JPH07313184A - 抗原性ｈｉｖ−ｉアミノ酸配列を含む組換えポリペプチド - Google Patents

抗原性ｈｉｖ−ｉアミノ酸配列を含む組換えポリペプチド

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JPH07313184A
JPH07313184A JP7045602A JP4560295A JPH07313184A JP H07313184 A JPH07313184 A JP H07313184A JP 7045602 A JP7045602 A JP 7045602A JP 4560295 A JP4560295 A JP 4560295A JP H07313184 A JPH07313184 A JP H07313184A
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acid sequence
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dna
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ポール・エイ・ルシウ
Dino Dina
ディノ・ディナ
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キャサリン・ステイマー
Ray Sanchez Pescador
レイ・サンチェス・ペスカドール
Carlos George-Nascimento
カルロス・ジョージ−ナシメント
Deborah Parkes
デボラ・パーケス
Hallewell Rob
ロブ・ホールウェル
Philip J Barr
フィリップ・ジェイ・バー
Martha Truett
マーサ・トゥルート
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Abstract

(57)【要約】 【目的】 抗原性ＨＩＶ−Ｉアミノ酸配列を含んでいる
組換えポリペプチドおよびその製造法を提供する。 【構成】 抗原性ＨＩＶ−Ｉアミノ酸配列を含んでいる
組換えポリペプチドの製造方法であって、(a)細胞中で
の組換えポリペプチドの転写および翻訳を制御する調節
配列、および解読枠内の、少なくとも約２１bpのＤＮＡ
配列を含んでいる、該調節配列によって制御される、該
組換えポリペプチドをコードしている暗号配列を含んで
いる組換えＤＮＡベクターであって、抗原性ＨＩＶ−Ｉ
アミノ酸配列をコードしている組換えＤＮＡベクターを
含んでいる細胞群を用意し、(b)該組換えポリペプチド
が発現される条件下で該細胞群を培養することからなる
方法。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【技術分野】本発明は、遺伝子工学分野に属する。より
詳細には、本発明はリンパ節疾患症候群(ＬＡＳ)および
／または後天性免疫不全症候群(ＡＩＤＳ:エイズ)に関
連する組換えウィルス・タンパク質に関する。
【０００２】
【技術的背景】ヒトＴ細胞リンパ趨行性ウィルス−Ｉ
(ＨＴＬＶ−Ｉ)が、ヒトにおける感染作用物質であるこ
とが発見されたことにより、レトロウィルスがヒトに感
染し、疾病の病因となり得ることが立証されるに至っ
た。ＨＴＬＶ−Ｉの発見後、それと同じ科に属する第２
のレトロウィルス、ＨＴＬＶ−ＩＩが、毛状細胞白血病
(hairy cell leukemia)の確立された株から発見され
た。それ以来、そのほかにも、リンパ節疾患症候群(Ｌ
ＡＳ)および／または後天性免疫不全症候群(エイズ)罹
患者に関連しているヒト・レトロウィルス類が単離され
た。種々のレトロウィルスが、エイズ(これらは、ＨＴ
ＬＶ−ＩＩＩとも呼ばれる)またはＬＡＳ(これらは、Ｌ
ＡＶとも呼ばれる)の患者から単離された[例えば、バー
レ・シヌーシ(Ｂarre−Ｓinoussi)ら、サイエンス(Ｓci
ence)、２２０巻、８６８〜８７１(１９８３年); およ
びモンタニエル(Ｍontagnier)ら、コールド・スプリン
グ・ハーバー・シンポジウム(Ｃold Ｓpring Ｈarbor
Ｓymposium)、１９８４年(印刷中);ビルマー(Ｖilme
r)ら、ランセット(Ｌancet)、１９８４年、１、７５３;
ポポビック(Ｐopovic)ら、サイエンス(Ｓcience)、２
２４巻、４９７(１９８４年)およびガロ(Ｇallo)ら、サ
イエンス(Ｓcience)、２２４巻、５００(１９８４年)、
参照]。また、フェオリノ(Ｆeorino)らは、ＨＴＬＶ−
ＩＩＩとＬＡＶとの比較を行っている(上記)。そのほ
か、クラッツマン(Ｋlatzman)らのサイエンス(Ｓcienc
e)、２２５巻、５９〜６２(１９８４年)、およびモンタ
ニエル(Ｍontagnier)らの文献(１９８４年(前掲))並び
にこれらの文献中で引用されているこの分野の調査資料
も参考にせよ。Ｔ細胞白血病ウィルスに関する総説は、
サイエンス誌[マークス(Ｍarx)、サイエンス(Ｓcienc
e)、２２４巻、４７５〜４７７(１９８４年)]に掲載さ
れている。また、レビー(Ｌevy)らはＡＲＶ(エイズに関
係しているレトロウィルス)を単離したことを報告して
いる[サイエンス(Ｓcience)、２２５巻、８４０〜８４
２(１９８４年)]。
【０００３】本明細書においては、これらのウィルス類
(ＨＴＬＶ−ＩＩＩ、ＬＡＶおよびＡＲＶ)を、ヒト・Ｔ
細胞リンパ趨行性レトロウィルス(hＴＬＲ)と総称す
る。これらのhＴＬＲは、前記の参考諸文献を参照すれ
ばわかるように、形態学、血清学、逆転写酵素の最適条
件、および細胞病理学上類似しているので、同一の綱に
属していることがわかる。例えば、それらの逆転写酵素
にはＭg+2が好ましく、その最適pＨは約７．８である。
【０００４】
【発明の開示】本発明は、hＴＬＲタンパク質を暗号化
しているhＴＬＲ・ＤＮＡ配列を含んでいる組換え発現
ベクターを使用する、組換え体hＴＬＲポリペプチド、
およびその製法を提供するものである。
【０００５】本発明の具体的態様は以下の通りである。
単細胞微生物によって認識される複製系と、オープン・
リーディング・フレーム(読取り枠)を有する少なくとも
２１bpのＤＮＡ配列、を含んでいる組換え体ＤＮＡ組立
物であって、該配列が、プロウィルスのhＴＬＲ・ＤＮ
Ａのgag、env、またはpol領域にある配列と実質的に相
補的であり、かつ、ＨＴＬＶ−ＩおよびＨＴＬＶ−ＩＩ
と免疫学的に非交差反応性であってhＴＬＲと反応し得
るポリペプチド、を暗号化している配列を含んでいるこ
とを特徴とする組換え体ＤＮＡ組立物:上記のＤＮＡ組
立物を含んでいる単細胞微生物を増殖させ、それによっ
て該ＤＮＡ配列を複製することから成るhＴＬＲに特異
的なＤＮＡのクローン化方法:
【０００６】以下の工程、(a)単細胞微生物宿主内で有
効に機能する転写および翻訳の開始並びに停止調節シグ
ナルおよび、読取り枠を有する少なくとも２１bpのＤＮ
Ａ配列であって、プロウィルスのhＴＬＲ・ＤＮＡのga
g、envまたはpol領域に存在する配列と実質的に相補的
であり、ＨＴＬＶ−ＩおよびＨＴＬＶ−ＩＩと免疫学的
に非交差反応性であってhＴＬＲとは反応し得るポリペ
プチドをコードしている、該シグナルの調節コントロー
ル下にある配列、を含んでいるＤＮＡ組立物を該宿主に
導入し、次いで(b)この宿主を栄養培地中で増殖させ、
所期の発現生産物を製造する、ことから成るhＴＬＲの
発現生産物の製造方法:および抗原性組換えＡＲＶ−２g
ag、polまたはenvポリペプチドの少なくとも１つをhＴ
ＬＲに対する抗体との結合に使用することを特徴とす
る、該抗体の存在が疑われる試料中のhＴＬＲ抗体を検
出するための免疫測定法:組換え体ポリペプチドが(a)
ＡＲＶ−２ p１６ gag、(b) ＡＲＶ−２ p２５ gag、
(c) ＡＲＶ−２ env、(d) ＡＲＶ−２ p３１ pol、
(e) ＡＲＶ−２ p１６ gagとＡＲＶ−２ p２５ gag と
の融合タンパク質、または(f) スーパーオキシド・ジス
ムターゼとＡＲＶ−２ p３１ pol との融合タンパク質
であることを特徴とする組換えポリペプチド: および固
形支持体と結合している上記の組換え体ポリペプチド
を、少なくとも１つ含有していることから成るhＴＬＲ
抗体の免疫測定に用いる製造物。
【０００７】
【図面の説明】図１は、プロウィルスＤＮＡ(ＡＲＶ−
２)の制限酵素切断地図を示している。
【０００８】図２および図３は、ＡＲＶ−２(９Ｂ)のヌ
クレオチド配列を示す。gag、polおよびenv遺伝子によ
る生産物のアミノ酸配列も示してある。また、ＬＴＲの
Ｕ３、ＲおよびＵ５領域も示してある。キャップ(cap)
部位は＋１の位置である。ＬＴＲの終末にある３bpの逆
方向反復配列、−２９位のＴＡＴＡボックス、１８３位
にあるtＲＮＡlysの３'−終末と相補的な配列、および
９１７４位にあるポリアデニル化シグナルには、下線を
引いてある。上線はウィリオン(ウィルス粒子)タンパク
質から決定されたアミノ配列を示す。各列毎の最初にヌ
クレオチド番号を付し、また各列の終わりにアミノ酸番
号を示した。
【０００９】図４は、プラスミドpＧＡＧ２５−１０の
製造方法を示した工程系統図である。
【００１０】図５は、プラスミドpＧＡＧ２５−１０に
クローンしたp２５ gag 遺伝子のヌクレオチド配列と、
この遺伝子によって暗号化されているアミノ酸配列を示
す。
【００１１】図６は、融合タンパク質p４１ gag を生産
するためのpＧＡＧ４１−１０にクローンしたヌクレオ
チド配列の暗号鎖と、それに対応するアミノ酸を示す。
【００１２】図７は、ＡＲＶ−２p１６ gag タンパク質
を暗号化しているヌクレオチド配列を示している。この
ものをプラスミドptac５にクローンし、細菌内中でp１
６ gag タンパク質を生産するための発現プラスミドを
作成する。
【００１３】図８は、プラスミドpＤＰＣ３０３を調製
するために使用されたＡＲＶ−２ env タンパク質を暗
号化しているヌクレオチド配列を示している。
【００１４】図９および図１０は、ＡＲＶ−２p３１ タ
ンパク質を暗号化しており、プラスミドpＴＰ３１に含
まれているヌクレオチド配列を示している。
【００１５】
【発明の実施態様】hＴＬＲ・ＤＮＡ配列は、プロウィ
ルスＤＮＡまたはそのcＤＮＡから分離し、クローンし
たものであっても、もしくは合成したものでも、いずれ
も、切断によってさらに操作する前駆体タンパク質の形
の、または完全な成熟タンパク質またはその断片の形の
ポリペプチドの発現に用いることができる。受容体、例
えば免疫グロブリンと特異的結合を行うことが可能なア
ミノ酸配列を暗号化している配列を得るための最も小さ
い配列は、開始コドンを除けば２１bpであり、通常、少
なくとも４５bpである。その配列は完全なポリペプチド
またはそれより大きい部分をコードしていてもよく、ま
た、２個またはそれ以上の異なった成熟ポリペプチドを
暗号化している配列の一部または全配列を含むように、
その配列は前駆体ポリペプチドの周辺領域を含んでいて
もよい。通常、配列は約５kbpを超えることはなく、さ
らに、約３kbpを超えないのが普通である。
【００１６】読取り枠(図６)を有する特に重要な配列
は、gagタンパク質(p１６およびp２５)、envタンパク質
およびpolタンパク質(p３１)の構造遺伝子である。上記
の配列は、その配列の５'−終末が発現生産物のＮ−末
端アミノ酸を暗号化しないようにレトロウィルスに存在
している他の配列にスプライス(接合)できるということ
を理解すべきである。スプライス部位は読取り枠の５'
−末端であってもよく、または読取り枠の内側にあって
もよい。上に挙げた全配列を使用すると伸張したタンパ
ク質が得られるので、タンパク質に対する開始コドンは
最初のメチオニンに対するコドンではなく、次のメチオ
ニンまたは３番目のメチオニンに対するコドンであるこ
ともある。ところが、哺乳類細胞にはgagまたはenv遺伝
子に関してタンパク質分解的プロセシングがあるらし
い。このプロセシングには、余分なアミノ酸の除去が含
まれる。
【００１７】種々のドメインを単離するには、プロウィ
ルスを制限エンドヌクレアーゼで消化し、断片を電気泳
動して、適切な大きさを有し、プローブが使用できる場
合にはこのプローブで２本鎖とした断片を単離し、クロ
ーニングベクターでクローンし、ベクターからこれを切
り取る。次いで、この断片を発現用に手術する。余分な
ヌクレオチドは、Ｂal３１の消化によって一方または両
末端から除去する。制限酵素切断地図を作成することに
より、都合のよい制限部位を暗号化領域の外側または内
側に位置付ける。アミノ酸を変化させたり、あるいは変
えることなく(隠れた変化)、コドンを変化させ得る場
合、制限部位を導入したり除去するために、末端を決め
たり、挿入、欠失、点または多重突然変異等を行うため
にプライマー修復、または試験管内突然変異誘発を行う
ことができる。遺伝子を先端切断(truncate)した場合、
アダプターを用いて失われたヌクレオチドと置き換え
る。暗号化領域を結合して好適な読取り枠を確保するの
にアダプターは特に有用である。
