JPH1132775A - 組み換えシュクロースシンターゼ - Google Patents
組み換えシュクロースシンターゼInfo
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- JPH1132775A JPH1132775A JP9207338A JP20733897A JPH1132775A JP H1132775 A JPH1132775 A JP H1132775A JP 9207338 A JP9207338 A JP 9207338A JP 20733897 A JP20733897 A JP 20733897A JP H1132775 A JPH1132775 A JP H1132775A
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- Japan
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- sucrose
- recombinant
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- enzyme
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- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 大腸菌を形質転換して、植物細胞由来のシュ
クロースシンターゼ遺伝子を大腸菌で発現させること。 【解決手段】 原核細胞由来の組み換えシュクロースシ
ンターゼ、特に１１番目のセリン残基がアスパラギン酸
残基又はグルタミン酸残基に置換された組み換えシュク
ロースシンターゼ。
クロースシンターゼ遺伝子を大腸菌で発現させること。 【解決手段】 原核細胞由来の組み換えシュクロースシ
ンターゼ、特に１１番目のセリン残基がアスパラギン酸
残基又はグルタミン酸残基に置換された組み換えシュク
ロースシンターゼ。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、糖鎖が付加されて
いない、原核細胞由来の組み換えシュクロースシンター
ゼ、及びその製造方法等に関する。
いない、原核細胞由来の組み換えシュクロースシンター
ゼ、及びその製造方法等に関する。
【０００２】
【従来の技術】シュクロースシンターゼ(EC 2.4.1.13)
はシュクロースからＵＤＰにグルコース残基を転移し、
ＵＤＰ−グルコース及びフラクトースを合成する反応、
並びにその逆反応を触媒する酵素である。この酵素は、
広く植物組織に存在している。イネ種子やインゲン豆よ
り得られた該酵素は、分子量約１０万のサブユニット四
つから成る四量体として存在している。又、該酵素は糖
鎖付加の認識配列であるAsn-X-Thr を２か所有している
ので、糖タンパクであると推定される。従来、このよう
な植物由来のシュクロースシンターゼ遺伝子を大腸菌と
セルロース生産菌のシャトルベクターに組み込んで、得
られた発現ベクターを用いてセルロース生産菌を形質転
換し、セルロースの生産性向上を図った例はある(WO95/
32279)。
はシュクロースからＵＤＰにグルコース残基を転移し、
ＵＤＰ−グルコース及びフラクトースを合成する反応、
並びにその逆反応を触媒する酵素である。この酵素は、
広く植物組織に存在している。イネ種子やインゲン豆よ
り得られた該酵素は、分子量約１０万のサブユニット四
つから成る四量体として存在している。又、該酵素は糖
鎖付加の認識配列であるAsn-X-Thr を２か所有している
ので、糖タンパクであると推定される。従来、このよう
な植物由来のシュクロースシンターゼ遺伝子を大腸菌と
セルロース生産菌のシャトルベクターに組み込んで、得
られた発現ベクターを用いてセルロース生産菌を形質転
換し、セルロースの生産性向上を図った例はある(WO95/
32279)。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、植物細
胞由来のシュクロースシンターゼを大腸菌等の原核細胞
に組み込み、該酵素を実際に発現させた例はこれまで知
られていない。本発明者等は、今回、植物細胞由来のシ
ュクロースシンターゼ遺伝子を含む大腸菌用の発現ベク
ターを作成し、該発現ベクターを用いて大腸菌を形質転
換して、植物細胞由来のシュクロースシンターゼ遺伝子
を大腸菌で発現させることに成功し、本発明を完成させ
た。
胞由来のシュクロースシンターゼを大腸菌等の原核細胞
に組み込み、該酵素を実際に発現させた例はこれまで知
られていない。本発明者等は、今回、植物細胞由来のシ
ュクロースシンターゼ遺伝子を含む大腸菌用の発現ベク
ターを作成し、該発現ベクターを用いて大腸菌を形質転
換して、植物細胞由来のシュクロースシンターゼ遺伝子
を大腸菌で発現させることに成功し、本発明を完成させ
た。
【０００４】
【課題を解決するための手段】即ち、本発明は、原核細
胞由来の組み換えシュクロースシンターゼに係わるもの
である。原核細胞の例としては、大腸菌、枯草菌等があ
る。大腸菌の具体的な株としては、例えば、ＢＬ２１
株、ＨＢ１０１株、ＪＭ１０９株等の公知の株を使用で
きる。更に、本発明は、植物細胞由来のシュクロースシ
ンターゼ遺伝子を含む大腸菌等の原核細胞用の発現プラ
スミド（ベクター）、該発現ベクターで形質転換された
大腸菌、及び該形質転換された大腸菌を培養することか
ら成る、組み換えシュクロースシンターゼの製造方法に
も係わるものである。
胞由来の組み換えシュクロースシンターゼに係わるもの
である。原核細胞の例としては、大腸菌、枯草菌等があ
る。大腸菌の具体的な株としては、例えば、ＢＬ２１
株、ＨＢ１０１株、ＪＭ１０９株等の公知の株を使用で
きる。更に、本発明は、植物細胞由来のシュクロースシ
ンターゼ遺伝子を含む大腸菌等の原核細胞用の発現プラ
スミド（ベクター）、該発現ベクターで形質転換された
大腸菌、及び該形質転換された大腸菌を培養することか
ら成る、組み換えシュクロースシンターゼの製造方法に
も係わるものである。
