JPH10179160A - モノクローナル抗体の調製方法、モノクローナル抗体、医薬組成物及び診断試薬 - Google Patents
モノクローナル抗体の調製方法、モノクローナル抗体、医薬組成物及び診断試薬Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 比較的少量しか存在しない抗原、または極め
て少量しか入手できない抗原、またはｉｎ ｖｉｖｏコ
ンホメーションが損傷され易い抗原に対して好適であ
る、細胞及びウイルスの表面抗原に対するモノクローナ
ル抗体を産生させる効率的な方法を提供する。 【解決手段】 表面抗原含有材料を注射した哺乳動物に
由来のＢ細胞を特異的Ｂ細胞の相対数に関して富化する
段階と、小規模融合技術から成る段階とを含む。
て少量しか入手できない抗原、またはｉｎ ｖｉｖｏコ
ンホメーションが損傷され易い抗原に対して好適であ
る、細胞及びウイルスの表面抗原に対するモノクローナ
ル抗体を産生させる効率的な方法を提供する。 【解決手段】 表面抗原含有材料を注射した哺乳動物に
由来のＢ細胞を特異的Ｂ細胞の相対数に関して富化する
段階と、小規模融合技術から成る段階とを含む。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、表面抗原に対する
モノクローナル抗体の製造方法、特に、哺乳動物に注射
される極めて微量の全抗原を構成する表面抗原、及び、
そのｉｎ ｖｉｖｏコンホメーションが損傷され易い表
面抗原に対するモノクローナル抗体の製造方法に関す
る。全抗原量に対して微量の抗原という問題は例えば、
哺乳動物に注射される抗原材料が別種の哺乳動物に由来
するときに生じる。
モノクローナル抗体の製造方法、特に、哺乳動物に注射
される極めて微量の全抗原を構成する表面抗原、及び、
そのｉｎ ｖｉｖｏコンホメーションが損傷され易い表
面抗原に対するモノクローナル抗体の製造方法に関す
る。全抗原量に対して微量の抗原という問題は例えば、
哺乳動物に注射される抗原材料が別種の哺乳動物に由来
するときに生じる。
【０００２】上記に特定した抗原に関連する問題は例え
ば、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）の特異性決定部位に対
するモノクローナル抗体の作製が望まれるときに明らか
になる。このような（モノクローナル）抗体は、１つの
特定Ｔ細胞クローンのＴ細胞レセプターの抗原特異的部
位（またはクロノタイプ構造）を認識するので抗クロノ
タイプ抗体として知られている。ネズミのＴ細胞レセプ
ター（ＴＣＲ）に対する（ネズミの）モノクローナル抗
クロノタイプ抗体は時々にしか報告されていないが、ヒ
トのＴ細胞レセプターに対する（ネズミの）モノクロー
ナル抗クロノタイプ抗体はもっと少ない。Ｔ細胞は培養
し難いので、十分な量の抗原即ちＴ細胞レセプタータン
パク質を入手し精製することが困難である。従って、免
疫応答を得ることも難しく、スクリーニングも難しい。
ヒトＴＣＲに対するモノクローナル抗クロノタイプ抗体
を入手できる少数の場合の１つでは、抗原がＪｕｒｋａ
ｔ白血病細胞に存在するのでこれらの問題が生じなかっ
た（参考文献１）。白血病細胞は無限量に培養できるの
で、抗原の不足という問題が生じなかった。従って、現
在までの処、希有な及び／または極めて不安定な抗原に
対するモノクローナル抗体を製造するために使用できる
方法であって多数のハイブリドーマクローンのスクリー
ニングを要するという欠点を伴っていない方法は存在し
ない。
ば、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）の特異性決定部位に対
するモノクローナル抗体の作製が望まれるときに明らか
