JPH09294591A - 組み換えシュクロースシンターゼ - Google Patents
組み換えシュクロースシンターゼInfo
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- JPH09294591A JPH09294591A JP9044855A JP4485597A JPH09294591A JP H09294591 A JPH09294591 A JP H09294591A JP 9044855 A JP9044855 A JP 9044855A JP 4485597 A JP4485597 A JP 4485597A JP H09294591 A JPH09294591 A JP H09294591A
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- sucrose synthase
- sucrose
- recombinant
- escherichia coli
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- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 植物細胞由来のシュクロースシンターゼを大
腸菌等の原核細胞で実際に発現させること。 【解決手段】 植物細胞由来のシュクロースシンターゼ
遺伝子を含む大腸菌用の発現ベクターを作成し、該発現
ベクターを用いて大腸菌を形質転換して、該シュクロー
スシンターゼ遺伝子を大腸菌で発現させること、並びに
該組み換えシュクロースシンターゼを触媒として使用す
る非対称標識シュクロースの製造方法及び該方法によっ
て得られる非対称標識シュクロース。
腸菌等の原核細胞で実際に発現させること。 【解決手段】 植物細胞由来のシュクロースシンターゼ
遺伝子を含む大腸菌用の発現ベクターを作成し、該発現
ベクターを用いて大腸菌を形質転換して、該シュクロー
スシンターゼ遺伝子を大腸菌で発現させること、並びに
該組み換えシュクロースシンターゼを触媒として使用す
る非対称標識シュクロースの製造方法及び該方法によっ
て得られる非対称標識シュクロース。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、糖鎖が付加されて
いない、原核細胞由来の組み換えシュクロースシンター
ゼ、及びその製造方法等に関する。
いない、原核細胞由来の組み換えシュクロースシンター
ゼ、及びその製造方法等に関する。
【０００２】
【従来の技術】シュクロースシンターゼ(EC 2.4.1.13)
はシュクロースからＵＤＰにグルコース残基を転移し、
ＵＤＰ−グルコース及びフラクトースを合成する反応、
並びにその逆反応を触媒する酵素である。この酵素は、
広く植物組織に存在している。イネ種子やインゲン豆よ
り得られた該酵素は、分子量約１０万のサブユニット四
つから成る四量体として存在している。又、該酵素は糖
鎖付加の認識配列であるAsn-X-Thr を２か所有している
ので、糖タンパクであると推定される。従来、このよう
な植物由来のシュクロースシンターゼ遺伝子を大腸菌と
セルロース生産菌のシャトルベクターに組み込んで、得
られた発現ベクターを用いてセルロース生産菌を形質転
換し、セルロースの生産性向上を図った例はある(WO95/
32279)。
はシュクロースからＵＤＰにグルコース残基を転移し、
ＵＤＰ−グルコース及びフラクトースを合成する反応、
並びにその逆反応を触媒する酵素である。この酵素は、
広く植物組織に存在している。イネ種子やインゲン豆よ
り得られた該酵素は、分子量約１０万のサブユニット四
つから成る四量体として存在している。又、該酵素は糖
鎖付加の認識配列であるAsn-X-Thr を２か所有している
ので、糖タンパクであると推定される。従来、このよう
な植物由来のシュクロースシンターゼ遺伝子を大腸菌と
セルロース生産菌のシャトルベクターに組み込んで、得
られた発現ベクターを用いてセルロース生産菌を形質転
換し、セルロースの生産性向上を図った例はある(WO95/
32279)。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、植物細
胞由来のシュクロースシンターゼを大腸菌等の原核細胞
に組み込み、該酵素を実際に発現させた例はこれまで知
られていない。本発明者等は、今回、植物細胞由来のシ
ュクロースシンターゼ遺伝子を含む大腸菌用の発現ベク
ターを作成し、該発現ベクターを用いて大腸菌を形質転
換して、植物細胞由来のシュクロースシンターゼ遺伝子
を大腸菌で発現させることに成功し、本発明を完成させ
た。
