JPH11299486A - 改変型酵素及びそれを用いた製造法 - Google Patents
改変型酵素及びそれを用いた製造法Info
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- JPH11299486A JPH11299486A JP10114907A JP11490798A JPH11299486A JP H11299486 A JPH11299486 A JP H11299486A JP 10114907 A JP10114907 A JP 10114907A JP 11490798 A JP11490798 A JP 11490798A JP H11299486 A JPH11299486 A JP H11299486A
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- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
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- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】アリールマロン酸脱炭酸酵素の触媒活性・耐熱
性の向上等の諸性質の改良が求められていた。 【解決手段】野生型アリールマロン酸脱炭酸酵素のアミ
ノ酸配列４５番目のプロリン残基がロイシン残基に置換
されている改変型アリールマロン酸脱炭酸酵素。また改
変型アリールマロン酸脱炭酸酵素を用いて、α−フェニ
ル−α−メチルマロン酸から光学活性なα−フェニルプ
ロピオン酸を製造する。
性の向上等の諸性質の改良が求められていた。 【解決手段】野生型アリールマロン酸脱炭酸酵素のアミ
ノ酸配列４５番目のプロリン残基がロイシン残基に置換
されている改変型アリールマロン酸脱炭酸酵素。また改
変型アリールマロン酸脱炭酸酵素を用いて、α−フェニ
ル−α−メチルマロン酸から光学活性なα−フェニルプ
ロピオン酸を製造する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は新規なアリールマロ
ン酸脱炭酸酵素及びそれを用いた製造法に関するもので
ある。
ン酸脱炭酸酵素及びそれを用いた製造法に関するもので
ある。
【０００２】
【従来の技術】光学活性アリールアルカン酸は強電磁液
晶や医農薬の合成中間体として有用な化合物である。従
来、二置換マロン酸誘導体を原料に不斉脱炭酸反応を行
い、光学活性アリールアルカン酸を高い収率で得る方法
は知られていなかったが、アリールマロン酸脱炭酸酵素
（以下、ＡＭＤａｓｅと略記する）の発見により容易に
得られるようになった（特開平５−１７６６７７８号公
報）。その後、この酵素は性質が詳細に解析され（特開
平５−２２７９６３号公報、特開平５−２８４９８１号
公報）、また本酵素を用いるフッ素含有α- アリールア
ルカン酸化合物の合成方法も開示される様になった（特
開平５- ２６０９８３号公報）。さらには本酵素の大量
生産のために大腸菌への遺伝子のクローニングも成さ
れ、また、この酵素のアミノ酸配列も明らかにされた
（特開平５−３２８９７６号公報）。ＡＭＤａｓｅのア
ミノ酸配列は、特開平５−３２８９７６及び９−２２４
６７５に記載された通りである。
晶や医農薬の合成中間体として有用な化合物である。従
来、二置換マロン酸誘導体を原料に不斉脱炭酸反応を行
い、光学活性アリールアルカン酸を高い収率で得る方法
は知られていなかったが、アリールマロン酸脱炭酸酵素
（以下、ＡＭＤａｓｅと略記する）の発見により容易に
得られるようになった（特開平５−１７６６７７８号公
報）。その後、この酵素は性質が詳細に解析され（特開
平５−２２７９６３号公報、特開平５−２８４９８１号
公報）、また本酵素を用いるフッ素含有α- アリールア
ルカン酸化合物の合成方法も開示される様になった（特
開平５- ２６０９８３号公報）。さらには本酵素の大量
生産のために大腸菌への遺伝子のクローニングも成さ
れ、また、この酵素のアミノ酸配列も明らかにされた
（特開平５−３２８９７６号公報）。ＡＭＤａｓｅのア
ミノ酸配列は、特開平５−３２８９７６及び９−２２４