になる。このような（モノクローナル）抗体は、１つの
特定Ｔ細胞クローンのＴ細胞レセプターの抗原特異的部
位（またはクロノタイプ構造）を認識するので抗クロノ
タイプ抗体として知られている。ネズミのＴ細胞レセプ
ター（ＴＣＲ）に対する（ネズミの）モノクローナル抗
クロノタイプ抗体は時々にしか報告されていないが、ヒ
トのＴ細胞レセプターに対する（ネズミの）モノクロー
ナル抗クロノタイプ抗体はもっと少ない。Ｔ細胞は培養
し難いので、十分な量の抗原即ちＴ細胞レセプタータン
パク質を入手し精製することが困難である。従って、免
疫応答を得ることも難しく、スクリーニングも難しい。
ヒトＴＣＲに対するモノクローナル抗クロノタイプ抗体
を入手できる少数の場合の１つでは、抗原がＪｕｒｋａ
ｔ白血病細胞に存在するのでこれらの問題が生じなかっ
た（参考文献１）。白血病細胞は無限量に培養できるの
で、抗原の不足という問題が生じなかった。従って、現
在までの処、希有な及び／または極めて不安定な抗原に
対するモノクローナル抗体を製造するために使用できる
方法であって多数のハイブリドーマクローンのスクリー
ニングを要するという欠点を伴っていない方法は存在し
ない。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、上述
のような好ましいくない状況下の細胞表面抗原に対する
モノクローナル抗体の製造方法を提供することである。
この方法はスクリーニングを要するハイブリドーマクロ
ーンの数を劇的に減少させるので、本発明方法を従来技
術の方法よりも効率的にするだけでなく、従来技術の方
法で成功しなかった場合を成功に導くことも可能であ
る。
のような好ましいくない状況下の細胞表面抗原に対する
モノクローナル抗体の製造方法を提供することである。
この方法はスクリーニングを要するハイブリドーマクロ
ーンの数を劇的に減少させるので、本発明方法を従来技
術の方法よりも効率的にするだけでなく、従来技術の方
法で成功しなかった場合を成功に導くことも可能であ
る。
【０００４】
【課題を解決するための手段】このために、本発明方法
は、（１）（ｉ）全細胞と、（ｉｉ）全細胞を処理する
ことによって得られた膜画分、とから成るグループから
選択された細胞表面抗原含有材料を哺乳動物に注射する
段階と、（２）前記哺乳動物の脾臓からＢ細胞含有細胞
画分を単離する段階と、（３）前記全細胞に近縁で前記
細胞表面抗原の欠如した細胞の担体結合材料と該細胞画
分とを接触させることによって、段階２で得られた前記
細胞画分中の前記細胞表面抗原特異的Ｂ細胞を富化し、
次いで、近縁細胞の担体結合材料に結合したＢ細胞を、
次段階で使用すべき富化された非結合Ｂ細胞含有画分か
ら分離する段階と、（４）前段階で得られた富化Ｂ細胞
含有細胞画分を限界希釈及びクローン増量（ｃｌｏｎａ
ｌ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）で順次に処理する段階と、
（５）Ｂ細胞クローンを選択し、前記選択されたＢ細胞
クローンを小規模融合技術を用いて不死化する段階と、
（６）前記細胞表面抗原に特異的に結合する抗体を産生
し得るハイブリドーマを選択及びクローニングし、次い
でモノクローナル抗体含有画分を前記ハイブリドーマの
上清から単離する段階とから成る。
は、（１）（ｉ）全細胞と、（ｉｉ）全細胞を処理する
ことによって得られた膜画分、とから成るグループから
選択された細胞表面抗原含有材料を哺乳動物に注射する
段階と、（２）前記哺乳動物の脾臓からＢ細胞含有細胞
画分を単離する段階と、（３）前記全細胞に近縁で前記
細胞表面抗原の欠如した細胞の担体結合材料と該細胞画
分とを接触させることによって、段階２で得られた前記
細胞画分中の前記細胞表面抗原特異的Ｂ細胞を富化し、
次いで、近縁細胞の担体結合材料に結合したＢ細胞を、