【０００５】植物胞由来のシュクロースシンターゼ遺伝
子の或るものは、既にクローニングされ、その塩基配列
も決定されている。コーン（Plant Molecular Biology
10,215-224 (1987), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83,
9099-9103 (1986), EMBOJ.4, 1373-1380 (1985))、イネ
（Plant Molecular Biology 18, 139-142 (1992),Plant
Molecular Biology 18, 1191-1194 (1992), Plant Mol
ecular Biology 19, 881-885 (1992)）、ソラマメ（Pla
nta 191, 394-401 (1993)）、ポテト（Gene60, 47-56
(1987) 、大麦 (E.J.B. 310, 46-50 (1992), E.J.B. 32
0, 177-181(1993)）、シロイヌナズナ（Plant Molecula
r Biology 18, 131-134 (1992)）、ダイズ（J.B.C. 26
2, 14780-14786 (1987)）などが報告されている。従っ
て、当業者であれば、適当な植物細胞由来のｃＤＮＡラ
イブラリーから、かかる公知の配列に基づいて、ＤＮＡ
オリゴマーから成るプライマーを作成し、ポリメラーゼ
連鎖反応(PCR) によって所望のシュクロースシンターゼ
遺伝子を増幅することによって容易に得ることが出来
る。或いは、コロニーハイブリダイゼーションを用い
て、サザン・ブロッテイングにより所望のシュクロース
シンターゼ遺伝子を選択することも可能である。尚、既
に述べたシュクロースシンターゼの活性（その程度の大
小は問わない。）を有する酵素をコードしている限り、
植物細胞由来のシュクロースシンターゼ遺伝子の全塩基
配列の一部が、例えば、部位特異的突然変異等の遺伝子
工学的手法によって、欠損、置換及び付加等されて、修
飾されて得られた遺伝子も本発明の「シュクロースシン
ターゼ遺伝子」であり、それを発現させて得られる、上
記活性を有する酵素も本発明の「組み換えシュクロース
シンターゼ」である。特に、植物由来のシュクロースシ
ンターゼの１１番目のセリン残基がアスパラギン酸残基
又はグルタミン酸残基に置換された組み換えシュクロー
スシンターゼは、置換前の組み換えシュクロースシンタ
ーゼと比べ、シュクロースに対する親和性の低下が抑制
されていることが特徴として挙げられる。
子の或るものは、既にクローニングされ、その塩基配列
も決定されている。コーン（Plant Molecular Biology
10,215-224 (1987), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83,
9099-9103 (1986), EMBOJ.4, 1373-1380 (1985))、イネ
（Plant Molecular Biology 18, 139-142 (1992),Plant
Molecular Biology 18, 1191-1194 (1992), Plant Mol
ecular Biology 19, 881-885 (1992)）、ソラマメ（Pla
nta 191, 394-401 (1993)）、ポテト（Gene60, 47-56
(1987) 、大麦 (E.J.B. 310, 46-50 (1992), E.J.B. 32
0, 177-181(1993)）、シロイヌナズナ（Plant Molecula
r Biology 18, 131-134 (1992)）、ダイズ（J.B.C. 26
2, 14780-14786 (1987)）などが報告されている。従っ
て、当業者であれば、適当な植物細胞由来のｃＤＮＡラ
イブラリーから、かかる公知の配列に基づいて、ＤＮＡ
オリゴマーから成るプライマーを作成し、ポリメラーゼ
連鎖反応(PCR) によって所望のシュクロースシンターゼ
遺伝子を増幅することによって容易に得ることが出来
る。或いは、コロニーハイブリダイゼーションを用い
て、サザン・ブロッテイングにより所望のシュクロース
シンターゼ遺伝子を選択することも可能である。尚、既
に述べたシュクロースシンターゼの活性（その程度の大
小は問わない。）を有する酵素をコードしている限り、
植物細胞由来のシュクロースシンターゼ遺伝子の全塩基
配列の一部が、例えば、部位特異的突然変異等の遺伝子
工学的手法によって、欠損、置換及び付加等されて、修
飾されて得られた遺伝子も本発明の「シュクロースシン
ターゼ遺伝子」であり、それを発現させて得られる、上
記活性を有する酵素も本発明の「組み換えシュクロース
シンターゼ」である。特に、植物由来のシュクロースシ
ンターゼの１１番目のセリン残基がアスパラギン酸残基
又はグルタミン酸残基に置換された組み換えシュクロー
スシンターゼは、置換前の組み換えシュクロースシンタ
ーゼと比べ、シュクロースに対する親和性の低下が抑制
されていることが特徴として挙げられる。
【０００６】本発明に使用しうる大腸菌用の発現ベクタ
ーとしては、公知のプラスミドベクター、例えば、pET2
0b(+) 、pKK233-2等である。このうち、pET20b(+) は、
ＮＯＶＡＧＥＮ社等から容易に入手することが出来る。
該大腸菌用の発現ベクターへの植物胞由来のシュクロー
スシンターゼ遺伝子の組み込みは、適当な制限酵素を使
用して、行うことが出来る。発現効率の向上等の目的
で、かかる発現ベクターは選択マーカー等の各種調節領
域ＤＮＡ組み込む等して、適宜、修飾することも可能で
ある。該発現ベクターによる大腸菌の形質転換は、電気
パルス法、リン酸カルシウム法等従来公知のいかなる方
法によっても実施することが出来る。このようにして形
質転換された大腸菌は、当業者に公知の適当な培養・発
現条件下で培養し、本発明の組み換えシュクロースシン
ターゼを製造することができる。尚、製造された組み換
えシュクロースシンターゼは、磨砕、ビーズミル、ホモ
ジュナイザー、超音波、高圧破砕、又はリゾチーム等の