６７５に記載された通りである。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】ところで、近年の遺伝
子工学技術の進歩により、タンパク質アミノ酸配列を人
為的に改変することによって、蛋白質の持つ諸性質を、
より工業的に使用しやすく改変することが可能になって
きた。例えばアスパルテーム前駆体合成に利用される酵
素であるサーモリシンのアミノ酸配列を人為的に改変す
ることにより触媒活性を向上させるような発明が成され
ている（特開平６−１８１７６１号公報）。ＡＭＤａｓ
ｅにおいても、よりアリールアルカン酸の生産性を向上
させるため、触媒活性の向上等の諸性質の改良が求めら
れていた。そのために、ＡＭＤａｓｅの１０１番目のシ
ステイン残基を他のアミノ酸に置換することにより、フ
ェニルマロン酸の脱炭酸に対する触媒活性が向上された
変異体が作製されている（特開平９−２２４６７５）。
当該出願の変異型ＡＭＤａｓｅにおいてはフェニルマロ
ン酸などに対する活性について開示されているが、さら
に触媒活性の向上や耐熱性の向上が求められていた。
子工学技術の進歩により、タンパク質アミノ酸配列を人
為的に改変することによって、蛋白質の持つ諸性質を、
より工業的に使用しやすく改変することが可能になって
きた。例えばアスパルテーム前駆体合成に利用される酵
素であるサーモリシンのアミノ酸配列を人為的に改変す
ることにより触媒活性を向上させるような発明が成され
ている（特開平６−１８１７６１号公報）。ＡＭＤａｓ
ｅにおいても、よりアリールアルカン酸の生産性を向上
させるため、触媒活性の向上等の諸性質の改良が求めら
れていた。そのために、ＡＭＤａｓｅの１０１番目のシ
ステイン残基を他のアミノ酸に置換することにより、フ
ェニルマロン酸の脱炭酸に対する触媒活性が向上された
変異体が作製されている（特開平９−２２４６７５）。
当該出願の変異型ＡＭＤａｓｅにおいてはフェニルマロ
ン酸などに対する活性について開示されているが、さら
に触媒活性の向上や耐熱性の向上が求められていた。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは特開平５−
３２８９７６号公報に開示されているＡＭＤａｓｅのア
ミノ酸配列およびＤＮＡ塩基配列を元に、種々の変異体
を作製し、その諸性質を詳細に解析した結果、本発明を
完成するに至った。
３２８９７６号公報に開示されているＡＭＤａｓｅのア
ミノ酸配列およびＤＮＡ塩基配列を元に、種々の変異体
を作製し、その諸性質を詳細に解析した結果、本発明を
完成するに至った。
【０００５】即ち本発明は、野生型アリールマロン酸脱
炭酸酵素のアミノ酸配列４５番目のプロリン残基が他の
アミノ酸残基に置換されていることを特徴とする、改変
型アリールマロン酸脱炭酸酵素である。また本発明は、
一般式［Ｉ］
炭酸酵素のアミノ酸配列４５番目のプロリン残基が他の
アミノ酸残基に置換されていることを特徴とする、改変
型アリールマロン酸脱炭酸酵素である。また本発明は、
一般式［Ｉ］
【０００６】
【化３】
【０００７】（式中、Ａｒはアリール基を示し、Ｒは水
素原子またはメチル基を示す）で表される化合物を、前
述の改変型アリールマロン酸脱炭酸酵素と接触させるこ
とを特徴とする、一般式［ＩＩ］
素原子またはメチル基を示す）で表される化合物を、前
述の改変型アリールマロン酸脱炭酸酵素と接触させるこ
とを特徴とする、一般式［ＩＩ］
【０００８】
【化４】
【０００９】（式中、Ａｒ及びＲは前述と同様のものを
示す）で表される化合物の製造法である。以下、本発明
をさらに詳細に説明する。
示す）で表される化合物の製造法である。以下、本発明
をさらに詳細に説明する。
【００１０】本発明の変異型ＡＭＤａｓｅは、野生型Ａ
ＭＤａｓｅのアミノ酸配列４５番目のプロリン残基が他
のアミノ酸残基に置換されている。４５番目のプロリン
残基を置換するアミノ酸としては特に限定は無いが、疎
水性アミノ酸が好ましく、特にロイシンが好ましい。４
５番目のプロリンがロイシンに置換された場合は、野生
型ＡＭＤａｓｅと比較して、α−フェニル−α−メチル
マロン酸の脱炭酸反応に対する活性が３割以上向上し、
またＴ1/2が３℃程度向上される。なおＴ1/2とは、ＡＭ
ＤａｓｅをｐＨ８．５で３０分間保温した場合に５０％
の酵素が失活する温度である。
ＭＤａｓｅのアミノ酸配列４５番目のプロリン残基が他