次段階で使用すべき富化された非結合Ｂ細胞含有画分か
ら分離する段階と、（４）前段階で得られた富化Ｂ細胞
含有細胞画分を限界希釈及びクローン増量（ｃｌｏｎａ
ｌ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）で順次に処理する段階と、
（５）Ｂ細胞クローンを選択し、前記選択されたＢ細胞
クローンを小規模融合技術を用いて不死化する段階と、
（６）前記細胞表面抗原に特異的に結合する抗体を産生
し得るハイブリドーマを選択及びクローニングし、次い
でモノクローナル抗体含有画分を前記ハイブリドーマの
上清から単離する段階とから成る。
【０００５】明細書の本文及び請求の範囲の解釈及び理
解を容易にするために、本文中で使用された細胞という
用語は、哺乳動物の細胞だけでなくウイルス、特に膜含
有ウイルスを包含する。
解を容易にするために、本文中で使用された細胞という
用語は、哺乳動物の細胞だけでなくウイルス、特に膜含
有ウイルスを包含する。
【０００６】細胞の担体結合材料という用語は、完全形
（ｉｎｔａｃｔ）細胞または全細胞（及びウイルス）、
このような完全形の全細胞（及びウイルス）の膜画分、
または実質的に精製された表面抗原またはその複合体を
意味する。
（ｉｎｔａｃｔ）細胞または全細胞（及びウイルス）、
このような完全形の全細胞（及びウイルス）の膜画分、
または実質的に精製された表面抗原またはその複合体を
意味する。
【０００７】特に注釈がない限り、全細胞なる用語は、
問題の表面抗原を有する細胞を意味する。近縁細胞なる
用語は、好ましくは問題の表面抗原が欠如していること
だけが違っている細胞、またはより詳細には、産生させ
ることが望まれるモノクローナル抗体に対する免疫決定
基が少なくとも欠如している細胞を意味する。
問題の表面抗原を有する細胞を意味する。近縁細胞なる
用語は、好ましくは問題の表面抗原が欠如していること
だけが違っている細胞、またはより詳細には、産生させ
ることが望まれるモノクローナル抗体に対する免疫決定
基が少なくとも欠如している細胞を意味する。
【０００８】意外にも、単離Ｂ細胞含有細胞画分を細胞
表面抗原含有材料と同種の細胞に由来するが細胞表面抗
原が欠如した細胞材料と接触させることによって、細胞
表面抗原の使用を要せずに細胞画分中で細胞表面抗原に
特異的なＢ細胞を富化させるのが可能であることが判明
した。言い換えると、Ｂ細胞を無関係（ｉｒｒｅｌｅｖ
ａｎｔ）の近縁細胞または細胞材料と接触させ、結合し
たＢ細胞を除去することによって富化が達成される。
表面抗原含有材料と同種の細胞に由来するが細胞表面抗
原が欠如した細胞材料と接触させることによって、細胞
表面抗原の使用を要せずに細胞画分中で細胞表面抗原に
特異的なＢ細胞を富化させるのが可能であることが判明
した。言い換えると、Ｂ細胞を無関係（ｉｒｒｅｌｅｖ
ａｎｔ）の近縁細胞または細胞材料と接触させ、結合し
たＢ細胞を除去することによって富化が達成される。
【０００９】従って、細胞表面抗原がコンホメーション
不安定な場合であっても、少量の細胞表面抗原に対する
モノクローナル抗体を製造することが可能である。
不安定な場合であっても、少量の細胞表面抗原に対する
モノクローナル抗体を製造することが可能である。
【００１０】欧州特許ＥＰ０，４８８，４７０及び該欧
州特許に基づく参考文献３は、（Ｉ）哺乳動物に抗原を
注射し、（ＩＩ）Ｂ細胞含有画分を単離し、（ＩＩＩ）
抗原特異的Ｂ細胞を選択し、（ＩＶ）富化画分をクロー
ン増量させ、（Ｖ）小規模融合技術を用いてＢ細胞クロ
ーンを選択し、不死化した後で、（ＶＩ）ハイブリドー
マを選択及びクローニングし、次いでモノクローナル抗
体含有画分を単離する方法を記載している。段階ＩＩＩ
では、抗原をコートしたプラスチック表面にＢ細胞を結
