JPH11196884A - トポイソメラーゼ阻害剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 ＤＮＡの複製に関係する酵素トポイソメラー
ゼＩおよびトポイソメラーゼIIを強く阻害し、ＤＮＡ鎖
に切断等の障害を引き起こさない新規なトポイソメラー
ゼ阻害剤の提供。 【解決手段】 ストレプトマイセス属に属する微生物が
生産する、以下の理化学的性質を有するトポイソメラー
ゼ阻害剤：（１）外観：白色粉末、（２）溶解性：水に
易溶、酸性水、メタノール、アセトン、クロロホルムに
不溶、（３）分子量：４５０００、（４）ＵＶ吸収スペ
クトル：水に溶解して測定したＵＶ吸収スペクトルは２
２４ｎｍに吸収極大を有する。（５）トポイソメラーゼ
阻害活性：トポイソメラーゼＩおよびIIのＤＮＡ緩和活
性に対し阻害活性を有し、ＩＣ₅₀値はそれぞれ０．４８
ｎｇ／μｌ、０．１７ｎｇ／μｌである。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、トポイソメラーゼ
阻害剤に関する。さらに詳しく言えば、放線菌に属する
微生物より抽出され分離精製された、ＤＮＡに損傷を与
えない新規トポイソメラーゼ阻害剤、その製造方法、そ
の阻害剤を産生する新規な微生物ストレプトマイセス・
スピーシーズ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）
Ｃ−１２７およびその阻害剤を有効成分とする医薬に関
する。

【０００２】

【従来の技術】高等生物は細胞の形態を形づくるのに必
要な細胞増殖の度合いを調節する能力を有しているが、
がん化した細胞ではこの能力に異常な変化がおこってお
り、正常細胞に比べて急速な増殖をするのが特徴と考え
られている。がん細胞では、正常細胞に比べて主に２つ
の異常、すなわち「細胞分裂の制御性の異常」と「がん
細胞の転移」とが存在すると考えられている。正常細胞
の分裂は細胞増殖抑制遺伝子により制御されており、必
要なときにだけ分裂が誘発される。がん細胞は正常細胞
の制御機構から逃れ増殖を繰り返す。つまり、１個のが
ん巣は繰り返し遺伝的な変化を受けた単一細胞から発生
し、分裂を繰り返し無数の同じように変化した異常な細
胞を作り出す。正常細胞は、その個体の全体的な形態を
維持するのに必要なルールに従って、それぞれの構成組
織の中に限定されている。これに対して、がん細胞はそ
れが生じた組織にとどまることなく、増殖しながら他の
組織へ転移していく。このような性質をもつがん細胞に
変化してしまう原因としては、化学物質による遺伝子の
損傷、放射線による遺伝子の損傷、ウイルスによる遺伝
子の変異および先天的な遺伝子の欠損等が挙げられる。

【０００３】がんを治療する戦略として、制がん剤を用
いる方法は最も一般的であり、多くの薬剤が研究開発さ
れてきた。中でも増殖細胞に対する抑制機能を指標とし
開発された制がん剤としては、アルキル化剤、抗腫瘍性
抗生物質、植物アルカロイドおよびキレート剤等が知ら
れている。しかし、これらは殆どが遺伝子に作用するも
のであるため、選択毒性が低く、またその効果も必ずし
も満足できるものではない。また、これらの制がん剤は
遺伝子の変異を引き起こすこともあり、二次的ながんを
誘発する可能性も高い等の問題がある。

【０００４】一方、がん細胞に関する分子生物学的研究
の進展は、従来明らかでなかった制がん剤の作用機構に
重大な手掛かりを与えている。中でも、エピポドフィロ
トキシン（ｅｐｉｐｏｄｏｐｈｙｌｌｏｔｏｘｉｎ）、
ｍ−ΑＭＳΑ、ドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉ
ｎ）、ストレプトニグリン（ｓｔｒｅｐｔｏｎｉｇｒｉ
ｎ）等の制がん剤は、がん細胞内に多く存在する酵素で
あるトポイソメラーゼ（ｔｏｐｏｉｓｏｍｅｒａｓｅ）
の酵素活性を阻害することで、制がん効果を示すことが
明らかになった（Ｙａｍａｓｈｉｔａ，Ｃａｎｃｅｒ
Ｒｅｓ．，５０，５８４１〜５８４４（１９９０）
等）。

【０００５】このトポイソメラーゼ（ｔｏｐｏｉｓｏｍ
ｅｒａｓｅ）は、超らせん型ＤＮΑを一時的な切断と再
結合により弛緩型ＤＮΑに変換する酵素であり、ＤＮΑ
の複製、転写、組み換え等の過程で生じる高次構造のひ
ずみを解消し、ＤＮΑ代謝をスムーズに進行させる機能
を有している。トポイソメラーゼには、超らせん２本鎖
ＤＮΑの１本鎖のみを切断し開環型ＤＮΑとした後、再
結合して弛緩型ＤＮΑとするトポイソメラーゼＩ（ｔｏ
ｐｏｉｓｏｍｅｒａｓｅ Ｉ）と、２本鎖を同時に切断
し直鎖ＤＮＡとした後、再結合して弛緩型ＤＮΑとする
トポイソメラーゼII（ｔｏｐｏｉｓｏｍｅｒａｓｅ I
I）の２種類がある。がん細胞のような増殖の激しい細
胞には、正常細胞に比べてこのトポイソメラーゼが多く
存在することが報告されている（Ｓｐｉｔｚｎｅｒ，Ｎ
ｕｃｌｅｉｃ，Ａｃｉｄｓ，Ｒｅｓ．，１６，５５３３
〜５５５６（１９８８））。従って、トポイソメラーゼ
の酵素活性を阻害する薬剤は、がん細胞の増殖を抑える
有効な制がん剤の一つとなり得る。