のアミノ酸残基に置換されている。４５番目のプロリン
残基を置換するアミノ酸としては特に限定は無いが、疎
水性アミノ酸が好ましく、特にロイシンが好ましい。４
５番目のプロリンがロイシンに置換された場合は、野生
型ＡＭＤａｓｅと比較して、α−フェニル−α−メチル
マロン酸の脱炭酸反応に対する活性が３割以上向上し、
またＴ1/2が３℃程度向上される。なおＴ1/2とは、ＡＭ
ＤａｓｅをｐＨ８．５で３０分間保温した場合に５０％
の酵素が失活する温度である。
【００１１】本発明の変異型ＡＭＤａｓｅの製造法には
特に限定はなく、任意の公知の方法を実施することが可
能であり、最終的に目的とする変異型ＡＭＤａｓｅが得
られればその製造方法は問わないものである。例えば、
野生型ＡＭＤａｓｅを化学的方法で直接改変することも
可能である。また、変異型ＡＭＤａｓｅに相当する遺伝
子を、野生型ＡＭＤａｓｅへの点突然変異の導入または
完全化学合成により作成し、その遺伝子で形質転換され
た任意の細胞に生産させる事も可能である。なお、本発
明の変異型ＡＭＤａｓｅは、野生型ＡＭＤａｓｅの４５
番目に相当するアミノ酸残基が他のアミノ酸に置換され
ていれば良く、その他のアミノ酸配列が一部欠損・挿入
がされていても、また他の部位にアミノ酸置換が行われ
ていても本発明の範囲内である。
特に限定はなく、任意の公知の方法を実施することが可
能であり、最終的に目的とする変異型ＡＭＤａｓｅが得
られればその製造方法は問わないものである。例えば、
野生型ＡＭＤａｓｅを化学的方法で直接改変することも
可能である。また、変異型ＡＭＤａｓｅに相当する遺伝
子を、野生型ＡＭＤａｓｅへの点突然変異の導入または
完全化学合成により作成し、その遺伝子で形質転換され
た任意の細胞に生産させる事も可能である。なお、本発
明の変異型ＡＭＤａｓｅは、野生型ＡＭＤａｓｅの４５
番目に相当するアミノ酸残基が他のアミノ酸に置換され
ていれば良く、その他のアミノ酸配列が一部欠損・挿入
がされていても、また他の部位にアミノ酸置換が行われ
ていても本発明の範囲内である。
【００１２】本発明では、このような変異型ＡＭＤａｓ
ｅを一般式［Ｉ］で表される化合物と接触させることに
より、一般式［ＩＩ］で表される化合物を製造すること
ができる。一般式［Ｉ］［ＩＩ］において、Ｒは水素原
子またはメチル基を表し、Ａｒはアリール基を表す。ア
リール基としては、例えばフェニル基、α−ナフチル
基、β−ナフチル基、２−フリル基、３−フリル基、２
−チエニル基、３−チエニル基などがあげられる。これ
らは置換基を有していてもよい。置換基としては、ハロ
ゲン、アルキル基、アルコキシ基、ハロゲン化アルキル
基、フェニル基、ベンゾイル基、ベンジル基などがあ
る。
ｅを一般式［Ｉ］で表される化合物と接触させることに
より、一般式［ＩＩ］で表される化合物を製造すること
ができる。一般式［Ｉ］［ＩＩ］において、Ｒは水素原
子またはメチル基を表し、Ａｒはアリール基を表す。ア
リール基としては、例えばフェニル基、α−ナフチル
基、β−ナフチル基、２−フリル基、３−フリル基、２
−チエニル基、３−チエニル基などがあげられる。これ
らは置換基を有していてもよい。置換基としては、ハロ
ゲン、アルキル基、アルコキシ基、ハロゲン化アルキル
基、フェニル基、ベンゾイル基、ベンジル基などがあ
る。
【００１３】本発明では、一般式［Ｉ］で表される化合
物を変異型ＡＭＤａｓｅに接触させるときの条件は特に
限定はない。しかしながら、温度は好ましくは１０〜５
０℃、さらに好ましくは２０〜４０℃、ｐＨは好ましく
は５．０〜９．５、さらに好ましくは６．０〜９．０、
時間は他の条件との兼ね合いによるが、好ましくは数分
〜数日である。
物を変異型ＡＭＤａｓｅに接触させるときの条件は特に
限定はない。しかしながら、温度は好ましくは１０〜５
０℃、さらに好ましくは２０〜４０℃、ｐＨは好ましく
は５．０〜９．５、さらに好ましくは６．０〜９．０、
時間は他の条件との兼ね合いによるが、好ましくは数分
〜数日である。
【００１４】本発明の変異型ＡＭＤａｓｅは、一般式
［Ｉ］においてＲが水素原子の場合（すなわち一般式
［Ｉ］がα−アリールマロン酸）だけでなく、Ｒがメチ
ル基の場合（すなわち一般式［Ｉ］がα−アリール−α
−メチルマロン酸）のように、メチル基が置換したアリ
ールマロン酸をも基質とするところに特徴がある。また
