4・12H2O）、
0.1％SDS、0.001M EDTA、0.001M PMSF、１μg/mlペプス
タチンに再懸濁し、6,300xgで15分間遠心する。得られ
たペレット（ペレット３）を、４容量のPBS、0.2％SD
S、0.001M EDTA、0.001M PMSF、１μg/mlペプスタチン
に懸濁し、これをチューブ・ロッカー（試験管揺動装
置）上で撹拌しながら、４℃において12時間抽出する。
溶液を6,300xgで15分間遠心する。可溶性画分を回収
し、下記のごとくにして精製する。（ペレットは、それ
を４容量の2.3％SDS、５％β−メルカプトエタノールに
再懸濁し、５分間煮沸することによって抽出してもよ
い。煮沸後、溶液を6,300xgで15分間遠心する。次い
で、可溶性画分を回収し、以後の精製に充てる。）
【００９４】Ｄ．３．選択沈澱およびゲル濾過 可溶性画分を、４℃において30％硫酸アンモニウム溶液
にすることにより、濃縮する。得られたペレット（ペレ
ット４）を2.3％SDS、５％β−メルカプトエタノールに
再懸濁し、ACA34（LKBプロダクツ）のゲル濾過用カラム
により、クロマトグラフする。このカラムは、室温で、
PBS、0.1％SDSによって平滑化されている。同じ溶液を
用い、流速0.3ml/分でクロマトグラフィーを展開させ
る。５mlの画分を集め、プールしてタンパク質ゲル電気
泳動法、ウェスタン分析、およびELISA法で特性化す
る。必要ならば、プールしたフラクションをスペクトラ
ポア(Spectrapor)＃２〔MWカットオフ(cut off)12-14
K〕を用いて真空透析（vacuum dialysis）することによ
り、濃縮する。
【００９５】Ｄ．４．組換えenvの特性化 SDSポリアクリルアミドゲル分析（12％アクリルアミド
ゲル）により、env-含有ベクターで形質転換された酵母
細胞内で、新たに55,000ダルトンのタンパク質が合成さ
れていることが示された。この55,000ダルトンのタンパ
ク質は、対照プラスミド（env挿入物を有しないベクタ
ー）で形質転換された細胞中には存在していない。AIDS
患者の血清を用いる、ELISA（９、Ｅ．４．ｃ．参照）
およびウェスタン分析法でenvを同定した。両分析法に
おいて、55,000ダルトンのタンパク質は免疫反応性を示
した。健常人から得た血清とは反応しなかった。組換え
envは哺乳類（Cos）細胞内でも発現した。
【００９６】１４．細菌内でのARV-2のp31polタンパク
質の発現 Ａ．宿主ベクター系 ポリメラーゼ遺伝子（p31pol）のＣ末端領域を、プラス
ミドpTP31.2で形質転換した大腸菌株D1210を用いて合成
した。プラスミドpTP31.2はハイブリッドtacプロモータ
ー（９．Ａ．に記載）の転写コントロール下で、p31の
暗号配列を含有しているpBR322誘導体である。p31は、
細菌性形質転換体をIPTGによって誘導することにより、
発現される。
【００９７】Ｂ．pTP31.2の組立て Ｂ．１．M13テンプレート（鋳型）01100484の組立て pol遺伝子の３'末端、orf-1、envおよびorf-2の５'末端
を含有しており、予め、１％の低融点アガロース〔シー
パック（Sea-Pak）〕ゲル電気泳動にかけ、65℃におい
てフェノール抽出し、100％エタノールで沈澱させた
後、TEに懸濁しておいた、ARV-2（9B）のKpnI消化物か
ら、5.2kb DNAフラグメントを単離した。この物質８μl
を終容量10μlでSstIにより、37℃でさらに１時間消化
した。酵素を熱的に不活化した後、この消化物1.25μl
を、予めKpnIとSstIで切断しておいたM13mp19（20ng）
に、ATPの存在下、終容量20μlでライゲートした。室温
で２時間反応を続けた。この混合物５μlを用い、コン
ピテントな大腸菌JM101を形質転換した。澄明なプラー
クが成長し、次いで、メッシング（Messing）およびビ
エイラ(Vieira)の方法〔ジーン(Gene)（1982）19：269
〜276〕に従った１本鎖DNAを調製した。
【００９８】Ｂ．２．01100484のインビトロでの突然変
異誘発 部位特異的突然変異誘発により、01100484のDNA配列を
変化させ、NcoIによって認識される制限部位（CCATGG）
を生成させた。4299位（図２および図３）のＡがＣで置
換され、4305位（図２および図３）のＴがＡに置き換え
られているオリゴデオキシヌクレオチドを、固相ホスフ
ォラミダイト（phosphoramidite）の化学を利用して合
成した。上記の変化はいずれも、アミノ酸配列において
サイレントであり、第２の置換は、ヘテロローガスな分
子の安定性を減ずるために行われた。このオリゴマーは
ARV-216と命名され、配列：5'-TTAAAATCACTTGCCATGGCTC
TCCAATTACTGを有する。これは、M13誘導体であるテンプ
レート01100484が１本鎖であり、暗号鎖を含有している
ことから、該配列は非暗号鎖である。５'をリン酸化し
たオリゴマーを、５'脱リン酸化M13シーケンシング（se
quenceing）プライマー、50mMトリスーHCl（pH８）、20
mM KCl、７mM MgCl2および0.1mM EDTAの存在下、55℃に
おいて、01100484 M13テンプレートにアニールした。重
合反応は、50ng/μlの二重螺旋DNA、150μMのdNTP類、