溶菌酵素及びＳＤＳ等の界面活性剤による溶菌処理、硫
安沈殿、及びゲル濾過等を任意に組み合わせた当業者に
は公知の適当な方法で精製することが出来る。
ーとしては、公知のプラスミドベクター、例えば、pET2
0b(+) 、pKK233-2等である。このうち、pET20b(+) は、
ＮＯＶＡＧＥＮ社等から容易に入手することが出来る。
該大腸菌用の発現ベクターへの植物胞由来のシュクロー
スシンターゼ遺伝子の組み込みは、適当な制限酵素を使
用して、行うことが出来る。発現効率の向上等の目的
で、かかる発現ベクターは選択マーカー等の各種調節領
域ＤＮＡ組み込む等して、適宜、修飾することも可能で
ある。該発現ベクターによる大腸菌の形質転換は、電気
パルス法、リン酸カルシウム法等従来公知のいかなる方
法によっても実施することが出来る。このようにして形
質転換された大腸菌は、当業者に公知の適当な培養・発
現条件下で培養し、本発明の組み換えシュクロースシン
ターゼを製造することができる。尚、製造された組み換
えシュクロースシンターゼは、磨砕、ビーズミル、ホモ
ジュナイザー、超音波、高圧破砕、又はリゾチーム等の
溶菌酵素及びＳＤＳ等の界面活性剤による溶菌処理、硫
安沈殿、及びゲル濾過等を任意に組み合わせた当業者に
は公知の適当な方法で精製することが出来る。
【０００７】更に、本発明は、組み換えシュクロースシ
ンターゼを触媒として使用する、非対称標識シュクロー
スの製造方法及び該方法によって得られる非対称標識シ
ュクロースにも係わるものである。該方法によれば、原
料となるグルコース又はフラクトースのいずれか一方
を、例えば、〔14Ｃ〕等の放射性物質等で標識し、それ
を用いて本発明の組み換えシュクロースシンターゼの触
媒作用下に反応させることによって、従来の化学合成法
に比べて、より簡便、経済的且つ効率良く非対称標識シ
ュクロース、即ち、グルコース又はフラクトースのいず
れか一方のみが〔14Ｃ〕等の放射性物質等で標識された
シュクロースを製造することが出来る。該製造方法に用
いる組み換えシュクロースシンターゼ酵素は上記のよう
に精製した酵素をそのまま反応系で使用するか、又は、
該酵素の回収及び安定化を図るために、担体結合法、包
括固定化法、架橋固定化法、及び複合固体化法等の公知
の方法により酵素を適当な担体に固定化してバイオリア
クターを構成することも出来る。非対称標識シュクロー
スの製造に際して、各出発物質の濃度、反応溶液の緩衝
剤の種類及び濃度、その他の共存イオンの種類及びその
強度、反応温度、反応時間並びに目的物質の分離・精製
手段等の反応の各種反応条件は当業者が反応様式等を考
慮して適宜設定することが出来る。
ンターゼを触媒として使用する、非対称標識シュクロー
スの製造方法及び該方法によって得られる非対称標識シ
ュクロースにも係わるものである。該方法によれば、原
料となるグルコース又はフラクトースのいずれか一方
を、例えば、〔14Ｃ〕等の放射性物質等で標識し、それ
を用いて本発明の組み換えシュクロースシンターゼの触
媒作用下に反応させることによって、従来の化学合成法
に比べて、より簡便、経済的且つ効率良く非対称標識シ
ュクロース、即ち、グルコース又はフラクトースのいず
れか一方のみが〔14Ｃ〕等の放射性物質等で標識された
シュクロースを製造することが出来る。該製造方法に用
いる組み換えシュクロースシンターゼ酵素は上記のよう
に精製した酵素をそのまま反応系で使用するか、又は、
該酵素の回収及び安定化を図るために、担体結合法、包
括固定化法、架橋固定化法、及び複合固体化法等の公知
の方法により酵素を適当な担体に固定化してバイオリア
クターを構成することも出来る。非対称標識シュクロー
スの製造に際して、各出発物質の濃度、反応溶液の緩衝
剤の種類及び濃度、その他の共存イオンの種類及びその
強度、反応温度、反応時間並びに目的物質の分離・精製
手段等の反応の各種反応条件は当業者が反応様式等を考
慮して適宜設定することが出来る。
【０００８】
【発明の実施の形態】以下、本発明の最良の実施の形態
を示す実施例により、本発明をより詳細に説明するが、
これらの実施例は本発明を何等限定するものではない。
を示す実施例により、本発明をより詳細に説明するが、
これらの実施例は本発明を何等限定するものではない。
【０００９】実施例１ シュクロースシンターゼ遺伝子
によって形質転換された大腸菌シュクロースシンターゼ
の製造 マング豆(Vigna radiata）をバーミキュライトに植えて
発芽させた幼苗の胚軸の組織よりｍＲＮＡを調製し、ｃ
ＤＮＡを作成した。２０ｇの胚軸を５０ｍＭトリス塩酸
塩（ｐＨ８．５）と１％ＳＤＳの１００mlと、同量の９
０％フェノールとともに破砕し、その遠心上層を再びフ
ェノール／クロロホルム（１：１）で洗浄し、ｐＨを５
にあわせた。ＲＮＡは０．６倍量のイソプロパノールと
ともに−２０℃で沈澱させ回収し、少量の水に溶かして
２０分の１量の６Ｍ塩化リチウムと２．５倍量のエタノ
ールで再沈澱させ、２回繰り返した。得られた精製ＲＮ
Ａをオリゴｄ（Ｔ）セルロースクロマトグラフィーによ
りｍＲＮＡを調製した。ｃＤＮＡはアマシャム社のｃＤ
ＮＡ合成キットを用いて作成した。一方、既に報告され
ているマング豆のシュクロースシンターゼｃＤＮＡの塩
基配列（Arai等、Plant Cell Physiology 、33巻、 503
頁 (1992年））をもとに、以下の２種類のＤＮＡオリゴ
マーを合成した。 １．ＴＧＧＣＴＡＣＣＧＡＴＣＧＴＴＴＧＡＣＣ ２．ＴＣＴＣＧＧＴＣＧＡＣＡＡＧＣＣＧＧＴＴＣＣＴ
ＣＣＡＴＴＴＣＴＴＣＡＴＣＣ
によって形質転換された大腸菌シュクロースシンターゼ
の製造 マング豆(Vigna radiata）をバーミキュライトに植えて
発芽させた幼苗の胚軸の組織よりｍＲＮＡを調製し、ｃ
ＤＮＡを作成した。２０ｇの胚軸を５０ｍＭトリス塩酸
塩（ｐＨ８．５）と１％ＳＤＳの１００mlと、同量の９
０％フェノールとともに破砕し、その遠心上層を再びフ
ェノール／クロロホルム（１：１）で洗浄し、ｐＨを５
にあわせた。ＲＮＡは０．６倍量のイソプロパノールと
ともに−２０℃で沈澱させ回収し、少量の水に溶かして