この反応において、Ｒがメチル基の場合、生成物のα−
アリールカルボン酸はほぼ１００％ｅｅの光学純度のＲ
体が得られることも特徴の１つである。
［Ｉ］においてＲが水素原子の場合（すなわち一般式
［Ｉ］がα−アリールマロン酸）だけでなく、Ｒがメチ
ル基の場合（すなわち一般式［Ｉ］がα−アリール−α
−メチルマロン酸）のように、メチル基が置換したアリ
ールマロン酸をも基質とするところに特徴がある。また
この反応において、Ｒがメチル基の場合、生成物のα−
アリールカルボン酸はほぼ１００％ｅｅの光学純度のＲ
体が得られることも特徴の１つである。
【００１５】
【実施例】以下、本発明を実施例により具体的に説明す
るが、本発明はこれら実施例に限定されるものではな
い。
るが、本発明はこれら実施例に限定されるものではな
い。
【００１６】実施例１＜変異型ＡＭＤａｓｅ遺伝子およ
びその保持菌の調製＞ 常法にしたがって抽出したプラスミドｐＡＭＤ１０１
（特開平９−２２４６７５）より、ＨｉｎｄＩＩＩ及び
ＰｓｔＩ両制限酵素によりＡＭＤａｓｅ遺伝子を切り出
し、同じくＨｉｎｄＩＩＩ及びＰｓｔＩ両制限酵素で予
め処理しておいたファージベクターＭ１３ｍｐ１９にラ
イゲーションし、大腸菌ＭＶ１１８４に形質導入した。
形質導入された大腸菌の培養液よりファージ液を得、そ
のファージ液よりＡＭＤａｓｅ遺伝子を保持するｓｓＤ
ＮＡを得た。
びその保持菌の調製＞ 常法にしたがって抽出したプラスミドｐＡＭＤ１０１
（特開平９−２２４６７５）より、ＨｉｎｄＩＩＩ及び
ＰｓｔＩ両制限酵素によりＡＭＤａｓｅ遺伝子を切り出
し、同じくＨｉｎｄＩＩＩ及びＰｓｔＩ両制限酵素で予
め処理しておいたファージベクターＭ１３ｍｐ１９にラ
イゲーションし、大腸菌ＭＶ１１８４に形質導入した。
形質導入された大腸菌の培養液よりファージ液を得、そ
のファージ液よりＡＭＤａｓｅ遺伝子を保持するｓｓＤ
ＮＡを得た。
【００１７】このｓｓＤＮＡを含む水溶液１０μｌに１
Ｍの亜硝酸ナトリウムを含む１Ｍ酢酸ナトリウム水溶液
１０μｌを加えて２１．５℃に保温し、５時間変異の導
入を行なった。変異の導入はエタノールの添加によって
ＤＮＡを沈澱させることにより停止した。このようにし
て得られた変異が導入されたＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩ及
びＰｓｔＩの両制限酵素で処理してＡＭＤａｓｅ遺伝子
を回収し、さらに両制限酵素で予め処理したｐＵＣ１９
にライゲーションして大腸菌ＪＭ１０９株に形質導入し
た。この形質導入された大腸菌をＰＭ−Ｐｌａｔｅに接
種し、ＡＭＤａｓｅの発現に伴うｐＨ指示薬ＢＴＢの変
色を示すコロニーを選択した。なお、ＰＭ−Ｐｌａｔｅ
の組成は表１に示した。
Ｍの亜硝酸ナトリウムを含む１Ｍ酢酸ナトリウム水溶液
１０μｌを加えて２１．５℃に保温し、５時間変異の導
入を行なった。変異の導入はエタノールの添加によって
ＤＮＡを沈澱させることにより停止した。このようにし
て得られた変異が導入されたＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩ及
びＰｓｔＩの両制限酵素で処理してＡＭＤａｓｅ遺伝子
を回収し、さらに両制限酵素で予め処理したｐＵＣ１９
にライゲーションして大腸菌ＪＭ１０９株に形質導入し
た。この形質導入された大腸菌をＰＭ−Ｐｌａｔｅに接
種し、ＡＭＤａｓｅの発現に伴うｐＨ指示薬ＢＴＢの変
色を示すコロニーを選択した。なお、ＰＭ−Ｐｌａｔｅ
の組成は表１に示した。
【００１８】
【表１】
【００１９】このようにして得られた各コロニーに由来
する菌体を破砕し、その上清中のフェニルマロン酸に対
する脱炭酸活性とフェニルメチルマロン酸に対する脱炭
酸活性を測定し、後者の活性が前者の活性より高いコロ
ニーを一つを選択した。このコロニーより常法にしたが
ってＡＭＤａｓｅ遺伝子を抽出し、アプライドバイオシ
ステムズ社製３７３型ＤＮＡシーケンシングシステムで
全塩基配列の分析を行なった。その塩基配列解析結果よ
り、得られたＡＭＤａｓｅは第４５番目のプロリンがロ
イシンに置換されていることが確認された。ここで得ら
れたＡＭＤａｓｅを変異型ＡＭＤａｓｅとし、変異型Ａ
ＭＤａｓｅ遺伝子をクローニングしたプラスミドを以
下、ｐＡＭＤ*と略記する。
する菌体を破砕し、その上清中のフェニルマロン酸に対