胞由来のシュクロースシンターゼを大腸菌等の原核細胞
に組み込み、該酵素を実際に発現させた例はこれまで知
られていない。本発明者等は、今回、植物細胞由来のシ
ュクロースシンターゼ遺伝子を含む大腸菌用の発現ベク
ターを作成し、該発現ベクターを用いて大腸菌を形質転
換して、植物細胞由来のシュクロースシンターゼ遺伝子
を大腸菌で発現させることに成功し、本発明を完成させ
た。
【０００４】
【課題を解決するための手段】即ち、本発明は、原核細
胞由来の組み換えシュクロースシンターゼに係わるもの
である。原核細胞の例としては、大腸菌、枯草菌等があ
る。大腸菌の具体的な株としては、例えば、ＢＬ２１
株、ＨＢ１０１株、ＪＭ１０９株等の公知の株を使用で
きる。更に、本発明は、植物細胞由来のシュクロースシ
ンターゼ遺伝子を含む大腸菌用の発現ベクター、該発現
ベクターで形質転換された大腸菌、及び該形質転換され
た大腸菌を培養することから成る、組み換えシュクロー
スシンターゼの製造方法にも係わるものである。
胞由来の組み換えシュクロースシンターゼに係わるもの
である。原核細胞の例としては、大腸菌、枯草菌等があ
る。大腸菌の具体的な株としては、例えば、ＢＬ２１
株、ＨＢ１０１株、ＪＭ１０９株等の公知の株を使用で
きる。更に、本発明は、植物細胞由来のシュクロースシ
ンターゼ遺伝子を含む大腸菌用の発現ベクター、該発現
ベクターで形質転換された大腸菌、及び該形質転換され
た大腸菌を培養することから成る、組み換えシュクロー
スシンターゼの製造方法にも係わるものである。
【０００５】植物胞由来のシュクロースシンターゼ遺伝
子の或るものは、既にクローニングされ、その塩基配列
も決定されている。コーン（Plant Molecular Biology
10,215-224 (1987), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83,
9099-9103 (1986), EMBOJ.4, 1373-1380 (1985))、イネ
（Plant Molecular Biology 18, 139-142 (1992),Plant
Molecular Biology 18, 1191-1194 (1992), Plant Mol
ecular Biology 19, 881-885 (1992)）、ソラマメ（Pla
nta 191, 394-401 (1993)）、ポテト（Gene 60, 47-56
(1987) 、大麦 (E.J.B. 310, 46-50 (1992), E.J.B. 32
0, 177-181(1993)）、シロイヌナズナ（Plant Molecula
r Biology 18, 131-134 (1992)）、ダイズ（J.B.C. 26
2, 14780-14786 (1987)）などが報告されている。従っ
て、当業者であれば、適当な植物細胞由来のｃＤＮＡラ
イブラリーから、かかる公知の配列に基づいて、ＤＮＡ
オリゴマーから成るプライマーを作成し、ポリメラーゼ
連鎖反応(PCR) によって所望のシュクロースシンターゼ
遺伝子を増幅することによって容易に得ることが出来
る。或いは、コロニーハイブリダイゼーションを用い
て、サザン・ブロッテイングにより所望のシュクロース
シンターゼ遺伝子を選択することも可能である。尚、既
に述べたシュクロースシンターゼの活性を有する酵素を
コードしている限り、植物細胞由来のシュクロースシン
ターゼ遺伝子の全塩基配列の一部が欠損、置換及び付加
等されて、修飾されて得られた遺伝子も本発明の「シュ
クロースシンターゼ遺伝子」であり、それを発現させて
得られる、上記活性を有する酵素も本発明の「組み換え
シュクロースシンターゼ」である。
子の或るものは、既にクローニングされ、その塩基配列
も決定されている。コーン（Plant Molecular Biology
10,215-224 (1987), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83,
9099-9103 (1986), EMBOJ.4, 1373-1380 (1985))、イネ
（Plant Molecular Biology 18, 139-142 (1992),Plant
Molecular Biology 18, 1191-1194 (1992), Plant Mol
ecular Biology 19, 881-885 (1992)）、ソラマメ（Pla
nta 191, 394-401 (1993)）、ポテト（Gene 60, 47-56
(1987) 、大麦 (E.J.B. 310, 46-50 (1992), E.J.B. 32
0, 177-181(1993)）、シロイヌナズナ（Plant Molecula