合させるか、または、抗原をコートした常磁性ビーズで
Ｂ細胞にロゼット形成することによってＢ細胞を選択す
る。非特異的Ｂ細胞を洗浄によって除去する。従って、
他の違いを別にすると、この方法は十分な量の抗原を入
手及び使用できることに依存している。即ち、選択中に
抗原でプレートをコートするために２マイクログラム／
ｍｌの抗原を使用する。これに反して本発明は、極めて
少量かつ極めて不純な抗原しか入手できない場合の問題
を解決する。
州特許に基づく参考文献３は、（Ｉ）哺乳動物に抗原を
注射し、（ＩＩ）Ｂ細胞含有画分を単離し、（ＩＩＩ）
抗原特異的Ｂ細胞を選択し、（ＩＶ）富化画分をクロー
ン増量させ、（Ｖ）小規模融合技術を用いてＢ細胞クロ
ーンを選択し、不死化した後で、（ＶＩ）ハイブリドー
マを選択及びクローニングし、次いでモノクローナル抗
体含有画分を単離する方法を記載している。段階ＩＩＩ
では、抗原をコートしたプラスチック表面にＢ細胞を結
合させるか、または、抗原をコートした常磁性ビーズで
Ｂ細胞にロゼット形成することによってＢ細胞を選択す
る。非特異的Ｂ細胞を洗浄によって除去する。従って、
他の違いを別にすると、この方法は十分な量の抗原を入
手及び使用できることに依存している。即ち、選択中に
抗原でプレートをコートするために２マイクログラム／
ｍｌの抗原を使用する。これに反して本発明は、極めて
少量かつ極めて不純な抗原しか入手できない場合の問題
を解決する。
【００１１】
【発明の実施の形態】好ましい実施態様は、表面抗原を
注射した哺乳動物が表面抗原の起原となる哺乳動物とは
異なる種から成ることを特徴とする。
注射した哺乳動物が表面抗原の起原となる哺乳動物とは
異なる種から成ることを特徴とする。
【００１２】本発明方法は、免疫応答を誘発し得る多数
の抗原が存在するときにモノクローナル抗体を産生させ
るために極めて好適である。
の抗原が存在するときにモノクローナル抗体を産生させ
るために極めて好適である。
【００１３】このような状況は特に、表面抗原が定常部
と可変部とを有し、可変部の少なくとも一部が表面抗原
の特異性決定部位を形成している場合に存在する。
と可変部とを有し、可変部の少なくとも一部が表面抗原
の特異性決定部位を形成している場合に存在する。
【００１４】好ましい実施態様によれば、レセプター分
子含有材料を細胞表面抗原含有材料として使用する。
子含有材料を細胞表面抗原含有材料として使用する。
【００１５】本発明方法は、レセプター分子の特異性決
定部位に対するモノクローナル抗体を製造するために特
に好適である。レセプター分子の特異性決定部位はレセ
プター分子の小部分でしかなく、しかもレセプター分子
自体が細胞の表面の全分子、即ち抗原の微量構成成分で
ある。
定部位に対するモノクローナル抗体を製造するために特
に好適である。レセプター分子の特異性決定部位はレセ
プター分子の小部分でしかなく、しかもレセプター分子
自体が細胞の表面の全分子、即ち抗原の微量構成成分で
ある。
【００１６】本発明の好ましいターゲットはＴ細胞クロ
ーンであり、このＴ細胞クローンはレセプター分子含有
材料を準備するために使用される。
ーンであり、このＴ細胞クローンはレセプター分子含有
材料を準備するために使用される。
【００１７】Ｔ細胞は全細胞として使用されてもよく、
または、その膜画分を調製するために使用されてもよ
い。前者の場合に、準備という用語は、Ｔ細胞の単なる
単離、またはＴ細胞を異なる媒体中に再懸濁させること
を意味する。
または、その膜画分を調製するために使用されてもよ
い。前者の場合に、準備という用語は、Ｔ細胞の単なる
単離、またはＴ細胞を異なる媒体中に再懸濁させること
を意味する。
【００１８】好ましい実施態様によれば、段階１の膜画
分は全細胞の機械的処理によって得られる。また、細胞