する脱炭酸活性とフェニルメチルマロン酸に対する脱炭
酸活性を測定し、後者の活性が前者の活性より高いコロ
ニーを一つを選択した。このコロニーより常法にしたが
ってＡＭＤａｓｅ遺伝子を抽出し、アプライドバイオシ
ステムズ社製３７３型ＤＮＡシーケンシングシステムで
全塩基配列の分析を行なった。その塩基配列解析結果よ
り、得られたＡＭＤａｓｅは第４５番目のプロリンがロ
イシンに置換されていることが確認された。ここで得ら
れたＡＭＤａｓｅを変異型ＡＭＤａｓｅとし、変異型Ａ
ＭＤａｓｅ遺伝子をクローニングしたプラスミドを以
下、ｐＡＭＤ*と略記する。
【００２０】＜遺伝子保持菌の培養および改変型ＡＭＤ
ａｓｅの精製＞変異型ＡＭＤａｓｅ遺伝子保持菌ＪＭ１
０９／ｐＡＭＤ*を２０ｍｌのＬＢ培地（トリプトン
１．０％、酵母エキス０．５％、ＮａＣｌ １．０％、
ｐＨ７．０）に接種し、３０℃で１８時間振蕩培養を行
なった。この培養液の１ｍｌを１００ｍｌの同培地に接
種し、３０℃で６時間培養を行なった後、イソプロピル
−β−チオ−ガラクトピラノシドを０．１ｍＭになるよ
うに添加して、さらに３０℃で１２時間培養を行なっ
た。
ａｓｅの精製＞変異型ＡＭＤａｓｅ遺伝子保持菌ＪＭ１
０９／ｐＡＭＤ*を２０ｍｌのＬＢ培地（トリプトン
１．０％、酵母エキス０．５％、ＮａＣｌ １．０％、
ｐＨ７．０）に接種し、３０℃で１８時間振蕩培養を行
なった。この培養液の１ｍｌを１００ｍｌの同培地に接
種し、３０℃で６時間培養を行なった後、イソプロピル
−β−チオ−ガラクトピラノシドを０．１ｍＭになるよ
うに添加して、さらに３０℃で１２時間培養を行なっ
た。
【００２１】このようにして得られた培養液を３０００
×ｇで２０分間遠心分離して微生物の菌体を回収した。
この菌体を０．５ｍＭ ＥＤＴＡ及び５ｍＭのβ−メル
カプトエタノールを含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に
懸濁し、超音波によって菌体の破砕を行なった。この破
砕菌体に２％の硫酸プロタミン水溶液を懸濁液の１％量
滴下し、３０分間攪拌した。この操作により生じた沈澱
を８０００×ｇで２０分間遠心分離することによって除
去し、無細胞抽出液とした。
×ｇで２０分間遠心分離して微生物の菌体を回収した。
この菌体を０．５ｍＭ ＥＤＴＡ及び５ｍＭのβ−メル
カプトエタノールを含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に
懸濁し、超音波によって菌体の破砕を行なった。この破
砕菌体に２％の硫酸プロタミン水溶液を懸濁液の１％量
滴下し、３０分間攪拌した。この操作により生じた沈澱
を８０００×ｇで２０分間遠心分離することによって除
去し、無細胞抽出液とした。
【００２２】無細胞抽出液をを５０℃で２分間加熱処理
した後、直ちに氷冷することにより、蛋白性の不純物を
変成させ、８０００×ｇ、２０分間の遠心分離で除去し
た。次いで硫酸アンモニウムを６０％飽和になるように
添加して１時間攪拌し、酵素を含む沈殿物を遠心分離に
よって回収した。
した後、直ちに氷冷することにより、蛋白性の不純物を
変成させ、８０００×ｇ、２０分間の遠心分離で除去し
た。次いで硫酸アンモニウムを６０％飽和になるように
添加して１時間攪拌し、酵素を含む沈殿物を遠心分離に
よって回収した。
【００２３】この沈殿物を０．５ｍＭ ＥＤＴＡ及び５
ｍＭ β−メルカプトエタノールを含む１０ｍＭのトリ
ス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５、以下緩衝液Ａと略記する）
に溶解し、さらに緩衝液Ａに対して透析を行なった後、
緩衝液Ａで予め平衡化したＤＥＡＥ−トヨパールカラム
に通過させて酵素を吸着させた。このカラムを緩衝液Ａ
で洗浄した後、１０ｍＭから５０ｍＭまでのＮａＣｌの
直線濃度勾配によって酵素の溶出をおこなった。次いで
ＡＭＤａｓｅ活性を示す溶出画分を回収して、硫酸アン
モニウムを２５％飽和になるように添加し、予め２５％
飽和硫安を含む緩衝液Ａで平衡化したブチルトヨパール
カラムに酵素を吸着させた。酵素の溶出は硫酸アンモニ
ウムの２５％飽和から０％飽和の直線濃度勾配により行
なった。ＡＭＤａｓｅ活性を示す画分を回収して緩衝液
Ａに対して透析し、精製された変異型ＡＭＤａｓｅを得
た。