【０００６】そこで、トポイソメラーゼに作用する制が
ん剤の探索研究が行われ、カンプトテシン（ｃａｍｐｔ
ｏｔｈｅｃｉｎ）、テルペンテシン（ｔｅｒｐｅｎｔｅ
ｃｉｎ）、セイントピン（ｓａｉｎｔｏｐｉｎ）、ブル
ガレイン（ｂｕｌｇａｒｅｉｎ）等、制がん剤の新しい
リード化合物となりうる酵素阻害剤が近年次々に報告さ
れている（Ｙａｍａｓｈｉｔａ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ，３０，５８３８〜５８４５（１９９１）等）。し
かし、これらの阻害剤は遊離のトポイソメラーゼに結合
して阻害するのではなく、酵素と切断されたＤＮΑから
なるトポイソメラーゼ−ＤＮΑ切断複合体（ｃｌｅａｖ
ａｂｌｅ ｃｏｍｐｌｅｘ）に結合してトポイソメラー
ゼの酵素活性を阻害するものであり、そのため、ＤＮΑ
に切れ目や切断等の障害を引き起こし強い毒性を示す。
従って、制がん剤としては、トポイソメラーゼに直接作
用しＤＮΑには障害を残さない阻害剤、つまり副作用の
少ない薬剤が要求されている。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、直接トポイ
ソメラーゼに作用しＤＮΑに障害を残さない酵素阻害剤
およびその酵素阻害剤を含有しがん等の治療に有効な医
薬を提供するものである。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するため、指標酵素としてトポイソメラーゼII
（ｔｏｐｏｉｓｏｍｅｒａｓｅ II）を用い、直接トポ
イソメラーゼに作用しＤＮΑには障害を残さないトポイ
ソメラーゼ阻害剤の探索を行ったところ、新たに分離し
たストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属
に属する微生物が培養液中にトポイソメラーゼ酵素活性
を阻害する物質を生産していることを見出した。その培
養液からトポイソメラーゼ阻害活性を有する物質を分離
精製し、その理化学的性質を調べたところ、その阻害物
質は分子量約４５０００の文献未載の新規物質であり、
さらに、トポイソメラーゼＩ（ｔｏｐｏｉｓｏｍｅｒａ
ｓｅＩ）およびトポイソメラーゼII（ｔｏｐｏｉｓｏｍ
ｅｒａｓｅ II）に直接作用して阻害効果を示し、ＤＮ
Αに損傷を与えないことを見出し、本発明を完成した。

【０００９】すなわち、本発明は、下記の理化学的性質
を有するトポイソメラーゼ阻害剤を提供するものであ
る。 （１）外観：白色粉末 （２）溶解性：水に易溶、酸性水、メタノール、アセト
ン、クロロホルムに不溶。 （３）分子量：４５０００ （４）ＵＶ吸収スペクトル：水に溶解して測定したＵＶ
吸収スペクトルは２２４ｎｍに吸収極大を有する。

【００１０】（５）呈色反応：硫酸試薬、ブロムクレゾ
ールグリーン（ｂｒｏｍｃｒｅｓｏｌｇｒｅｅｎ）試
薬、ニンヒドリン（ｎｉｎｈｙｄｒｉｎ）試薬、ライド
ン−スミス（Ｒｙｄｏｎｅ−Ｓｍｉｔｈ）試薬およびア
ズレＡ（Ａｚｕｒｅ Ａ）試薬による呈色反応は陽性で
あり、モーリッシュ（Ｍｏｌｉｓｃｈ）試薬、フェノー
ル硫酸試薬、アニスアルデヒド（ａｎｉｓａｌｄｅｈｙ
ｄｅ）試薬、エルソン−モルガン（Ｅｌｓｏｎ−Ｍｏｒ
ｇａｎ）試薬、エーリッヒ（Ｅｈｒｌｉｃｈ）試薬およ
びジットマー（Ｄｉｔｔｍｅｒ）試薬による呈色反応は
陰性である。 （６）トポイソメラーゼ阻害活性：トポイソメラーゼＩ
およびIIのＤＮＡ弛緩活性に対し阻害活性を有し、ＩＣ
₅₀値はそれぞれ０．４８ｎｇ／μｌ、０．１７ｎｇ／μ
ｌである。 （７）熱安定性：１００℃において１５分間加熱したと
き、トポイソメラーゼ阻害活性は１００％残存する。

【００１１】なお、本発明者らは、本トポイソメラーゼ
阻害剤をＣ１２７−ＤＴＩと命名した。以降、その名称
を使用して説明することがある。

【００１２】さらに本発明は、ストレプトマイセス属に
属する微生物を培養し、培養物からＣ１２７−ＤＴＩを
採取するトポイソメラーゼ阻害剤Ｃ１２７−ＤＴＩの製
造方法を提供するものである。本発明において使用され
る微生物は、ストレプトマイセス属に属し、本発明のト
ポイソメラーゼ阻害剤Ｃ１２７−ＤＴＩを産生する能力
を有する微生物であれば、どのようなものでも使用でき
るが、代表例として本発明者らが熊本市郊外の土壌より
分離した、ストレプトマイセス・スピーシーズ（Ｓｔｒ
ｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．） Ｃ−１２７株を挙げる
ことができる。

【００１３】以下、Ｃ−１２７株の菌学的性状を説明す
る。 １．形態的性質 よく分枝した基生菌糸よりラセン状ないしはフック状の
気中菌糸を伸長する。成熟した気中菌糸の先に１０〜５
０個の楕円〜円筒形の胞子からなる胞子鎖を形成する。
胞子のうは認められない。胞子の大きさは０．７〜１．
０×１．０〜１．５μｍであり、鞭毛は認められない。