２０分の１量の６Ｍ塩化リチウムと２．５倍量のエタノ
ールで再沈澱させ、２回繰り返した。得られた精製ＲＮ
Ａをオリゴｄ（Ｔ）セルロースクロマトグラフィーによ
りｍＲＮＡを調製した。ｃＤＮＡはアマシャム社のｃＤ
ＮＡ合成キットを用いて作成した。一方、既に報告され
ているマング豆のシュクロースシンターゼｃＤＮＡの塩
基配列（Arai等、Plant Cell Physiology 、33巻、 503
頁 (1992年））をもとに、以下の２種類のＤＮＡオリゴ
マーを合成した。 １．ＴＧＧＣＴＡＣＣＧＡＴＣＧＴＴＴＧＡＣＣ ２．ＴＣＴＣＧＧＴＣＧＡＣＡＡＧＣＣＧＧＴＴＣＣＴ
ＣＣＡＴＴＴＣＴＴＣＡＴＣＣ
【００１０】これらのＤＮＡオリゴマーをプライマーと
して用い、マング豆より調製したｃＤＮＡからＰＣＲ
（ポリメラーゼ連鎖反応）によりシュクロースシンター
ゼ遺伝子を増幅した。増幅されたＤＮＡを制限酵素Ｓａ
ｌＩで処理した。一方、大腸菌用の発現プラスミドベク
ターであるｐＥＴ２０ｂ（＋）をＮｄｅＩで処理し、ク
レノウフラグメントにより末端平滑化を行った後、Ｓａ
ｌＩで処理した。この処理したｐＥＴベクターをＳａｌ
Ｉ処理したｃＤＮＡ断片と連結して発現プラスミドベク
ターｐＥＢ−０１を作成し、これを大腸菌ＢＬ２１株に
電気パルス法で導入して、該大腸菌株を形質転換して、
目的のプラスミドを持つ形質転換株を選択した。ＬＢ培
地中で３７℃にてこの株を培養してＩＰＴＧ（イソプロ
ピル−チオ−β−Ｄ−ガラクトシド）によりシュクロー
スシンターゼ遺伝子の発現を行った。次に、こうして得
られた形質転換大腸菌を２５ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ
（ｐＨ７．５）（０．１ｍＭ ＥＤＴＡ及び１０．１ｍ
Ｍ ＤＴＴを含む）で超音波で破砕し、遠心して上清を
取った。上清に硫酸アンモニウムを加え（６５％）、蛋
白質を沈澱させた。この沈殿物を０．０３Ｍ Ｔｒｉｓ
／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）（０．１５Ｍ ＮａＣｌ，０．
１ｍＭ ＥＤＴＡ及び１０．１ｍＭ ＤＴＴを含む）中
に懸濁させてた後、再び遠心して上清を取った。この上
清を、ＦＰＬＣシステム（ファーマシア）の一部であ
る、同じＴｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液で平衡化させたスーパ
ーロース(Superose)６ゲル濾過カラム（1.0 X 30cm、フ
ァーマシア）にかけ、流速０．３mlで流した。得られた
活性分画は−８５℃で保存した。以降の実験には、この
蛋白質を２５ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）に
溶かしたものを酵素標品として用いた。又、このように
形質転換大腸菌から調製した酵素標品をそれぞれＳＤＳ
−ＰＡＧＥ（ゲル濃度５％）にかけた。ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ後、ニトロセルロースミンブランに転写後、ＥＣＬウ
ェスタンブロッティング検出システムキット（アマシャ
ム社製）によって発色させた。その結果、シュクロース
シンターゼに該当する分子量のバンドが検出され、単量
体の分子量は約９０ｋＤａ、二量体の分子量は約１８０
ｋＤａ、四量体の分子量約３６０ｋＤａと測定された。
この実験事実から、形質転換大腸菌の菌体内に大量にシ
ュクロースシンターゼが蓄積したことが認められた。
して用い、マング豆より調製したｃＤＮＡからＰＣＲ
（ポリメラーゼ連鎖反応）によりシュクロースシンター
ゼ遺伝子を増幅した。増幅されたＤＮＡを制限酵素Ｓａ
ｌＩで処理した。一方、大腸菌用の発現プラスミドベク
ターであるｐＥＴ２０ｂ（＋）をＮｄｅＩで処理し、ク
レノウフラグメントにより末端平滑化を行った後、Ｓａ
ｌＩで処理した。この処理したｐＥＴベクターをＳａｌ
Ｉ処理したｃＤＮＡ断片と連結して発現プラスミドベク
ターｐＥＢ−０１を作成し、これを大腸菌ＢＬ２１株に
電気パルス法で導入して、該大腸菌株を形質転換して、
目的のプラスミドを持つ形質転換株を選択した。ＬＢ培
地中で３７℃にてこの株を培養してＩＰＴＧ（イソプロ
ピル−チオ−β−Ｄ−ガラクトシド）によりシュクロー
スシンターゼ遺伝子の発現を行った。次に、こうして得
られた形質転換大腸菌を２５ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ
（ｐＨ７．５）（０．１ｍＭ ＥＤＴＡ及び１０．１ｍ
Ｍ ＤＴＴを含む）で超音波で破砕し、遠心して上清を
取った。上清に硫酸アンモニウムを加え（６５％）、蛋
白質を沈澱させた。この沈殿物を０．０３Ｍ Ｔｒｉｓ
／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）（０．１５Ｍ ＮａＣｌ，０．
１ｍＭ ＥＤＴＡ及び１０．１ｍＭ ＤＴＴを含む）中
に懸濁させてた後、再び遠心して上清を取った。この上
清を、ＦＰＬＣシステム（ファーマシア）の一部であ
る、同じＴｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液で平衡化させたスーパ
ーロース(Superose)６ゲル濾過カラム（1.0 X 30cm、フ
ァーマシア）にかけ、流速０．３mlで流した。得られた
活性分画は−８５℃で保存した。以降の実験には、この
蛋白質を２５ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）に
溶かしたものを酵素標品として用いた。又、このように
形質転換大腸菌から調製した酵素標品をそれぞれＳＤＳ
−ＰＡＧＥ（ゲル濃度５％）にかけた。ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ後、ニトロセルロースミンブランに転写後、ＥＣＬウ
ェスタンブロッティング検出システムキット（アマシャ
ム社製）によって発色させた。その結果、シュクロース
シンターゼに該当する分子量のバンドが検出され、単量