【００１８】hＴＬＲゲノムのenv領域は、プロウィルス
をＥcoＲＩおよびＫpnＩで消化し、３３００塩基対(bp)
断片を精製することによって得ることができる。この断
片には、約４００bpの５'−非暗号化領域と、約２００b
pの３'−非暗号化領域が含まれている。読取り枠の５'
−末端の配列によって暗号化されている３個のメチオニ
ンは、翻訳開始部位として役立つ。
【００１９】プロウィルス配列をＳacＩおよびＥcoＲＶ
で消化すると、gagドメイン(領域)と、gag領域の３'−
末端側に第２の小さい読取り枠を含んでいる約２３００
bpの断片が得られる。このgagドメインは約１５００bp
であって、プロセシングにより約２５,０００(p２５)、
１６,０００(p１６)および１２,０００(p１２)ダルトン
のタンパク質を与える大きい前駆体タンパク質を暗号化
している。また、ＳacＩおよびＢglＩＩで消化を行って
もよく、この場合はp１２およびp２５並びにｐ１６の一
部を含んでいるｇａｇドメインのみが得られる。
【００２０】上記のものをＫpnＩおよびＳstＩにより消
化すると、p３１を暗号化しているpolドメイン部分を含
んでいる断片が得られる。
【００２１】上記のＤＮＡ配列群によって発現されるポ
リペプチド類は、多方面にわたって利用できる。これら
のポリペプチドまたは免疫的活性を有するその断片は、
標識し、または標識しない形で、または固定化(即ち、
固体表面と結合させて)して診断試薬として使用でき、
また、例えば阻止抗体等のモノクローナル抗体の生産に
より、ワクチンとして使用することができる。
【００２２】ＤＮＡ配列を、ウィルスのような他の配列
(例えば、ワクチニアウィルスやアデノウィルス等)と結
合させて、ワクチン化に使用することができる。具体的
に言うと、宿主によって免疫原として認識されるhＴＬ
Ｒ抗原を与えるように、ワクチニアウィルスに該ウィル
ス抗原のＤＮＡ配列を、それが発現され得る部位へと挿
入する。gag、polまたはenv遺伝子、免疫原性を暗号化
しているそれら遺伝子の断片が使用できる。
【００２３】もう１つの別法は、gag、envまたはpol領
域またはそれらの一部を、ＨＢsＡg遺伝子、またはpre
−Ｓ ＨＢsＡg遺伝子、または免疫原性を有し、例えば
酵母のような単細胞微生物宿主または哺乳動物細胞中で
粒子を形成し得るそれらの一部分と結合させる方法であ
る。このようにして、組立てられた粒子を宿主に接種す
ると宿主にとってhＴＬＲ免疫原となる粒子が生成す
る。
【００２４】該免疫原は、ワクチンとして種々の形で、
経口、非経口、静脈内、動脈内、皮下等、様々の経路で
投与することができる。通常、これらは生理学的に許容
し得る担体、即ち一般に、蒸留水、リン酸緩衝食塩液、
生理食塩液等に加えて投与する。水酸化アルミニウムの
ような種々のアジュバンドを加えることができ、投与
量、投与回数および投与方法は経験的に決定する。
【００２５】hＴＬＲ配列を得るために、感染宿主細胞
の上清からウィルスをペレット化することができる。低
融点アガロースゲル中で、ウィルスＲＮＡの電気泳動を
行った後、フェノール抽出により、９kbのＲＮＡ種を精
製する。次に、この精製ＲＮＡを鋳型として使用し、ラ
ンダム・プライヤーと共に逆転写酵素反応にかける。次
いで、得られたcＤＮＡを、感染細胞および非感染細胞
からのポリＡ＋ＲＮＡとのハイブリダイゼーションによ
ってスクリーニングする。感染細胞のものとはハイブリ
ダイゼーションする非感染細胞からのものとはハイブリ
ダイズしないものがhＴＬＲに関係している。
【００２６】感染細胞から得られるゲノムＤＮＡを制限
酵素で消化し、これを使用してバクテリオファージ・ラ
イブラリーを作成することができる。先に得られたレト
ロウィルス断片の制限分析に基づいて、ウィルス・ゲノ
ムをＥcoＲＩで部分消化し、９kb〜１５kbＤＮＡ断片を
単離し、ライブラリーの作成に使用する。得られた組換
え体ファージを、ウィルスcＤＮＡプローブを使用する
二重リフト・スクリーニング法によってスクリーニング
し、次いでこれを、例えばプラーク精製などにより更に
精製し、大型液体培養により増殖させる。このライブラ
リーから、ウィルスの完全配列を得ることができ、前記
のプローブで検出できる。
【００２７】hＴＬＲ・ＤＮＡ(それがプロウィルスであ
っても、cＤＮＡであっても)は、都合よい任意のベクタ
ーでクローンすることができる。hＴＬＲ・ＤＮＡは、
それが完全なhＴＬＲであっても、あるいはその断片で
あっても、微生物宿主内で(それは哺乳類、酵母、節足
動物、植物等、原核細胞または真核細胞の何れであって
もよい)機能し得る複製系に連結できる場合であれば、
組立物は、環状または線状の何れにも調製することがで
きる。微生物宿主には、イー・コリ(Ｅ．coli)、バチラ
ス・サブチリス(Ｂ．subtilis)、シュードモナス・アエ
ルギノーザ(Ｐ．aerugenosa)、エス・セレビシアエ
(Ｓ．cerevisiae)、エヌ・クラッサ(Ｎ．crassa)等が含
まれる。複製系は、Ｃol Ｅl、２mμ、プラスミド、
λ、ＳＶ４０、ウシ乳頭腫ウィルス等、即ち、プラスミ
ドおよびウィルスの何れのものであってもよい。組立物
は、複製系およびhＴＬＲ・ＤＮＡ以外に、形質転換ま
たはトランスフェクトされた宿主を選択し得る、通常、
１またはそれ以上のマーカーを含んでいる。マーカーと
しては、例えば抗生物質、重金属に対する耐性のような
微生物殺滅剤に対する抵抗性、栄養素要求性宿主(オー
クソトロフィー)に原栄養体(プロトトロフィー)を与え
る相補性等が含まれる。
【００２８】発現のためには、発現ベクターが使用され
る。微生物における発現では、発現ベクターはクローニ
ングベクターと異なり、転写および翻訳の開始および停
止の調節シグナルを有しており、発現宿主において機能
し得る複製系を含むこともあり、含んでいないこともあ
る。暗号配列は、調節コントロールを受けるように開始
および停止の両調節シグナルの間に挿入する。更に発現
ベクターは、例えば、温度に鋭敏な、または化学薬品に
より誘導される調節可能なプロモーター、または、tk、
dhfr、金属チオネイン等のような、ベクターとhＴＬＲ
・ＤＮＡの組込みおよび増幅を可能にする遺伝子等を含
んでいることもある。
【００２９】発現ベクターは、調節機能が宿主内で機能
する適切な宿主へ導入する。発現宿主を好適な栄養培地
中で増殖させ、所望のポリペプチドを生産させる。ポリ
ペプチドが分泌されたら、細胞または培地からこれを単
離する。
【００３０】転写および翻訳の調節シグナルが機能し得
る宿主を使用する場合、hＴＬＲ・ＤＮＡを操作し、調
節シグナルに並置させて所望のポリペプチドが発現され
るようにする。
【００３１】ポリペプチド生産物は、特にヒト細胞に由
来する残渣を含まない、実質的に純粋な形で得ることが
できる。この残渣は、タンパク質、多糖類、脂質、核
酸、ウィルス、細菌類、真菌類等、およびその組合せの
ような汚染物から成っている。一般に、該ポリペプチド
生産物の有する発現宿主からの夾雑物は０．１(重量)％
より少なく、通常は０．０１％より少ない。所望のポリ
ペプチドが、細胞質内で生産されたか、または分泌され
たかによって、単離の方法は変わってくる。生産物が細
胞質内にある場合は、細胞を回収し、酸素分解し、生産
物を抽出し、溶媒抽出、クロマトグラフィー、ゲル排
除、電気泳動等によって精製する。分泌されている場合
は、所望の生産物を栄養培地から抽出し、上記の方法に
従って精製する。
【００３２】env、gagおよびpol遺伝子、および免疫原
性部位を有するそれらの免疫原性断片の発現生産物は、
hＴＬＲ抗原に結合する抗体存在の有無を測定する患者
血液の抗血清スクリーニングに使用することができる。
１またはそれ以上の組換え体抗原が、この血清学的測定
に使用できる。好ましい測定の態様は、gag、envおよび
pol抗原の組合せを使用する。p２５、p３１およびenv組
換え体抗原の組合せが特に好ましい。標識した、または
標識しない抗原、または固定化抗原を含め、極めて多様
な免疫測定手法を使用することができる。標識物として
は、蛍光体、放射性核種酵素、化学発光体、磁気粒子、
酵素基質、補助因子または阻害物質、配位子(リガンド)
等を挙げることができる。
【００３３】特に都合のよい手法は、測定管の表面また
は測定板のウェル(井戸)、またはニトロセルロースまた
はナイロンのような物質のようにタンパク質を結合する
支持体に抗原を結合し、試料をこの固定化抗原と接触さ
せる方法である。支持体を洗浄して、非特異的結合抗血
清を除去した後、標識したヒトＩg(免疫グロブリン)抗
体を加える。次いで、支持体をもう一度洗浄して、結合
していない標識抗ヒトＩgを除去する。次いで、標識物
を検出することにより、結合している被検物質の存在量
を測定する。
【００３４】イライサ法(ＥＬＩＳＡ)および「ドット・
ブロット(dot−blot)」測定法は、抗hＴＬＲ抗体につい
て血液または血清試料をスクリーニングするのに特に有
用である。イライサ測定法は、抗原性hＴＬＲポリペプ
チドで被覆してあるウェル(井戸)を有する微量滴定皿を
使用する。ウェルはまた、試料中の抗体がウェル表面と
非特異的結合をすることを避けるため、上からさらに非
抗原性タンパク質で被覆してある。試料をウェルに加
え、抗原−抗体結合に好ましい条件下で、好適な時間、
インキュベートする。
【００３５】試料中に存在している抗hＴＬＲ抗体はウ
ェル壁の抗原または抗原群と結合する。次いで、試料を
除き、ウェルを洗浄して残っている未結合試料を除く。
酵素標識をしてあるヒト免疫グロブリンを含有している
試薬をウェルに加え、標識した抗ヒトＩg抗体と、ウェ
ル壁に結合しているhＴＬＲ抗原−ヒト抗体複合体との
間に結合が生じるように、インキュベートする。インキ
ュベーション完了後、試薬を除去し、ウェルを洗浄して
未結合の標識試薬を除く。次いで、基質試薬をウェルに
加え、インキュベートする。基質に対する酵素活性を、
肉眼的または分光学的に測定し、ウェル表面に結合して
いる抗hＴＬＲ抗体含有免疫複合体の存在および量の測
定値(indication)とする。
【００３６】「ドット・ブロット」法は、抗原被覆した微
量滴定皿を使うより、むしろニトロセルロース濾紙また
はナイロン膜のような吸水性の支持材料小片の１個また
は１枚に固定化したhＴＬＲ抗原を使用する。支持体は
また、抗体と支持体との非特異的結合を防ぐため、さら
に非抗原性タンパク質で処理しておく。抗原を保有して
いる支持体を試料中に浸し、そのままインキュベートす
る。この場合も、試料中にある抗hＴＬＲ抗体は、支持
体に固定化してある抗原と結合する。好適なインキュベ
ーション時間を経過した後、支持体を試料から取り出
し、これを洗浄用緩衝液に繰り返し浸して、結合しなか
った試料を濾紙から除く。次いで、支持体を酵素標識ヒ
トＩg抗体試薬に浸し、好適な時間、インキュベートす
る。標識試薬で処理した後、支持体を洗浄用緩衝液に浸
し、次いで、基質液中でインキュベートする。支持体上
の抗hＴＬＲ抗体含有複合体の存在を示す酵素活性によ
って支持体上に色の変化が起こり、これは光学的に検出
できる。
【００３７】これらの手法の何れの場合でも、酵素以外
の標識を用いて修飾することができる。それに伴って読
取り相または検出相を変える。
【００３８】また、hＴＬＲの抗原性ポリペプチド類
は、それ自体または他のポリペプチドと結合させること
により、免疫原として、治療または診断に使用し得る抗
血清またはモノ・クローナル抗体の生産に使用すること
ができる。免疫グロブリンは、任意の哺乳類供給源、例
えば、ラットまたはマウスのようなゲツ歯類、ヒヒ、サ
ルまたはヒトのような霊長類等から得ることができる。
診断のためには、臨床試料中のhＴＬＲを通常の方法で
検出するのに、この抗体を使用できる。
【００３９】また、hＴＬＲ、ＤＮＡ配列を、同位元素
または非同位元素の標識またはマーカーで標識し、天然
のhＴＬＲヌクレオチド配列を含有していることが予測
される試料中の該ヌクレオチド配列を検出するＤＮＡプ
ローブとして使用することができる。
【００４０】本発明より詳細に説明するため、以下に実
施例を挙げる。但し、本発明はこれらの実施例に限定さ
れるものではない。
【００４１】
【実施例】
１．エイズ関連ウィルス−２(ＡＲＶ−２)の精製および
ウィルスＲＮＡの作成 ＡＲＶ−２に感染させたＨＵＴ−７８細胞(ＡＴＣＣ受
理番号、ＣＲＬ８５７９、１９８４年８月７日、寄託)
は、カリホルニア大学(サンフランシスコ)のジェイ・レ
ビー(Ｊay Ｌevy)博士から入手した。培養は、１０％
ウシ胎児血清を含んでいるＲＰＭＩ培地で２週間、増殖
させた。ＳＷ−２８ローターを使用して、２Ｋrpmで１
時間、４℃で培養を遠心した。ウィルスを含有している
得られたペレットを、氷上で、１０mＭトリス−ＨＣl(p
Ｈ７．５)に再浮遊させた。再浮遊させた該ペレットを
１０μg ＤＮＡエース[ベーリンガー・マンハイム(Ｂoe
hringer−Ｍannheim)]で処理し、直線状ショ糖勾配[１
５〜５０％、１０mＭトリス−ＨＣl(pＨ７．５)、１mＭ
ＥＤＴＡ、２０mＭ ＮaＣl中]で層化した。ショ糖勾配
をＳＷ−４１ローターで、４℃で４時間、３４Ｋrpmで