１mM ATP、33mMトリス−酢酸（pH7.8）、66mM酢酸カリ
ウム、10mM酢酸マグネシウム、５mM DTT、12.5単位のT4
ポリメラーゼ、100μg/mlのT4遺伝子32タンパク質およ
び５単位のT4 DNAリガーゼを含む混合物100μl中で行っ
た。30℃で30分間インキュベートして反応させ、EDTAと
SDS（終濃度を、それぞれ10mMおよび0.2％とする）を加
えて反応を止めた。重合産物の１：10希釈液１，２およ
び４μlを用いてコンピテントJM101大腸菌細胞を形質転
換し、YTプレート上で平板培養した。プラークをニトロ
セルロースフィルターに吸着させて拾い上げ、0.2M NaO
H、1.5M NaCl中で変性させ、次いで、0.5Mトリス−HCl
（pH7.3）、３M NaClで中和し、６×SSC中に平衡させ
た。フィルター上のブロットを乾かし、80℃で２時間乾
燥させ、37℃で、0.2％SDS、10×デンハーツ（Denhard
t's）、６×SSC中においてプレアニールした。１時間
後、フィルターに標識したARV-216（7.5×106CPM）を加
え、37℃で２時間インキュベートした。フィルターを、
42℃で20分間、６×SSC中で洗浄し、ブロットを乾燥
し、これを−70℃で１時間、増感スクリーンを用いてフ
ィルムに感光させた。強くハイブリダイズしたプラーク
が増殖し、それから１本鎖DNAを調製し、配列決定にお
けるテンプレートとして用いた。配列決定の結果、テン
プレート01021785が上記の第２の置換と、NcoI部位とを
含有していることが分かった。
【００９９】第２のオリゴマーは、pol遺伝子の終止コ
ドンの直後（図２および図３における5101位）にSalIお
よびEcoRIのための部位を挿入するために合成された。
このオリゴマーはARV-248と命名され、配列：5'-GGTGTT
TTACTAAAGAATTCCGTCGACTAATCCTCATCCで示される。テン
プレート01020785を用い、65℃でハイブリダイゼーショ
ンを行った後、フィルターを洗浄することを除き、上記
の方法と同様にして部位特異的突然変異誘発を行った。
上記のごとく、８個の強くハイブリダイズしたプラーク
が増殖し、これから、１本鎖DNAの配列を決定した。テ
ンプレート01031985の配列は、SalI、およびEcoRI部位
を、意図通りに含有していることが示された。
【０１００】Ｂ．３．p31を含有しているNcoI−EcoRI D
NAフラグメントおよびNcoI−SalI DNAフラグメントの単
離 ６個の透明なプラークを1.5mlづつの２×YT中で、37℃
において５時間増殖させることにより、01031985テンプ
レートの複製型（RF）を調製した。マニアティス（Mani
atis）らの記述したごとくにして〔モレキュラー・クロ
ーニング、ア・ラボラトリィ・マニュアル（Molecular
Cloning a Laboratory Manual)、コールドスプリングハ
ーバー（Cold Spring Harbor）1982〕２本鎖DNAを得、
プールして終容量100μlになるよう懸濁した。終容量20
μlにしてRF10μlをNcoIおよびEcoRIで消化した。得ら
れたフラグメントを用いて細菌内でp31を直接発現させ
た。さらにRF20μlを、40μl中で、NcoIおよびSalIで消
化した。このフラグメントを酵母内でp31を発現させる
ために用いた。これらの試料を１％の低融点アガロース
（シーパック）ゲル上で泳動させ、臭化エチジウムを用
い、蛍光により観察した。800bpのバンドを切り取り、
上記のごとくにしてDNA(類)をゲルから抽出し、TE10μl
に再懸濁した。これらのフラグメントをそれぞれARV248
NR＃２およびARV248NLと命名した。
【０１０１】Ｂ．４．p31のplot7へのクローニング ベクターplot7〔ホールウェル（Hall well）ら、ヌクレ
イック・アシッズ・リチーサ（1985）13、No.６、pp．2
017〜2034〕３μgを終容量40μlとし、NcoIおよびEcoRI
で切断し、３時間後にこれらの酵素を熱的に不活化し
た。この消化物２μlを２μlのARV248 NR＃２と混合
し、ATPとT4 DNAリガーゼの存在下、20μl中で、14℃に
おいて一夜ライゲートし、得られた混合物10μlを用い
てコンピテントD1210細胞を形質転換した。２mM IPTGお
よび100μg/mlのアンピシリンに耐性を有するコロニー
を選択し、その各々からスーパーコイルDNAを抽出し
た。次いで、これらのDNAをNcoIおよびEcoRIで制限消化
し、アガロース電気泳動にかけて分析した。約800bpの
挿入物を有するクローンを選択し、以後の使用に供し
た。これらをpRSP248のNo.３およびNo.４と命名した。
【０１０２】Ｂ．５．pTP31の組立て 01100485に導入されたNcoI部位はp31の推定の開始部位
から52bp下流である。p31の最初の18アミノ酸をコード
している３つのオリゴマーを上記のごとくに合成し、こ
の分子の３'末端にNcoI粘着末端を生成させた。この分
子の５'末端は、開始コドンを越えて伸長しており、リ
ボゾーム結合部位を含有している。合成されたオリゴマ
ーは、配列：
【０１０３】
【化１９】
【０１０４】で示される。
【０１０５】脱リン酸化ARV-211、リン酸化ARV-222およ
びARV-223の各150ピコモルを、予めNcoIで切断しておい