【００１４】２．各種培地における生育状態 培養は全て２８℃で行った。結果を表１に示す。

【００１５】

【表１】 表１．Ｃ−１２７株の各種培地における生育状態 ──────────────────────────────────── 培 地 生育状態 気中菌糸 コロニー 溶解性色素 とその色調 の裏面 ──────────────────────────────────── イースト・麦芽 良好 良好 暗灰褐色 褐色 寒天培地(ISP2) 灰褐色 ──────────────────────────────────── オートミール 良好 良好 赤味がかった 赤味がかった 寒天培地(ISP3) 灰褐色 灰褐色 灰褐色 ──────────────────────────────────── シュークロース・硝酸塩 良好 良好 緑灰色 なし 寒天培地(Czapek's soln.) 灰白色 ──────────────────────────────────── スターチ・無機塩 良好 良好 茶色 なし 寒天培地(ISP4) 灰褐色 ──────────────────────────────────── グリセリン・アスパラギン 良好 良好 黒褐色 黒褐色 寒天培地(ISP5) 淡灰褐色 ──────────────────────────────────── ペプトン・酵母エキス 普通 なし なし 暗褐色 鉄寒天培地(ISP6) ──────────────────────────────────── チロシン寒天培地 良好 良好 黒褐色 濃褐色 (ISP7) 灰褐色 ──────────────────────────────────── 栄養寒天培地 普通 なし なし なし ──────────────────────────────────── （表中 ISPは、International Streptomyces Projectの略である。）

【００１６】３．生理学的性質 （１）生育温度範囲 ＭＧＡ寒天培地（ｐＨ７）において、２０〜３７℃で生
育が認められた。 （２）メラニン様色素の生成 ワックスマンのメラニン生成用寒天培地（ｐＨ７）を用
い、２８℃で培養したところ、メラニン様色素の生成が
認められた。 （３）ゼラチンの液化 ゼラチン培地（ｐＨ７）を用い、２８℃で１４日間培養
したがゼラチンの液化は認められない。 （４）脱脂牛乳の凝固・ペプトン化 培地として脱脂牛乳を用い、２８℃で１４日間培養し
た。ペプトン化は認められたが、凝固は認められなかっ
た。

【００１７】（５）スターチの加水分解 スターチ・無機塩寒天培地（ｐＨ７）を用い、２８℃で
培養したところ、顕著な水解性が認められた。 （６）セルロースの分解 濾紙片添加ツアぺック培地を用い、２８℃で１４日間培
養したところ、わずかに分解が認められた。 （７）各種炭素源の利用性 プリドハム・ゴトリープ寒天培地（ＩＳＰ９）に各種炭
素源を加え、２８℃における生育をみた。結果を表２に
示す。

【００１８】

【表２】 ＋ 利用する ± わずかに利用する − 利用しない

【００１９】以上の菌学的性質から本微生物は、ストレ
プトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する
ことは明確であるので、本発明者らは本微生物をストレ
プトマイセス・スピーシーズ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅ
ｓ ｓｐ．） Ｃ−１２７と命名し、平成９年１１月１
０日付で、工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲ
Ｍ Ｐ−１６５０９の番号で寄託した。その後、さらに
菌学的性状を調べたところ、気菌糸の色調が灰色（ｇｒ
ａｙ：Ｇｙ）であること、気菌糸の形状がらせん状（ｓ
ｐｉｒａｌ：Ｓ）であること、メラニン色素を生成（ｃ
ｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃｉｔｙ：Ｃ＋）すること、および
電子顕微鏡観察による胞子表面の形状が滑らか（ｓｍｏ
ｏｔｈ：ＳＭ）であることから［Ｇｙ；Ｓ；Ｃ＋；Ｓ
Ｍ］に分類されることが明らかになった。従って、本微
生物をストレプトマイセス・アベルミティリス（Ｓｔｒ
ｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）に属す
る菌株と同定した。

【００２０】本発明のトポイソメラーゼ阻害剤Ｃ１２７
−ＤＴＩは、上記微生物を栄養培地に接種し、好気的に
培養することにより製造される。上記微生物の培養方法
は、原則的には一般の微生物の培養方法に準ずるが、通
常は液体培養による振とう培養、通気撹拌培養などの好
気的条件下で行うのが好適である。

【００２１】培養に用いられる培地としてはストレプト
マイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する微生
物が利用できる栄養源を含有する培地であればよく、各
種の合成培地、半合成培地、天然培地などいずれも用い
ることができる。培地組成としては炭素源としてのグル
コース、シュークロース、フルクトース、グリセリン、
デキストリン、スターチ、糖蜜などを単独または組合わ
せて用いることができる。

【００２２】窒素源としてはファーマメディア、ペプト
ン、肉エキス、大豆粉、カゼイン、アミノ酸、酵母エキ
ス、尿素などの有機窒素源、硝酸ナトリウム、硫酸アン
モニウムなどの無機窒素源を、単独または組合わせて用
いることができる。その他、塩化ナトリウム、塩化カリ
ウム、炭酸カルシウム、硫酸マグネシウム、リン酸ナト
リウム、リン酸カリウム、塩化コバルトなどの塩類、ビ
タミンＢ、ビオチンなどのビタミン類も必要に応じて添
加することができる。なお、培養中に発泡が著しいとき
は公知の各種消泡剤を適宜培地中に添加することもでき
る。

【００２３】培養条件は、上記微生物が良好に生育して
Ｃ１２７−ＤＴＩを良好に生産しうる範囲内で適宜選択
すればよい。例えば、培地のｐＨは、７〜７．６程度と
することが好ましい。培養温度は、微生物が良好に生育
する温度、通常２０〜３７℃、好ましくは２８℃に保つ
のがよい。培養時間は５〜８日間程度でよく、好ましく
は６〜７日間である。もちろん上述した各種の培養条件
は、使用する微生物の種類や特性、外部条件などに応じ
て適宜変更でき、またそれに応じて上記範囲から最適条
件を選択、調整できる。

【００２４】先に述べたとおり、本発明のトポイソメラ
ーゼ阻害剤Ｃ１２７−ＤＴＩは、トポイソメラーゼＩお
よびIIに対して阻害作用を示すので、後述するトポイソ
メラーゼ阻害活性測定法により培養液中の蓄積量を定量
することができる。

【００２５】Ｃ１２７−ＤＴＩは、上記培養液の液体部
分に蓄積されるので分離精製にあたっては、まず濾過、
遠心分離などの一般的固液分離手段を用いて菌体を除去
し、上澄液を得る。次に酸による沈殿、酢酸エチル、ｎ
−ブタノール等を用いた溶媒抽出やダウエックス５０Ｗ
×２（ダウケミカル社製）、アンバーライトＩＲ−１２
０Ｂ（オルガノ社製）、ダイヤイオンＰＫ２０８（三菱
化学社製）などの強酸性イオン交換樹脂、セルロース、
活性炭などの担体を用いるカラムクロマトグラフィー、
さらにセファデックスＧ−７５、セファデックスＧ−１
００（ファルマシア社製）などのゲル濾過などの各種精
製手段を単独または適宜組合わせて、場合によっては反
復使用することにより分離精製することができる。