体の分子量は約９０ｋＤａ、二量体の分子量は約１８０
ｋＤａ、四量体の分子量約３６０ｋＤａと測定された。
この実験事実から、形質転換大腸菌の菌体内に大量にシ
ュクロースシンターゼが蓄積したことが認められた。
【００１１】実施例２ Ｎ末端５残基を欠損したプラス
ミドの構築 １．ＴＧＴＴＧＡＣＣＣＧＴＧＴＴＣＡＣＡＧＴＣＴＣ
Ｃ ２．ＴＣＴＣＧＧＴＣＧＡＣＡＡＧＣＣＧＧＴＴＣＣＴ
ＣＣＡＴＴＴＣＴＴＣＡＴＣＣ これらプライマーを用いて、実施例１と同様に、シュク
ロースシンターゼのＮ末端５残基の欠損したｃＤＮＡを
ｐＥＴ２０ｂ（＋）に導入した。こうして得られた発現
プラスミドベクターを用いて、実施例１と同様に、大腸
菌ＢＬ２１株を形質転換株し、Ｎ末端５残基の欠損した
本発明のシュクロースシンターゼを発現させ、実施例１
と同様に、形質転換大腸菌の菌体内に蓄積したことを確
認した。
ミドの構築 １．ＴＧＴＴＧＡＣＣＣＧＴＧＴＴＣＡＣＡＧＴＣＴＣ
Ｃ ２．ＴＣＴＣＧＧＴＣＧＡＣＡＡＧＣＣＧＧＴＴＣＣＴ
ＣＣＡＴＴＴＣＴＴＣＡＴＣＣ これらプライマーを用いて、実施例１と同様に、シュク
ロースシンターゼのＮ末端５残基の欠損したｃＤＮＡを
ｐＥＴ２０ｂ（＋）に導入した。こうして得られた発現
プラスミドベクターを用いて、実施例１と同様に、大腸
菌ＢＬ２１株を形質転換株し、Ｎ末端５残基の欠損した
本発明のシュクロースシンターゼを発現させ、実施例１
と同様に、形質転換大腸菌の菌体内に蓄積したことを確
認した。
【００１２】実施例３ 形質転換大腸菌から抽出したシ
ュクロースシンターゼによるＵＤＰ−グルコース合成の
タイムコース 反応系（最終濃度） ２ｍＭ〔14Ｃ〕シュクロース（２×１０5 cpm) １０ｍＭ ＵＤＰ ２５ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．５ 酵素標品（蛋白量 約５０mg） 上記の反応系の全量２０μl を３０℃で一定時間インキ
ュベイトした後、 1/C量をワットマン３ＭＭ濾紙に２cm
間隔にスポットした後、５０ｍＭホウ酸ナトリウムバッ
ファー（ｐＨ９．５）にて２００Ｖ、２時間通電した。
その後、オートラジオグラフィを行い、各時間経過後の
ＵＤＰ−グルコース画分の放射能を測定した。その結
果、実施例１で得られた形質転換大腸菌由来の酵素標品
を使用した場合には、ＵＤＰ−グルコースが生成したこ
とが確認された。該酵素標品の比活性は１０-3Ｕ／mg p
r.であった。実施例２で得られたＮ末端５残基の欠損し
た本発明の組み換えシュクロースシンターゼを酵素標品
として使用して同様な実験をしたところ、ＵＤＰ−グル
コースが生成したことが確認された。
ュクロースシンターゼによるＵＤＰ−グルコース合成の
タイムコース 反応系（最終濃度） ２ｍＭ〔14Ｃ〕シュクロース（２×１０5 cpm) １０ｍＭ ＵＤＰ ２５ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．５ 酵素標品（蛋白量 約５０mg） 上記の反応系の全量２０μl を３０℃で一定時間インキ
ュベイトした後、 1/C量をワットマン３ＭＭ濾紙に２cm
間隔にスポットした後、５０ｍＭホウ酸ナトリウムバッ
ファー（ｐＨ９．５）にて２００Ｖ、２時間通電した。
その後、オートラジオグラフィを行い、各時間経過後の
ＵＤＰ−グルコース画分の放射能を測定した。その結
果、実施例１で得られた形質転換大腸菌由来の酵素標品
を使用した場合には、ＵＤＰ−グルコースが生成したこ
とが確認された。該酵素標品の比活性は１０-3Ｕ／mg p
r.であった。実施例２で得られたＮ末端５残基の欠損し
た本発明の組み換えシュクロースシンターゼを酵素標品
として使用して同様な実験をしたところ、ＵＤＰ−グル
コースが生成したことが確認された。
【００１３】実施例４ 形質転換大腸菌から抽出したシ
ュクロースシンターゼによる非対称標識シュクロースの
合成 反応系１：グルコース標識非対称シュクロース （最終
濃度） ２μＭ ＵＤＰ−〔14Ｃ〕グルコース（２nCi) ５０ｍＭ フラクトース １０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．５ 酵素標品（蛋白量 約７．５μｇ） 反応系２：フラクトース標識非対称シュクロース （最
終濃度） １６．７μＭ 〔14Ｃ〕フラクトース（１００nCi) ５０ｍＭ ＵＤＰ−グルクース ５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．５ 酵素標品（蛋白量 約７．５μｇ） 上記の反応系の全量２０μl を３０℃で１０分間インキ
ュベイトした後、 1/C量をワットマン３ＭＭ濾紙に２cm
間隔にスポットした後、５０ｍＭホウ酸ナトリウムバッ
ファー（ｐＨ９．６）にて２５０Ｖ、３時間通電して電
気泳動させた。その後、該濾紙を乾燥させ、オートラジ
オグラフィ（Fujix Bio-imaging analyzer Bas2000, 富
士フィルム株式会社）を行った。その結果、放射活性を
有する画分と標準シュクロースの移動度はほぼ等しいこ
とが確認された。そこで、該濾紙上のシュクロースに対
応する領域を切り出して水で溶出した。得られた水溶液
をダウエックス５０Ｗ（Ｈ+ 型、ダウケミカルカンパニ
ー）で処理し、ナトリウムイオンを除去した。又、ホウ
酸イオンはメタノールと共に繰り返し蒸留することによ
って除去した。こうして得られた放射活性試料を０．０
１Ｎのトリフルオロ酢酸中にて１００℃で３０分間処理
して加水分解させ、トリフルオロ酢酸は減圧蒸留にて除
去した。抗して得られた試料を１−プロパノール／酢酸
エチル／水（３：３：１）でペーパークロマトグラフィ
にかけ、Ｘ線フィルムに感光させた。その結果、ペーパ
ークロマトグラフィに於いても、放射活性を有する画分
と標準シュクロースの移動度はほぼ等しく、又、該放射
活性試料を加水分解して得られた画分は標準グルコース
及びフラクトースの移動度にほぼ等しいことが確認され
た。尚、対照となる各種標準糖類はアルカリ性硝酸銀で
処理して各クロマトグラム上で検出した。上記各反応系
に於ける非対称標識シュクロースの触媒合成のタイムコ