た20μgのpRSP248に、終容量62μlで、14℃において18
時間ライゲートした。フェノール抽出、エタノール沈澱
の後、DNAを水40μlに再懸濁し、0.5mMのdNTP類の存在
下、室温で１時間、クレノー（Klenow）フラグメントと
一緒にインキュベートした。試料をフェノール抽出し、
エタノール沈澱に付した後、水40μlに再懸濁し、EcoRI
で消化した。次いで、このDNAを低融点のアガロースゲ
ルで泳動させ、上記のごとくにして約820bpのフラグメ
ントを抽出し、水に懸濁し、終容量を20μlとした。末
端をリン酸化した後、該試料５μlを、PvuIIおよびEcoR
Iで消化し、末端を脱リン酸化しておいたplot7（150n
g）と一緒に、T4 DNAリガーゼおよびATPの存在下、終容
量31μlとして、14℃において18時間、インキュベート
した。このライゲーション産物５μlを用いてRR1deltaM
15を形質転換した。100μg/mlのアンピシリンに耐性を
示すクローンを選択し、そこから、スーパーコイルDNA
を抽出した。DNA(類)をNcoIおよびEcoRIで消化し、１％
アガロースゲルによって分離した。適当な大きさの挿入
体を含有しているコロニーを得、pTP31と命名した。こ
の挿入体部分に含まれているp31配列を図９および図１
０に示す。下線を付した配列は化学合成された部分であ
る。他はDNAから得られた配列である。
【０１０６】Ｃ．AIDS血清と反応する特異的なタンパク
質を含有する形質転換体のスクリーニング ベクターのみ、あるいはp31 DNAを有するベクター（pTP
31.2）を含有している細菌性形質転換体を0.02％アンピ
シリン含有Ｌ−ブロス中でO.D.650が0.5になるまで増殖
させた。IPTGを終濃度が２mMになるように加えて培養物
を誘導し、さらに３時間増殖させた。培養物１ml中の細
菌をペレット化し、ゲル標本バッファー200μl中に再懸
濁した。凍結−解凍サイクルを３回行うことにより細胞
を破壊し、煮沸して得た抽出物を12.5％のポリアクリル
アミド−SDSミニゲルに適用した。タンパク質を電気泳
動させ、ニトロセルロース上に電気的に移し、ブロット
した。このニトロセルロースフィルターをEW5111血清
（ウィルス性p31と強く反応するCDCから得られた正の基
準血清、１：100に希釈）、西洋ワサビのペルオキシダ
ーゼとコンジュゲートしたヤギの抗−ヒトIgGならびにH
RP基質と反応させた。p31 DNAによる形質転換体から得
た抽出物のゲル中には、〜30,000dにおいて優勢な１つ
のバンド、ならびにさらに低分子量の種の存在を示すい
くつかのバンドが見られたが、ベクターのみで形質転換
された細菌形質転換体から得た抽出物にはそのようなバ
ンドが見られなかった。
【０１０７】Ｄ．pol遺伝子のＣ末端領域からのポリペ
プチドがウィルス性p31タンパク質とアナローガス（構
造類似性）であることの証明 pTP31.2またはベクター単独で形質転換された細菌から
リゾチーム−NP40を調製した。５mlの培養物を増殖さ
せ、細胞をペレット化し、１mlの50mMトリス−HCl（pH
８）、0.5mM EDTA、１mg/mlリゾチームに再懸濁し、０
℃で15分間インキュベートし、NaC1、MgCl2およびNP40
をそれぞれ、終濃度が0.4mM、５mMおよび0.5％となるよ
うに加えて混合し、DNAseＩ（100μg/ml）と一緒に０℃
で30分間インキュベートした。EW5111血清（希釈率１：
100）と、pTP31.2で形質転換した細菌から得た細胞抽出
物の１：10希釈液とをプレインキュベートしてからウィ
ルス性ブロットと反応させると、ウィルス性p31のバン
ドは完全に消失したが、他のウィルス性タンパク質との
反応性は残存していた。これに対して、ベクターのみで
形質転換された細菌から得た抽出物は、p31反応性抗体
を吸収し、除去する作用を有していなかった。このよう
に、ウィルス性p31タンパク質は、ARV-2のpol遺伝子の
Ｃ末端領域、またはエンドヌクレアーゼ領域からの産物
であることが分かった。
【０１０８】１５．酵母内でのp31pdタンパク質の発現 Ａ．酵母ベクターp31／GAP−ADH2の組立て：p31のpAB24
へのクローニング ARV248NLフラグメントを、予めNcoIおよびSalIで切断し
ておいたpBS100にクローンした。pBS100はpAB12から導
かれ、GAP−ADH2プロモーター、NcoI−SalIフラグメン
トであるARV−env遺伝子、およびGAPターミネーターか
らなるBamHIカセットを有する。pBS100／p31／GAP−ADH
2の２個の陽性クローンから得られたBamHIカセットを、
uraおよびleuの両者に関する選択能力を有する酵母ベク
ターである、pAB24にクローンした。ベクター内でのカ
セットの方向性を、両方向についてスクリーンし、それ
らを用いて酵母のAB110株（Mat a ura3-52 leu2-04また
は、leu2-3とleu2-112の両者、pep4-3、his4-580、Ci
rO）を形質転換した。これらの細胞を、ura−およびleu
−両プレート上で平板培養した。また、ura−細胞をleu
−プレート上で平板培養した。
【０１０９】Ｂ．p31の発現の誘導 ３種類の異なる誘導法を行った。１．ura−プレート上
に貼り付いたura−コロニーを、YEP／１％グルコース中
で１時間誘導した。これらの試料に関して、ウェスタン