【００２６】以上のようにして得られるトポイソメラー
ゼ阻害剤Ｃ１２７−ＤＴＩは、以下に示す理化学的性質
を示す。 （１）外観：白色粉末 （２）溶解性：水に易溶、酸性水、メタノール、アセト
ン、クロロホルムに不溶。 （３）分子量：セファデックスＧ−７５を用いたゲル濾
過法により測定された結果は図１に示すとおりであり、
分子量は４５０００である。 （条件）カラムサイズ：φ１．８×８５ｃｍ、流速：１
０ｍｌ／ｈｒ、溶離液：０．１Ｍ ＫＣｌを０．０２Ｍ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、マーカー：チトク
ロームＣ、アルカリ性プロテアーゼインヒビター、卵ア
ルブミン、牛血清アルブミン （４）ＵＶ吸収スペクトル：０．０２ｍｇ／ｍｌの濃度
となるよう水に溶解して測定したＵＶ吸収スペクトル
は、図２に示すとおりであり、２２４ｎｍに吸収極大を
有する。

【００２７】（５）呈色反応：硫酸試薬、ブロムクレゾ
ールグリーン（ｂｒｏｍｃｒｅｓｏｌｇｒｅｅｎ）試
薬、ニンヒドリン（ｎｉｎｈｙｄｒｉｎ）試薬、ライド
ン−スミス（Ｒｙｄｏｎｅ−Ｓｍｉｔｈ）試薬およびア
ズレＡ（Ａｚｕｒｅ Ａ）試薬による呈色反応は陽性で
あり、モーリッシュ（Ｍｏｌｉｓｃｈ）試薬、フェノー
ル硫酸試薬、アニスアルデヒド（ａｎｉｓａｌｄｅｈｙ
ｄｅ）試薬、エルソン−モルガン（Ｅｌｓｏｎ−Ｍｏｒ
ｇａｎ）試薬、エーリッヒ（Ｅｈｒｌｉｃｈ）試薬およ
びジットマー（Ｄｉｔｔｍｅｒ）試薬による呈色反応は
陰性である。 （６）トポイソメラーゼＩ阻害活性：後述する実施例に
示すとおり、トポイソメラーゼＩのＤＮＡ弛緩（ｒｅｌ
ａｘａｔｉｏｎ）活性に対するＩＣ₅₀値は０．４８ｎｇ
／μｌである。阻害形式は非拮抗阻害であり、Ｋｉ値
は、３．７ｎＭである。

【００２８】（７）トポイソメラーゼII阻害活性：後述
する実施例に示すとおり、トポイソメラーゼIIのＤＮＡ
弛緩（ｒｅｌａｘａｔｉｏｎ）活性に対するＩＣ₅₀値は
０．１７ｎｇ／μｌである。阻害形式は非拮抗阻害であ
り、Ｋｉ値は、１．３ｎＭである。またトポイソメラー
ゼIIのＤＮＡ相互通り抜け（ｄｅｃａｔｅｎａｔｉｏ
ｎ）活性に対するＩＣ₅₀値はそれぞれ０．０９ｎｇ／μ
ｌである。阻害形式は非拮抗阻害であり、Ｋｉ値は、
３．０ｎＭである。 （８）熱安定性：１００℃において１５分間加熱したと
き、トポイソメラーゼＩに対する阻害活性は、１００％
残存する。 （９）核酸関連酵素に対する阻害活性：表３に示すとお
り、多くの制限酵素に対して阻害活性を示す。

【００２９】

【表３】表３．核酸関連酵素に対するＣ１２７−ＤＴＩ
の阻害活性 ───────────────────────── 酵 素 ＩＣ₅₀（ｎｇ／μｌ） ───────────────────────── Ｅｃｏ ＲＩ ０．０９ Ｂａｍ ＨＩ ０．４０ Ｐｓｔ I ０．１６ Ｓｃａ I ０．０６ Ｈｉｎｄ III ０．１６ Ａｌｕ I ０．１６ ＲＮａｓｅ Ａ ＞２０．０ ＤＮａｓｅ I ＞２０．０ ＤＮａｓｅ II ＞２０．０ Ｔ４ ｌｉｇａｓｅ ＞２０．０ ─────────────────────────

【００３０】（１０）ＤＮＡ切断複合体の形成：後述す
る実施例に示すとおり、ＤＮＡ切断複合体を形成しな
い。 （１１）ＤＮＡへのインターカレート作用：後述する実
施例に示すとおり、ＤＮＡへインターカレートしない。

【００３１】以上、記したとおり本発明のトポイソメラ
ーゼ阻害剤Ｃ１２７−ＤＴＩは、直接トポイソメラーゼ
に強く作用し、ＤＮＡへの作用が少ない阻害剤であり、
ＤＮＡに障害を与えないことから副作用の少ない薬剤、
特に制がん剤となることが期待される。

【００３２】がん細胞は、正常細胞に比べ急速な増殖を
するのが特徴と考えられている。制がん剤は、この特徴
を利用して増殖性の細胞に対し毒性を持つ薬剤を用いる
化学療法である。本発明の阻害剤は、がん細胞の核酸合
成を抑制する制がん剤として、肉腫、白血病、リンパ腫
およびがん腫などの悪性腫瘍（がん）等の治療のために
用いることができる。

【００３３】

【実施例】以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に
説明するが、これらは本発明の範囲を制限するものでは
ない。