ースを図３及び図４に示す。いずれの反応系において
も、約８０％の放射活性が合成された非対称標識シュク
ロース内に回収されたことが判る。
ュクロースシンターゼによる非対称標識シュクロースの
合成 反応系１：グルコース標識非対称シュクロース （最終
濃度） ２μＭ ＵＤＰ−〔14Ｃ〕グルコース（２nCi) ５０ｍＭ フラクトース １０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．５ 酵素標品（蛋白量 約７．５μｇ） 反応系２：フラクトース標識非対称シュクロース （最
終濃度） １６．７μＭ 〔14Ｃ〕フラクトース（１００nCi) ５０ｍＭ ＵＤＰ−グルクース ５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．５ 酵素標品（蛋白量 約７．５μｇ） 上記の反応系の全量２０μl を３０℃で１０分間インキ
ュベイトした後、 1/C量をワットマン３ＭＭ濾紙に２cm
間隔にスポットした後、５０ｍＭホウ酸ナトリウムバッ
ファー（ｐＨ９．６）にて２５０Ｖ、３時間通電して電
気泳動させた。その後、該濾紙を乾燥させ、オートラジ
オグラフィ（Fujix Bio-imaging analyzer Bas2000, 富
士フィルム株式会社）を行った。その結果、放射活性を
有する画分と標準シュクロースの移動度はほぼ等しいこ
とが確認された。そこで、該濾紙上のシュクロースに対
応する領域を切り出して水で溶出した。得られた水溶液
をダウエックス５０Ｗ（Ｈ+ 型、ダウケミカルカンパニ
ー）で処理し、ナトリウムイオンを除去した。又、ホウ
酸イオンはメタノールと共に繰り返し蒸留することによ
って除去した。こうして得られた放射活性試料を０．０
１Ｎのトリフルオロ酢酸中にて１００℃で３０分間処理
して加水分解させ、トリフルオロ酢酸は減圧蒸留にて除
去した。抗して得られた試料を１−プロパノール／酢酸
エチル／水（３：３：１）でペーパークロマトグラフィ
にかけ、Ｘ線フィルムに感光させた。その結果、ペーパ
ークロマトグラフィに於いても、放射活性を有する画分
と標準シュクロースの移動度はほぼ等しく、又、該放射
活性試料を加水分解して得られた画分は標準グルコース
及びフラクトースの移動度にほぼ等しいことが確認され
た。尚、対照となる各種標準糖類はアルカリ性硝酸銀で
処理して各クロマトグラム上で検出した。上記各反応系
に於ける非対称標識シュクロースの触媒合成のタイムコ
ースを図３及び図４に示す。いずれの反応系において
も、約８０％の放射活性が合成された非対称標識シュク
ロース内に回収されたことが判る。
【００１４】実施例５ 部位特異的突然変異によって修
飾されたシュクロースシンターゼ遺伝子等によって形質
転換された大腸菌によるシュクロースシンターゼの製造 （１）野生型の組み換えシュクロースシンターゼ発現用
プラスミドベクタ−の構築：実施例１においては、ｐＥ
Ｔ２０ｂ（＋）を用いて発現ベクターｐＥＢ−０１を作
成したが、このｐＥＴ２０ｂ（＋）のＮｄｅＩ部位が切
断されにくいこともある為、その代りにｐＥＴ２１ｄを
Ｎｏｖａｇｅｎ社から購入して用いた。このベクターは
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの開始コドン上にＮｃｏＩ部位
（ＣＣＡＴＧＧ）が設けられている。プライマーとし
て、 ＳＳ−８：ＴＴＧＡＣＣＣＧＴＧＴＴＣＡＣＡＧＴＣＴ
ＣＣＧ：ｆｏｒｗａｒｄ ＳＳＬ−２：ＴＣＴＣＧＧＴＣＧＡＣＡＡＧＣＣＧＧＴ
ＴＣＣＴＣＣＡＴＴＴＣＴＴＣＡＴＣＣ：ｒｅｖｅｒｓ
ｅ の２つを使用し、鋳型として、前掲のArai等（Plant Ce
ll Physiology 、33巻、503頁 (1992年））に記載され
ているマング豆のシュクロースシンターゼｃＤＮＡの塩
基配列（ｐＭ−ＳＳ−５）を用いて、ＰＣＲ法によって
シュクロースシンターゼｃＤＮＡを増幅した。増幅され
たＤＮＡ産物をアガロースゲルから切り出した後に、Ｓ
ａｌＩで処理した。一方、ｐＥＴ２１ｄをＮｃｏＩで切
断後、クレノウフラグメントにより末端平滑化を行った
後、ＸｈｏＩで処理した。この処理したｐＥＴ２１ｄベ
クターをＳａｌＩ処理したｃＤＮＡ断片と連結して発現
プラスミドベクターｐＥＤ−０１を作成した。こうして
作製した発現ベクターを実施例１と同様に大腸菌ＢＬ２
１株に電気パルス法で導入して、該大腸菌株を形質転換
して、目的のプラスミドを持つ形質転換株を選択した。
この形質転換株を用いて、実施例１と同様にしてシュク
ロースシンターゼ遺伝子の発現を行ない、形質転換大腸
菌株の菌体内に大量のシュクロースシンターゼが蓄積し
たことを確認した。
飾されたシュクロースシンターゼ遺伝子等によって形質
転換された大腸菌によるシュクロースシンターゼの製造 （１）野生型の組み換えシュクロースシンターゼ発現用
プラスミドベクタ−の構築：実施例１においては、ｐＥ
Ｔ２０ｂ（＋）を用いて発現ベクターｐＥＢ−０１を作
成したが、このｐＥＴ２０ｂ（＋）のＮｄｅＩ部位が切
断されにくいこともある為、その代りにｐＥＴ２１ｄを
Ｎｏｖａｇｅｎ社から購入して用いた。このベクターは
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの開始コドン上にＮｃｏＩ部位
（ＣＣＡＴＧＧ）が設けられている。プライマーとし
て、 ＳＳ−８：ＴＴＧＡＣＣＣＧＴＧＴＴＣＡＣＡＧＴＣＴ
ＣＣＧ：ｆｏｒｗａｒｄ ＳＳＬ−２：ＴＣＴＣＧＧＴＣＧＡＣＡＡＧＣＣＧＧＴ
ＴＣＣＴＣＣＡＴＴＴＣＴＴＣＡＴＣＣ：ｒｅｖｅｒｓ
ｅ の２つを使用し、鋳型として、前掲のArai等（Plant Ce
ll Physiology 、33巻、503頁 (1992年））に記載され
ているマング豆のシュクロースシンターゼｃＤＮＡの塩
基配列（ｐＭ−ＳＳ−５）を用いて、ＰＣＲ法によって
シュクロースシンターゼｃＤＮＡを増幅した。増幅され
たＤＮＡ産物をアガロースゲルから切り出した後に、Ｓ
ａｌＩで処理した。一方、ｐＥＴ２１ｄをＮｃｏＩで切
断後、クレノウフラグメントにより末端平滑化を行った
後、ＸｈｏＩで処理した。この処理したｐＥＴ２１ｄベ