r Biology 18, 131-134 (1992)）、ダイズ（J.B.C. 26
2, 14780-14786 (1987)）などが報告されている。従っ
て、当業者であれば、適当な植物細胞由来のｃＤＮＡラ
イブラリーから、かかる公知の配列に基づいて、ＤＮＡ
オリゴマーから成るプライマーを作成し、ポリメラーゼ
連鎖反応(PCR) によって所望のシュクロースシンターゼ
遺伝子を増幅することによって容易に得ることが出来
る。或いは、コロニーハイブリダイゼーションを用い
て、サザン・ブロッテイングにより所望のシュクロース
シンターゼ遺伝子を選択することも可能である。尚、既
に述べたシュクロースシンターゼの活性を有する酵素を
コードしている限り、植物細胞由来のシュクロースシン
ターゼ遺伝子の全塩基配列の一部が欠損、置換及び付加
等されて、修飾されて得られた遺伝子も本発明の「シュ
クロースシンターゼ遺伝子」であり、それを発現させて
得られる、上記活性を有する酵素も本発明の「組み換え
シュクロースシンターゼ」である。
【０００６】本発明に使用しうる大腸菌用の発現ベクタ
ーとしては、公知のプラスミドベクター、例えば、pET2
0b(+) 、pKK233-2等である。該大腸菌用の発現ベクター
への植物胞由来のシュクロースシンターゼ遺伝子の組み
込みは、適当な制限酵素を使用して、行うことが出来
る。発現効率の向上等の目的で、かかる発現ベクターは
選択マーカー等の各種調節領域ＤＮＡ組み込む等して、
適宜、修飾することも可能である。該発現ベクターによ
る大腸菌の形質転換は、電気パルス法、リン酸カルシウ
ム法等従来公知のいかなる方法によっても実施すること
が出来る。このようにして形質転換された大腸菌は、当
業者に公知の適当な培養・発現条件下で培養し、本発明
の組み換えシュクロースシンターゼを製造することがで
きる。尚、製造された組み換えシュクロースシンターゼ
は、磨砕、ビーズミル、ホモジュナイザー、超音波、高
圧破砕、又はリゾチーム等の溶菌酵素及びＳＤＳ等の界
面活性剤による溶菌処理、硫安沈殿、及びゲル濾過等を
任意に組み合わせた当業者には公知の適当な方法で精製
することが出来る。
ーとしては、公知のプラスミドベクター、例えば、pET2
0b(+) 、pKK233-2等である。該大腸菌用の発現ベクター
への植物胞由来のシュクロースシンターゼ遺伝子の組み
込みは、適当な制限酵素を使用して、行うことが出来
る。発現効率の向上等の目的で、かかる発現ベクターは
選択マーカー等の各種調節領域ＤＮＡ組み込む等して、
適宜、修飾することも可能である。該発現ベクターによ
る大腸菌の形質転換は、電気パルス法、リン酸カルシウ
ム法等従来公知のいかなる方法によっても実施すること
が出来る。このようにして形質転換された大腸菌は、当
業者に公知の適当な培養・発現条件下で培養し、本発明
の組み換えシュクロースシンターゼを製造することがで
きる。尚、製造された組み換えシュクロースシンターゼ
は、磨砕、ビーズミル、ホモジュナイザー、超音波、高
圧破砕、又はリゾチーム等の溶菌酵素及びＳＤＳ等の界
面活性剤による溶菌処理、硫安沈殿、及びゲル濾過等を
任意に組み合わせた当業者には公知の適当な方法で精製
することが出来る。
【０００７】更に、本発明は、組み換えシュクロースシ
ンターゼを触媒として使用する、非対称標識シュクロー
スの製造方法及び該方法によって得られる非対称標識シ
ュクロースにも係わるものである。該方法によれば、原
料となるグルコース又はフラクトースのいずれか一方
を、例えば、〔14Ｃ〕等の放射性物質等で標識し、それ
を用いて本発明の組み換えシュクロースシンターゼの触
媒作用下に反応させることによって、従来の化学合成法
に比べて、より簡便、経済的且つ効率良く非対称標識シ
ュクロース、即ち、グルコース又はフラクトースのいず
れか一方のみが〔14Ｃ〕等の放射性物質等で標識された
シュクロースを製造することが出来る。該製造方法に用
いる組み換えシュクロースシンターゼ酵素は上記のよう
に精製した酵素をそのまま反応系で使用するか、又は、
該酵素の回収及び安定化を図るために、担体結合法、包
括固定化法、架橋固定化法、及び複合固体化法等の公知
の方法により酵素を適当な担体に固定化してバイオリア
クターを構成することも出来る。非対称標識シュクロー
スの製造に際して、各出発物質の濃度、反応溶液の緩衝
剤の種類及び濃度、その他の共存イオンの種類及びその
強度、反応温度、反応時間並びに目的物質の分離・精製
手段等の反応の各種反応条件は当業者が反応様式等を考
慮して適宜設定することが出来る。
ンターゼを触媒として使用する、非対称標識シュクロー
スの製造方法及び該方法によって得られる非対称標識シ