【００３４】実施例１：Ｃ１２７−ＤＴＩの製造 ストレプトマイセス・スピーシーズ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍ
ｙｃｅｓ ｓｐ．）Ｃ−１２７（ＦＥＲＭ Ｐ−１６５
０９）を種母培地（グルコース２％、スターチ３％、ペ
プトン０．５％、コーン・スティープ・リカー１％、大
豆粉１％、塩化ナトリウム０．３％、炭酸カルシウム
０．５％、加熱滅菌前にｐＨ７．０に調整）５０ｍｌを
含む２００ｍｌ容フラスコに接種し、２８℃で２日間ロ
ータリーシェーカー（１８０ｒｐｍ）上で培養し、種母
を得た。

【００３５】次に種母培地と同組成の培地５０ｍｌを含
む２００ｍｌ容フラスコ２０本に種母を４％添加し、２
８℃で６日間ロータリーシェーカー（１８０ｒｐｍ）上
で培養した。培養終了後、培養液を集め濾過により菌体
を除き、濾液１０００ｍｌを得た。これに塩酸を加え、
ｐＨ３に調整し、５℃にて３時間靜置した。生成した沈
殿を遠心分離（６０００ｒｐｍ、１５分）して集め、
０．２Ｎ水酸化ナトリウムに溶解させ、精製水に対して
一晩透析し、粗精製液を得た。

【００３６】これを精製水で平衡化した陽イオン交換樹
脂ダウエックス５０Ｗ×２（ダウケミカル社製）カラム
（φ３．０×２０ｃｍ）に付し、吸着させた後、精製水
で洗浄し、さらに０．１Ｎ水酸化ナトリウムにて溶出さ
せた。溶出液をエバポレーターにて濃縮乾固し、さらに
これを水酸化ナトリウム水溶液に溶解させ、等量のｎ−
ブタノールと振り混ぜ、脂溶性物質を除去した。Ｃ１２
７−ＤＴＩが含まれる水相部を濃縮して活性画分Ｉを得
た。

【００３７】その後、塩酸酸性水（ｐＨ３．０）で平衡
化した活性炭カラム（和光純薬社製、φ２．６×２０ｃ
ｍ）に活性画分Ｉを流し、Ｃ１２７−ＤＴＩが含まれる
通過液をエバポレーターにて濃縮し、活性画分IIを得
た。次に０．０５Ｍ ＫＣｌを含む水酸化ナトリウム水
溶液（ｐＨ１２）で平衡化したセファデックスＧ−７５
カラム（ファルマシア社製、φ１．８×９０ｃｍ）に活
性画分IIを付し、０．０５Ｍ ＫＣｌを含む水酸化ナト
リウム水溶液（ｐＨ１２）で溶出した。Ｃ１２７−ＤＴ
Ｉが含まれる画分を集め、エバポレーターで濃縮し、活
性画分IIIを得た。

【００３８】さらに精製水で平衡化したセファデックス
Ｇ−１００カラム（ファルマシア社製、φ１．８×９０
ｃｍ）に活性画分IIIを付し、精製水で展開した。Ｃ１
２７−ＤＴＩが含まれる画分を集め、エバポレーターで
濃縮し、活性画分ＩＶとした。次に１％酢酸を含む２０
％メタノール水溶液で平衡化したセルロースカラム（メ
ルク社製、φ１．８×１６ｃｍ）に活性画分ＩＶを付
し、１％酢酸含有２０％メタノール水溶液で溶出した。
Ｃ１２７−ＤＴＩを含有する画分を集め、精製水に対し
て一晩室温にて透析し、さらに凍結乾燥してＣ１２７−
ＤＴＩの精製品４ｍｇを得た。以上述べた精製工程の結
果を表４にまとめて示す。

【００３９】

【表４】 ──────────────────────────────────── 精製工程 容量 阻害活性 総阻害活性 収率 比活性 精製比率 (ml) (U/μl) (U×10^-3) (%) (U/OD₂₁₀) ──────────────────────────────────── 培養濾液 1000 13 13000 100 0.3 1.0 粗精製液 100 45 4500 35 0.4 1.2 活性画分Ｉ 50 92 4600 35 0.7 2.2 活性画分II 8 525 4200 32 1.5 4.6 活性画分III 4 920 3680 28 3.4 10.3 活性画分IV 2 478 956 7 14.5 43.9 C127-DTI 1 420 420 3 55.3 167.5 ────────────────────────────────────

【００４０】なお、阻害活性は、トポイソメラーゼＩの
活性を５０％阻害する量を１ｕｎｉｔと定めた。

【００４１】実施例２：トポイソメラーゼＩ阻害活性測
定 トポイソメラーゼＩは、二重鎖ＤＮＡに切断を導入する
ことにより超らせんを弛緩する活性を有しているので、
トポイソメラーゼＩによるＤＮＡ弛緩（ｒｅｌａｘａｔ
ｉｏｎ）活性の減少を測定して、Ｃ１２７−ＤＴＩの阻
害活性を算出した。９６穴プレートに２倍濃度のトポイ
ソメラーゼＩ活性測定用緩衝液（２×ＴｏｐｏＩ ａｓ
ｓａｙ ｂｕｆｆｅｒ；１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ΗＣｌ
緩衝液（ｐΗ７．５）、２４０ｍＭ ＫＣｌ、２０ｍＭ
ＭｇＣｌ₂、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭジチオスレイ
トール、６０μｇ／ｍｌ 牛血清アルブミン（ＢＳ
Ａ））１０μｌ、Ｃ１２７−ＤＴＩ試料溶液８．３μ
ｌ、子牛胸腺由来のトポイソメラーゼＩ（２ｕｎｉｔ／
μｌ）０．５μｌを添加後、３７℃で５分間プレインキ
ュベーションする。次に、基質ＤＮΑであるｐＢＲ３２
２（０．１２５μｇ／μｌ）１．２μｌを添加し、３７
℃、４０分間反応させる。反応後、電気泳動試料用緩衝
液（２倍濃度のＴＢＥ緩衝液（２００ｍＭ Ｔｒｉｓ、
２００ｍＭホウ酸、５ｍＭ ＥＤＴＡ）、１０％ブロム
フェノールブルー、５０％グリシン）１０μｌを添加
し、その反応液１２μｌをアガロースゲル電気泳動に用
いた。