回転した。２．５mlづつの５画分を採取し、それぞれそ
の一部を、１％アガロース＋５mＭ水酸化メチル水銀ゲ
ルで電気泳動し[ベイリー(Ｂailey)およびダビッドソン
(Ｄavidson)、アナリテイカル・バイオケミストリー(Ａ
nal．Ｂiochem．)、７０巻、７５〜８５(１９７６
年)]、９kbのウィルスＲＮＡが含まれていることを測定
した。ウィルスＲＮＡを含有している画分を１０mＭト
リス−ＨＣl(pＨ７．５)、１mＭＥＤＴＡで１０mlに希
釈し３４Ｋrpmで、２時間４℃で遠心した。ペレットを
２０mＭトリス−ＨＣl(pＨ７．６)、１０mＭ ＥＤＴ
Ａ、０．１％ ＳＤＳおよび２００μ／mlのプロテイナ
ーゼＫに再び浮遊した。室温で１５分間インキュベート
した。混合物をフェノールで抽出し、水相にＮaＣlを加
えて４００mＭ濃度とし、エタノールで沈澱させた。ペ
レットを再び水に浮遊し、−７０℃で貯蔵した。上記の
ごとくして得られた核酸ペレットに含まれているウィル
スＲＮＡを精製するため、試料を、５mＭ水酸化メチル
水銀を含有している低融点１％アガロースゲルで電気泳
動した。電気泳動後、ゲルを０．１％臭化エチジウムで
染色し、核酸バンドを紫外光下で観察した。９kbに対応
する領域をゲルから切り出し、アガロースを３容量の
０．３Ｍ ＮaＣl、１０mＭトリス(pＨ７．５)、１mＭ
ＥＤＴＡ中で、７０℃で２〜３分間溶融した。混合物を
等量のフェノールで抽出した。もう一度、水相をフェノ
ールで抽出し、エタノールで沈澱させた。ペレットを９
５％冷エタノールで洗浄し、空気乾燥し、もう一度水に
浮遊させ、使用時まで−７０℃で貯蔵した。１００mlの
培地から０．５〜１μgの精製ＲＮＡが得られた。
【００４２】２．標識したホモローガス(相同)ウィルス
・プローブの合成 マニアチス(Ｍaniatis)ら[ア・ラボラトリー・マニュア
ル(Ａ ＬaboratoryＭanual)、コールド・スプリング・
ハーバー(Ｃold Ｓpring Ｈarbor、ＮＹ)、１９８２
年]の記載のごとく作成したランダム・プライマー(ウシ
胸線プライマー)を使用して、ゲル精製を行ったウィル
スＲＮＡに対して32Ｐ−標識cＤＮＡを作成した。反応
混合物は、５０μlの反応容量中に、０．５Ｍ ＭgＣl2
２μl、０．１Ｍジチオスレイトール５μl、各２．５μ
lづつの１０mＭ dＡＴＰ、１０mＭ dＧＴＰおよび１０m
Ｍ dＴＴＰ、２．５μlウシ胸線プライマー(１００Ａ
260／ml)、０．５μlウィルスＲＮＡ、５μlアクチノマ
イシンＤ(２００μg／ml)、１０μl 32Ｐ−dＣＴＰ(＞
３０００Ｃi／ミリモル、１mＣi／ml)および１μl ＡＮ
Ｖ逆転写酵素(１７単位／μl)を含有していた。反応を
３７℃で１時間インキュベートした。プローブを、遊離
ヌクレオチド類からセファデックス(Ｓephadex)Ｇ５０
カラムを用いるゲル濾過により分離精製した。ボイド
(空)容量をプールし、ＮaＣlの最終濃度が４００mＭ、
またはキャリアー１本鎖濃度が１００μg／mlとなるよ
うに加え、エタノールでcＤＮＡを沈澱させた。ペレッ
トを水に再浮遊させ、取り込まれた。32Ｐのカウントを
測定した。
【００４３】３．感染ＨＵＴ−７８細胞から作成したポ
リＡ＋ＲＮＡ中のＡＲＶ配列の検出 ＡＲＶ−２、ＡＲＶ−３またはＡＲＶ−４(３人の異な
るエイズ患者から、それぞれ単離した３種の異株)で感
染させたＨＵＴ−７８細胞と、非感染ＨＵＴ−７８細胞
から、それぞれ、ポリＡ＋ＲＮＡを作成した。ポリＡ＋
ＲＮＡを、５mＭ水酸化メチル水銀含有０．１％ゲルで
電気泳動し(ベイリーおよびダビッドソン、前掲)、これ
をニトロセルロース・フィルターへ移し、第２項に記載
した相同プロープを用いてハイブリダイズした。ハイブ
リダイゼーションは、５０％ホルムアミド、３×ＳＳＣ
中で、４２℃で行った。洗浄は０．２×ＳＳＣ中で、５
０℃で行った。感染ＨＵＴ−７８細胞の３つの試料すべ
てに、９kbバンドが存在した。非感染細胞から得たポリ
Ａ＋には、このバンドは存在していなかった。
【００４４】４．感染、および非感染ＨＵＴ−７８細胞
内のＡＲＶ配列の検出 ルシウ(Ｌuciw)らの方法[モレキュラー・アンド・セル
ラー・バイオロジー(Ｍolec and Ｃell Ｂiol)、４
巻、１２６０〜１２６９(１９８４年)]に従って、ＡＲ
Ｖ−２感染ＨＵＴ細胞の培養、および非感染ＨＵＴ−７
８細胞から高分子量ＤＮＡ(染色体性)を作成した。この
ＤＮＡを、サザーンの記載の方法(１９７５年、前掲)に
従って、制限酵素で消化し、１％アガロースゲルで電気
泳動し、ニトロセルロースにブロットした。ブロットを
32Ｐ−標識プローブ(１０6cpm／ブロット)と共に、５０
％ホルムアミド、３×ＳＳＣ、１０mＭ ヘペス(Ｈepes)
(pＨ７．０)１００μg／mlの変性したキャリアーＤＮ
Ａ、１００μg／ml酵母ＲＮＡおよび１×デンハート液
(Ｄenhardt's)を含有する混合液中で、４２℃で３６時
間、ハイブリッド化した。フィルターを室温で１回、２
×ＳＳＣで洗浄し、次いで、２回４２℃で０．２×ＳＳ
Ｃ、０．１％ＳＤＳで洗浄した。フィルターを空気乾燥
し、増感スクリーンを用い、Ｘ−オーマット(Ｘ−Ｏma
t)、フィルムに露出した。
【００４５】ＡＲＶ−２と相同である32Ｐ−プローブ
は、ＳacＩで制限消化した感染細胞から、２本のバンド
を特異的にＤＮＡにハイブリッド化した。非感染細胞の
ＤＮＡを使用した場合、これらのバンドは存在しなかっ
た。このことから、プローブは染色体ＤＮＡに組み込ま
れて、特異的に感染細胞にハイブリッド化し、結局プロ
ウィルスにハイブリッド化されることが分かる。これら
のバンドの分子量は、ほぼ５kbおよび３kbである。
【００４６】プロウィルスの配列を別の酵素で切断した
場合を検討するため、ＥcoＲＩ、ＳphＩまたはＫpnＩま
たはそれらの２つを使用する二重消化を用い、細胞ＤＮ
Ａのいろいろな制限消化を行った。サザーン・ハイブリ
ダイゼーションの成績から、感染細胞のＤＮＡを使用し
た場合は、特異的なバンドがハイブリッド化されること
が分かる。図１はプロウィルス配列における制限酵素部
位の位置を示した模式的地図であり、断片部位を示して
いる。
【００４７】５．プロウィルスＡＲＶ−２ＤＮＡのクロ
ーン化 ルシウらの方法(前掲)に従って、感染ＨＵＴ−７８細胞
から高分子量細胞ＤＮＡを作成した。このＤＮＡをＥco
ＲＩ(これはプロウィルスを１回切断する)で消化して、
ショ糖勾配で遠心し、８〜１５kbに対応する画分をプー
ルし、これを透析し、エタノール沈澱によって濃縮し
た。バクテリオファージλ誘導体をクローン化したベク
ターＥＭＢＬ−４[カーン(Ｋarn)ら、メソッズ・オブ・
エンザイモロジー(Ｍethods Ｅnzymol)、１０１巻、３
〜１９(１９８３年)]を、ＥcoＲＩ、ＢamＨＩおよびＳa
lＩ制限酵素の混合物で完全に消化し、次いで、フェノ
ール−クロロホルム抽出によって該ＤＮＡを除タンパク
し、冷エタノールで沈澱させ、ライゲーション緩衝液に
再浮遊させた。このＥＭＰＬ−４ファージＤＮＡと、細
胞ＤＮＡのＥcoＲＩ消化物を混合し、連結(ライゲート)
し、得られた組換え体ファージゲノムをイン・ビトロ
(試験管内)でパッケージした。λ−感受性イー・コリ
(Ｅ．coli)(ＤＰ５０−ＳupＦ)にファージを感染した
後、約５００,０００個のファージ・プラックをニトロ
セルロース上に移入し、ＤＮＡを固定して、第２項の記
載のごとく作成した相同32Ｐ−プローブで該フィルター
をスクリーニングした。５００,０００ファージの中か
ら選ばれた１１個の組換え体ファージを最初の二重リフ
ト・スクリーニング法[マニアティス(Ｍaniatis)ら、モ
レキュラー・クローニング、ア・ラボラトリー・マニュ
アル(Ｍolecular Ｃloning, ＡＬaboratory Ｍanua
l)、１９８２年]によって、ウィルスcＤＮＡプローブに
アニーリングし、これらをさらにプラック精製し、次い
で、組換え体ＤＮＡを作成するため、大型液体培養で増
殖させた。プラック精製したＡＲＶ・ＤＮＡを含んでい
るファージは、液体培養で、イー・コリ(Ｅ．coli)ＤＰ
５０−supＦに繁殖させた。ファージ粒子を回収し、Ｃs
Ｃl勾配中でバンドをとり、フェノール抽出後、エタノ
ール沈澱によって組換え体ファージＤＮＡを作成した
(マニアティスら、前掲)。精製ファージＤＮＡ１μgを
制限酵素で消化し、１％アガロースゲルで電気泳動し、
臭化エチジウムで紫外光下に視覚化した。これらのゲル
から得られたＤＮＡをニトロセルロースに移し、ウィル
スのcＤＮＡプローブとアニーリングした。
【００４８】１１個のファージのうち、λＡＲＶ−２
(９Ｂ)と命名された１つは、１９８５年１月２５日にＡ
ＴＣＣに寄託され、受入れ番号４０１５８が与えられ
た。λＡＲＶ−２(９Ｂ)は周辺細胞配列と共にプロウィ
ルスＤＮＡの完全鎖長の挿入を含んでいた。λＡＲＶ−
２(９Ｂ)をＳacＩで消化すると、３．８kbおよび５．７
kbウィルスＤＮＡ断片が得られた。λＡＲＶ−２(９Ｂ)
のＥcoＲＩ消化では、６．４kbおよび８．０kbに、ＤＮ
Ａ種(species)を含んでいるウィルスを生成した。Ｓac
ＩおよびＥcoＲＩの二重消化では、３．８kbおよび５．
４kbにウィルスＤＮＡ断片が得られた。このパターン
は、細胞ＤＮＡと連結しているプロウィルスのパターン
とよく一致している。
【００４９】λＡＲＶ−２(９Ｂ)以外にも、(１)周辺細
胞ＤＮＡへ伸長しているウィルスＤＮＡのＥcoＲＩ部位
から左半分のウィルス・ゲノムを有するファージ(λＡ
ＲＶ−２(８Ａ))、および周辺細胞ＤＮＡへ伸長してい
るウィルスＤＮＡのＥcoＲＩ部位から右半分のウィルス
・ゲノムを有するファージ(λＡＲＶ−２(７Ｄ))が得ら
れた。バクテリオファージλＡＲＶ−２(７Ｄ)(右側)お
よびλＡＲＶ−２(８Ａ)(左側)は、１９８４年１０月２
６日に共にＡＴＣＣに寄託され、それぞれ、受入れ番号
４０１４３および４０１４４が与えられた。
【００５０】６．多形現象 独立したＡＲＶ分離体の関連度を調べるため、ＡＲＶ−
３およびＡＲＶ−４で感染させたＨＵＴ−７８細胞から
制限酵素で消化して得たＤＮＡ消化物を、クローンした
ＡＲＶ−２ＤＮＡから作成したプローブで分析した。Ａ
ＲＶ−３ＤＮＡのＳacＩ消化物はＡＲＶ−２の同様の消
化物と相似しているが、一方、ＨindＩＩＩの消化物は
異なったパターンを示していた。ＡＲＶ−４ＤＮＡのＳ
acＩ消化物およびＰstＩ消化物は、ＡＲＶ−２ＤＮＡの
対応する消化物と異なっている。ＡＲＶ−３およびＡＲ
Ｖ−４試料で得られたアニーリング・シグナル強度は、
ＡＲＶ−２ＤＮＡの場合よりもはるかに低い(約１０倍
低い)。多分、このことはＡＲＶ−３およびＡＲＶ−４
培養において感染した細胞が、比較的少ない事実による
ものであろう。ＡＲＶ−３およびＡＲＶ−４のＤＮＡを
ＳacＩで処理することによって生成したウィルス特異性
ＤＮＡは、総計して９．０〜９．５kbpであり、これは
ＡＲＶ−２の値と相似した値であり、該ＲＮＡゲノムの
大きさとよく一致している。
【００５１】７．プロウィルスＤＮＡの配列決定 λファージ９ＢからのＡＲＶ−２の断片および下位断片
(サブフラグメント)を作成し、通常の方法(マニアティ
スら、前掲)によりＭ１３へとクローンした。配列決定
は、サンガー(Ｓanger)ら[プロシーディング・オブ・ナ
ショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズＵＳＡ(Ｐr
oc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ)、７４巻、５４６３
(１９７７年)]に従い、共通のＭ１３プライマー、また
は化学的に合成したＡＲＶ−２配列に相補的なプライマ
ーを使用して実施した。その配列を図２および図３に示
す。
【００５２】８．p２５およびp１６ gag が暗号化して
いるタンパク質のアミノ酸配列 第１項に記載のごとく、ＡＲＶ−２を作成し、精製し
た。ウィルスのタンパク質をアクリルアミドゲルで電気
泳動し、２４,０００ダルトンおよび１６,０００ダルト
ンのタンパク質に対応しているバンドをゲルから切り取
り、配列決定に使用した。アプライド・バイオシステム
(Ａpplied Ｂiosystem)４７０Ａ型タンパク質アミノ酸
配列分析装置を使用し、ヒューイック(Ｈewick)ら[ジャ
ーナル・オブ・バイオケミストリー(Ｊ．Ｂiol．Ｃhe
m．)、２５６巻、７９９０〜７９９７(１９８１年)]の
記載と同様にして、微量配列分析を行った。フェニルチ
オヒダントイン・アミノ酸は、ホーケ(Ｈawke)ら[アナ
リティカル・バイオケミストリー(Ａnal．Ｂioche
m．)、１２０巻、３０２〜３１１(１９８２年)]の報告
のごとく、ベックマン・ウルトラスフェア・ＯＤＳ・カ
ラム(Ｂeckman ultrasphereＯＤＳ column)を使用
し、トリフルオロ酢酸−アセトニトリル・バッファー系
を使用するＨＰＬＣにより、同定した。表１はp２５−g
agタンパク質について測定したアミノ末端からの最初の
２０アミノ酸を示しており、表２はp１６−gagの最初の
３０アミノ酸を示している。