分析と、ポリアクリルアミドゲル法を適用した。結果は
いずれも陰性であった。２．leu−プレートに貼り付い
たura−プレートから得たコロニーをleu−／３％エタノ
ールまたはYEP／１％グルコース中で24時間誘導した。
これらの試料に関してウェスタン分析法とポリアクリル
アミドゲル法を適用したところ、結果はこれもまた陰性
であった。３．leu−プレート上に貼り付いているleu−
プレートからのコロニーを、leu−／３％エタノールま
たはYEP／１％グルコース中で24時間誘導した。ポリア
クリルアミドゲル法の結果は陰性であった。これらの試
料に関しては、ウェスタン分析法を適用しなかった。
【０１１０】１６．酵母内における超過酸化物不均化酵
素（スーパーオキシドジスムターゼ）(SOD)−p31融合タ
ンパク質の発現 Ａ．pC１/１−pSP31−GAP−ADH2誘導体の組立て SOD-p31融合タンパク質を酵母内で発現させるための遺
伝子を組立てる目的で、プラスミド（pS14／39-2）を用
いた。このプラスミドは、ADH-2／GAPプロモーターの制
御下にある、プロインシュリン遺伝子と融合したSOD遺
伝子を含有している。このプロインシュリン遺伝子は、
EcoRI制限部位とSalI制限部位との間に位置する。この
プロインシュリン遺伝子をARV248NLフラグメントで置き
換えるために、それぞれARV-300およびARV-301と称する
２個のオリゴマーを、ホスホラミダイトの化学を利用し
て合成した。これらの２個のオリゴマーをアニールする
と、分子の両側にEcoRIおよびNcoI粘着末端を有する配
列が得られる。ARV-300およびARV-301は、配列：
【化２０】 で示される。
【０１１１】EcoRIで線状化されたpSI4／39-2（２μg）
を100ピコモルづつの、リン酸化ARV-300および脱リン酸
化ARV-301と、ATPおよびT4 DNAリガーゼの存在下、終容
量35μlでライゲートした。反応は、14℃で18時間行っ
た。DNAをSalIでさらに消化し、得られたフラグメント
を１％の低融点アガロースゲル上で分離(割)し、SOD遺
伝子（〜6.5kb）を伴ったベクターを含有するフラグメ
ントを前記のごとくにして精製し、TE50μlに再懸濁し
た。この標品５μlをARV248 NL５μlと、終容量20μl
で、14℃において18時間ライゲートした後、その５μl
を用いてコンピテントHB101細胞を形質転換した。得ら
れたプラスミドをpSP31と命名した。このプラスミド20
μgをBamHIで消化し、ゲル電気泳動によって約2900bpの
フラグメントを単離し、TEに再懸濁した後、予めBamHI
で切断しておいたpC１/１にライゲートした。このDNAを
用いてHB101を形質転換し、BamHIカセットを有する形質
転換体を得た。酵母株、2150、PO17、およびAB110をこ
のpC１/１−pSP31−GAP−ADH2誘導体を用い、短い方向
性と長い方向性の両者により、形質転換した。2150株
は、形質転換体を与えなかった。その他の形質転換体は
全てleu−プレート上に貼り付けられた。
【０１１２】Ｂ．pC１/１−pSP31−GAP−ADH2の誘導 ３種類の異なる誘導法を行った。１．−PO17コロニー
を、YEP／１％グルコース培養物またはleu−／３％エタ
ノール培養物のいずれか10ml中で24時間誘導した。酵母
ペレットをポリアクリルアミドゲル法およびウェスタン
法の両方法で分析したところ、クーマシー染色ゲルによ
る結果は陰性であったが、ウェスタン法の場合は、両誘
導法によって、正しい分子量のバンドが示された。２．
−PO17コロニーをYEP／１％エタノール培養物30ml中で4
8時間誘導した。このインキュベーション期間中、様々
な時間に、一部を採ってPAGEにより分析した。クーマシ
ー染色ゲルによると、YEP／１％エタノール中に入れて
から14時間後に正しい分子量域（47−50kb）にバンドが
現れ始め、誘導開始から24時間後に強度は最大になっ
た。ウェスタン法の結果は、このクーマシー染色ゲルに
よる結果と良く相関しており、24および48時間目に強い
バンドが現れた。３．−AB110コロニーを、leu−／３％
エタノールまたはYEP／１％グルコース中で24時間誘導
した。PAGEおよびウェスタン法の両方法を適用したとこ
ろ、これら両誘導法において、PAGEの結果は陰性であっ
たが、ウェスタン法の結果は陽性であった。
【０１１３】１７．細菌または酵母からのSOD-p31の精
製および特性化 凍結細菌（酵母）細胞を室温で解凍し、1.5容量の溶菌
バッファー〔20mMトリス−HCl pH8.0、２mM EDTA、１mM
PMSF (細菌用)；50mMトリス−HCl pH8.0、２mM EDTA、
１mM PMSF（酵母用）〕に懸濁し、１容量の酸で洗浄し
たガラスビーズを混合した。
【０１１４】−20℃の冷却装置と連結されているダイノ
ミル・ユニットのガラス室（3,000rpm）を用いて15分間
処理することにより、非連続的な方法で細胞を破壊し
た。氷上に２〜３分置いてガラスビーズをデカントし、
細胞リゼイト（溶菌液）を除いた。デカントしたガラス
ビーズを溶菌バッファー30mlによって４℃で２回洗浄し
た。細胞溶菌液を39,000xgで30分間遠心した。
【０１１５】上記の遠心により得たペレットを溶菌バッ
ファーで１回洗浄し、ボルテックスした後、４℃で懸濁
した（遠心処理は上記と同じ）。洗浄したペレットを0.