【００４２】電気泳動は、次のようにして行った。アガ
ロース０．３ｇにＴＢＥ緩衝液３０ｍｌを加え、加熱溶
解する。電気泳動用プレートにアガロース液を流し入
れ、固化後、アガロースゲルの溝に試料溶液を添加し、
１００Ｖ、１時間、ＴＢＥ緩衝液中で電気泳動を行う。
泳動後、ゲルをエチジウムブロマイド溶液（５０μｇ／
ｍｌ）２００ｍｌで１分間染色し、次に水５００ｍｌで
５分、１０分および１０分間隔で３回脱色する。泳動お
よび染色後、ｐＢＲ３２２の弛緩ＤＮＡ（ｒｅｌａｘｅ
ｄ ＤＮＡ）のバンドと超らせんＤＮΑ（ｓｕｐｅｒｃ
ｏｉｌｅｄ ＤＮＡ）のバンドとは移動度の違いにより
別バンドとして現れるので、各バンドをＵＶトランスイ
ルミネーター（ＴＭ３６（商品名、フナコシ（株））と
デンシトメーター（ＡＥ−６９００Ｍ（商品名、アトー
（株）））で測定し、反応前後における各ＤＮＡ量の変
化を求める。すなわち、Ｃ１２７−ＤＴＩによってトポ
イソメラーゼＩが阻害されるために現れる未反応のｐＢ
Ｒ３２２のバンド（超らせんＤＮΑ量）から、トポイソ
メラーゼＩのＤＮＡ弛緩（ｒｅｌａｘａｔｉｏｎ）活性
の減少を求め、阻害活性を算出した。

【００４３】Ｃ１２７−ＤＴＩの濃度変化に伴う、トポ
イソメラーゼＩに対する阻害活性を図３に示す（○）。
図３中の横軸は反応系中の阻害剤の濃度（試料溶液中ｎ
ｇ／μｌ）、縦軸はトポイソメラーゼＩに対する阻害活
性（％）を表わす。この阻害活性は、トポイソメラーゼ
ＩによるＤＮＡ弛緩（ｒｅｌａｘａｔｉｏｎ）活性の減
少を指標としている。図３から明らかなように、Ｃ１２
７−ＤＴＩはトポイソメラーゼＩのＤＮＡ弛緩活性を阻
害し、ＩＣ₅₀値は０．４８ｎｇ／μｌであった。

【００４４】また上記のトポイソメラーゼＩ阻害活性測
定法においてＣ１２７−ＤＴＩ濃度を０．５３ｎｇ／μ
ｌに固定し、基質ＤＮＡであるｐＢＲ３２２の濃度を変
化させて活性を測定した。これをＬｉｎｅｗｅａｖｅｒ
−Ｂｕｒｋプロットにしたものを図４に示す。図４から
明らかなようにＣ１２７−ＤＴＩの阻害形式は、非拮抗
阻害であり、Ｋｉ値は３．７ｎＭである。

【００４５】実施例３：トポイソメラーゼII阻害活性測
定（１） トポイソメラーゼIIによるＤＮＡ弛緩（ｒｅｌａｘａｔ
ｉｏｎ）活性が、Ｃ１２７−ＤＴＩによって減少する程
度を測定し、Ｃ１２７−ＤＴＩの阻害活性を算出した。
阻害活性の測定は以下のようにして行った。ＤＮＡ弛緩
活性の阻害を測定するための反応混合液は、９６穴プレ
ートに２倍濃度のトポイソメラーゼII活性測定用緩衝液
（２×Ｔｏｐｏ II ａｓｓａｙ ｂｕｆｆｅｒ（商品
名、トポゲン（ＴｏｐｏＧｅｎ）社）；１０ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ，ｐΗ８．０、２４ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ
ΜｇＣｌ₂、０．１ｍＭ ＡＴＰ、０．１ｍΜ ジチ
オスレイトール、６μｇ／ｍｌ ＢＳΑ）１０μｌ、Ｃ
１２７−ＤＴＩ試料溶液８．３μｌ、ヒト胎盤由来のト
ポイソメラーゼII（２ｕｎｉｔ／μｌ）０．５μｌおよ
びｐＢＲ３２２（０．１２５μｇ／μｌ）１．２μｌを
添加後、３７℃で４０分間反応させたものである。

【００４６】反応後、前記の電気泳動試料用緩衝液４μ
ｌを添加し、その１２μｌをアガロースゲル電気泳動に
用いた。泳動後、ｐＢＲ３２２の超らせんＤＮΑ（ｓｕ
ｐｅｒｃｏｉｌｅｄ ＤＮＡ）量の変化をデンシトメー
ターで測定し、ＤＮＡ弛緩（ｒｅｌａｘａｔｉｏｎ）活
性の減少から、Ｃ１２７−ＤＴＩの阻害活性を求めた。

【００４７】Ｃ１２７−ＤＴＩの濃度変化に伴う、トポ
イソメラーゼIIのＤＮＡ弛緩（ｒｅｌａｘａｔｉｏｎ）
活性に対する阻害活性を図３に示す（●）。図３中の横
軸は反応系中のＣ１２７−ＤＴＩの濃度（試料溶液中ｎ
ｇ／μｌ）、縦軸はトポイソメラーゼIIのＤＮＡ弛緩
（ｒｅｌａｘａｔｉｏｎ）活性に対する阻害活性（％）
を表わす。図３から明らかなように、Ｃ１２７−ＤＴＩ
はトポイソメラーゼIIのＤＮＡ弛緩活性を阻害し、その
ＩＣ₅₀値は０．１７ｎｇ／μｌであった。

【００４８】また上記のトポイソメラーゼIIのＤＮＡ弛
緩（ｒｅｌａｘａｔｉｏｎ）活性に対する阻害活性測定
法において、Ｃ１２７−ＤＴＩ濃度を０．２０ｎｇ／μ
ｌに固定し、基質ＤＮＡであるｐＢＲ３２２の濃度を変
化させて活性を測定した。これをＬｉｎｅｗｅａｖｅｒ
−Ｂｕｒｋプロットにしたものを図５に示す。図５から
明らかなようにＣ１２７−ＤＴＩの阻害形式は、非拮抗
阻害であり、Ｋｉ値は１．３ｎＭである。