【００５３】
【表１】 p２５−gag のアミノ末端配列位置 アミノ酸 １ プロリン ２ イソロイシン ３ バリン ４ グルタミン ５ アスパラギン ６ ロイシン ７ グルタミン ８ グリシン ９ グルタミン １０ メチオニン １１ バリン １２ (ヒスチジン) １３ グルタミン １４ アラニン １５ イソロイシン １６ (セリン) １７ プロリン １８ (アルギニン、リシン) １９ スレオニン２０ （ロイシン）
【００５４】
【表２】 p１６−gag のアミノ末端配列位置 アミノ酸 １ (メチオニン) ２ グルタミン ３ アルギニン ４ グリシン ５ アスパラギン ６ フェニルアラニン ７ アルギニン ８ アスパラギン ９ グルタミン １０ アルギニン １１ リシン １２ スレオニン １３ バリン １４ リシン １５ −−−(システイン) １６ フェニルアラニン １７ アスパラギン １８ −−−(システイン) １９ グリシン ２０ リシン ２１ グルタミン酸 ２２ グリシン ２３ (ヒスチジン) ２４ イソロイシン ２５ アラニン ２６ (リシン) ２７ アスパラギン ２８ (グリシン) ２９ アルギニン３０ (アラニン、ロイシン)
【００５５】表１のアミノ酸配列は、表２のＡＲＶ−２
ＤＮＡ配列から予見される。従って、これらの結果か
ら、提示された gag の読取り枠が実際に翻訳されてい
るということ、およびそれがp２５およびp１６のＮ−末
端を確定しているということが確かめられた。
【００５６】９．細菌内ＡＲＶ−２のp２５ gag タンパ
ク質の発現 Ａ．宿主ベクター系 p２５タンパク質は、プラスミドpＧＡＧ２５−１０を導
入したイー・コリ(Ｅ．coli)のＤ１２１０株によって合
成する。
【００５７】プラスミドpＧＡＧ２５−１０はpＢＲ３２
２誘導体であって、trpとlac ＵＶ５プロモーター配列
から誘導されたハイブリッドtacプロモーター[デ・ボア
(ＤeBoer)ら、プロシーディングズ・オブ・ナショナル
・アカデミー・オブ・サイエンシズＵＳＡ(ＰＮＡＳ)、
８０巻、２１〜５５(１９８３年)]の転写コントロール
の支配下にあるp２５暗号配列を含んでいる。p２５gag
の発現は、イソプロピルチオガラクシド(ＩＰＴＧ)によ
って細菌性形質転換株に誘発される。
【００５８】イー・コリＤ１２１０は、ラクトースリプ
レッサー過剰生産株で、染色体にlacＩqおよびlacＹ+の
対立遺伝子を持っているが、それ以外は、その誘導され
たもとのイー・コリ(Ｅ．coli)ＨＢ１０１(Ｆ-lacＩ+、
lacＯ+、lacＺ+、lacＹ-、gal-、pro-、leu-、thi-、en
d-、hsm-、hsr-、recＡ-、rpsＬ-)と同一である。
【００５９】Ｂ．pＧＡＧ２５−１０の組立て プラスミドpＧＡＧ２５−１０は、図４の模式図に示し
たように、p２５gagを暗号化している６９９bpのＤＮＡ
をプラスミドptac５へクローンすることにより組立てら
れる。ベクターptac５は、tacプロモーター、シャイン
・ダルガルノの配列、およびＥcoＲＩおよびＰvuＩＩの
制限部位の間にもとのpＢＲ３２２の置換物として含ま
れているポリリンカーを含んでいるpＢＲ３２２の誘導
体である。
【００６０】６９９bp断片は、完全なp２５gagタンパク
質を含んでいるが(図２および図３、１３９番から３６
９番までのアミノ酸残基)、但し、翻訳開始を行わせる
ため、メチオニンを最初のアミノ酸としてpＧＡＧ２５
−１０に付け加えている点だけが異なっている。この変
更だけでなく、下記に示したヌクレオチド配列における
他の変化も、該ＤＮＡ断片の各部分の化学合成を用いる
ことによって達成した。また、該ＤＮＡは配列の３'末
端に２つの停止コドンを含んでいる。
【００６１】図５は、pＧＡＧ２５−１０にクローンし
たヌクレオチドと、それから誘導されるアミノ酸配列を
示している。ＤＮＡは、この図では下線を引いて示して
ないが、ＡＲＶ−２(９Ｂ)cＤＮＡから直接誘導した。
その他の配列は、すべて化学的に合成するか、ベクター
ptac５から誘導した。もとになるcＤＮＡに関連して、
制限部位を新たに設け、または欠失し、プロリンの前に
メチオニンを加え(p２５の最初の残基)、またはp２５の
最終コドンの後に停止コドンを含める等の変化を、この
ＤＮＡ配列に導入した。但し、予め示したように、最初
のコドンの場合を除き、該ＤＮＡ配列におけるすべての
変化はp２５gagのアミノ酸配列を変化させるものではな
い。
【００６２】Ｃ．Ｄ１２１０(pＧＡＧ２５−１０)株の
作成と、形質転換株によって発現されるp２５gagタンパ
ク質の形質決定 イー・コリ(Ｅ．coli)Ｄ１２１０細胞は、標準プロトコ
ールに照らして形質転換に適格なものを作成する[コー
エン(Ｃohen)ら、プロシーディングズ・オブ・ナショナ
ル・アカデミー・オブ・サイエンシズＵＳＡ(ＰＮＡ
Ｓ)、６９巻、２１１０(１９７２年)]。形質転換は、p
ＧＡＧ−２５−１０の２５〜５０ngを用い、プロトコー
ルの指示のごとく遂行する。１００μg／mlアンピシリ
ンを含有しているＬ−ブロス内で調製した寒天平板上に
形質転換混合物を置く。平板を３７℃で１２時間、イン
キュベートする。
【００６３】単集落アンピシリン耐性コロニーを１００
μg／mlアンピシリン含有Ｌ−ブロス１mlに移し、３７
℃で増殖させる。１００mＭ ＩＰＴＧ[シグマ(Ｓigm
a)]１０μlを最終濃度１mＭとなるように加え、３７℃
で２時間インキュベートすることにより、p２５gagタン
パク質の発現を誘導する。
【００６４】誘導培養の１mlから細胞をペレットとし、
これをラエムリ(Ｌaemmli)・サンプル・バッファー１０
０μlに再浮遊させる。煮沸と凍結を３回反復した後、
得られた分解物の一部を標準変性アクリルアミドゲル上
で分析する。タンパク質はクーマシー・ブルーで染色す
ることによって視覚化する。
【００６５】発現の程度はまず、誘導検体試料によって
新しく出現するタンパク質バンドを、対照と比較するこ
とにより測定する。
【００６６】発現した遺伝子から予想される分子量のタ
ンパク質は、既知量の標準タンパク質を対照とする肉眼
的検査による測定で、最高に発現している組換え体の場
合でも、細胞タンパク質合計の２％〜５％であった。
【００６７】発現されたタンパク質の信頼性は、標準的
ウェスタン法によってタンパク質をニトロセルロースに
移し、好適なヒトまたは家兎の免疫血清、またはマウス
の単クローン性抗体で分析するか(下記のＥ．４．aを参
照)、またはエイズ患者から得られたヒト免疫血清を使
用する。易溶性イー・コリ(Ｅ．coli)タンパク質のイラ
イサ(ＥＬＩＳＡ)測定法(下記のＥ．４．b)により測定
した。
【００６８】Ｄ．発酵工程 Ｄ．１． 形質転換されたマスター・シード・ストック
の調製 p２５gagを高レベル(３％)に発現している培養物から得
た形質転換細胞をアンピシリン１００μg／mlを含んだ
Ｌ−ブロス平板上に画線接種し、この平板を一夜、３７
℃でインキュベートする。単一のコロニーをアンピシリ
ン１００μg／mlを含んだＬ−ブロス１０mlに接種し、
３７℃で一夜増殖させる。その一部を用い、ＳalＩおよ
びＰstＩによる制限マッピングによってプラスミド構造
を確かめる。更に培養物の一部を用いてp２５gagの発現
を誘導し、残りの培養物に１／４容量の７５％滅菌グリ
セリンを加えて１５％グリセリン濃度に調製する。グリ
セリン細胞ストックを１mlづつに分けて、液体窒素また
はドライアイス−エタノール浴中で素早く凍結させる。
これらのマスター・シード・ストックを−７０℃で保存
する。
【００６９】Ｄ．２．マスタープレート／単一コロニー
およびその一夜培養物 マスター・シード・ストックを滅菌したアプリケーター
で削り取り、これをアンピシリン１００μg／mlを含ん
だＬ−ブロス平板に画線接種する。この平板から得た単
一のコロニーを２０〜５０mlのＬ−ブロス／アンピシリ
ンに接種し、３７℃で一夜インキュベートする。
【００７０】Ｄ．３．発酵槽接種 一夜培養物の一部を、より多量(１〜６リットル)のＬ−
ブロス／アンピシリンに接種する。細胞を３７℃で、
Ｏ．Ｄ．６５０が約５になるまで一夜培養した後、発酵
用の接種物として使用する。
【００７１】Ｄ．４．発酵および収穫 Ｌ−ブロス１０リットルと消泡剤１mlとを含有する発酵
槽(容量:１．６リットル)に、接種培養物１００〜５０
０mlを接種する。３７℃で、Ｏ．Ｄ．が約１になるまで
細胞を培養する。発酵槽に最終濃度が１mＭになるよ
う、ＩＰＴＧ溶液(１００mＭ)１００mlを加えて、p２５
gagの発現を誘導する。更に３時間、細胞を増殖させ、
次いで、連続的な浮遊遠心法(flow centrifugation)に
よって収穫する。この段階で細胞を凍結し、p２５gagの
純化が進行するまで−２０℃に保持する。あるいは、接
種培養物１〜５リットルを２５０リットルの発酵槽に接
種する。増殖、誘導および発酵は先に記載したようにし
て行う。
【００７２】Ｅ．p２５gagの精製および特性化 Ｅ．１．細胞の破壊 凍結大腸菌(Ｅ．coli)細胞を解凍し、２．５容量の溶菌
バッファー[０．１Ｍリン酸ナトリウム(ＮaＰi)、pＨ
７．５、１mＭ ＥＤＴＡ、０．１Ｍ ＮaＣl]に懸濁す
る。ダイノ・ミル(Ｄyno Ｍill)の３００mlガラス・ユ
ニット(３０００rpm)と、酸で洗浄したガラスビーズ１
４０mlを用いて細胞を非連続的な系で破壊する。ジャケ
ットでくるんだ容器を、−２０℃のエチレングリコール
溶液で冷やしてやく。破壊された細胞を２７,０００xg
で２５分間遠心し、残骸とガラスビーズを除く。上清を
回収し、４℃に保つ。
【００７３】Ｅ．２．タンパク質の選択沈澱 ４℃で硫酸アンモニウムをゆっくり加えることにより、
細胞抽出物(エキス)を３０％(ＮＨ4)2ＳＯ4に調製す
る。この最終濃度に達した後、該抽出物を２７,０００x
gで２０分間遠心する。得られたペレットを、１Ｍ Ｎa
Ｃl、１mＭ ＥＤＴＡ、１％トリトンＸ−１００および
５％ＳＤＳに再懸濁した後、５分間煮沸する。
【００７４】Ｅ．３．ゲル濾過 選択沈澱で得たフラクションを、０．０３Ｍ ＮaＰi(p
Ｈ６．８)で平衡化したＧ５０セファデックスカラムを
用いてゲル濾過する。同じ溶液中でクロマトグラフィー
を展開させる。フラクションを集め、２８０nmにおける
吸収を測定する。タンパク質含有フラクションをプール
し、タンパク質ゲル電気泳動(ウェスタン・アナリシス)
およびＥＬＩＳＡ法によって特性化する。
【００７５】Ｅ．４．組換えp２５gagの特性化 a．タンパク質ゲル電気泳動 pＧＡＧ２５含有細胞と対照細胞から得られるタンパク
質をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル分析(１０％〜２
０％のグラディエントゲル)にかけたところ、分析結果
は、tacＩプロモーターをＩＰＴＧで脱抑制した後のp２
５gag発現プラスミド含有細胞において、分子量約２５,
０００の様々なレベルのタンパク質が明確に誘導されて
いることを示していた。p２５gag遺伝子産物の同定は、
いずれも、ＡＩＤＳ患者の血清およびウィルス性p２５g
agに対するモノクローナル抗体を用いた、酵素−結合イ
ムノアブソーバント・アッセイ(ＥＬＩＳＡ、Ｅ．４．
c．参照)およびウェスタン・イムノブロット・アナリシ
ス(Ｅ．４．b．参照)で行った。
【００７６】b．ウェスタン分析 試料を、１０％〜２０％ポリアクリルアミドグラディエ
ントゲル上、変性条件下で電気泳動させた。試料をニト
ロセルロース上に電気的にブロットした。このニトロセ
ルロースペーパーを、ＡＩＤＳ患者の標準血清[ＥＷ５
１１１、Ｐ．フェオリノ(Ｐ．Ｆeorino)、センターズ・
フォ・ディディーズ・コントロール(Ｃenters for Ｄ
isease Ｃontrol)、アトランタ、ジョージア]の１:２
５０希釈液、次いで、ＨＲＰと、ヒト−イムノグロブリ
ンに対するヤギ抗血清との複合物(コンジュゲート)[カ
ペル(cappel)、Ｎo．３２０１−００８１]の１:５００
希釈液で洗浄した。別法として、ニトロセルロースを、
７６Ｃ、即ち、ＡＲＶ−２ p２５gagに対するネズミ−
モノクローナル抗体の希釈されていない培養上清、次い
でＨＲＰと、マウス−イムノグロブリンに対するヤギ抗
血清とのコンジュゲート(ＴＡＧＯ Ｎo．６４５０)の
１:５００希釈液で洗浄してもよい。このイムノブロッ
トの基質は４−クロロ−１−ナフトールを含有する、Ｈ
ＲＰ発色剤であった。
【００７７】p２５gagタンパク質はＡＩＤＳ患者の標準
血清およびモノクローナル抗体のいずれとも反応した
が、非−免疫血清との反応性は示さなかった。
【００７８】c．ＥＬＩＳＡ 前記のごとくにして細菌抽出物からp２５gagを精製し
た。精製(純化)タンパク質と血清との反応性を、微量力
価検定用プレートの凹み(ウェル)を０．２５μg／mlで
コートし、試験血清(ヒト−負血清の正標準血清ＥＷ５
１１１)の希釈液を加え、次いで、ＨＲＰとヒト−イム
ノグロブリンに対するヤギ抗血清とのコンジュゲートの
１:１０００希釈液を加えることにより、分析した。p２
５gagタンパク質は正血清と反応し、その滴定曲線の中
点は約１:８００であった。健常人からの血清とは反応