表面抗原含有材料はアジュバントを存在させずに哺乳動
物に注射される。
分は全細胞の機械的処理によって得られる。また、細胞
表面抗原含有材料はアジュバントを存在させずに哺乳動
物に注射される。
【００１９】双方の処置は表面抗原のｉｎ ｖｉｖｏコ
ンホメーションの損傷を防止するために役立つ。
ンホメーションの損傷を防止するために役立つ。
【００２０】更に、富化Ｂ細胞を含有する細胞画分を好
ましくはより高度に富化する（段階３）。このために
は、（ｊ）全細胞と、（ｊｊ）全細胞から得られた膜画
分と、（ｊｊｊ）実質的に精製された細胞表面抗原との
グループから選択された材料から成り細胞表面抗原を含
有している担体結合材料と細胞画分とを接触させ、次い
で担体結合材料に結合したＢ細胞から担体結合材料に結
合しなかったＢ細胞を分離する。この担体結合材料に結
合したＢ細胞が、より高度に富化された細胞画分を構成
する。
ましくはより高度に富化する（段階３）。このために
は、（ｊ）全細胞と、（ｊｊ）全細胞から得られた膜画
分と、（ｊｊｊ）実質的に精製された細胞表面抗原との
グループから選択された材料から成り細胞表面抗原を含
有している担体結合材料と細胞画分とを接触させ、次い
で担体結合材料に結合したＢ細胞から担体結合材料に結
合しなかったＢ細胞を分離する。この担体結合材料に結
合したＢ細胞が、より高度に富化された細胞画分を構成
する。
【００２１】この高度な富化は正の選択技術と命名さ
れ、特異的Ｂ細胞を特定的に選択する。従って、任意の
抗原がほとんど入手できない場合であっても、高度な富
化が達成された。
れ、特異的Ｂ細胞を特定的に選択する。従って、任意の
抗原がほとんど入手できない場合であっても、高度な富
化が達成された。
【００２２】好ましい実施態様によれば、常磁性ビーズ
が担体として有利に使用される。
が担体として有利に使用される。
【００２３】富化中の常磁性ビーズの使用は、必要なＢ
細胞と不要なＢ細胞との分離を容易にする。
細胞と不要なＢ細胞との分離を容易にする。
【００２４】微量の抗原もスクリーニング中の問題とな
る。好ましい実施態様によれば、段階５及び６の少なく
とも１つにおける選択を凝集アッセイを用いて行う。こ
の凝集アッセイにおいては、Ｂ細胞クローンの上清を、
段階１で使用した注射哺乳動物種の抗体に結合し得る抗
体をコートした担体と、細胞表面抗原を含む全細胞と接
触とにさせ、凝集を検出する。
る。好ましい実施態様によれば、段階５及び６の少なく
とも１つにおける選択を凝集アッセイを用いて行う。こ
の凝集アッセイにおいては、Ｂ細胞クローンの上清を、
段階１で使用した注射哺乳動物種の抗体に結合し得る抗
体をコートした担体と、細胞表面抗原を含む全細胞と接
触とにさせ、凝集を検出する。
【００２５】Ｂ細胞培養上清と、全細胞と、段階１で使
用した哺乳動物種の抗体に結合し得る抗体をコートした
担体とを単に混合するだけで、洗浄を必要とすることな
く適当なクローンを極めて高感度で迅速に検出し得る。
用した哺乳動物種の抗体に結合し得る抗体をコートした
担体とを単に混合するだけで、洗浄を必要とすることな
く適当なクローンを極めて高感度で迅速に検出し得る。
【００２６】全細胞に近縁であるが細胞表面抗原の欠失
した全細胞を対照として使用するのが有利である。
した全細胞を対照として使用するのが有利である。
【００２７】これによって疑陽性クローンを排除し、余
分な小規模融合を阻止することによって時間を節約し得
る。
分な小規模融合を阻止することによって時間を節約し得
る。
【００２８】本発明方法の好ましい実施態様によれば、
段階５で選択されたＢ細胞クローンを骨髄腫細胞と混合
し、微量電気融合で処理する。
段階５で選択されたＢ細胞クローンを骨髄腫細胞と混合
し、微量電気融合で処理する。