【００４９】実施例４：トポイソメラーゼII阻害活性測
定（２） トポイソメラーゼIIによるＤＮＡ相互通り抜け反応（ｄ
ｅｃａｔｅｎａｔｉｏｎ）活性が、Ｃ１２７−ＤＴＩに
よって減少する程度を測定し、Ｃ１２７−ＤＴＩの阻害
活性を算出した。阻害活性の測定は以下のようにして行
った。ＤＮＡ弛緩活性の阻害を測定するための反応混合
液は、９６穴プレートに２倍濃度のトポイソメラーゼII
活性測定用緩衝液（２×Ｔｏｐｏ II ａｓｓａｙ ｂ
ｕｆｆｅｒ（商品名、トポゲン（ＴｏｐｏＧｅｎ）
社）；１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐΗ８．０、２４
ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ΜｇＣｌ₂、０．１ｍＭ ＡＴ
Ｐ、０．１ｍΜ ジチオスレイトール、６μｇ／ｍｌ
ＢＳΑ）１０μｌ、Ｃ１２７−ＤＴＩ試料溶液４．５μ
ｌ、ヒト胎盤由来のトポイソメラーゼII（２ｕｎｉｔ／
μｌ）０．５μｌおよびＫｉｎｅｔｏｐｌａｓｔ ＤＮ
Ａ（０．０６５μｇ／μｌ）５．０μｌを添加後、３７
℃で４０分間反応させたものである。

【００５０】反応後、前記の電気泳動試料用緩衝液４μ
ｌを添加し、反応液中１２μｌをアガロースゲル電気泳
動に用いた。泳動後、Ｋｉｎｅｔｏｐｌａｓｔ ＤＮＡ
の相互通り抜けしたＤＮＡ（ｄｅｃａｔｅｎａｔｅｄ
ＤＮＡ）量の変化をデンシトメーターで測定し、ＤＮＡ
相互通り抜け反応活性の減少から、Ｃ１２７−ＤＴＩの
阻害活性を求めた。その結果、Ｃ１２７−ＤＴＩは、ト
ポイソメラーゼIIによるＤＮＡ相互通り抜け反応（ｄｅ
ｃａｔｅｎａｔｉｏｎ）活性を阻害し、そのＩＣ₅₀値は
０．０９ｎｇ／μｌであった。

【００５１】また上記のトポイソメラーゼIIのＤＮＡ相
互通り抜け反応（ｄｅｃａｔｅｎａｔｉｏｎ）活性に対
する阻害活性測定法において、Ｃ１２７−ＤＴＩ濃度を
０．１１ｎｇ／μｌに固定し、基質ＤＮＡであるｋｉｎ
ｅｔｏｐｌａｓｔ ＤＮＡの濃度を変化させて活性を測
定した。これをＬｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋプロッ
トにしたものを図６に示す。図６から明らかなようにＣ
１２７−ＤＴＩの阻害形式は、非拮抗阻害であり、Ｋｉ
値は３．０ｎＭである。

【００５２】実施例４：Ｃ１２７−ＤＴＩとＤＮＡの相
互作用 公知のトポイソメラーゼ阻害剤であるカンプトテシンは
トポイソメラーゼ−ＤＮΑ複合体に結合して切断複合体
を形成することが報告されており（Ｙａｍａｓｈｉｔ
ａ，Ｂｉｏｃｈｃｍｉｓｔｒｙ，３０，５８３８〜５８
４５（１９９１））、この性質のためにＤＮＡに損傷を
与える。そこで、本発明による阻害剤であるＣ１２７−
ＤＴＩのＤＮＡに対する影響を調べた。

【００５３】（１）ＤＮＡ切断複合体の形成図７にＣ１
２７−ＤＴＩおよびカンプトテシンの濃度に対する、こ
れらの阻害剤によって生成したニックの入ったＤＮＡ
（ｎｉｃｋｅｄ ＤＮΑ）の量（％）を示す。図７より
明らかなように、カンプトテシンは前記したようにトポ
イソメラーゼＩ−ＤＮΑ複合体に結合して切断複合体を
形成するため、該阻害剤を添加したもの（図中○）で
は、ニックの入ったＤＮＡ量の増加が認められた。一
方、Ｃ１２７−ＤＴＩを添加したもの（図中●）では、
ニックの入ったＤＮＡ量の増加が認められなかったこと
から、Ｃ１２７−ＤＴＩはＤＮＡ切断複合体を形成せ
ず、遊離のトポイソメラーゼＩに直接結合して酵素活性
を阻害すると考えられる。

【００５４】なお、測定は、以下のようにして行った。
エッペンドルフチューブに、２倍濃度のトポイソメラー
ゼＩ活性測定用緩衝液（２×ＴｏｐｏＩ ａｓｓａｙ
ｂｕｆｆｅｒ）１０μｌ、ｐＢＲ３２２（０．１μｇ／
μｌ）１．７μｌ、試料溶液７．５μｌ、トポイソメラ
ーゼＩ（２５ｕｎｉｔ／μｌ）０．８μｌを加え、３７
℃にて４０分間反応させた。次に反応停止液（５％ＳＤ
Ｓ、２．５ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ）５μｌを添加
し、再度３７℃にて４０分間処理した。その後、電気泳
動試料用緩衝液（２倍濃度のＴＢＥ緩衝液（２００ｍＭ
Ｔｒｉｓ、２００ｍＭホウ酸、５ｍＭ ＥＤＴＡ）、
１０％ブロムフェノールブルー、５０％グリシン）１０
μｌを添加し、その反応液２０μｌををエチジウムブロ
マイド０．５μｇ／ｍｌを含むアガロースゲルを用いて
電気泳動を行い、ニックの入ったｐＢＲ３２２量をデン
シトメーターで測定した。