性を示さなかった。
【００７９】１０．ＥＬＩＳＡにおける天然のp２５gag
タンパク質と組換えp２５gagタンパク質との比較 精製した、組換えp２５gagの様々な血清に対する反応性
を、プレパラティブ・ポリアクリルアミドゲル電気泳動
法によって精製された天然のp２５gagタンパク質のそれ
と、ＥＬＩＳＡ法により、比較した。破壊し、グラディ
エント精製したウィルス(５μg／ml)を用いて分析し、
対照とした。
【００８０】ＰＶＣ微量力価検定用プレートを、ネズミ
抗−p２５gagモノクローナル抗体７６Ｃから導かれた腹
水のＩgフラクション１０μg／ml(０．１Ｍホウ酸ナト
リウム(pＨ９．０)中、５０μl／ウェル)と共に３７℃
で２時間インキュベートした。プレートをＰＢＳで洗浄
した後、各ウェルを、ＰＢＳ中に入れた１０％正常ヤギ
血清で満たした。室温で３０分間インキュベートした
後、プレートを０．０５％トリトン(Ｔriton)Ｘ−１０
０(ＳＴ)を含有する通常の食塩水で洗浄し、ウェルに、
被検ＡＲＶタンパク質(１０％ヤギ血清を含有するＳＴ
[ＳＴＧＳ]中、５０μl／ウェル)を加えた。プレートを
３７℃で２時間インキュベートし、ＳＴで洗浄した後、
破壊されたＡＲＶに対して惹起されたウサギ抗血清(Ｓ
ＴＧＳ中、１:１０００希釈液)５０μl／ウェルと共に
３７℃で１時間インキュベートした。ウェルを洗浄し、
ＨＲＰとウサギ−イムノグロブリンに対する抗血清との
コンジュゲートのＳＴＧＳ中、１:１５００希釈液５０
μlと１時間インキュベートし、洗浄し、次いで、ウェ
ルに基質溶液(２,２'−アジノ−ジ−[３−エチルベンズ
チアゾレンスルホン酸]１５０μg／ml、０．００１％Ｈ
2Ｏ2、０．１Ｍクエン酸pＨ４)を５０μg／ウェルの割
合で加えた。３７℃で３０分間インキュベートした後、
１０％ＳＤＳを５０μl／ウェルの割合で加えることに
より、反応を止めた。４１４nmにおける吸収は、フロー
・タイターテク(Ｆlow Ｔitertech)ＥＬＩＳＡリーダ
ーにより、測定した。試料は、まず最初１:１０に希釈
して始め、以後、連続的に２倍希釈する方法で、２回、
測定した。以下の表は、破壊ウィルスを用いた分析で正
に採点された８人からのＡＩＤＳ血清、および破壊ウィ
ルス分析で負に採点された６人の健常人の血清に関する
測定結果を示すものである。
【００８１】
【表３】血清の番号 ＥＬＩＳＡ分析の力価a 破壊ウィルス 組換えp２５gag ウィルス性p２５gag グループＩ: ウィルスＥＬＩＳＡによる点数が正の血清b １ ５１,２００ ３,１２５ ３,１２５ ５ １２,８００ ２５ ２５ ６ １２,８００ ６２５ ６２５ ７ １２,８００ ３,１２５ ３,１２５ ８ ２５,６００ １５,６２５ １５,６２５ ９ １２,８００ ６２５ ６２５ １３ ８００ １２５ １２５ １８ ３,２００ ６２５ ６２５グループＩＩ: ウィルスＥＬＩＳＡによる点数が負の血清b １５ −c − − １６ − − − １９ − − − ２１ − − − ２６ − − − ３３ − − − a．最大値の５０％と同等なシグナルを与える血清希釈
率の逆数で示してある。 b．前記のごとく、イムノフルオレスセインおよびイム
ノブロッテングにより、結果を確認した。 c．血液希釈率１:２５では、シグナルを検出しなかっ
た。
【００８２】以上の結果は、細菌から精製されたp２５g
agが、ＡＩＤＳウィルスから同様に精製されたp２５gag
と、８人のＡＩＤＳ患者の血清のＥＬＩＳＡにおいて同
様な作用を現すことを示している。ＥＬＩＳＡの結果
は、抗−p２５gag抗体のレベルには広範な変動があるこ
と、さらに、いくつかの、ウィルスにコードされている
タンパク質は、従来からのウィルスに基づく分析系によ
っては検出されないことを示している。
【００８３】１１．細菌内でのＡＲＶ−２のp４１gagタ
ンパク質の発現 ＡＲＶ−２のp２５gagタンパク質とp１６gagタンパク質
との融合物で(p４１gagと命名)を、プラスミドpＧＡＧ
４１−１０で形質転換された大腸菌株Ｄ１２１０形質転
換体中で合成した。pＧＡＧ４１−１０は、図４に示す
ごとく、p５３gag前駆体ポリタンパク質のＣ末端p１６g
ag部分の配列と、p２５gagタンパク質の配列の一部を含
む、ＡＲＶ−２ゲノムのＳphＩ−ＨpaＩフラグメント
を、pＧＡＧ２５−１０のＳphＩ部位とＢamＨＩ部位と
の間に挿入することにより、プラスミドpＧＡＧ２５−
１０から組立てられた。pＧＡＧ４１−１０にクローン
されたＤＮＡ配列の暗号鎖を図６に示す。形質転換およ
び発現の誘導は、上記の方法で行われた。細胞を処理
し、上記のごとく、クーマシー(Ｃoomassie)染色ゲル上
で観察した。観察されたタンパク質の分子量の概略値は
４１,０００ダルトンであった。このタンパク質は、上
記のごとくにして行ったウェスタン分析およびＥＬＩＳ
Ａ分析において、ＡＩＤＳ血清および、p２５gagに対す
るモノクローナル抗体と反応した。
【００８４】１２．細菌内での、ＡＲＶ−２のp１６gag
タンパク質の発現 図７に示した、p１６gagタンパク質をコードしている配
列は、酵母にとって好ましいコドンを用いて化学合成さ
れた。平滑末端ＳalＩフラグメント(３２１bp)を、Ｐvu
ＩＩ−ＳalＩで消化し、ゲルで単離したptac５にクロー
ンした(上記９および１１参照)。得られたプラスミドを
用いて上記９のごとくにしてＤ１２１０細胞を形質転換
した。ＩＰＴＧによって発現を誘導し、ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動およびウェスタン分析法により、タン
パク質を分析した。約１６,０００ダルトンのバンド
は、形質転換細胞中で、ＩＰＴＧにより誘導されたもの
である。このタンパク質は、ウェスタンブロット法にお
いて、ＡＩＤＳ患者の免疫血清と反応性を有することが
分かった。健常人からの血清とは反応をしなかった。組
換えgagタンパク質はＣos(哺乳類)細胞内でも発現し
た。
【００８５】１３．酵母によるＡＲＶ−２envタンパク
質の生産 Ａ．宿主−ベクター系 プラスミドpＤＰＣ３０３で形質転換されたＳ．セレビ
シエ(Ｓ．cerevisiae)２１５０−２−３により、envタ
ンパク質の一部を合成した。プラスミドpＤＰＣ３０３
は、envタンパク質の２／３に関する暗号配列と、酵母l
eu２−０４遺伝子を含んでいる２−ミクロン配列および
ampR遺伝子を含んでいるpＢＲ３２２配列を含有してい
る。envの発現は、酵母のピルビン酸キナーゼプロモー
ターおよび終止配列の制御下で行われる。酵母Ｓ．セレ
ビシエ２１５０−２−３株は、以下の遺伝子型を有す
る: Ｍet a 、ade １、leu ２−１１２、cir o 。この
菌株は、Ｄr．レランド・ハートウェル(Ｌeland Ｈart
well、ワシントン大学)から入手した。
【００８６】Ｂ．envタンパク質のための酵母発現ベク
ター、pＤＰＣ３０３の組立て プラスミドpＤＰＣ３０３は、ベクターpＣ１／１のＢam
ＨＩ部位にクローンされた、envのための“発現カセッ
ト(expression cassette、下記)”を含有している。ベ
クターpＣ１／１はampＲマーカーと酵母leu２−０４マ
ーカーとを含む、pＢＲ３２２および２ミクロン配列を
含有している。これは、pＪＤＢ２１９d[ベッグス(Ｂeg
gs)、ネイチャー(Ｎature)(１９７８)、２７５:１０４]
のpＭＢ９領域をpＢＲ３２２配列で置き換えることによ
り導かれた。
【００８７】envのための“発現カセット"は、以下の配
列をこの順序(５'から３'へ)で融合している: 酵母のピ
ルビン酸キナーゼ(ＰＹＫ)プロモーター、env cＤＮＡ
およびＰＹＫターミネーター。ＰＹＫプロモーターおよ
びターミネーター領域は、バーク(Ｂurke)らが記載した
ごとくにして単離されたcＤＮＡから導かれた[ジャーナ
ル・オブ・ザ・バイオロジカル・ケミストリィ(Ｊ．Ｂi
ol．Ｃhem．)(１９８３)２５８: ２１９３〜２２０
１]。
【００８８】発現カセットにクローンされているenvフ
ラグメントはＡＲＶ−２ cＤＮＡから導かれており、該
フラグメントは、nt ５８５７からnt ７２５１のヌクレ
オチドによってコードされているenvアミノ酸残基をコ
ードしている１３９５bpのcＤＮＡフラグメントから成
る(図２および図３)。さらに、リーディングフレーム内
で、メチオニンに相当する、５'末端の最初のコドンに
５個の余分な(エキストラ)コドンが、また、終止コドン
が後続している、リーディングフレーム(解読相)内の
３'末端に４個の余分のコドンが融合している。余分な
コドンは、もっぱら、クローニング工程を容易にするた
めに挿入されたものである。
【００８９】図８はpＤＰＣ３０３にクローンされてい
るヌクレオチド配列の暗号鎖、並びにそれから導かれる
アミノ酸配列を示している。図中、下線の付されていな
いＤＮＡ配列は上記のＡＲＶ−２(９Ｂ)cＤＮＡから直
接導かれた。その他の配列は全て、化学合成されたか、
またはＰＹＫベクターに由来する。
【００９０】Ｃ．２１５０(pＤＰＣ３０３)鎖の調製 ハイネン(Ｈinnen)らの記載[ＰＮＡＳ(１９７８)７５:
１９２９〜１９３３]に従って酵母細胞Ｓ．セレビシエ
２１５０−２−３(Ｍat a、ade １、leu２−０４、cir
o )を形質転換し、leu−選択プレート上で平板培養し
た。単一のコロニーをleu−選択培地に接種し、飽和す
るまで増殖させた。細胞を収穫し、下記のごとく、env
タンパク質の精製および特性化を行った。
【００９１】Ｄ．envタンパク質の精製および特性化 Ｄ．１．細胞の破壊 凍結Ｓ．セレビシエ２１５０−２−３(pＤＰＣ３０３)
を解凍し、１容量の溶菌バッファー(１μg／mlペプスタ
チン、０．０１Ｍ ＰＭＳＦ、０．００１Ｍ ＥＤＴＡ、
０．１５Ｍ ＮaＣl、０．０５Ｍトリス−ＨＣl pＨ
８．０)に懸濁し、１容量の酸で洗浄したガラスビーズ
を加える。ダイノ・ミルの３００mlガラスユニット(３
０００rpm)内で３０００rpmで１０分間処理することか
らなる非連続的な系で細胞を破壊する。ジャケットを、
−２０℃のエチレングリコール溶液中で保冷する。この
混合物を氷上に３分間放置することにより、ガラスビー
ズをデカントする。細胞抽出物を回収し、１８,０００r
pm(３９,２００xg)で３５分間遠心する。上清を捨て、
沈澱(ペレット１)を、以下に示すごとく、引き続いて処
理する。
【００９２】Ｄ．２．不溶性物質のＳＤＳ抽出 ペレット１を４容量のトリス−ＨＣlバッファー(０．０
１Ｍトリス−ＨＣl pＨ８．０、０．０１Ｍ ＮaＣl、
０．００１Ｍ ＰＭＳＦ、１μg／mlペプスタチン、０．
００１Ｍ ＥＤＴＡ、０．１％ＳＤＳ)に再懸濁し、撹拌
下、４℃で２時間抽出する。この溶液を６,３００xgで
１５分間遠心する。不溶性のフラクション(ペレット２)
を４容量(３６０ml)のＰＢＳ(１リットル当たり、０．
２g ＫＣl、０．２g ＫＨ2ＰＯ4、８．０g ＮaＣl、
２．９g Ｎa2ＨＰＯ4・１２Ｈ2Ｏ)、０．１％ＳＤＳ、
０．００１Ｍ ＥＤＴＡ、０．００１Ｍ ＰＭＳＦ、１μ
g／mlペプスタチンに再懸濁し、６,３００xgで１５分間
遠心する。得られたペレット(ペレット３)を、４容量の
ＰＢＳ、０．２％ＳＤＳ、０．００１Ｍ ＥＤＴＡ、
０．００１Ｍ ＰＭＳＦ、１μg／mlペプスタチンに懸濁
し、これをチューブ・ロッカー(試験管揺動装置)上で撹
拌しながら、４℃において１２時間抽出する。溶液を
６,３００xgで１５分間遠心する。可溶性画分を回収
し、下記のごとくにして精製する。(ペレットは、それ
を４容量の２．３％ＳＤＳ、５％β−メルカプトエタノ
ールに再懸濁し、５分間煮沸することによって抽出して
もよい。煮沸後、溶液を６,３００xgで１５分間遠心す
る。次いで、可溶性画分を回収し、以後の精製に充て
る。)
【００９３】Ｄ．３．選択沈澱およびゲル濾過 可溶性画分を、４℃において３０％硫酸アンモニウム溶
液にすることにより、濃縮する。得られたペレット(ペ
レット４)を２．３％ＳＤＳ、５％β−メルカプトエタ
ノールに再懸濁し、ＡＣＡ３４(ＬＫＢプロダクツ)のゲ
ル濾過用カラムにより、クロマトグラフする。このカラ
ムは、室温で、ＰＢＳ、０．１％ＳＤＳによって平滑化
されている。同じ溶液を用い、流速０．３ml／分でクロ
マトグラフィーを展開させる。５mlの画分を集め、プー
ルしてタンパク質ゲル電気泳動法、ウェスタン分析、お
よびＥＬＩＳＡ法で特性化する。必要ならば、プールし
たフラクションをスペクトラポア(Ｓpectrapor)＃２[Ｍ
Ｗカットオフ(cut off)１２−１４Ｋ]を用いて真空透析
(vacuum dialysis)することにより、濃縮する。
【００９４】Ｄ．４．組換えenvの特性化 ＳＤＳポリアクリルアミドゲル分析(１２％アクリルア
ミドゲル)により、env−含有ベクターで形質転換された
酵母細胞内で、新たに５５,０００ダルトンのタンパク
質が合成されていることが示された。この５５,０００
ダルトンのタンパク質は、対照プラスミド(env挿入物を
有しないベクター)で形質転換された細胞中には存在し
ていない。ＡＩＤＳ患者の血清を用いる、ＥＬＩＳＡ