クターをＳａｌＩ処理したｃＤＮＡ断片と連結して発現
プラスミドベクターｐＥＤ−０１を作成した。こうして
作製した発現ベクターを実施例１と同様に大腸菌ＢＬ２
１株に電気パルス法で導入して、該大腸菌株を形質転換
して、目的のプラスミドを持つ形質転換株を選択した。
この形質転換株を用いて、実施例１と同様にしてシュク
ロースシンターゼ遺伝子の発現を行ない、形質転換大腸
菌株の菌体内に大量のシュクロースシンターゼが蓄積し
たことを確認した。
【００１５】（２）部位特異的突然変異を有する組み換
えシュクロースシンターゼ発現用プラスミドベクタ−の
構築：１１番目のセリン残基をアスパラギン酸残基に置
換する為に、ｆｏｒｗａｒｄのプライマーとしＳＳ−８
の代りに以下に示すＳＳ−１４を用いて（１）と同様に
ｐＭ−ＳＳ−５を鋳型に用いて、ＰＣＲ法によってシュ
クロースシンターゼｃＤＮＡを増幅した。 ＳＳ−１４：ＴＧＧＣＴＡＣＣＧＡＴＣＧＴＴＴＧＡＣ
ＣＣＧＴＧＴＴＣＡＣＧＡＴＣＴＣＣＧＴＧＡＧＡＧＧ
Ｃ（下線部で示した箇所が当該変異部分） このＳＳ−１４はｐＥＴ２０ｂ（＋）へ導入するつもり
でＮｄｅＩ部位にクローニングするように設計した為
に、ＰＣＲ法によって増幅して得られたｃＤＮＡ産物を
鋳型として、ＳＳ−８とＳＳＬ−２２をプライマーとし
て使用して再度ＰＣＲ法によって増幅し部位特異的突然
変異を有するシュクロースシンターゼｃＤＮＡを得た。
このＰＣＲ産物をｐＥＤ−０１を作製したときと同様に
ｐＥＴ２１ｄにクローニングし、プラスミドを得た。し
かしながら、このプラスミドの塩基配列を決定してみた
ところ、これに含まれるシュクロースシンターゼｃＤＮ
Ａの下流に突然変異が発見された。そこで、このシュク
ロースシンターゼｃＤＮＡのＸｈｏＩの部位（該ｃＤＮ
Ａの約８００bp付近）と当該プラスミド上のＸｂａＩ部
位を用いて、該シュクロースシンターゼｃＤＮＡのＮ末
端部分を切り出し、ｐＥＤ−０１の同じ部位へ導入し、
こうして得られた発現プラスミドベクターｐＥＤ−０１
−Ｓ１１Ｄと名付けた。更に、１１番目のセリン残基を
グルタミン酸残基に置換する為に、ｆｏｒｗａｒｄのプ
ライマーとしＳＳ−８の代りに以下に示すＳＳ−１７を
用いて（１）と同様にｐＭ−ＳＳ−５を鋳型に用いて、
ＰＣＲ法によってシュクロースシンターゼｃＤＮＡを増
幅した。 ＳＳ−１７：ＧＣＴＡＣＣＧＡＴＣＧＴＴＴＧＡＣＣＣ
ＧＴＧＴＴＣＡＣＧＡＡＣＴＣＣＧＴＧＡＧＡＧＧＣ
（下線部で示した箇所が当該変異部分） このＳＳ−１７はｐＥＴ２１ｄに導入出来るように設計
されている為に、（１）でｐＥＤ−０１を作製した場合
と同様にして、ＰＣＲ法によって増幅されたシュクロー
スシンターゼｃＤＮＡをｐＥＴ２１ｄへクローニングし
た。得られたプラスミドからシュクロースシンターゼｃ
ＤＮＡのＮ末端部分を含むＸｈｏＩ−ＸｂａＩ断片を切
り出し、発現プラスミドベクターｐＥＤ−０１−Ｓ１１
Ｄを作製したように、ｐＥＤ−０１の同じ部位へ導入
し、こうして得られた発現プラスミドベクターｐＥＤ−
０１−Ｓ１１Ｅと名付けた。
えシュクロースシンターゼ発現用プラスミドベクタ−の
構築：１１番目のセリン残基をアスパラギン酸残基に置
換する為に、ｆｏｒｗａｒｄのプライマーとしＳＳ−８
の代りに以下に示すＳＳ−１４を用いて（１）と同様に
ｐＭ−ＳＳ−５を鋳型に用いて、ＰＣＲ法によってシュ
クロースシンターゼｃＤＮＡを増幅した。 ＳＳ−１４：ＴＧＧＣＴＡＣＣＧＡＴＣＧＴＴＴＧＡＣ
ＣＣＧＴＧＴＴＣＡＣＧＡＴＣＴＣＣＧＴＧＡＧＡＧＧ
Ｃ（下線部で示した箇所が当該変異部分） このＳＳ−１４はｐＥＴ２０ｂ（＋）へ導入するつもり
でＮｄｅＩ部位にクローニングするように設計した為
に、ＰＣＲ法によって増幅して得られたｃＤＮＡ産物を
鋳型として、ＳＳ−８とＳＳＬ−２２をプライマーとし
て使用して再度ＰＣＲ法によって増幅し部位特異的突然
変異を有するシュクロースシンターゼｃＤＮＡを得た。
このＰＣＲ産物をｐＥＤ−０１を作製したときと同様に
ｐＥＴ２１ｄにクローニングし、プラスミドを得た。し
かしながら、このプラスミドの塩基配列を決定してみた
ところ、これに含まれるシュクロースシンターゼｃＤＮ
Ａの下流に突然変異が発見された。そこで、このシュク
ロースシンターゼｃＤＮＡのＸｈｏＩの部位（該ｃＤＮ
Ａの約８００bp付近）と当該プラスミド上のＸｂａＩ部
位を用いて、該シュクロースシンターゼｃＤＮＡのＮ末
端部分を切り出し、ｐＥＤ−０１の同じ部位へ導入し、
こうして得られた発現プラスミドベクターｐＥＤ−０１
−Ｓ１１Ｄと名付けた。更に、１１番目のセリン残基を
グルタミン酸残基に置換する為に、ｆｏｒｗａｒｄのプ
ライマーとしＳＳ−８の代りに以下に示すＳＳ−１７を
用いて（１）と同様にｐＭ−ＳＳ−５を鋳型に用いて、
ＰＣＲ法によってシュクロースシンターゼｃＤＮＡを増
幅した。 ＳＳ−１７：ＧＣＴＡＣＣＧＡＴＣＧＴＴＴＧＡＣＣＣ
ＧＴＧＴＴＣＡＣＧＡＡＣＴＣＣＧＴＧＡＧＡＧＧＣ
（下線部で示した箇所が当該変異部分） このＳＳ−１７はｐＥＴ２１ｄに導入出来るように設計
されている為に、（１）でｐＥＤ−０１を作製した場合
と同様にして、ＰＣＲ法によって増幅されたシュクロー
スシンターゼｃＤＮＡをｐＥＴ２１ｄへクローニングし
た。得られたプラスミドからシュクロースシンターゼｃ
ＤＮＡのＮ末端部分を含むＸｈｏＩ−ＸｂａＩ断片を切
り出し、発現プラスミドベクターｐＥＤ−０１−Ｓ１１
Ｄを作製したように、ｐＥＤ−０１の同じ部位へ導入
し、こうして得られた発現プラスミドベクターｐＥＤ−
０１−Ｓ１１Ｅと名付けた。
【００１６】こうして作製した各発現プラスミドベクタ
ーを実施例１と同様に大腸菌ＢＬ２１株に電気パルス法
で導入して、該大腸菌株を形質転換して、目的のプラス
ミドを持つ形質転換株を選択した。こうして得られた各
形質転換株を用いて、実施例１と同様にしてシュクロー
スシンターゼ遺伝子の発現を行ない、形質転換大腸菌株
の菌体内に大量のシュクロースシンターゼが蓄積したこ
とを確認した。
ーを実施例１と同様に大腸菌ＢＬ２１株に電気パルス法
で導入して、該大腸菌株を形質転換して、目的のプラス
ミドを持つ形質転換株を選択した。こうして得られた各