2％SDS（細菌用）および0.1％SDS（酵母用）により、溶
菌バッファー中で処理し、４℃で10分間、揺動させて撹
拌した。溶菌液を39,000xgで30分間遠心した。試料バッ
ファー（67.5mMトリス−HCl、pH7.0、５％β−メルカプ
トエタノール、2.3％SDS）中で煮沸し、39,000xgで10分
間遠心した。上清を回収し、さらに60分間、100,000xg
で遠心した（60Tiローター）。酵母の場合には、この工
程を行う代わりに0.45μmの濾過を行った。上記の遠心
で得た上清をゲル濾過カラム（2.5×90cm、ACA34LKB）
にかけ（最大タンパク質量50mg）、流速0.3〜0.4ml／分
の速度で、リン酸緩衝食塩水（PBS)、0.1％SDSにより平
衡化した。SOD-p31を含む画分をプールし、真空透析ま
たはYM5アミコン膜を40psiで用いて透析することによ
り、濃縮した。タンパク質を濃縮液として、−20℃で保
存した。
【０１１６】ゲル電気泳動の結果、SOD-p31タンパク質
は分子量約46kbとして誘導し、純度は90％以上であるこ
とが分かった。
【０１１７】１８．組換えARV-2ポリペプチドを用い
た、hTLRに対する抗体のためのELISA 純化p25gagタンパク質〔20mMリン酸ナトリウム（0.1％S
DS）pH7.2中、1.25mg/ml〕、純化envタンパク質〔20mM
リン酸ナトリウム（0.1％SDS)pH7.2中、２mg/ml〕、お
よび純化SOD-p31融合タンパク質〔20mMリン酸ナトリウ
ム（0.1％SDS）pH7.2中、２mg/ml〕の、各ストック溶液
を調製した。
【０１１８】微量力価検定プレート〔ダイナテクイムロ
ン(Dynatech Immulon)Ｉ〕を被覆するために、p25gag、
envおよびSOD-p31のストック溶液を１部づつ取り、997
部のホウ酸被覆バッファー（0.05Mホウ酸塩pH9.0）に加
えた。各ウェルにこの被覆溶液100μlを入れ、プレート
に覆いをして37℃で２時間、または４℃で12時間インキ
ュベートした。次いで、被覆溶液をウェルから吸い上
げ、プレートを洗浄液（0.137Mの0.8％NaCl、0.05％の
トリトンX-100）で６回洗った。
【０１１９】希釈溶液（0.1％カゼイン、１mM EDTA、１
％トリトンX-100、0.5M NaCl、0.01％チメローサル（Th
imerosal）、pH7.5）中で１：100に希釈し、この希釈液
に、酵母タンパク質（AB103.1株）の抽出物（１％トリ
トンX-100、２mM PMSF、0.01％チメローサルを含んだPB
S中で１：40に希釈、タンパク質約２mg/ml）および大腸
菌タンパク質抽出物（１％トリトンX-100、２mM PMSF、
0.01％チメローサル中で１：40に希釈、タンパク質約１
mg/ml）を加えた。抽出方法は、非組換え株を用いる外
は前記の１３および１４の記載と同様である。各ウェル
に希釈した血清100μlを加え、37℃で30分間インキュベ
ートした。次いで、プレートを洗浄液で６回洗った。こ
のプレートに、酵母および大腸菌抽出物を加えてない希
釈溶液によって１：8000に希釈された西洋ワサビのペル
オキシダーゼ（カペル）で標識したヤギの抗−ヒトＩg
を100μl/ウェルの割合で加え、37℃で30分間インキュ
ベートした。次いで、洗浄液でプレートを６回洗った。
次いで、プレートに、基質溶液〔クエン酸バッファー10
ml、（クエン酸10.5g/l（dH2O）に６M NaOHを加えてpH
を4.0に調節）、0.1mlのABTS（2,2'-アジノ-ジ-(3-エチ
ルベンズチアゾレン・スルホン酸）15mg/ml dH2O溶
液）、および3.33μlのH2O2〕を100μl/ウェルの割合で
加え、プレートをホイルで包み、37℃で30分間インキュ
ベートした。次いで、10％SDSを50μl/ウェルの割合で
加えて反応を止めた。読み取りは、二重波長読取り用の
ダイナテクELISA読取り装置（Dynatech ELISA rea-ding
set)を使用して行った：吸収波長は１（410nm）であ
り、基準波長は４である。
【０１２０】結果 次の血清を試験した： Ａ．カンサスシティ血液銀行から得た89の連続的な血液
供給者（「正常な血液供給者」）からの血清：log No.1
001〜1081、1085〜1092。 Ｂ．リンパ腺症候群（LAD）またはAIDS患者、あるいはL
ADまたはAIDSの性的パートナー（「接触者」と称する）
から得た血清…これらは全てUCSF AIDS血清銀行パネル
（Serum Bank Panel）から得た：log No.4601〜4652。
【０１２１】陽性／陰性の判断の境界として、５×（バ
ックグラウンドシグナルの平均値−希釈液のみによるシ
グナル）を採用し、その値を0.195と決定した。即ち、
0.195以下のシグナルを示す血清は（−）と評価され；
それ以上のものは（＋）と評価される。各試料はまた、