ュクロースにも係わるものである。該方法によれば、原
料となるグルコース又はフラクトースのいずれか一方
を、例えば、〔14Ｃ〕等の放射性物質等で標識し、それ
を用いて本発明の組み換えシュクロースシンターゼの触
媒作用下に反応させることによって、従来の化学合成法
に比べて、より簡便、経済的且つ効率良く非対称標識シ
ュクロース、即ち、グルコース又はフラクトースのいず
れか一方のみが〔14Ｃ〕等の放射性物質等で標識された
シュクロースを製造することが出来る。該製造方法に用
いる組み換えシュクロースシンターゼ酵素は上記のよう
に精製した酵素をそのまま反応系で使用するか、又は、
該酵素の回収及び安定化を図るために、担体結合法、包
括固定化法、架橋固定化法、及び複合固体化法等の公知
の方法により酵素を適当な担体に固定化してバイオリア
クターを構成することも出来る。非対称標識シュクロー
スの製造に際して、各出発物質の濃度、反応溶液の緩衝
剤の種類及び濃度、その他の共存イオンの種類及びその
強度、反応温度、反応時間並びに目的物質の分離・精製
手段等の反応の各種反応条件は当業者が反応様式等を考
慮して適宜設定することが出来る。
【０００８】
【発明の実施の形態】以下、本発明の最良の実施の形態
を示す実施例により、本発明をより詳細に説明するが、
これらの実施例は本発明を何等限定するものではない。
を示す実施例により、本発明をより詳細に説明するが、
これらの実施例は本発明を何等限定するものではない。
【０００９】実施例１ シュクロースシンターゼ遺伝子
によって形質転換された大腸菌シュクロースシンターゼ
の製造 マング豆(Vigna radiata）をバーミキュライトに植えて
発芽させた幼苗の胚軸の組織よりｍＲＮＡを調製し、ｃ
ＤＮＡを作成した。２０ｇの胚軸を５０ｍＭトリス塩酸
塩（ｐＨ８．５）と１％ＳＤＳの１００mlと、同量の９
０％フェノールとともに破砕し、その遠心上層を再びフ
ェノール／クロロホルム（１：１）で洗浄し、ｐＨを５
にあわせた。ＲＮＡは０．６倍量のイソプロパノールと
ともに−２０℃で沈澱させ回収し、少量の水に溶かして
２０分の１量の６Ｍ塩化リチウムと２．５倍量のエタノ
ールで再沈澱させ、２回繰り返した。得られた精製ＲＮ
Ａをオリゴｄ（Ｔ）セルロースクロマトグラフィーによ
りｍＲＮＡを調製した。ｃＤＮＡはアマシャム社のｃＤ
ＮＡ合成キットを用いて作成した。一方、既に報告され
ているマング豆のシュクロースシンターゼｃＤＮＡの塩
基配列（Arai等、Plant Cell Physiology 、33巻、 503
頁 (1992年））をもとに、以下の２種類のＤＮＡオリゴ
マーを合成した。 １．ＴＧＧＣＴＡＣＣＧＡＴＣＧＴＴＴＧＡＣＣ ２．ＴＣＴＣＧＧＴＣＧＡＣＡＡＧＣＣＧＧＴＴＣＣＴ
ＣＣＡＴＴＴＣＴＴＣＡＴＣＣ
によって形質転換された大腸菌シュクロースシンターゼ
の製造 マング豆(Vigna radiata）をバーミキュライトに植えて
発芽させた幼苗の胚軸の組織よりｍＲＮＡを調製し、ｃ
ＤＮＡを作成した。２０ｇの胚軸を５０ｍＭトリス塩酸
塩（ｐＨ８．５）と１％ＳＤＳの１００mlと、同量の９
０％フェノールとともに破砕し、その遠心上層を再びフ
ェノール／クロロホルム（１：１）で洗浄し、ｐＨを５
にあわせた。ＲＮＡは０．６倍量のイソプロパノールと
ともに−２０℃で沈澱させ回収し、少量の水に溶かして
２０分の１量の６Ｍ塩化リチウムと２．５倍量のエタノ
ールで再沈澱させ、２回繰り返した。得られた精製ＲＮ
Ａをオリゴｄ（Ｔ）セルロースクロマトグラフィーによ
りｍＲＮＡを調製した。ｃＤＮＡはアマシャム社のｃＤ
ＮＡ合成キットを用いて作成した。一方、既に報告され
ているマング豆のシュクロースシンターゼｃＤＮＡの塩
基配列（Arai等、Plant Cell Physiology 、33巻、 503
頁 (1992年））をもとに、以下の２種類のＤＮＡオリゴ
マーを合成した。 １．ＴＧＧＣＴＡＣＣＧＡＴＣＧＴＴＴＧＡＣＣ ２．ＴＣＴＣＧＧＴＣＧＡＣＡＡＧＣＣＧＧＴＴＣＣＴ
ＣＣＡＴＴＴＣＴＴＣＡＴＣＣ
【００１０】これらのＤＮＡオリゴマーをプライマーと
して用い、マング豆より調製したｃＤＮＡからＰＣＲ
（ポリメラーゼ連鎖反応）によりシュクロースシンター
ゼ遺伝子を増幅した。増幅されたＤＮＡを制限酵素Ｓａ
ｌＩで処理した。一方、大腸菌用の発現プラスミドベク
ターであるｐＥＴ２０ｂ（＋）をＮｄｅＩで処理し、ク
レノウフラグメントにより末端平滑化を行った後、Ｓａ
ｌＩで処理した。この処理したｐＥＴベクターをＳａｌ
Ｉ処理したｃＤＮＡ断片と連結して発現ベクターｐＥＢ
−０１を作成し、これを大腸菌ＢＬ２１株に電気パルス
法で導入して、該大腸菌株を形質転換して、目的のプラ
スミドを持つ形質転換株を選択した。ＬＢ培地中で３７