【００２９】微量電気融合は極めて少数（例えば数百
個）の細胞を効率的に融合させ得る。
個）の細胞を効率的に融合させ得る。
【００３０】本発明はまた、本発明に従って製造された
モノクローナル抗体を適当な賦形剤と混合して成る医薬
組成物に関する。
モノクローナル抗体を適当な賦形剤と混合して成る医薬
組成物に関する。
【００３１】更に本発明は、Ｔ細胞レセプターのクロノ
タイプ構造に反応性のモノクローナル抗体に関する。
タイプ構造に反応性のモノクローナル抗体に関する。
【００３２】このようなモノクローナル抗体は、診断目
的及び医薬組成物を調製するために使用され得る。
的及び医薬組成物を調製するために使用され得る。
【００３３】より詳細には、Ｔ細胞レセプターは自己免
疫疾患、特にリューマチ様関節炎に関連するＴ細胞レセ
プターである。
疫疾患、特にリューマチ様関節炎に関連するＴ細胞レセ
プターである。
【００３４】好ましくは、モノクローナル抗体がＨＣ
ｇｐ−３９反応性Ｔ細胞クローン、特にＴ細胞クローン
Ｈ．２４３（ＥＣＡＣＣ受託番号Ｎｏ．９６１０３１２
２）のＴ細胞レセプターに反応性である。
ｇｐ−３９反応性Ｔ細胞クローン、特にＴ細胞クローン
Ｈ．２４３（ＥＣＡＣＣ受託番号Ｎｏ．９６１０３１２
２）のＴ細胞レセプターに反応性である。
【００３５】適当なモノクローナル抗体の特定例は、Ｔ
ＣＲ６９（ＥＣＡＣＣ受託番号Ｎｏ．９６１０３１１
８）、ＴＣＲ７０（ＥＣＡＣＣ受託番号Ｎｏ．９６１０
３１１９）、ＴＣＲ７２（ＥＣＡＣＣ受託番号Ｎｏ．９
６１０３１２０）及びＴＣＲ８３（ＥＣＡＣＣ受託番号
９６１０３１２１）から成るグループから選択されたハ
イブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体で
ある。
ＣＲ６９（ＥＣＡＣＣ受託番号Ｎｏ．９６１０３１１
８）、ＴＣＲ７０（ＥＣＡＣＣ受託番号Ｎｏ．９６１０
３１１９）、ＴＣＲ７２（ＥＣＡＣＣ受託番号Ｎｏ．９
６１０３１２０）及びＴＣＲ８３（ＥＣＡＣＣ受託番号
９６１０３１２１）から成るグループから選択されたハ
イブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体で
ある。
【００３６】上記のように、本発明はまた、本発明のモ
ノクローナル抗体を適当な賦形剤に混合して成るリュー
マチ様関節炎の治療に好適な医薬組成物に関する。
ノクローナル抗体を適当な賦形剤に混合して成るリュー
マチ様関節炎の治療に好適な医薬組成物に関する。
【００３７】最後に、本発明は、本発明の方法を用いて
製造したモノクローナル抗体と本発明のモノクローナル
抗体とから成るグループから選択されたモノクローナル
抗体を診断目的で使用する方法に関する。抗体を含む診
断用試薬も本発明の実施態様の１つである。
製造したモノクローナル抗体と本発明のモノクローナル
抗体とから成るグループから選択されたモノクローナル
抗体を診断目的で使用する方法に関する。抗体を含む診
断用試薬も本発明の実施態様の１つである。
【００３８】次に、以下の実施例に基づいて本発明を更
に詳細に説明する。この実施例は、ヒトＴ細胞レセプタ
ーのクロノタイプに特異的なネズミのモノクローナル抗
体の産生に応用した本発明方法の最良の実施態様を示
す。
に詳細に説明する。この実施例は、ヒトＴ細胞レセプタ
ーのクロノタイプに特異的なネズミのモノクローナル抗
体の産生に応用した本発明方法の最良の実施態様を示
す。
【００３９】
【実施例】材料及び方法 試薬 培養培地：２５００ｍｇ／リットルの炭酸水素ナトリウ
ムと、２．３ｍｇ／リットルの２−メルカプトエタノー
ルと、５５ｍｇ／リットルのピルビン酸ナトリウムと、
１．２２ｍｇ／リットルのエタノールアミンと、３６０
ｍｇ／リットルのＬ−グルタミンと、４．５×１０-4ｍ