(９、Ｅ．４．c．参照)およびウェスタン分析法でenvを
同定した。両分析法において、５５,０００ダルトンの
タンパク質は免疫反応性を示した。健常人から得た血清
とは反応しなかった。組換えenvは哺乳類(Ｃos)細胞内
でも発現した。
【００９５】１４．細菌内でのＡＲＶ−２のp３１ pol
タンパク質の発現 Ａ．宿主ベクター系 ポリメラーゼ遺伝子(p３１ pol)のＣ末端領域を、プラ
スミドpＴＰ３１.２で形質転換した大腸菌株Ｄ１２１０
を用いて合成した。プラスミドpＴＰ３１.２はハイブリ
ッドtacプロモーター(９．Ａ．に記載)の転写コントロ
ール下で、p３１の暗号配列を含有しているpＢＲ３２２
誘導体である。p３１は、細菌性形質転換体をＩＰＴＧ
によって誘導することにより、発現される。
【００９６】Ｂ．pＴＰ３１.２の組立て Ｂ．１．Ｍ１３テンプレート(鋳型)０１１００４８４の
組立て pol遺伝子の３'末端、orf−１、envおよびorf−２の５'
末端を含有しており、予め、１％の低融点アガロース
[シーパック(Ｓea−Ｐak)]ゲル電気泳動にかけ、６５℃
においてフェノール抽出し、１００％エタノールで沈澱
させた後、ＴＥに懸濁しておいた、ＡＲＶ−２(９Ｂ)の
ＫpnＩ消化物から、５．２kb ＤＮＡフラグメントを単
離した。この物質８μlを終容量１０μlでＳstＩによ
り、３７℃で更に１時間消化した。酵素を熱的に不活化
した後、この消化物１．２５μlを、予めＫpnＩとＳst
Ｉで切断しておいたＭ１３mp１９(２０ng)に、ＡＴＰの
存在下、終容量２０μlでライゲートした。室温で２時
間反応を続けた。この混合物５μlを用い、コンピテン
トな大腸菌ＪＭ１０１を形質転換した。澄明なプラーク
が成長し、次いで、メッシング(Ｍessing)およびビエイ
ラ(Ｖieira)の方法[ジーン(Ｇene)(１９８２)１９: ２
６９〜２７６]に従った１本鎖ＤＮＡを調製した。
【００９７】Ｂ．２．０１１００４８４のインビトロで
の突然変異誘発 部位特異的突然変異誘発により、０１１００４８４のＤ
ＮＡ配列を変化させ、ＮcoＩによって認識される制限部
位(ＣＣＡＴＧＧ)を生成させた。４２９９位(図２およ
び図３)のＡがＣで置換され、４３０５位(図２および図
３)のＴがＡに置き換えられているオリゴデオキシヌク
レオチドを、固相ホスフォラミダイト(phosphoramidit
e)の化学を利用して合成した。上記の変化はいずれも、
アミノ酸配列においてサイレントであり、第２の置換
は、ヘテロローガスな分子の安定性を減ずるために行わ
れた。このオリゴマーはＡＲＶ−２１６と命名され、配
列:５'−ＴＴＡＡＡＡＴＣＡＣＴＴＧＣＣＡＴＧＧＣＴ
ＣＴＣＣＡＡＴＴＡＣＴＧを有する。これは、Ｍ１３誘
導体であるテンプレート０１１００４８４が１本鎖であ
り、暗号鎖を含有していることから、該配列は非暗号鎖
である。５'をリン酸化したオリゴマーを、５'脱リン酸
化Ｍ１３シーケンシング(sequenceing)プライマー、５
０mＭトリス−ＨＣl(pＨ８)、２０mＭ ＫＣl、７mＭ Ｍ
gＣl2および０．１mＭ ＥＤＴＡの存在下、５５℃にお
いて、０１１００４８４ Ｍ１３テンプレートにアニー
ルした。重合反応は、５０ng／μlの二重螺旋ＤＮＡ、
１５０μＭのdＮＴＰ類、１mＭ ＡＴＰ、３３mＭトリス
−酢酸(pＨ７．８)、６６mＭ酢酸カリウム、１０mＭ酢
酸マグネシウム、５mＭ ＤＴＴ、１２．５単位のＴ４ポ
リメラーゼ、１００μg／mlのＴ４遺伝子３２タンパク
質および５単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼを含む混合物１
００μl中で行った。３０℃で３０分間インキュベート
して反応させ、ＥＤＴＡとＳＤＳ(終濃度を、それぞれ
１０mＭおよび０．２％とする)を加えて反応を止めた。
重合産物の１:１０希釈液１,２および４μlを用いてコ
ンピテントＪＭ１０１大腸菌細胞を形質転換し、ＹＴプ
レート上で平板培養した。プラークをニトロセルロース
フィルターに吸着させて拾い上げ、０．２Ｍ ＮaＯＨ、
１．５Ｍ ＮaＣl中で変性させ、次いで、０．５Ｍ トリ
ス−ＨＣl(pＨ７．３)、３Ｍ ＮaＣlで中和し、６×Ｓ
ＳＣ中に平衡させた。フィルター上のブロットを乾か
し、８０℃で２時間乾燥させ、３７℃で、０．２％ＳＤ
Ｓ、１０×デンハーツ(Ｄenhardt's)、６×ＳＳＣ中に
おいてプレアニールした。１時間後、フィルターに標識
したＡＲＶ−２１６(７．５×１０6ＣＰＭ)を加え、３
７℃で２時間インキュベートした。フィルターを、４２
℃で２０分間、６×ＳＳＣ中で洗浄し、ブロットを乾燥
し、これを−７０℃で１時間、増感スクリーンを用いて
フィルムに感光させた。強くハイブリダイズしたプラー
クが増殖し、それから１本鎖ＤＮＡを調製し、配列決定
におけるテンプレートとして用いた。配列決定の結果、
テンプレート０１０２１７８５が上記の第２の置換と、
ＮcoＩ部位とを含有していることが分かった。
【００９８】第２のオリゴマーは、pol遺伝子の終止コ
ドンの直後(図２および図３における５１０１位)にＳal
ＩおよびＥcoＲＩのための部位を挿入するために合成さ
れた。このオリゴマーはＡＲＶ−２４８と命名され、配
列:５'−GGTGTTTTACTAAAGAATTCCGTCGACTAATCCTCATCCで
示される。テンプレート０１０２０７８５を用い、６５
℃でハイブリダイゼーションを行った後、フィルターを
洗浄することを除き、上記の方法と同様にして部位特異
的突然変異誘発を行った。上記のごとく、８個の強くハ
イブリダイズしたプラークが増殖し、これから、１本鎖
ＤＮＡの配列を決定した。テンプレート０１０３１９８
５の配列は、ＳalＩ、およびＥcoＲＩ部位を、意図通り
に含有していることが示された。
【００９９】Ｂ．３．p３１を含有しているＮcoＩ−Ｅc
oＲＩ ＤＮＡフラグメントおよびＮcoＩ−ＳalＩ ＤＮ
Ａフラグメントの単離 ６個の透明なプラークを１．５mlづつの２×ＹＴ中で、
３７℃において５時間増殖させることにより、０１０３
１９８５テンプレートの複製型(ＲＦ)を調製した。マニ
アティス(Ｍaniatis)らの記述したごとくにして[モレキ
ュラー・クローニング、ア・ラボラトリィ・マニュアル
(Ｍolecular Ｃloning、a ＬaboratoryＭanual)、コー
ルドスプリングハーバー(Ｃold Ｓpring Ｈarbor)１
９８２]２本鎖ＤＮＡを得、プールして終容量１００μl
になるよう懸濁した。終容量２０μlにしてＲＦ１０μl
をＮcoＩおよびＥcoＲＩで消化した。得られたフラグメ
ントを用いて細菌内でp３１を直接発現させた。さらに
ＲＦ２０μlを、４０μl中で、ＮcoＩおよびＳalＩで消
化した。このフラグメントを酵母内でp３１を発現させ
るために用いた。これらの試料を１％の低融点アガロー
ス(シーパック)ゲル上で泳動させ、臭化エチジウムを用
い、蛍光により観察した。８００bpのバンドを切り取
り、上記のごとくにしてＤＮＡ(類)をゲルから抽出し、
ＴＥ１０μlに再懸濁した。これらのフラグメントをそ
れぞれＡＲＶ２４８ ＮＲ＃２およびＡＲＶ２４８ＮＬ
と命名した。
【０１００】Ｂ．４．p３１のplot７へのクローニング ベクターplot７[ホールウェル(Ｈall well)ら、ヌクレ
イック・アシッズ・リチーサ(１９８５)１３、Ｎo．
６、pp．２０１７〜２０３４]３μgを終容量４０μlと
し、ＮcoＩおよびＥcoＲＩで切断し、３時間後にこれら
の酵素を熱的に不活化した。この消化物２μlを２μlの
ＡＲＶ２４８ ＮＲ＃２と混合し、ＡＴＰとＴ４ ＤＮＡ
リガーゼの存在下、２０μl中で、１４℃において一夜
ライゲートし、得られた混合物１０μlを用いてコンピ
テントＤ１２１０細胞を形質転換した。２mＭ ＩＰＴＧ
および１００μg／mlのアンピシリンに耐性を有するコ
ロニーを選択し、その各々からスーパーコイルＤＮＡを
抽出した。次いで、これらのＤＮＡをＮcoＩおよびＥco
ＲＩで制限消化し、アガロース電気泳動にかけて分析し
た。約８００bpの挿入物を有するクローンを選択し、以
後の使用に供した。これらをpＲＳＰ２４８のＮo．３お
よびＮo．４と命名した。
【０１０１】Ｂ．５．pＴＰ３１の組立て ０１１００４８５に導入されたＮcoＩ部位はp３１の推
定の開始部位から５２bp下流である。p３１の最初の１
８アミノ酸をコードしている３つのオリゴマーを上記の
ごとくに合成し、この分子の３'末端にＮcoＩ粘着末端
を生成させた。この分子の５'末端は、開始コドンを越
えて伸長しており、リボゾーム結合部位を含有してい
る。合成されたオリゴマーは、配列:
【化５】 で示される。
【０１０２】脱リン酸化ＡＲＶ−２１１、リン酸化ＡＲ
Ｖ−２２２およびＡＲＶ−２２３の各１５０ピコモル
を、予めＮcoＩで切断しておいた２０μgのpＲＳＰ２４
８に、終容量６２μlで、１４℃において１８時間ライ
ゲートした。フェノール抽出、エタノール沈澱の後、Ｄ
ＮＡを水４０μlに再懸濁し、０．５mＭのdＮＴＰ類の
存在下、室温で１時間、クレノー(Ｋlenow)フラグメン
トと一緒にインキュベートした。試料をフェノール抽出
し、エタノール沈澱に付した後、水４０μlに再懸濁
し、ＥcoＲＩで消化した。次いで、このＤＮＡを低融点
のアガロースゲルで泳動させ、上記のごとくにして約８
２０bpのフラグメントを抽出し、水に懸濁し、終容量を
２０μlとした。末端をリン酸化した後、該試料５μl
を、ＰvuＩＩおよびＥcoＲＩで消化し、末端を脱リン酸
化しておいたplot７(１５０ng)と一緒に、Ｔ４ ＤＮＡ
リガーゼおよびＡＴＰの存在下、終容量３１μlとし
て、１４℃において１８時間、インキュベートした。こ
のライゲーション産物５μlを用いてＲＲldeltaＭ１５
を形質転換した。１００μg／mlのアンピシリンに耐性
を示すクローンを選択し、そこから、スーパーコイルＤ
ＮＡを抽出した。ＤＮＡ(類)をＮcoＩおよびＥcoＲＩで
消化し、１％アガロースゲルによって分離した。適当な
大きさの挿入体を含有しているコロニーを得、pＴＰ３
１と命名した。この挿入体部分に含まれているp３１配
列を図９および図１０に示す。下線を付した配列は化学
合成された部分である。他はＤＮＡから得られた配列で
ある。
【０１０３】Ｃ．ＡＩＤＳ血清と反応する特異的なタン
パク質を含有する形質転換体のスクリーニング ベクターのみ、あるいはp３１ＤＮＡを有するベクター
(pＴＰ３１.２)を含有している細菌性形質転換体を０．
０２％アンピシリン含有Ｌ−ブロス中でＯ．Ｄ．６５０
が０．５になるまで増殖させた。ＩＰＴＧを終濃度が２
mＭになるように加えて培養物を誘導し、さらに３時間
増殖させた。培養物１ml中の細菌をペレット化し、ゲル
標本バッファー２００μl中に再懸濁した。凍結−解凍
サイクルを３回行うことにより細胞を破壊し、煮沸して
得た抽出物を１２．５％のポリアクリルアミド−ＳＤＳ
ミニゲルに適用した。タンパク質を電気泳動させ、ニト
ロセルロース上に電気的に移し、ブロットした。このニ
トロセルロースフィルターをＥＷ５１１１血清(ウィル
ス性p３１と強く反応するＣＤＣから得られた正の基準
血清、１:１００に希釈)、西洋ワサビのペルオキシダー
ゼとコンジュゲートしたヤギの抗−ヒトＩgＧ並びにＨ
ＲＰ基質と反応させた。p３１ＤＮＡによる形質転換体
から得た抽出物のゲル中には、〜３０,０００dにおいて
優勢な１つのバンド、並びにさらに低分子量の種の存在
を示すいくつかのバンドが見られたが、ベクターのみで
形質転換された細菌形質転換体から得た抽出物にはその
ようなバンドが見られなかった。
【０１０４】Ｄ．pol遺伝子のＣ末端領域からのポリペ
プチドがウィルス性p３１タンパク質とアナローガス(構
造類似性)であることの証明 pＴＰ３１.２またはベクター単独で形質転換された細菌
からリゾチーム−ＮＰ４０を調製した。５mlの培養物を
増殖させ、細胞をペレット化し、１mlの５０mＭトリス
ーＨＣl(pＨ８)、０．５mＭ ＥＤＴＡ、１mg／mlリゾチ
ームに再懸濁し、０℃で１５分間インキュベートし、Ｎ
aＣl、ＭgＣl2およびＮＰ４０をそれぞれ、終濃度が
０．４mＭ、５mＭおよび０．５％となるように加えて混
合し、ＤＮＡseＩ(１００μg／ml)と一緒に０℃で３０
分間インキュベートした。ＥＷ５１１１血清(希釈率１:
１００)と、pＴＰ３１.２で形質転換した細菌から得た
細胞抽出物の１:１０希釈液とをプレインキュベートし
てからウィルス性ブロットと反応させると、ウィルス性
p３１のバンドは完全に消失したが、他のウィルス性タ
ンパク質との反応性は残存していた。これに対して、ベ
クターのみで形質転換された細菌から得た抽出物は、p
３１反応性抗体を吸収し、除去する作用を有していなか
った。このように、ウィルス性p３１タンパク質は、Ａ
ＲＶ−２のpol遺伝子のＣ末端領域、またはエンドヌク
レアーゼ領域からの産物であることが分かった。
【０１０５】１５．酵母内でのp３１pdタンパク質の発
現 Ａ．酵母ベクターp３１／ＧＡＰ−ＡＤＨ２の組立て: p
３１のpＡＢ２４へのクローニング ＡＲＶ２４８ＮＬフラグメントを、予めＮcoＩおよびＳ
alＩで切断しておいたpＢＳ１００にクローンした。pＢ
Ｓ１００はpＡＢ１２から導かれ、ＧＡＰ−ＡＤＨ２プ