℃にてこの株を培養してＩＰＴＧ（イソプロピル−チオ
−β−Ｄ−ガラクトシド）によりシュクロースシンター
ゼ遺伝子の発現を行った。次に、こうして得られた形質
転換大腸菌を２５ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．
５）（０．１ｍＭ ＥＤＴＡ及び１０．１ｍＭ ＤＴＴ
を含む）で超音波で破砕し、遠心して上清を取った。上
清に硫酸アンモニウムを加え（６５％）、蛋白質を沈澱
させた。この沈殿物を０．０３Ｍ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ
（ｐＨ７．５）（０．１５Ｍ ＮａＣｌ，０．１ｍＭ
ＥＤＴＡ及び１０．１ｍＭ ＤＴＴを含む）中に懸濁さ
せてた後、再び遠心して上清を取った。この上清を、Ｆ
ＰＬＣシステム（ファーマシア）の一部である、同じＴ
ｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液で平衡化させたスーパーロース(S
uperose)６ゲル濾過カラム（1.0 X 30cm、ファーマシ
ア）にかけ、流速０．３mlで流した。得られた活性分画
は−８５℃で保存した。以降の実験には、この蛋白質を
２５ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）に溶かした
ものを酵素標品として用いた。又、このように形質転換
大腸菌から調製した酵素標品をそれぞれＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ（ゲル濃度５％）にかけた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、ニ
トロセルロースミンブランに転写後、ＥＣＬウェスタン
ブロッティング検出システムキット（アマシャム社製）
によって発色させた。その結果、シュクロースシンター
ゼに該当する分子量のバンドが検出され、単量体の分子
量は約９０ｋＤａ、二量体の分子量は約１８０ｋＤａ、
四量体の分子量約３６０ｋＤａと測定された。この実験
事実から、形質転換大腸菌の菌体内に大量にシュクロー
スシンターゼが蓄積したことが認められた。
して用い、マング豆より調製したｃＤＮＡからＰＣＲ
（ポリメラーゼ連鎖反応）によりシュクロースシンター
ゼ遺伝子を増幅した。増幅されたＤＮＡを制限酵素Ｓａ
ｌＩで処理した。一方、大腸菌用の発現プラスミドベク
ターであるｐＥＴ２０ｂ（＋）をＮｄｅＩで処理し、ク
レノウフラグメントにより末端平滑化を行った後、Ｓａ
ｌＩで処理した。この処理したｐＥＴベクターをＳａｌ
Ｉ処理したｃＤＮＡ断片と連結して発現ベクターｐＥＢ
−０１を作成し、これを大腸菌ＢＬ２１株に電気パルス
法で導入して、該大腸菌株を形質転換して、目的のプラ
スミドを持つ形質転換株を選択した。ＬＢ培地中で３７
℃にてこの株を培養してＩＰＴＧ（イソプロピル−チオ
−β−Ｄ−ガラクトシド）によりシュクロースシンター
ゼ遺伝子の発現を行った。次に、こうして得られた形質
転換大腸菌を２５ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．
５）（０．１ｍＭ ＥＤＴＡ及び１０．１ｍＭ ＤＴＴ
を含む）で超音波で破砕し、遠心して上清を取った。上
清に硫酸アンモニウムを加え（６５％）、蛋白質を沈澱
させた。この沈殿物を０．０３Ｍ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ
（ｐＨ７．５）（０．１５Ｍ ＮａＣｌ，０．１ｍＭ
ＥＤＴＡ及び１０．１ｍＭ ＤＴＴを含む）中に懸濁さ
せてた後、再び遠心して上清を取った。この上清を、Ｆ
ＰＬＣシステム（ファーマシア）の一部である、同じＴ
ｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液で平衡化させたスーパーロース(S
uperose)６ゲル濾過カラム（1.0 X 30cm、ファーマシ
ア）にかけ、流速０．３mlで流した。得られた活性分画
は−８５℃で保存した。以降の実験には、この蛋白質を
２５ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）に溶かした
ものを酵素標品として用いた。又、このように形質転換
大腸菌から調製した酵素標品をそれぞれＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ（ゲル濃度５％）にかけた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、ニ