ｍＭ β−メルカプトエタノールを含む１０ｍＭのトリ
ス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５、以下緩衝液Ａと略記する）
に溶解し、さらに緩衝液Ａに対して透析を行なった後、
緩衝液Ａで予め平衡化したＤＥＡＥ−トヨパールカラム
に通過させて酵素を吸着させた。このカラムを緩衝液Ａ
で洗浄した後、１０ｍＭから５０ｍＭまでのＮａＣｌの
直線濃度勾配によって酵素の溶出をおこなった。次いで
ＡＭＤａｓｅ活性を示す溶出画分を回収して、硫酸アン
モニウムを２５％飽和になるように添加し、予め２５％
飽和硫安を含む緩衝液Ａで平衡化したブチルトヨパール
カラムに酵素を吸着させた。酵素の溶出は硫酸アンモニ
ウムの２５％飽和から０％飽和の直線濃度勾配により行
なった。ＡＭＤａｓｅ活性を示す画分を回収して緩衝液
Ａに対して透析し、精製された変異型ＡＭＤａｓｅを得
た。
【００２４】実施例２＜変異型ＡＭＤａｓｅの活性評価
＞ 基質として３−１２. ５ｍＭのフェニルマロン酸または
５−２０ｍＭのα−フェニル−α−メチルマロン酸と、
適当量の野生型または変異型ＡＭＤａｓｅを含む０．１
２５Ｍのトリス塩酸緩衝液４００μｌを３０℃で保温
し、５分間反応を行なった後に２Ｎ塩酸１００μｌを加
えて酵素反応を停止した。この反応中に生じたフェニル
酢酸またはα−フェニルプロピオン酸を逆相高速液体ク
ロマトグラフィーにより定量し、種々の濃度の両基質に
対する脱炭酸反応の初速度を測定した。
＞ 基質として３−１２. ５ｍＭのフェニルマロン酸または
５−２０ｍＭのα−フェニル−α−メチルマロン酸と、
適当量の野生型または変異型ＡＭＤａｓｅを含む０．１
２５Ｍのトリス塩酸緩衝液４００μｌを３０℃で保温
し、５分間反応を行なった後に２Ｎ塩酸１００μｌを加
えて酵素反応を停止した。この反応中に生じたフェニル
酢酸またはα−フェニルプロピオン酸を逆相高速液体ク
ロマトグラフィーにより定量し、種々の濃度の両基質に
対する脱炭酸反応の初速度を測定した。
【００２５】両逆数プロット（ラインウィーバー・バー
グプロット）で反応速度論的パラメーターを求めた。フ
ェニルマロン酸を用いた場合の結果を表２に、α−フェ
ニル−α−メチルマロン酸を用いた場合の結果を表３に
示した。変異型ＡＭＤａｓｅは、フェニルマロン酸に対
して約２４％のＫｍ値の低下を、フェニルメチルマロン
酸に対して約６３％のＫｍ値の低下を示した。即ち両基
質に対して野生型酵素より高い親和性を示し、特に後者
の基質に対してより高い選択性を示した。また、フェニ
ルマロン酸に対する触媒効率を示すｋｃａｔ／Ｋｍ値は
野生型酵素の９１％であり大きな変化は認められなかっ
たが、フェニルメチルマロン酸に対しては野生型酵素の
１２８％の値を示し、Ｋｃａｔ／Ｋｍ値によってもフェ
ニルメチルマロン酸に対して選択性と活性が向上してい
る事が示された。
グプロット）で反応速度論的パラメーターを求めた。フ
ェニルマロン酸を用いた場合の結果を表２に、α−フェ
ニル−α−メチルマロン酸を用いた場合の結果を表３に
示した。変異型ＡＭＤａｓｅは、フェニルマロン酸に対
して約２４％のＫｍ値の低下を、フェニルメチルマロン
酸に対して約６３％のＫｍ値の低下を示した。即ち両基
質に対して野生型酵素より高い親和性を示し、特に後者
の基質に対してより高い選択性を示した。また、フェニ
ルマロン酸に対する触媒効率を示すｋｃａｔ／Ｋｍ値は
野生型酵素の９１％であり大きな変化は認められなかっ
たが、フェニルメチルマロン酸に対しては野生型酵素の
１２８％の値を示し、Ｋｃａｔ／Ｋｍ値によってもフェ
ニルメチルマロン酸に対して選択性と活性が向上してい
る事が示された。
【００２６】なお、本反応により得られたα−フェニル
プロピオン酸の光学純度を測定したところ、ほぼ１００
％ｅｅの光学純度のＲ体であることが示された。即ち変
異体酵素の光学選択性は野生型酵素と同じであった。
プロピオン酸の光学純度を測定したところ、ほぼ１００
％ｅｅの光学純度のＲ体であることが示された。即ち変
異体酵素の光学選択性は野生型酵素と同じであった。
【００２７】
【表２】
【００２８】
【表３】
【００２９】実施例３＜熱安定性の分析＞ 野生型及び変異型のＡＭＤａｓｅ溶液（ｐＨ８．５）
を、３０から７０℃の間の種々の温度で３０分間加熱を
行ない、直ちに冷却した。この加熱処理前後の酵素活性