ロモーター、ＮcoＩ−ＳalＩフラグメントであるＡＲＶ
−env遺伝子、およびＧＡＰターミネーターからなるＢa
mＨＩカセットを有する。pＢＳ１００／p３１／ＧＡＰ
−ＡＤＨ２の２個の陽性クローンから得られたＢamＨＩ
カセットを、uraおよびleuの両者に関する選択能力を有
する酵母ベクターである、pＡＢ２４にクローンした。
ベクター内でのカセットの方向性を、両方向についてス
クリーンし、それらを用いて酵母のＡＢ１１０株(Ｍat
a ura３−５２ leu２−０４または、leu２−３とleu
２−１１２の両者、pep４−３、his４−５８０、Ｃir
o)を形質転換した。これらの細胞を、ura−およびleu
−両プレート上で平板培養した。また、ura−細胞をleu
−プレート上で平板培養した。
【０１０６】Ｂ．p３１の発現の誘導 ３種類の異なる誘導法を行った。１．ura−プレート上
に貼り付いたura−コロニーを、ＹＥＰ／１％グルコー
ス中で１時間誘導した。これらの試料に関して、ウェス
タン分析と、ポリアクリルアミドゲル法を適用した。結
果はいずれも陰性であった。２．leu−プレートに貼り
付いたura−プレートから得たコロニーをleu−／３％エ
タノールまたはＹＥＰ／１％グルコース中で２４時間誘
導した。これらの試料に関してウェスタン分析法とポリ
アクリルアミドゲル法を適用したところ、結果はこれも
また陰性であった。３．leu−プレート上に貼り付いて
いるleu−プレートからのコロニーを、leu−／３％エタ
ノールまたはＹＥＰ／１％グルコース中で２４時間誘導
した。ポリアクリルアミドゲル法の結果は陰性であっ
た。これらの試料に関しては、ウェスタン分析法を適用
しなかった。
【０１０７】１６．酵母内における超過酸化物不均化酵
素(スーパーオキシドジスムターゼ)(ＳＯＤ)−p３１融
合タンパク質の発現 Ａ．pＣ１／１−pＳＰ３１−ＧＡＰ−ＡＤＨ２誘導体の
組立て ＳＯＤ−p３１融合タンパク質を酵母内で発現させるた
めの遺伝子を組立てる目的で、プラスミド(pＳ１４／３
９−２)を用いた。このプラスミドは、ＡＤＨ−２／Ｇ
ＡＰプロモーターの制御下にある、プロインシュリン遺
伝子と融合したＳＯＤ遺伝子を含有している。このプロ
インシュリン遺伝子は、ＥcoＲＩ制限部位とＳalＩ制限
部位との間に位置する。このプロインシュリン遺伝子を
ＡＲＶ２４８ＮＬフラグメントで置き換えるために、そ
れぞれＡＲＶ−３００およびＡＲＶ−３０１と称する２
個のオリゴマーを、ホスホラミダイトの化学を利用して
合成した。これらの２個のオリゴマーをアニールする
と、分子の両側にＥcoＲＩおよびＮcoＩ粘着末端を有す
る配列が得られる。ＡＲＶ−３００およびＡＲＶ−３０
１は、配列:
【化６】 で示される。
【０１０８】ＥcoＲＩで線状化されたpＳＩ４／３９−
２(２μg)を１００ピコモルづつの、リン酸化ＡＲＶ−
３００および脱リン酸化ＡＲＶ−３０１と、ＡＴＰおよ
びＴ４ＤＮＡリガーゼの存在下、終容量３５μlでライ
ゲートした。反応は、１４℃で１８時間行った。ＤＮＡ
をＳalＩでさらに消化し、得られたフラグメントを１％
の低融点アガロースゲル上で分離(割)し、ＳＯＤ遺伝子
(〜６．５kb)を伴ったベクターを含有するフラグメント
を前記のごとくにして精製し、ＴＥ５０μlに再懸濁し
た。この標品５μlをＡＲＶ２４８ ＮＬ５μlと、終容
量２０μlで、１４℃において１８時間ライゲートした
後、その５μlを用いてコンピテントＨＢ１０１細胞を
形質転換した。得られたプラスミドをpＳＰ３１と命名
した。このプラスミド２０μgをＢamＨＩで消化し、ゲ
ル電気泳動によって約２９００bpのフラグメントを単離
し、ＴＥに再懸濁した後、予めＢamＨＩで切断しておい
たpＣ１／１にライゲートした。このＤＮＡを用いてＨ
Ｂ１０１を形質転換し、ＢamＨＩカセットを有する形質
転換体を得た。酵母株、２１５０、ＰＯ１７、およびＡ
Ｂ１１０をこのpＣ１／１−pＳＰ３１−ＧＡＰ−ＡＤＨ
２誘導体を用い、短い方向性と長い方向性の両者によ
り、形質転換した。２１５０株は、形質転換体を与えな
かった。その他の形質転換体は全てleu−プレート上に
貼り付けられた。
【０１０９】Ｂ．pＣ１／１−pＳＰ３１−ＧＡＰ−ＡＤ
Ｈ２の誘導 ３種類の異なる誘導法を行った。１．−ＰＯ１７コロニ
ーを、ＹＥＰ／１％グルコース培養物またはleu−／３
％エタノール培養物のいずれか１０ml中で２４時間誘導
した。酵母ペレットをポリアクリルアミドゲル法および
ウェスタン法の両方法で分析したところ、クーマシー染
色ゲルによる結果は陰性であったが、ウェスタン法の場
合は、両誘導法によって、正しい分子量のバンドが示さ
れた。２．−ＰＯ１７コロニーをＹＥＰ／１％エタノー
ル培養物３０ml中で４８時間誘導した。このインキュベ
ーション期間中、様々な時間に、一部を採ってＰＡＧＥ
により分析した。クーマシー染色ゲルによると、ＹＥＰ
／１％エタノール中に入れてから１４時間後に正しい分
子量域(４７−５０kb)にバンドが現れ始め、誘導開始か
ら２４時間後に強度は最大になった。ウェスタン法の結
果は、このクーマシー染色ゲルによる結果と良く相関し
ており、２４および４８時間目に強いバンドが現れた。
３．−ＡＢ１１０コロニーを、leu−／３％エタノール
またはＹＥＰ／１％グルコース中で２４時間誘導した。
ＰＡＧＥおよびウェスタン法の両方法を適用したとこ
ろ、これら両誘導法において、ＰＡＧＥの結果は陰性で
あったが、ウェスタン法の結果は陽性であった。
【０１１０】１７．細菌または酵母からのＳＯＤ−p３
１の精製および特性化 凍結細菌(酵母)細胞を室温で解凍し、１．５容量の溶菌
バッファー[２０mＭトリス−ＨＣl pＨ８．０、２mＭ
ＥＤＴＡ、１mＭ ＰＭＳＦ(細菌用); ５０mＭトリス−
ＨＣl pＨ８．０、２mＭ ＥＤＴＡ、１mＭ ＰＭＳＦ(酵
母用)]に懸濁し、１容量の酸で洗浄したガラスビーズを
混合した。
【０１１１】−２０℃の冷却装置と連結されているダイ
ノミル・ユニットのガラス室(３,０００rpm)を用いて１
５分間処理することにより、非連続的な方法で細胞を破
壊した。氷上に２〜３分置いてガラスビーズをデカント
し、細胞リゼイト(溶菌液)を除いた。デカントしたガラ
スビーズを溶菌バッファー３０mlによって４℃で２回洗
浄した。細胞溶菌液を３９,０００xgで３０分間遠心し
た。
【０１１２】上記の遠心により得たペレットを溶菌バッ
ファーで１回洗浄し、ボルテックスした後、４℃で懸濁
した(遠心処理は上記と同じ)。洗浄したペレットを０．
２％ＳＤＳ(細菌用)および０．１％ＳＤＳ(酵母用)によ
り、溶菌バッファー中で処理し、４℃で１０分間、揺動
させて撹拌した。溶菌液を３９,０００xgで３０分間遠
心した。試料バッファー(６７．５mＭトリス−ＨＣl、p
Ｈ７．０、５％β−メルカプトエタノール、２．３％Ｓ
ＤＳ)中で煮沸し、３９,０００xgで１０分間遠心した。
上清を回収し、さらに６０分間、１００,０００xgで遠
心した(６０Ｔiローター)。酵母の場合には、この工程
を行う代わりに０．４５μmの濾過を行った。上記の遠
心で得た上清をゲル濾過カラム(２．５×９０cm、ＡＣ
Ａ３４ＬＫＢ)にかけ(最大タンパク質量５０mg)、流速
０．３〜０．４ml／分の速度で、リン酸緩衝食塩水(Ｐ
ＢＳ)、０．１％ＳＤＳにより平衡化した。ＳＯＤ−p３
１を含む画分をプールし、真空透析またはＹＭ５アミコ
ン膜を４０psiで用いて透析することにより、濃縮し
た。タンパク質を濃縮液として、−２０℃で保存した。
【０１１３】ゲル電気泳動の結果、ＳＯＤ−p３１タン
パク質は分子量約４６kbとして誘導し、純度は９０％以
上であることが分かった。
【０１１４】１８．組換えＡＲＶ−２ポリペプチドを用
いた、hＴＬＲに対する抗体のためのＥＬＩＳＡ 純化p２５gagタンパク質[２０mＭリン酸ナトリウム
(０．１％ＳＤＳ)、pＨ７．２中、１．２５mg／ml]、純
化envタンパク質[２０mＭリン酸ナトリウム(０．１％Ｓ
ＤＳ)pＨ７．２中、２mg／ml]、および純化ＳＯＤ−p３
１融合タンパク質[２０mＭリン酸ナトリウム(０．１％
ＳＤＳ)pＨ７．２中、２mg／ml]の、各ストック溶液を
調製した。
【０１１５】微量力価検定プレート[ダイナテクイムロ
ン(Ｄynatech Ｉmmulon)Ｉ]を被覆するために、p２５g
ag、envおよびＳＯＤ−p３１のストック溶液を１部づつ
取り、９９７部のホウ酸被覆バッファー(０．０５Ｍホ
ウ酸塩pＨ９．０)に加えた。各ウェルにこの被覆溶液１
００μlを入れ、プレートに覆いをして３７℃で２時
間、または４℃で１２時間インキュベートした。次い
で、被覆溶液をウェルから吸い上げ、プレートを洗浄液
(０．１３７Ｍの０．８％ＮaＣl、０．０５％のトリト
ンＸ−１００)で６回洗った。
【０１１６】希釈溶液(０．１％カゼイン、１mＭ ＥＤ
ＴＡ、１％トリトンＸ−１００、０．５Ｍ ＮaＣl、
０．０１％チメローサル(Ｔhimerosal)、pＨ７．５)中
で１:１００に希釈し、この希釈液に、酵母タンパク質
(ＡＢ１０３.１株)の抽出物(１％トリトンＸ−１００、
２mＭ ＰＭＳＦ、０．０１％チメローサルを含んだＰＢ
Ｓ中で１:４０に希釈、タンパク質約２mg／ml)および大
腸菌タンパク質抽出物(１％トリトンＸ−１００、２mＭ
ＰＭＳＦ、０．０１％チメローサル中で１:４０に希
釈、タンパク質約１mg／ml)を加えた。抽出方法は、非
組換え株を用いる外は前記の１３および１４の記載と同
様である。各ウェルに希釈した血清１００μlを加え、
３７℃で３０分間インキュベートした。次いで、プレー
トを洗浄液で６回洗った。このプレートに、酵母および
大腸菌抽出物を加えてない希釈溶液によって１:８００
０に希釈された西洋ワサビのペルオキシダーゼ(カペル)
で標識したヤギの抗−ヒトＩgを１００μl／ウェルの割
合で加え、３７℃で３０分間インキュベートした。次い
で、洗浄液でプレートを６回洗った。次いで、プレート
に、基質溶液[クエン酸バッファー１０ml、(クエン酸１
０．５g／l(dＨ2Ｏ)に６Ｍ ＮaＯＨを加えてpＨを４．
０に調節)、０．１mlのＡＢＴＳ(２,２'−アジノ−ジ−
(３−エチルベンズチアゾレン・スルホン酸)１５mg／ml
dＨ2Ｏ溶液)、および３．３３μlのＨ2Ｏ2]を１００μ
l／ウェルの割合で加え、プレートをホイルで包み、３
７℃で３０分間インキュベートした。次いで、１０％Ｓ
ＤＳを５０μl／ウェルの割合で加えて反応を止めた。
読み取りは、二重波長読取り用のダイナテクＥＬＩＳＡ
読取り装置(Ｄynatech ＥＬＩＳＡ rea−dingset)を
使用して行った: 吸収波長は１(４１０nm)であり、基準
波長は４である。
【０１１７】結果 次の血清を試験した: Ａ．カンサスシティ血液銀行から得た８９の連続的な血
液供給者(“正常な血液供給者")からの血清: log Ｎo．
１００１〜１０８１、１０８５〜１０９２。
【０１１８】Ｂ．リンパ腺症候群(ＬＡＤ)またはＡＩＤ
Ｓ患者、あるいはＬＡＤまたはＡＩＤＳの性的パートナ
ー(“接触者"と称する)から得た血清…これらは全てＵ
ＣＳＦ ＡＩＤＳ血清銀行パネル(Ｓerum Ｂank Ｐan
el)から得た: log Ｎo．４６０１〜４６５２。
【０１１９】陽性／陰性の判断の境界として、５×(バ
ックグラウンドシグナルの平均値−希釈液のみによるシ
グナル)を採用し、その値を０．１９５と決定した。即
ち、０．１９５以下のシグナルを示す血清は(−)と評価
され; それ以上のものは(＋)と評価される。各試料はま
た、市販品から購入可能なＡＢＢＯＴＴＨＴＬＶ ＩＩ
Ｉ ＥＩＡキット[アボット・ラボラトリィズ(Ａbborr
Ｌabs)]およびウェスタン分析法により評価した。
【０１２０】正常な血清供給者試料に関する、本発明の
ＥＬＩＳＡ試験では、１例を除き全て陰性であることが
示された。この正常な血清はＡＢＢＯＴＴＨＴＬＶ Ｉ
ＩＩＥＩＡ試験でも陰性の値を示したが、ウェスタン分
析法では、実際上、陽性であることが確認された。
【０１２１】ＬＡＤおよびＡＩＤＳ患者、並びに接触者
達から得た５２の血清に関する試験の結果を次の表に示
す。
【０１２２】