ｇ／リットルの亜セレン酸ナトリウムと、６２．５ｍｇ
／リットルのペニシリンナトリウムと、６２．５ｍｇ／
リットルの硫酸ストレプトマイシンとを補充したＤＭＥ
Ｍ／ＨＡＭのＦ１２（Ｇｉｂｃｏ，ｃａｔ．ｎｏ．３２
５００）。融合実験では、更に、１３．６１ｍｇ／リッ
トルのヒポキサンチンと、３．８３ｍｇ／リットルのチ
ミジンとを培地に補充した。この培地をＤＭＥＭ／ＨＡ
ＭのＦ１２／ＨＴと呼ぶ。ハイブリドーマの選択は、ヒ
ト膀胱癌細胞系Ｔ２４（Ｔ２４ＣＭ）のＩＬ−６含有上
清１％（ｖ／ｖ）と０．４マイクロモルのアミノプテリ
ンとを補充したＤＭＥＭ／ＨＡＭのＦ１２／ＨＴ中で実
施した。
ムと、２．３ｍｇ／リットルの２−メルカプトエタノー
ルと、５５ｍｇ／リットルのピルビン酸ナトリウムと、
１．２２ｍｇ／リットルのエタノールアミンと、３６０
ｍｇ／リットルのＬ−グルタミンと、４．５×１０-4ｍ
ｇ／リットルの亜セレン酸ナトリウムと、６２．５ｍｇ
／リットルのペニシリンナトリウムと、６２．５ｍｇ／
リットルの硫酸ストレプトマイシンとを補充したＤＭＥ
Ｍ／ＨＡＭのＦ１２（Ｇｉｂｃｏ，ｃａｔ．ｎｏ．３２
５００）。融合実験では、更に、１３．６１ｍｇ／リッ
トルのヒポキサンチンと、３．８３ｍｇ／リットルのチ
ミジンとを培地に補充した。この培地をＤＭＥＭ／ＨＡ
ＭのＦ１２／ＨＴと呼ぶ。ハイブリドーマの選択は、ヒ
ト膀胱癌細胞系Ｔ２４（Ｔ２４ＣＭ）のＩＬ−６含有上
清１％（ｖ／ｖ）と０．４マイクロモルのアミノプテリ
ンとを補充したＤＭＥＭ／ＨＡＭのＦ１２／ＨＴ中で実
施した。
【００４０】融合培地：２８０ｍＭのイノシトールと
０．１ｍＭの酢酸カルシウムと０．５ｍＭの酢酸マグネ
シウムと１ｍＭのヒスチジン；比抵抗：１．１１・１０
4オーム・ｃｍ。諸成分をＭｉｌｌｉ−Ｑ水に溶解し、
次いでＭｉｌｌｉ−Ｑ水または１ｍＭの酢酸カルシウム
と５ｍＭの酢酸マグネシウムとを含有する溶液によって
伝導率を９０マイクロ秒／ｃｍに調整した。
０．１ｍＭの酢酸カルシウムと０．５ｍＭの酢酸マグネ
シウムと１ｍＭのヒスチジン；比抵抗：１．１１・１０
4オーム・ｃｍ。諸成分をＭｉｌｌｉ−Ｑ水に溶解し、
次いでＭｉｌｌｉ−Ｑ水または１ｍＭの酢酸カルシウム
と５ｍＭの酢酸マグネシウムとを含有する溶液によって
伝導率を９０マイクロ秒／ｃｍに調整した。
【００４１】細胞培養物 Ｔ細胞クローンＨ．２４３はリューマチ様関節炎の患者
に由来した。このＴｈ１様Ｔ細胞クローンは、（ＭＨＣ
クラスＩＩに属する）ＤＲＢ１*０４０１との関係でヒ
ト軟骨ｇｐ−３９（ＨＣ ｇｐ−３９）からのエピトー
プＲＳＦＴＬＡＳＳＥＴＧＶＧ（配列１）を認識する。
このクローンのＴＣＲは、Ｖアルファ８及びＶベータ９
陽性であることを特徴とする。１０％のＦＣＳと２０Ｕ
／ｍｌのＩＬ−２と５Ｕ／ｍｌのＩＬ−４とを補充した
ＤＭＥＭ／ＨＡＭのＦ１２中で細胞を定型通りに培養
し、抗原と組織適合性抗原提示細胞（ＡＰＣ）とによっ
てまたは植物凝集素（ＰＨＡ）と養育細胞とによって定
期的に再刺激した。増殖アッセイのためには、ウシ胎仔
血清（ＦＣＳ）に代えて正常ヒト血清（ＮＨＳ）を用い
た。
に由来した。このＴｈ１様Ｔ細胞クローンは、（ＭＨＣ
クラスＩＩに属する）ＤＲＢ１*０４０１との関係でヒ
ト軟骨ｇｐ−３９（ＨＣ ｇｐ−３９）からのエピトー
プＲＳＦＴＬＡＳＳＥＴＧＶＧ（配列１）を認識する。
このクローンのＴＣＲは、Ｖアルファ８及びＶベータ９
陽性であることを特徴とする。１０％のＦＣＳと２０Ｕ
／ｍｌのＩＬ−２と５Ｕ／ｍｌのＩＬ−４とを補充した
ＤＭＥＭ／ＨＡＭのＦ１２中で細胞を定型通りに培養
し、抗原と組織適合性抗原提示細胞（ＡＰＣ）とによっ
てまたは植物凝集素（ＰＨＡ）と養育細胞とによって定
期的に再刺激した。増殖アッセイのためには、ウシ胎仔
血清（ＦＣＳ）に代えて正常ヒト血清（ＮＨＳ）を用い