トロセルロースミンブランに転写後、ＥＣＬウェスタン
ブロッティング検出システムキット（アマシャム社製）
によって発色させた。その結果、シュクロースシンター
ゼに該当する分子量のバンドが検出され、単量体の分子
量は約９０ｋＤａ、二量体の分子量は約１８０ｋＤａ、
四量体の分子量約３６０ｋＤａと測定された。この実験
事実から、形質転換大腸菌の菌体内に大量にシュクロー
スシンターゼが蓄積したことが認められた。
【００１１】 実施例２ Ｎ末端５残基を欠損したプラスミドの構築 １．ＴＧＴＴＧＡＣＣＣＧＴＧＴＴＣＡＣＡＧＴＣＴＣ
Ｃ ２．ＴＣＴＣＧＧＴＣＧＡＣＡＡＧＣＣＧＧＴＴＣＣＴ
ＣＣＡＴＴＴＣＴＴＣＡＴＣＣ これらプライマーを用いて、実施例１と同様に、シュク
ロースシンターゼのＮ末端５残基の欠損したｃＤＮＡを
ｐＥＴ２０ｂ（＋）に導入した。こうして得られた発現
プラスミドベクターを用いて、実施例１と同様に、大腸
菌ＢＬ２１株を形質転換株し、Ｎ末端５残基の欠損した
本発明のシュクロースシンターゼを発現させ、実施例１
と同様に、形質転換大腸菌の菌体内に蓄積したことを確
認した。
Ｃ ２．ＴＣＴＣＧＧＴＣＧＡＣＡＡＧＣＣＧＧＴＴＣＣＴ
ＣＣＡＴＴＴＣＴＴＣＡＴＣＣ これらプライマーを用いて、実施例１と同様に、シュク
ロースシンターゼのＮ末端５残基の欠損したｃＤＮＡを
ｐＥＴ２０ｂ（＋）に導入した。こうして得られた発現
プラスミドベクターを用いて、実施例１と同様に、大腸
菌ＢＬ２１株を形質転換株し、Ｎ末端５残基の欠損した
本発明のシュクロースシンターゼを発現させ、実施例１
と同様に、形質転換大腸菌の菌体内に蓄積したことを確
認した。
【００１２】実施例３ 形質転換大腸菌から抽出したシ
ュクロースシンターゼによるＵＤＰ−グルコース合成の
タイムコース 反応系（最終濃度） ２ｍＭ〔14Ｃ〕シュクロース（２×１０5 cpm) １０ｍＭ ＵＤＰ ２５ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．５ 酵素標品（蛋白量 約５０mg） 上記の反応系の全量２０μl を３０℃で一定時間インキ
ュベイトした後、 1/4量をワットマン３ＭＭ濾紙に２cm
間隔にスポットした後、５０ｍＭホウ酸ナトリウムバッ
ファー（ｐＨ９．５）にて２００Ｖ、２時間通電した。
その後、オートラジオグラフィを行い、各時間経過後の
ＵＤＰ−グルコース画分の放射能を測定した。その結
果、実施例１で得られた形質転換大腸菌由来の酵素標品
を使用した場合には、ＵＤＰ−グルコースが生成したこ
とが確認された。該酵素標品の比活性は１０-3Ｕ／mg p
r.であった。実施例２で得られたＮ末端５残基の欠損し
た本発明の組み換えシュクロースシンターゼを酵素標品
として使用して同様な実験をしたところ、ＵＤＰ−グル
コースが生成したことが確認された。
ュクロースシンターゼによるＵＤＰ−グルコース合成の
タイムコース 反応系（最終濃度） ２ｍＭ〔14Ｃ〕シュクロース（２×１０5 cpm) １０ｍＭ ＵＤＰ ２５ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．５ 酵素標品（蛋白量 約５０mg） 上記の反応系の全量２０μl を３０℃で一定時間インキ
ュベイトした後、 1/4量をワットマン３ＭＭ濾紙に２cm
間隔にスポットした後、５０ｍＭホウ酸ナトリウムバッ
ファー（ｐＨ９．５）にて２００Ｖ、２時間通電した。
その後、オートラジオグラフィを行い、各時間経過後の
ＵＤＰ−グルコース画分の放射能を測定した。その結
果、実施例１で得られた形質転換大腸菌由来の酵素標品
を使用した場合には、ＵＤＰ−グルコースが生成したこ
とが確認された。該酵素標品の比活性は１０-3Ｕ／mg p
r.であった。実施例２で得られたＮ末端５残基の欠損し
た本発明の組み換えシュクロースシンターゼを酵素標品
として使用して同様な実験をしたところ、ＵＤＰ−グル
コースが生成したことが確認された。
【００１３】実施例４ 形質転換大腸菌から抽出したシ
ュクロースシンターゼによる非対称標識シュクロースの
合成 反応系１：グルコース標識非対称シュクロース （最終
濃度） ２μＭ ＵＤＰ−〔14Ｃ〕グルコース（２nCi) ５０ｍＭ フラクトース １０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．５ 酵素標品（蛋白量 約７．５μｇ） 反応系２：フラクトース標識非対称シュクロース （最
終濃度） １６．７μＭ 〔14Ｃ〕フラクトース（１００nCi) ５０ｍＭ ＵＤＰ−グルクース ５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．５ 酵素標品（蛋白量 約７．５μｇ） 上記の反応系の全量２０μl を３０℃で１０分間インキ