を３０ｍＭフェニルマロン酸を基質として実施例２に示
した方法で測定し、加熱処理後の酵素残存活性を求め
た。結果を図１に示す。縦軸は酵素残存活性を、横軸は
加熱温度を示す。図中、黒丸は変異型ＡＭＤａｓｅ、白
丸は野生型ＡＭＤａｓｅを示す。図１より残存酵素活性
が５０％となる温度（Ｔ1/2）を求めると、野生型ＡＭ
Ｄａｓｅは５０℃であったのに対し、改変型ＡＭＤａｓ
ｅでは５３℃であり、本発明の改変型ＡＭＤａｓｅは３
℃のＴ1/2の向上が確認された。
を、３０から７０℃の間の種々の温度で３０分間加熱を
行ない、直ちに冷却した。この加熱処理前後の酵素活性
を３０ｍＭフェニルマロン酸を基質として実施例２に示
した方法で測定し、加熱処理後の酵素残存活性を求め
た。結果を図１に示す。縦軸は酵素残存活性を、横軸は
加熱温度を示す。図中、黒丸は変異型ＡＭＤａｓｅ、白
丸は野生型ＡＭＤａｓｅを示す。図１より残存酵素活性
が５０％となる温度（Ｔ1/2）を求めると、野生型ＡＭ
Ｄａｓｅは５０℃であったのに対し、改変型ＡＭＤａｓ
ｅでは５３℃であり、本発明の改変型ＡＭＤａｓｅは３
℃のＴ1/2の向上が確認された。
【００３０】また野生型及び変異型のＡＭＤａｓｅ溶液
（ｐＨ８．５）を、５０℃で加熱を行なった際の残存酵
素活性の経時変化を図２に示した。縦軸は酵素残存活性
を、横軸は時間を示す。図中、黒丸は変異型ＡＭＤａｓ
ｅ、白丸は野生型ＡＭＤａｓｅを示す。ＡＭＤａｓｅの
失活は野生型、変異型ともに見かけ上１次反応で進行し
たが、３０分間加熱後の残存酵素活性が、野生型ＡＭＤ
ａｓｅは５０％であったのに対し、改変型ＡＭＤａｓｅ
では６０％であった。すなわち、この分析によっても改
変型ＡＭＤａｓｅが野生型ＡＭＤａｓｅより高い安定性
を示すことが確認された。失活の一次反応速度定数を計
算すると野生型酵素では２．３×１０-2ｍｉｎ-1であっ
たのに対し、本変異型酵素では１. ６×１０-2であっ
た。すなわち変異型酵素では野生型酵素に対して失活速
度が３０％程度減少していた。
（ｐＨ８．５）を、５０℃で加熱を行なった際の残存酵
素活性の経時変化を図２に示した。縦軸は酵素残存活性
を、横軸は時間を示す。図中、黒丸は変異型ＡＭＤａｓ
ｅ、白丸は野生型ＡＭＤａｓｅを示す。ＡＭＤａｓｅの
失活は野生型、変異型ともに見かけ上１次反応で進行し
たが、３０分間加熱後の残存酵素活性が、野生型ＡＭＤ
ａｓｅは５０％であったのに対し、改変型ＡＭＤａｓｅ
では６０％であった。すなわち、この分析によっても改
変型ＡＭＤａｓｅが野生型ＡＭＤａｓｅより高い安定性
を示すことが確認された。失活の一次反応速度定数を計
算すると野生型酵素では２．３×１０-2ｍｉｎ-1であっ
たのに対し、本変異型酵素では１. ６×１０-2であっ
た。すなわち変異型酵素では野生型酵素に対して失活速
度が３０％程度減少していた。
【００３１】
【発明の効果】本発明の改変型ＡＭＤａｓｅは、アミノ
酸配列の４５番目が置換されたことにより、酵素の特性
が改善されることが期待される。特にアミノ酸配列に４
５番目をロイシンに置換した改変型ＡＭＤａｓｅでは、
触媒活性、耐熱性及び基質特異性の向上がみられ、具体
的にはα−フェニル−α−メチルマロン酸をα−フェニ
ルプロピオン酸に変換する触媒活性が高く、その触媒活
性の高さは主として基質との親和性が増したことによ
る。また優位に熱安定性が高く、加熱処理による失活に
抵抗性を示す。従って、光学活性α−アリールプロピオ
ン酸の合成において、従来の酵素と比べて反応時間の短
縮、酵素使用量の削減などの点で優れた効果を発揮する
ことが出来る。
酸配列の４５番目が置換されたことにより、酵素の特性
が改善されることが期待される。特にアミノ酸配列に４
５番目をロイシンに置換した改変型ＡＭＤａｓｅでは、
触媒活性、耐熱性及び基質特異性の向上がみられ、具体
的にはα−フェニル−α−メチルマロン酸をα−フェニ
ルプロピオン酸に変換する触媒活性が高く、その触媒活
性の高さは主として基質との親和性が増したことによ
る。また優位に熱安定性が高く、加熱処理による失活に
抵抗性を示す。従って、光学活性α−アリールプロピオ
ン酸の合成において、従来の酵素と比べて反応時間の短
縮、酵素使用量の削減などの点で優れた効果を発揮する
ことが出来る。
【図１】実施例３で行った、ＡＭＤａｓｅを３０分間加
熱した後の残存酵素活性を示す図である。