【表４】 番号 診断 ＡＢＢＯＴＴ 本発明の ウェスタン法 ＥＩＡ ＥＬＩＳＡ ４６０１ 接触者 ＋ １.８９ ＋ ＋ ０２ 接触者 − ０.０４ − − ０３ 接触者 ＋ １.４４ ＋ ＋ ０４ 接触者 ＋ １.９２ ＋ ＋ ０５ 接触者 − ０.０４ − − ０６ 接触者 ＋ ＞２ ＋ ＋ ０７ 接触者 ＋ １.３７ ＋ ＋ ０８ 接触者 ＋ １.６０ ＋ ＋ ０９ 接触者 ＋ ＞２ ＋ ＋ １０ 接触者 ＋ ＞２ ＋ ＋ １１ 接触者 ＋ １.９４ ＋ ＋ １２ 接触者 ＋ ＞２ ＋ ＋ １３ 接触者 ＋ ＞２ ＋ ＋ １４ 接触者 ＋ ＞２ ＋ ＋ １５ 接触者 ＋ １.９７ ＋ ＋ １６ ＡＩＤＳ ＋ ０.６１ ＋ ＋ １７ ＡＩＤＳ ＋ ＞２ ＋ ＋ １８ ＡＩＤＳ ＋ ＞２ ＋ ＋ １９ ＡＩＤＳ ＋ １.５８ ＋ ＋ ２０ ＡＩＤＳ ＋ １.５８ ＋ ＋ ２１ ＡＩＤＳ ＋ ０.７６ ＋ ＋ ２２ ＡＩＤＳ ＋ １.７４ ＋ ＋ ２３ ＬＡＤ ＋ １.２６ ＋ ＋ ２４ ＬＡＤ ＋ ＞２ ＋ ＋ ２５ ＡＩＤＳ ＋ １.０４ ＋ ＋ ２６ ＡＩＤＳ ＋ １.２４ ＋ ＋ ２７ ＡＩＤＳ ＋ １.４０ ＋ ＋ ２８ ＡＩＤＳ − ０.０７ − − ２９ ＬＡＤ ＋ １.９３ ＋ ＋ ３０ 接触者 ＋ １.９６ ＋ ＋ ３１ ＡＩＤＳ ＋ １.７６ ＋ ＋ ３２ ＡＩＤＳ ＋ ０.９０ ＋ ＋ ３３ ＡＩＤＳ ＋ １.６９ ＋ ＋ ３４ ＬＡＤ ＋ １.０９ ＋ ＋ ３５ ＡＩＤＳ ＋ １.５４ ＋ ＋ ３６ ＡＩＤＳ ＋ １.２２ ＋ ＋ ３７ ＡＩＤＳ ＋ １.９６ ＋ ＋ ３８ ＡＩＤＳ − ＞２ ＋ ＋ ３９ ＬＡＤ ＋ １.８５ ＋ ＋ ４０ ＬＡＤ ＋ ＞２ ＋ ＋ ４１ ＬＡＤ ＋ ０.８４ ＋ ＋ ４２ ＬＡＤ ＋ １.５９ ＋ ＋ ４３ ＬＡＤ ＋ １.７１ ＋ ＋ ４４ ＡＩＤＳ ＋ １.４０ ＋ ＋ ４５ ＬＡＤ ＋ ＞２ ＋ ＋ ４６ ＡＩＤＳ ＋ １.３８ ＋ ＋ ４７ ＡＩＤＳ ＋ １.２９ ＋ ＋ ４８ ＬＡＤ ＋ １.９３ ＋ ＋ ４９ ＬＡＤ ＋／− ０.４８ ＋ ＋ ５０ ＬＡＤ − ０.０４ − − ５１ ＬＡＤ − ０.０７ − − ５２ ＬＡＤ ＋ １.９２ ＋ ＋
【０１２３】上記の結果は、組換えＡＲＶタンパク質を
用いる本発明のＥＬＩＳＡが少なくともＡＢＢＯＴＴＨ
ＴＬＶ ＩＩＩ ＥＩＡ試験またはウェスタン分析法と
同様に優れた方法であることを示している。
【０１２４】この実施例で報告した本発明のＥＬＩＳＡ
法では、酵母または細菌または細菌に対する血清抗体が
組換えＡＲＶ−２タンパク質と結合するのを阻止するた
めに、血清に、酵母および細菌抽出物を加えてこれら血
清抗体と結合させる。組換えポリペプチドは酵母内で発
現されるポリペプチド、および細菌内で発現されるポリ
ペプチドを含有しているので、酵母および細菌の抽出物
両者が必要である。もしも、あらゆるポリペプチドが同
じ型の生物内で発現されるならば、１個の抽出物しか必
要としないであろう。例えば、酵母内で発現されたp２
５gagを実施例の、細菌によって生産されたp２５gagポ
リペプチドと置き換えることができれば、血清試料中に
は酵母抽出物だけを加えればよい。
【０１２５】１９．組換えＡＲＶ−２ポリペプチド類を
用いた、hＴＬＲに対する抗体のためのドット・ブロッ
ト・アッセイ ニトロセルラー・ストリップ(０．５×０．５cm)に、Ｐ
ＢＳ中に含有させたポリペプチド５０ngをスポットした
(スポットの容量、２μl)。スポットした後、ストリッ
プを室温で１時間またはそれ以上乾燥させた。次いで、
このストリップをカーネーション(Ｃarnation)脱脂(non
−fat)ドライミルクのＰＢＳ中５％溶液、０．０１％チ
メローサル中で、室温において１５〜６０分間、後被覆
処理(ポスト・コーティング)に付した。各被検溶液試料
を試験管内でポスト−コーティング溶液０．５ml中で
１:５０に希釈した。次いで、ポスト−コートしたスト
リップを試験管内に入れ、試料中で揺動しながら３７℃
で１時間インキュベートした。次いで、このストリップ
をポスト−コーティング溶液で１:５００に希釈した西
洋ワサビのペルオキシダーゼで標識したヤギ抗−ヒトＩ
g試薬中、室温で１５分間インキュベートした。標識し
た抗体中でインキュベートした後、ストリップをＰＢ
Ｓ、１％トリトン(Ｔriton)、および蒸留水で順次洗浄
した。これらのストリップを基質溶液中で、室温におい
て１５分間インキュベートすることにより、展開させた
(上記２３参照)。
【０１２６】試料が陽性であれば、スポットの位置に連
続的な色の変化が生じ、それを観察することができる。
正常な(陰性)試料の場合には、色の変化がないか、ある
いは陽性シグナルと識別し得る、かすかなシグナルを呈
する。かすかなシグナルを与える血清に関しては、競合
的な分析を行い、それらが陰性であることを明確にする
こともできる。競合法の場合には、ストリップを試料中
でインキュベートする前に、ポリペプチド(１０〜２５
μg／ml)を被検試料に加え、３７℃で１時間〜インキュ
ベートする。真に陽性の血清の場合には、シグナルは添
加したポリペプチドによって完全にブロックされるが、
正常な(陰性の)血清の場合には、シグナルに変化が生じ
ない。
【０１２７】上記のＡＲＶ−２p２５gagポリペプチドお
よびＡＲＶ−２envポリペプチド、並びにＡＲＶ−２ p
３１をＳＯＤとの融合タンパク質を発現する生物の標本
はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(Ａm
erican Ｔype ＣultureＣollection、ＡＴＣＣ)、１
２３０１、パークローンドライブ、ロックビル、メアリ
ーランド(Ｐarklawn Ｄrive、Ｒockville、Ｍaryland)
にブタペスト条約に則し、寄託された。これらの寄託番
号および日付は下記の通りである。
【０１２８】 発現産物 ＡＴＣＣ寄託番号 寄託日 ＡＲＶ−２ p２５gag ５３２４６ １９８５年８月２７日 ＡＲＶ−２ env ２０７６９ １９８５年８月２７日 ＡＲＶ−２ p３１／ＳＯＤ ２０７６８ １９８５年８月２７日
【図面の簡単な説明】
【図１】 プロウィルスＤＮＡ(ＡＲＶ−２)の制限酵素
切断地図の模式図である。
【図２】 ＡＲＶ−２のヌクレオチド配列を示す模式図
である。
【図３】 ＡＲＶ−２のヌクレオチド配列を示す模式図
である。
【図４】 プラスミドpＧＡＧ２５−１０の製造工程系
統図である。
【図５】 プラスミドpＧＡＧ２５−１０にクローンし
た p２５gag 遺伝子のヌクレオチド配列と、この遺伝子
によって暗号化されているアミノ酸を示す模式図であ
る。
【図６】 融合タンパク質 p４１gag を生産するための
pＧＡＧ４１−１０にクローンしたヌクレオチド配列の
暗号鎖と、それに対応するアミノ酸を示す模式図であ
る。
【図７】 ＡＲＶ−２ p１６gag タンパク質を暗号化し
ているヌクレオチド配列を示す模式図である。
【図８】 ＡＲＶ−２ env タンパク質を暗号化してい
るヌクレオチド配列を示す模式図である。
【図９】 ＡＲＶ−２ p３１タンパク質を暗号化してお
り、プラスミドpＴＰ３１に含まれているヌクレオチド
配列を示す模式図である。
【図１０】 ＡＲＶ−２ p３１タンパク質を暗号化して
おり、プラスミドpＴＰ３１に含まれているヌクレオチ
ド配列を示す模式図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｈ 33/577 Ｂ // Ａ６１Ｋ 39/21 Ｃ０７Ｈ 21/04 Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:865） (72)発明者 ディノ・ディナ アメリカ合衆国カリフォルニア94108、サ ン・フランシスコ、ワシントン・ストリー ト1254番 (72)発明者 キャサリン・ステイマー アメリカ合衆国カリフォルニア94530、エ ル・セライト、ラモナ118番 (72)発明者 レイ・サンチェス・ペスカドール アメリカ合衆国カリフォルニア94605、オ ークランド、クレスト・アベニュー7729番 (72)発明者 カルロス・ジョージ−ナシメント アメリカ合衆国カリフォルニア94526、ダ ンビレ、サウス・フォレスト・ヒル1907番 (72)発明者 デボラ・パーケス アメリカ合衆国カリフォルニア94610、オ ークランド、ナンバー104、ユークリッ ド・アベニュー302番 (72)発明者 ロブ・ホールウェル アメリカ合衆国カリフォルニア94109、サ ン・フランシスコ、プライエスト・ストリ ート27番 (72)発明者 フィリップ・ジェイ・バー アメリカ合衆国カリフォルニア94563、オ リンダ、ナンバー14、ブルックウッド73番 (72)発明者 マーサ・トゥルート アメリカ合衆国カリフォルニア94611、オ ークランド、ブロードウェイ・テラス9082 番

Claims (23)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 抗原性ＨＩＶ−Ｉアミノ酸配列を含んで
    いる組換えポリペプチドの製造方法であって、(a)細胞
    中での組換えポリペプチドの転写および翻訳を制御する
    調節配列、および解読枠内の、少なくとも約２１bpのＤ
    ＮＡ配列を含んでいる、該調節配列によって制御され
    る、該組換えポリペプチドをコードしている暗号配列を
    含んでいる組換えＤＮＡベクターであって、該ＤＮＡ配
    列がＡＲＶ−２(７Ｄ)(ＡＴＣＣ Ｎo．４０１４３)ま
    たはＡＲＶ−２(８Ａ)(ＡＴＣＣＮo.４０１４４)中の抗
    原性ＨＩＶ−Ｉアミノ酸配列をコードしており、この配
    列はＨＴＬＶ−IおよびＨＴＬＶ−ＩＩと免疫学的に交
    差反応しないがＨＩＶ−Ｉとは反応するものであり、該
    抗原性ＨＩＶ−Ｉアミノ酸配列は、以下の配列１に示す
    アミノ酸配列に含まれるものであることを特徴とする組
    換えＤＮＡベクターを含んでいる細胞群を用意し、(b)
    該組換えポリペプチドが発現される条件下で該細胞群を
    培養することからなる方法： 【化１】 【化２】 【化３】 【化４】
  2. 【請求項２】 細胞が真核細胞である請求項１に記載の
    方法。
  3. 【請求項３】 細胞が酵母または細菌である請求項１に
    記載の方法。
  4. 【請求項４】 ＤＮＡ配列がＨＩＶ−Ｉのｅｎｖポリペ
    プチドからのアミノ酸配列をコードしている請求項１〜
    ３のいずれかに記載の方法。
  5. 【請求項５】 ＤＮＡ配列が完全なenvポリペプチドを
    コードしている請求項４に記載の方法。
  6. 【請求項６】 ＤＮＡ配列がＨＩＶ−Ｉのgagポリペプ
    チドからのアミノ酸配列をコードしている請求項１〜３
    のいずれかに記載の方法。
  7. 【請求項７】 ＤＮＡ配列が完全なgagポリペプチドを
    コードしている請求項６に記載の方法。
  8. 【請求項８】 ＤＮＡ配列がＨＩＶ−Ｉのpolポリペプ
    チドからのアミノ酸配列をコードしている請求項１〜３
    のいずれかに記載の方法。
  9. 【請求項９】 ＤＮＡ配列が完全なpolポリペプチドを
    コードしている請求項８に記載の方法。
  10. 【請求項１０】 細胞中での組換えポリペプチドの転写
    および翻訳を制御する調節配列、および解読枠内の、少
    なくとも約２１bpのＤＮＡ配列を含んでいる、該調節配
    列によって制御される暗号配列を含んでいる組換えＤＮ
    Ａベクターであって、該ＤＮＡ配列がＡＲＶ−２(７Ｄ)
    (ＡＴＣＣ Ｎo．４０１４３)またはＡＲＶ−２(８Ａ)
    (ＡＴＣＣ Ｎo.４０１４４)中の抗原性ＨＩＶ−Ｉアミ
    ノ酸配列をコードしており、この配列はＨＴＬＶ−Iお
    よびＨＴＬＶ−ＩＩと免疫学的に交差反応しないがＨＩ
    Ｖ−Ｉとは反応するものであり、該抗原性ＨＩＶ−Ｉア
    ミノ酸配列は、前記の配列１に示すアミノ酸配列に含ま
    れるものであることを特徴とする組換えＤＮＡベクター
    を含んでいる細胞内で組換えポリペプチドを発現するの
    に有用な該組換えＤＮＡベクターによって形質転換され
    た細胞によって製造される組換えポリペプチド。
  11. 【請求項１１】 真核細胞中で発現される請求項１０の
    組換えポリペプチド。
  12. 【請求項１２】 酵母細胞中で発現される請求項１０の
    組換えポリペプチド。
  13. 【請求項１３】 細菌細胞中で発現される請求項１０の
    組換えポリペプチド。
  14. 【請求項１４】 envポリペプチドからのアミノ酸配列
    を含んでいる請求項１０の組換えポリペプチド。
  15. 【請求項１５】 envアミノ酸配列が完全なenvポリペプ
    チドを含んでいる請求項１４の組換えポリペプチド。
  16. 【請求項１６】 gagポリペプチドからのアミノ酸配列
    を含んでいる請求項１５の組換えポリペプチド。
  17. 【請求項１７】 gagアミノ酸配列がp１６gagを含んで
    いる請求項１５の組換えポリペプチド。
  18. 【請求項１８】 gagアミノ酸配列がp２５gagを含んで
    いる請求項１５の組換えポリペプチド。
  19. 【請求項１９】 gagアミノ酸配列がp１６gagおよびp２
    ５gagアミノ酸配列の融合タンパクを含んでいる請求項
    １５の組換えポリペプチド。
  20. 【請求項２０】 polポリペプチドからのアミノ酸配列
    を含んでいる請求項１０の組換えポリペプチド。
  21. 【請求項２１】 polアミノ酸配列がp３１polを含んで
    いる請求項２０の組換えポリペプチド。
  22. 【請求項２２】 polアミノ酸配列が超酸化ジスムター
    ゼとp３１polアミノ酸配列の融合タンパクを含んでいる
    請求項２０の組換えポリペプチド。
  23. 【請求項２３】 ＨＩＶ−Ｉ抗体の免疫検定に使用され
    る固状担体と結合した請求項１０の組換えポリペプチ
    ド。
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