ュベイトした後、 1/4量をワットマン３ＭＭ濾紙に２cm
間隔にスポットした後、５０ｍＭホウ酸ナトリウムバッ
ファー（ｐＨ９．６）にて２５０Ｖ、３時間通電して電
気泳動させた。その後、該濾紙を乾燥させ、オートラジ
オグラフィ（Fujix Bio-imaging analyzer Bas2000, 富
士フィルム株式会社）を行った。その結果、放射活性を
有する画分と標準シュクロースの移動度はほぼ等しいこ
とが確認された。そこで、該濾紙上のシュクロースに対
応する領域を切り出して水で溶出した。得られた水溶液
をダウエックス５０Ｗ（Ｈ+ 型、ダウケミカルカンパニ
ー）で処理し、ナトリウムイオンを除去した。又、ホウ
酸イオンはメタノールと共に繰り返し蒸留することによ
って除去した。こうして得られた放射活性試料を０．０
１Ｎのトリフルオロ酢酸中にて１００℃で３０分間処理
して加水分解させ、トリフルオロ酢酸は減圧蒸留にて除
去した。抗して得られた試料を１−プロパノール／酢酸
エチル／水（３：３：１）でペーパークロマトグラフィ
にかけ、Ｘ線フィルムに感光させた。その結果、ペーパ
ークロマトグラフィに於いても、放射活性を有する画分
と標準シュクロースの移動度はほぼ等しく、又、該放射
活性試料を加水分解して得られた画分は標準グルコース
及びフラクトースの移動度にほぼ等しいことが確認され
た。尚、対照となる各種標準糖類はアルカリ性硝酸銀で
処理して各クロマトグラム上で検出した。上記各反応系
に於ける非対称標識シュクロースの触媒合成のタイムコ
ースを図３及び図４に示す。いずれの反応系において
も、約８０％の放射活性が合成された非対称標識シュク
ロース内に回収されたことが判る。
ュクロースシンターゼによる非対称標識シュクロースの
合成 反応系１：グルコース標識非対称シュクロース （最終
濃度） ２μＭ ＵＤＰ−〔14Ｃ〕グルコース（２nCi) ５０ｍＭ フラクトース １０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．５ 酵素標品（蛋白量 約７．５μｇ） 反応系２：フラクトース標識非対称シュクロース （最
終濃度） １６．７μＭ 〔14Ｃ〕フラクトース（１００nCi) ５０ｍＭ ＵＤＰ−グルクース ５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．５ 酵素標品（蛋白量 約７．５μｇ） 上記の反応系の全量２０μl を３０℃で１０分間インキ
ュベイトした後、 1/4量をワットマン３ＭＭ濾紙に２cm
間隔にスポットした後、５０ｍＭホウ酸ナトリウムバッ
ファー（ｐＨ９．６）にて２５０Ｖ、３時間通電して電
気泳動させた。その後、該濾紙を乾燥させ、オートラジ
オグラフィ（Fujix Bio-imaging analyzer Bas2000, 富
士フィルム株式会社）を行った。その結果、放射活性を
有する画分と標準シュクロースの移動度はほぼ等しいこ
とが確認された。そこで、該濾紙上のシュクロースに対
応する領域を切り出して水で溶出した。得られた水溶液
をダウエックス５０Ｗ（Ｈ+ 型、ダウケミカルカンパニ
ー）で処理し、ナトリウムイオンを除去した。又、ホウ
酸イオンはメタノールと共に繰り返し蒸留することによ
って除去した。こうして得られた放射活性試料を０．０
１Ｎのトリフルオロ酢酸中にて１００℃で３０分間処理
して加水分解させ、トリフルオロ酢酸は減圧蒸留にて除
去した。抗して得られた試料を１−プロパノール／酢酸
エチル／水（３：３：１）でペーパークロマトグラフィ
にかけ、Ｘ線フィルムに感光させた。その結果、ペーパ
ークロマトグラフィに於いても、放射活性を有する画分
と標準シュクロースの移動度はほぼ等しく、又、該放射
活性試料を加水分解して得られた画分は標準グルコース
及びフラクトースの移動度にほぼ等しいことが確認され
た。尚、対照となる各種標準糖類はアルカリ性硝酸銀で
処理して各クロマトグラム上で検出した。上記各反応系
に於ける非対称標識シュクロースの触媒合成のタイムコ
ースを図３及び図４に示す。いずれの反応系において
も、約８０％の放射活性が合成された非対称標識シュク
ロース内に回収されたことが判る。
【図１】 発現ベクターｐＥＢ−０１の作成の過程を示
す。
す。
【図２】 形質転換大腸菌から抽出したシュクロースシ
ンターゼによるＵＤＰ−グルコース合成のタイムコース
を示す。
ンターゼによるＵＤＰ−グルコース合成のタイムコース
を示す。
【図３】 形質転換大腸菌から抽出したシュクロースシ
ンターゼによるＵＤＰ−〔14Ｃ〕グルコース（白丸）か
らの非対称標識シュクロース（黒丸）の合成のタイムコ
ースを示す。
ンターゼによるＵＤＰ−〔14Ｃ〕グルコース（白丸）か