形質転換株を用いて、実施例１と同様にしてシュクロー
スシンターゼ遺伝子の発現を行ない、形質転換大腸菌株
の菌体内に大量のシュクロースシンターゼが蓄積したこ
とを確認した。
【００１７】実施例６ 各種組み換えシュクロースシン
ターゼによる酵素反応 実施例５で得られた３種類の組み換えシュクロースシン
ターゼ及び元のマング豆由来のシュクロースシンターゼ
を用いて、実施例３及び実施例４にそれぞれ記載したよ
うに、グルコース合成反応及びシュクロース合成反応の
タイムコースを測定し、ラインウイバー−バークプロッ
トからそれぞれの反応に於けるミカエリス定数（Ｋｍ）
及び最大速度（Ｖmax)を求めた。得られた結果を以下の
表１に示す。
ターゼによる酵素反応 実施例５で得られた３種類の組み換えシュクロースシン
ターゼ及び元のマング豆由来のシュクロースシンターゼ
を用いて、実施例３及び実施例４にそれぞれ記載したよ
うに、グルコース合成反応及びシュクロース合成反応の
タイムコースを測定し、ラインウイバー−バークプロッ
トからそれぞれの反応に於けるミカエリス定数（Ｋｍ）
及び最大速度（Ｖmax)を求めた。得られた結果を以下の
表１に示す。
【００１８】
【表１】
【００１９】Ser-11：実施例５（１）で調製した野生型
の組み換えシュクロースシンターゼ； Asp-11：実施例５（２）で得られた１１番目のセリン残
基をアスパラギン酸残基に置換した組み換えシュクロー
スシンターゼ； Glu-11：実施例５（２）で得られた１１番目のセリン残
基をグルタミン酸残基に置換した組み換えシュクロース
シンターゼ； 野生型：元のマング豆由来のシュクロースシンターゼ
の組み換えシュクロースシンターゼ； Asp-11：実施例５（２）で得られた１１番目のセリン残
基をアスパラギン酸残基に置換した組み換えシュクロー
スシンターゼ； Glu-11：実施例５（２）で得られた１１番目のセリン残
基をグルタミン酸残基に置換した組み換えシュクロース
シンターゼ； 野生型：元のマング豆由来のシュクロースシンターゼ
【図１】 発現プラスミドベクターｐＥＢ−０１の作成
の過程を示す。
の過程を示す。
【図２】 形質転換大腸菌から抽出したシュクロースシ
ンターゼによるＵＤＰ−グルコース合成のタイムコース
を示す。
ンターゼによるＵＤＰ−グルコース合成のタイムコース
を示す。
【図３】 形質転換大腸菌から抽出したシュクロースシ
ンターゼによるＵＤＰ−〔14Ｃ〕グルコース（白丸）か
らの非対称標識シュクロース（黒丸）の合成のタイムコ
ースを示す。
ンターゼによるＵＤＰ−〔14Ｃ〕グルコース（白丸）か
らの非対称標識シュクロース（黒丸）の合成のタイムコ
ースを示す。
【図４】 形質転換大腸菌から抽出したシュクロースシ
ンターゼによる〔14Ｃ〕フラクトース（白丸）からの非
対称標識シュクロース（黒丸）の合成のタイムコースを
示す。
ンターゼによる〔14Ｃ〕フラクトース（白丸）からの非
対称標識シュクロース（黒丸）の合成のタイムコースを
示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/10 Ｃ１２Ｒ 1:19）
Claims (9)
- 【請求項１】 原核細胞由来の組み換えシュクロースシ
ンターゼ。 - 【請求項２】 １１番目のセリン残基がアスパラギン酸
残基又はグルタミン酸残基に置換された請求項１に記載
の組み換えシュクロースシンターゼ。 - 【請求項３】 原核細胞が大腸菌である、請求項１又は
２に記載の組み換えシュクロースシンターゼ。 - 【請求項４】 植物細胞由来のシュクロースシンターゼ
遺伝子を含む原核細胞用の発現プラスミド。 - 【請求項５】 １１番目のセリン残基がアスパラギン酸
残基又はグルタミン酸残基に置換された請求項４に記載
の発現プラスミド。 - 【請求項６】 請求項４又は５に記載の発現プラスミド
で形質転換された原核細胞。 - 【請求項７】 請求項６に記載の形質転換された原核細
胞を培養することから成る、請求項２に記載の組み換え
シュクロースシンターゼの製造方法。 - 【請求項８】 請求項１，２又は３に記載の組み換えシ
ュクロースシンターゼを触媒として使用する、非対称標
識シュクロースの製造方法。 - 【請求項９】 請求項８に記載の製造方法で得られる非
対称標識シュクロース。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP20733897A JP3837853B2 (ja) | 1997-07-16 | 1997-07-16 | 組み換えシュクロースシンターゼ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP20733897A JP3837853B2 (ja) | 1997-07-16 | 1997-07-16 | 組み換えシュクロースシンターゼ |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1132775A true JPH1132775A (ja) | 1999-02-09 |
| JP3837853B2 JP3837853B2 (ja) | 2006-10-25 |
Family
ID=16538099
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP20733897A Expired - Fee Related JP3837853B2 (ja) | 1997-07-16 | 1997-07-16 | 組み換えシュクロースシンターゼ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3837853B2 (ja) |
-
1997
- 1997-07-16 JP JP20733897A patent/JP3837853B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3837853B2 (ja) | 2006-10-25 |
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