【００５５】（２）インターカレート作用 Ｃ１２７−ＤＴＩのインターカレート作用について調べ
るため、インターカレート作用を有する蛍光剤であるエ
チジウムブロマイド（Ｅｔｈｉｄｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄ
ｅ）を用い、該阻害剤と拮抗阻害させて調べた（堀口ら
の方法に準じて行った。Ｈｏｒｉｇｕｃｈｉ，Ｊ．Ａｎ
ｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，４７，５４５〜５５５（１９９
４））。すなわち、ニシン精子ＤＮＡ６．６μｇ、１０
ｍＭエチジウムブロマイド、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１
ｍＭ ＥＤＴＡを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐ
Ｈ７．５）緩衝液１００μｌに阻害剤溶液１００μｌを
混合した後、５７５ｎｍにおける蛍光強度を測定した。
なお、ドキソルビシンについては３００ｎｍ、Ｃ１２７
−ＤＴＩおよびカンプトテシンについては５４５ｎｍの
励起光をそれぞれ用いた。

【００５６】図８に、Ｃ１２７−ＤＴＩ、カンプトテシ
ンおよびドキソルビシンのエチジウムブロマイドとの拮
抗阻害活性について調べた結果を示す。図８の横軸は図
７と同様であり、縦軸はコントロールに対するエチジウ
ムブロマイドの蛍光強度（％）を示す。図８から明らか
なように、ＤＮΑにインターカレートすることが知られ
ているドキソルビシン（図中□）では、エチジウムブロ
マイドの蛍光強度の減少が認められ、ＤＮＡに本剤がイ
ンターカレートすることが確認された。一方、Ｃ１２７
−ＤＴＩ（図中●）およびカンプトテシン（図中○）で
は、エチジウムブロマイドの蛍光強度の減少が認められ
ず、Ｃ１２７−ＤＴＩはＤＮＡにインターカレートしな
いことが明らかとなった。

【００５７】

【発明の効果】本発明の酵素阻害剤であるＣ１２７−Ｄ
ＴＩは、トポイソメラーゼＩおよびIIを強く阻害し、そ
の阻害形式は非拮抗阻害である。現在制がん剤として用
いられているカンプトテシンおよびドキソルビシンとは
異なり、ＤＮＡ鎖に切断等の障害を全く引き起こさない
ので、副作用の少ない新しい制がん剤として期待され
る。

【図面の簡単な説明】

【図１】 ゲル濾過法によるＣ１２７−ＤＴＩの分子量
を示すグラフである。

【図２】 Ｃ１２７−ＤＴＩのＵＶ吸収スペクトルであ
る。

【図３】 トポイソメラーゼＩおよびトポイソメラーゼ
IIのＤＮＡ弛緩活性に対するＣ１２７−ＤＴＩの阻害活
性を示すグラフである。

【図４】 Ｃ１２７−ＤＴＩのトポイソメラーゼＩのＤ
ＮＡ弛緩活性に対する阻害形式を示すＬｉｎｅｗｅａｖ
ｅｒ−Ｂｕｒｋプロットである。

【図５】 Ｃ１２７−ＤＴＩのトポイソメラーゼIIのＤ
ＮＡ弛緩活性に対する阻害形式を示すＬｉｎｅｗｅａｖ
ｅｒ−Ｂｕｒｋプロットである。

【図６】 Ｃ１２７−ＤＴＩのトポイソメラーゼIIのＤ
ＮＡ相互通り抜け反応活性に対する阻害形式を示すＬｉ
ｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋプロットである。

【図７】 Ｃ１２７−ＤＴＩおよびカンプトテシンによ
る、酵素−ＤＮＡの切断複合体の形成度を示すグラフで
ある。

【図８】 Ｃ１２７−ＤＴＩ、カンプトテシンおよびド
キソルビシンとＤＮＡとの結合に対するエチジウムブロ
マイドの拮抗阻害を示すグラフである。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記の理化学的性質を有するトポイソメ
   ラーゼ阻害剤； （１）外観：白色粉末 （２）溶解性：水に易溶、酸性水、メタノール、アセト
   ン、クロロホルムに不溶。 （３）分子量：４５０００ （４）ＵＶ吸収スペクトル：水に溶解して測定したＵＶ
   吸収スペクトルは２２４ｎｍに吸収極大を有する。 （５）呈色反応：硫酸試薬、ブロムクレゾールグリーン
   （ｂｒｏｍｃｒｅｓｏｌｇｒｅｅｎ）試薬、ニンヒドリ
   ン（ｎｉｎｈｙｄｒｉｎ）試薬、ライドン−スミス（Ｒ
   ｙｄｏｎｅ−Ｓｍｉｔｈ）試薬およびアズレＡ（Ａｚｕ
   ｒｅ Ａ）試薬による呈色反応は陽性であり、モーリッ
   シュ（Ｍｏｌｉｓｃｈ）試薬、フェノール硫酸試薬、ア
   ニスアルデヒド（ａｎｉｓａｌｄｅｈｙｄｅ）試薬、エ
   ルソン−モルガン（Ｅｌｓｏｎ−Ｍｏｒｇａｎ）試薬、
   エーリッヒ（Ｅｈｒｌｉｃｈ）試薬およびジットマー
   （Ｄｉｔｔｍｅｒ）試薬による呈色反応は陰性である。 （６）トポイソメラーゼ阻害活性：トポイソメラーゼＩ
   およびIIのＤＮＡ弛緩活性に対し阻害活性を有し、ＩＣ
   ₅₀値はそれぞれ０．４８ｎｇ／μｌ、０．１７ｎｇ／μ
   ｌである。 （７）熱安定性：１００℃において１５分間加熱したと
   き、トポイソメラーゼ阻害活性は１００％残存する。
2. 【請求項２】 ストレプトマイセス属に属する微生物を
   培養し、培養物から請求項１に記載のトポイソメラーゼ
   阻害剤を採取することを特徴とする請求項１記載のトポ
   イソメラーゼ阻害剤の製造方法。
3. 【請求項３】 請求項１記載のトポイソメラーゼ阻害剤
   を生産する能力を有する微生物、ストレプトマイセス・
   スピーシーズ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｓｐ．） Ｃ
   −１２７（ＦＥＲＭ Ｐ−１６５０９）。
4. 【請求項４】 請求項１に記載のトポイソメラーゼ阻害
   剤を有効成分とする医薬。