らの非対称標識シュクロース（黒丸）の合成のタイムコ
ースを示す。
【図４】 形質転換大腸菌から抽出したシュクロースシ
ンターゼによる〔14Ｃ〕フラクトース（白丸）からの非
対称標識シュクロース（黒丸）の合成のタイムコースを
示す。
ンターゼによる〔14Ｃ〕フラクトース（白丸）からの非
対称標識シュクロース（黒丸）の合成のタイムコースを
示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/88 Ｃ１２Ｒ 1:19）
Claims (7)
- 【請求項１】 原核細胞由来の組み換えシュクロースシ
ンターゼ。 - 【請求項２】 原核細胞が大腸菌である、請求項１記載
の組み換えシュクロースシンターゼ。 - 【請求項３】 植物細胞由来のシュクロースシンターゼ
遺伝子を含む大腸菌用の発現ベクター。 - 【請求項４】 請求項３に記載の発現ベクターで形質転
換された大腸菌。 - 【請求項５】 請求項４に記載の形質転換された大腸菌
を培養することから成る、請求項２に記載の組み換えシ
ュクロースシンターゼの製造方法。 - 【請求項６】 請求項１又は２に記載の組み換えシュク
ロースシンターゼを触媒として使用する、非対称標識シ
ュクロースの製造方法。 - 【請求項７】 請求項６に記載の製造方法で得られる非
対称標識シュクロース。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9044855A JPH09294591A (ja) | 1996-03-07 | 1997-02-14 | 組み換えシュクロースシンターゼ |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7810696 | 1996-03-07 | ||
| JP8-78106 | 1996-03-07 | ||
| JP9044855A JPH09294591A (ja) | 1996-03-07 | 1997-02-14 | 組み換えシュクロースシンターゼ |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09294591A true JPH09294591A (ja) | 1997-11-18 |
Family
ID=26384826
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9044855A Ceased JPH09294591A (ja) | 1996-03-07 | 1997-02-14 | 組み換えシュクロースシンターゼ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH09294591A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115927236A (zh) * | 2022-09-23 | 2023-04-07 | 重庆工商大学 | 一种蛋白SUS2、基因sus2、重组表达载体、转化体及其制药用途 |
-
1997
- 1997-02-14 JP JP9044855A patent/JPH09294591A/ja not_active Ceased
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115927236A (zh) * | 2022-09-23 | 2023-04-07 | 重庆工商大学 | 一种蛋白SUS2、基因sus2、重组表达载体、转化体及其制药用途 |
| CN115927236B (zh) * | 2022-09-23 | 2024-05-24 | 重庆工商大学 | 一种蛋白SUS2、基因sus2、重组表达载体、转化体及其制药用途 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20060215 |
|
| A761 | Written withdrawal of application |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A761 Effective date: 20060619 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20060711 |
|
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Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971092 Effective date: 20061128 |