市販品から購入可能なABBOTTHTLV III EIAキット〔アボ
ット・ラボラトリィズ（Abborr Labs）〕およびウェス
タン分析法により評価した。
【０１２２】正常な血清供給者試料に関する、本発明の
ELISA試験では、１例を除き全て陰性であることが示さ
れた。この正常な血清はABBOTTHTLV III EIA試験でも陰
性の値を示したが、ウェスタン分析法では、実際上、陽
性であることが確認された。
【０１２３】LADおよびAIDS患者、ならびに接触者達か
ら得た52の血清に関する試験の結果を次の表に示す。
【０１２４】
【表４】
【０１２５】上記の結果は、組換えARVタンパク質を用
いる本発明のELISAが少なくともABBOTTHTLV III EIA試
験またはウェスタン分析法と同様に優れた方法であるこ
とを示している。
【０１２６】この実施例で報告した本発明のELISA法で
は、酵母または細菌または細菌に対する血清抗体が組換
えARV-2タンパク質と結合するのを阻止するために、血
清に、酵母および細菌抽出物を加えてこれら血清抗体と
結合させる。組換えポリペプチドは酵母内で発現される
ポリペプチド、および細菌内で発現されるポリペプチド
を含有しているので、酵母および細菌の抽出物両者が必
要である。もしも、あらゆるポリペプチドが同じ型の生
物内で発現されるならば、１個の抽出物しか必要としな
いであろう。例えば、酵母内で発現されたp25gagを実施
例の、細菌によって生産されたp25gagポリペプチドと置
き換えることができれば、血清試料中には酵母抽出物だ
けを加えればよい。
【０１２７】１９．組換えARV-2ポリペプチド類を用い
た、hTLRに対する抗体のためのドット・ブロット・アッ
セイ ニトロセルラー・ストリップ（0.5×0.5cm）に、PBS中
に含有させたポリペプチド50ngをスポットした（スポッ
トの容量、２μl）。スポットした後、ストリップを室
温で１時間またはそれ以上乾燥させた。次いで、このス
トリップをカーネーション（Carnation）脱脂（non-fa
t）ドライミルクのPBS中５％溶液、0.01％チメローサル
中で、室温において15〜60分間、後被覆処理（ポスト・
コーティング）に付した。各被検体液試料を試験管内で
ポスト−コーティング溶液0.5ml中で１：50に希釈し
た。次いで、ポスト−コートしたストリップを試験管内
に入れ、試料中で揺動しながら37℃で１時間インキュベ
ートした。次いで、このストリップをポスト−コーティ
ング溶液で１：500に希釈した西洋ワサビのペルオキシ
ダーゼで標識したヤギ抗−ヒトＩg試薬中、室温で15分
間インキュベートした。標識した抗体中でインキュベー
トした後、ストリップをPBS、１％トリトン（Trito
n）、および蒸留水で順次洗浄した。これらのストリッ
プを基質溶液中で、室温において15分間インキュベート
することにより、展開させた（上記２３参照）。
【０１２８】試料が陽性であれば、スポットの位置に連
続的な色の変化が生じ、それを観察することができる。
正常な（陰性）試料の場合には、色の変化がないか、あ
るいは陽性シグナルと識別し得る、かすかなシグナルを
呈する。かすかなシグナルを与える血清に関しては、競
合的な分析を行い、それらが陰性であることを明確にす
ることもできる。競合法の場合には、ストリップを試料
中でインキュベートする前に、ポリペプチド（10〜25μ
g/ml）を被検試料に加え、37℃で１時間〜インキュベー
トする。真に陽性の血清の場合には、シグナルは添加し
たポリペプチドによって完全にブロックされるが、正常
な（陰性の）血清の場合には、シグナルに変化が生じな
い。
【０１２９】上記のARV-2 p25gagポリペプチドおよびAR
V-2 envポリペプチド、ならびにARV-2 p31をSODとの融
合タンパク質を発現する生物の標本はアメリカン・タイ
プ・カルチャー・コレクション（American Type Cultur
e Collection、ATCC）、12301、パークローンドライ
ブ、ロックビル、メアリーランド（Parklawn Drive、Ro
ckville、Maryland）にブタペスト条約に則し、寄託さ
れた。これらの寄託番号および日付は下記の通りであ
る。
【０１３０】 発現産物 ATCC寄託番号 寄託日 ARV-2 p25gag ５３２４６ 1985年8月27日 ARV-2 env ２０７６９ 1985年8月27日 ARV-2 p31/SOD ２０７６８ 1985年8月27日
【図面の簡単な説明】
【図１】 プロウィルスDNA（ARV-2）の制限酵素切断地
図の模式図である。
【図２】 ARV-2のヌクレオチド配列を示す模式図であ
る。
【図３】 図２の続きである。
【図４】 プラスミドpGAG25-10の製造工程系統図であ
る。
【図５】 プラスミドpGAG25-10にクローンしたp25gag
遺伝子のヌクレオチド配列と、この遺伝子によって暗号