熱した後の残存酵素活性を示す図である。
【図２】実施例３で行った、ＡＭＤａｓｅを加熱した際
の残存酵素活性の経時変化を示す図である。
の残存酵素活性の経時変化を示す図である。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/88 Ｃ１２Ｒ 1:19）
Claims (4)
- 【請求項１】野生型アリールマロン酸脱炭酸酵素のアミ
ノ酸配列４５番目のプロリン残基が他のアミノ酸残基に
置換されていることを特徴とする、改変型アリールマロ
ン酸脱炭酸酵素。 - 【請求項２】請求項１において、４５番目のプロリン残
基が疎水性アミノ酸残基に置換されていることを特徴と
する、改変型アリールマロン酸脱炭酸酵素。 - 【請求項３】請求項１において、４５番目のプロリン残
基がロイシン残基に置換されていることを特徴とする、
改変型アリールマロン酸脱炭酸酵素。 - 【請求項４】一般式［Ｉ］ 【化１】 （式中、Ａｒはアリール基を示し、Ｒは水素原子または
メチル基を示す）で表される化合物を、請求項１〜３い
ずれかに記載の改変型改変型アリールマロン酸脱炭酸酵
素と接触させることを特徴とする、一般式［ＩＩ］ 【化２】 （式中、Ａｒ及びＲは前述と同様のものを示す）で表さ
れる化合物の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10114907A JPH11299486A (ja) | 1998-04-24 | 1998-04-24 | 改変型酵素及びそれを用いた製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10114907A JPH11299486A (ja) | 1998-04-24 | 1998-04-24 | 改変型酵素及びそれを用いた製造法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11299486A true JPH11299486A (ja) | 1999-11-02 |
Family
ID=14649624
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10114907A Pending JPH11299486A (ja) | 1998-04-24 | 1998-04-24 | 改変型酵素及びそれを用いた製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH11299486A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1564298A1 (de) * | 2004-02-13 | 2005-08-17 | BioSpring GmbH | Enzymatische asymmetrische Decarboxylierung von disubstituierten Malonsäuren |
-
1998
- 1998-04-24 JP JP10114907A patent/JPH11299486A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1564298A1 (de) * | 2004-02-13 | 2005-08-17 | BioSpring GmbH | Enzymatische asymmetrische Decarboxylierung von disubstituierten Malonsäuren |
| WO2005078111A1 (de) * | 2004-02-13 | 2005-08-25 | Biospring Gmbh | Enzymatische asymmetrische decarboxylierung von disubstituierten malonsäuren |
| US7981645B2 (en) | 2004-02-13 | 2011-07-19 | Biospring Gmbh | Enzymatic asymmetric decarboxylation of disubstituted malonic acids |
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