化されているアミノ酸を示す模式図である。
【図６】 融合タンパク質p41gagを生産するためのpGAG
41-10にクローンしたヌクレオチド配列の暗号鎖と、そ
れに対応するアミノ酸を示す模式図である。
【図７】 ARV-2 p16gagタンパク質を暗号化しているヌ
クレオチド配列を示す模式図である。
【図８】 ARV-2 envタンパク質を暗号化しているヌク
レオチド配列を示す模式図である。
【図９】 ARV-2 p31タンパク質を暗号化しており、プ
ラスミドpTP31に含まれているヌクレオチド配列を示す
模式図である。
【図１０】 図９の続きである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 39/395 Ａ６１Ｋ 39/395 Ｓ Ｃ０７Ｋ 14/155 Ｃ０７Ｋ 14/155 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 33/569 33/569 Ｈ 33/577 33/577 Ｂ // Ｃ０７Ｈ 21/04 Ｃ０７Ｈ 21/04 Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:865） (72)発明者 ディノ・ディナ アメリカ合衆国カリフォルニア94108、サ ン・フランシスコ、ワシントン・ストリー ト1254番 (72)発明者 キャサリン・ステイマー アメリカ合衆国カリフォルニア94530、エ ル・セライト、ラモナ118番 (72)発明者 レイ・サンチェス・ペスカドール アメリカ合衆国カリフォルニア94605、オ ークランド、クレスト・アベニュー7729番 (72)発明者 カルロス・ジョージ−ナシメント アメリカ合衆国カリフォルニア94526、ダ ンビレ、サウス・フォレスト・ヒル1907番 (72)発明者 デボラ・パーケス アメリカ合衆国カリフォルニア94610、オ ークランド、ナンバー104、ユークリッ ド・アベニュー302番 (72)発明者 ロブ・ホールウェル アメリカ合衆国カリフォルニア94109、サ ン・フランシスコ、プライエスト・ストリ ート27番 (72)発明者 フィリップ・ジェイ・バー アメリカ合衆国カリフォルニア94563、オ リンダ、ナンバー14、ブルックウッド73番 (72)発明者 マーサ・トゥルート アメリカ合衆国カリフォルニア94611、オ ークランド、ブロードウェイ・テラス9082 番

Claims (10)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 少なくとも２１ｂｐのフラグメントを含
    有するポリヌクレオチドであって、該フラグメントはＡ
    ＲＶ−２（７Ｄ）（ＡＴＣＣ Ｎｏ． ４０１４３）ま
    たはＡＲＶ−２（８Ａ）（ＡＴＣＣ Ｎｏ． ４０１４
    ４）に由来し、かつ該フラグメントは以下のヌクレオチ
    ド配列から得られる、ポリヌクレオチド： 【化１】 【化２】 【化３】 【化４】 【化５】 【化６】 （ただし、少なくとも２１ｂｐの該フラグメントは、特
    願昭６０−５０３９３７号（特表昭６１−５０１４３
    １）に開示された ｉ）ＨＴＬＶ−ＩＩＩ組換えクローンＢＨ５からの３．
    ５ｋｂウイルス挿入体ではなく、 ｉｉ）ＨＴＬＶ−ＩＩＩ組換えクローンＢＨ８からの
    ５．５ｋｂウイルス挿入体ではなく、また、 ｉｉｉ）ＨＴＬＶ−ＩＩＩ組換えクローンＢＨ１０から
    の９．０ｋｂウイルス挿入体ではなく、 更に、少なくとも２１ｂｐの該フラグメントは特願昭６
    ０−５０４３２７（特表昭６２−５００２８２）に開示
    された ａ）ＬＡＶ７５と命名されたＬＡＶからの０．６ｋｂｐ
    ウイルス挿入体ではなく、 ｂ）ＬＡＶ８２と命名されたＬＡＶからの０．８ｋｂｐ
    ウイルス挿入体ではなく、 ｃ）ＬＡＶ１３と命名されたＬＡＶからの２．５ｋｂｐ
    ウイルス挿入体ではなく、 ｄ）ＬＡＶファージλＪ１９からの９．１ｋｂｐウイル
    ス挿入体ではなく、 ｅ）λＪ１９のほぼＫｐｎＩ（６１００）からほぼＢｇ
    ｌＩＩ（９１５０）に至るＤＮＡフラグメントではな
    く、 ｆ）λＪ１９のほぼＫｐｎＩ（３５００）からほぼＢｇ
    ｌＩＩ（６５００）に至るＤＮＡフラグメントではな
    く、 ｇ）λＪ１９のほぼＰｓｔＩ（８００）からほぼＫｐｎ
    Ｉ（３５００）に至るＤＮＡフラグメントではなく、ま
    た、 ｈ）λＪ１９を図２に示される任意の制限部位で消化す
    ることにより得られたＤＮＡフラグメントではなく、更
    に、少なくとも２１ｂｐの該フラグメントは、特願昭６
    ０−２２６６５８号（特開昭６２−２６３００）に開示
    された （Ｉ）２．３ｋｂｐＫｐｎＩ−ＫｐｎＩフラグメントで
    はなく、（ＩＩ）１．０ｋｂｐＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ
    フラグメントではなく、また、（ＩＩＩ）２．４ｋｂｐ
    ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントではない）。
  2. 【請求項２】 前記フラグメントがｅｎｖ領域に由来す
    る、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
  3. 【請求項３】 前記フラグメントがｇａｇ領域に由来す
    る、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
  4. 【請求項４】 前記フラグメントがｐｏｌ領域に由来す
    る、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
  5. 【請求項５】 少なくとも２１ｂｐのフラグメントを含
    有するポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドプ
    ローブであって、該フラグメントはＡＲＶ−２（７Ｄ）
    （ＡＴＣＣ Ｎｏ． ４０１４３）またはＡＲＶ−２
    （８Ａ）（ＡＴＣＣ Ｎｏ． ４０１４４）に由来し、
    かつ該フラグメントは以下のヌクレオチド配列から得ら
    れる、ポリヌクレオチドプローブ： 【化７】 【化８】 【化９】 【化１０】 【化１１】 【化１２】 （ただし、少なくとも２１ｂｐの該フラグメントは、特
    願昭６０−５０３９３７号（特表昭６１−５０１４３
    １）に開示された ｉ）ＨＴＬＶ−ＩＩＩ組換えクローンＢＨ５からの３．
    ５ｋｂウイルス挿入体ではなく、 ｉｉ）ＨＴＬＶ−ＩＩＩ組換えクローンＢＨ８からの
    ５．５ｋｂウイルス挿入体ではなく、また、 ｉｉｉ）ＨＴＬＶ−ＩＩＩ組換えクローンＢＨ１０から
    の９．０ｋｂウイルス挿入体ではなく、 更に、少なくとも２１ｂｐの該フラグメントは特願昭６
    ０−５０４３２７（特表昭６２−５００２８２）に開示
    された ａ）ＬＡＶ７５と命名されたＬＡＶからの０．６ｋｂｐ
    ウイルス挿入体ではなく、 ｂ）ＬＡＶ８２と命名されたＬＡＶからの０．８ｋｂｐ
    ウイルス挿入体ではなく、 ｃ）ＬＡＶ１３と命名されたＬＡＶからの２．５ｋｂｐ
    ウイルス挿入体ではなく、 ｄ）ＬＡＶファージλＪ１９からの９．１ｋｂｐウイル
    ス挿入体ではなく、 ｅ）λＪ１９のほぼＫｐｎＩ（６１００）からほぼＢｇ
    ｌＩＩ（９１５０）に至るＤＮＡフラグメントではな
    く、 ｆ）λＪ１９のほぼＫｐｎＩ（３５００）からほぼＢｇ
    ｌＩＩ（６５００）に至るＤＮＡフラグメントではな
    く、 ｇ）λＪ１９のほぼＰｓｔＩ（８００）からほぼＫｐｎ
    Ｉ（３５００）に至るＤＮＡフラグメントではなく、ま
    た、 ｈ）λＪ１９を図２に示される任意の制限部位で消化す
    ることにより得られたＤＮＡフラグメントではなく、 更に、少なくとも２１ｂｐの該フラグメントは、特願昭
    ６０−２２６６５８号（特開昭６２−２６３００）に開
    示された （Ｉ）２．３ｋｂｐＫｐｎＩ−ＫｐｎＩフラグメントで
    はなく、（ＩＩ）１．０ｋｂｐＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ
    フラグメントではなく、また、（ＩＩＩ）２．４ｋｂｐ
    ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントではない）。
  6. 【請求項６】 前記フラグメントがｅｎｖ領域に由来す
    る、請求項５に記載のポリヌクレオチドプローブ。
  7. 【請求項７】 前記フラグメントがｇａｇ領域に由来す
    る、請求項５に記載のポリヌクレオチドプローブ。
  8. 【請求項８】 前記フラグメントがｐｏｌ領域に由来す
    る、請求項５に記載のポリヌクレオチドプローブ。
  9. 【請求項９】 前記ポリヌクレオチドがＤＮＡである、
    請求項５に記載のポリヌクレオチドプローブ。
  10. 【請求項１０】 少なくとも２１ｂｐのフラグメントを
    含有するポリヌクレオチドを製造する方法であって、該
    ポリヌクレオチドの少なくとも一部を化学的に合成する
    工程を包含し、該フラグメントはＡＲＶ−２（７Ｄ）
    （ＡＴＣＣ Ｎｏ． ４０１４３）またはＡＲＶ−２
    （８Ａ）（ＡＴＣＣ Ｎｏ． ４０１４４）に由来し、
    かつ該フラグメントは以下のヌクレオチド配列から得ら
    れる、方法： 【化１３】 【化１４】 【化１５】 【化１６】 【化１７】 【化１８】
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