た。
【００４２】Ｔ細胞溶解物の調製及びＴＣＲ／ＣＤ３複
合体によるビーズ充填 再刺激の１０〜１４日後にＴ細胞をＰＢＳで洗浄し、Ｏ
ｅｔｔｇｅｎら（参考文献２）に従って抽出バッファ
（１０ｍＭのトリエタノールアミン、１５０ｍＭのＮａ
Ｃｌ、１ｍＭのＮａ2ＥＤＴＡ、１％のジギトニン、１
０マイクログラム／ｍｌのロイペプチン、１０マイクロ
グラム／ｎｌのアプロチニン、１マイクログラム／ｍｌ
のペプスタチン、１ｍＭのＰｅｆａｂｌｏｃ（登録商
標）ＡＥＢＳＦ及び１．８ｍｇ／ｍｌのヨードアセトア
ミドｐＨ７．８）中で１０8細胞／ｍｌの濃度でインキ
ュベート（３０分間、０℃）することによって可溶化し
た。穏やかな界面活性剤であるジギトニンは、完全形の
ＴＣＲ／ＣＤ３複合体を抽出し得る。落屑した核及び細
胞を４℃、１６，０００ｇで１５分間遠心することによ
って除去し、Ｂ細胞の選択または免疫沈降のために使用
するまで上清を−２０℃のアリコートとして保存した。
合体によるビーズ充填 再刺激の１０〜１４日後にＴ細胞をＰＢＳで洗浄し、Ｏ
ｅｔｔｇｅｎら（参考文献２）に従って抽出バッファ
（１０ｍＭのトリエタノールアミン、１５０ｍＭのＮａ
Ｃｌ、１ｍＭのＮａ2ＥＤＴＡ、１％のジギトニン、１
０マイクログラム／ｍｌのロイペプチン、１０マイクロ
グラム／ｎｌのアプロチニン、１マイクログラム／ｍｌ
のペプスタチン、１ｍＭのＰｅｆａｂｌｏｃ（登録商
標）ＡＥＢＳＦ及び１．８ｍｇ／ｍｌのヨードアセトア
ミドｐＨ７．８）中で１０8細胞／ｍｌの濃度でインキ
ュベート（３０分間、０℃）することによって可溶化し
た。穏やかな界面活性剤であるジギトニンは、完全形の
ＴＣＲ／ＣＤ３複合体を抽出し得る。落屑した核及び細
胞を４℃、１６，０００ｇで１５分間遠心することによ
って除去し、Ｂ細胞の選択または免疫沈降のために使用
するまで上清を−２０℃のアリコートとして保存した。
【００４３】特異的Ｂ細胞を選択するために、常磁性ビ
ーズにＴＣＲ／ＣＤ３複合体を充填した。
ーズにＴＣＲ／ＣＤ３複合体を充填した。
【００４４】簡単に説明すると、１００マイクロリット
ルのヒツジ抗マウスＩｇを結合させた常磁性ビーズ（Ｓ
ＡＭ−ビーズ、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）１１
０．０２）を、２２マイクログラムの抗−ＣＤ３、ＯＫ
Ｔ３と共に、０．１％のＢＳＡを加えたＰＢＳ中でイン
キュベートした（一夜、４℃）。ビーズをＰＢＳ／ＢＳ
Ａで洗浄した後、１．４×１０8細胞に等価のＴ細胞溶
解物と、１％の正常マウス血清を加えた等量（１．４ｍ
ｌ）のＰＢＳ／ＢＳＡとを添加した。後者は、ビーズの
自由なＳＡＭ結合部位にＢ細胞が結合することを阻止す
るために添加したものである。ビーズ懸濁液を４℃で２
〜４時間インキュベートし、使用する前にＰＢＳ／ＢＳ
Ａで洗浄した。
ルのヒツジ抗マウスＩｇを結合させた常磁性ビーズ（Ｓ
ＡＭ−ビーズ、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）１１
０．０２）を、２２マイクログラムの抗−ＣＤ３、ＯＫ
Ｔ３と共に、０．１％のＢＳＡを加えたＰＢＳ中でイン
キュベートした（一夜、４℃）。ビーズをＰＢＳ／ＢＳ
Ａで洗浄した後、１．４×１０8細胞に等価のＴ細胞溶
解物と、１％の正常マウス血清を加えた等量（１．４ｍ
ｌ）のＰＢＳ／ＢＳＡとを添加した。後者は、ビーズの
自由なＳＡＭ結合部位にＢ細胞が結合することを阻止す
るために添加したものである。ビーズ懸濁液を４℃で２
〜４時間インキュベートし、使用する前にＰＢＳ／ＢＳ
Ａで洗浄した。
【００４５】免疫感作 ６週齢の雌ＢＡＬＢ／Ｃマウスを５×１０6の全Ｔ細胞
（本発明）または５×１０7細胞に等価のＴＣＲ／ＣＤ
３複合体を充填した常磁性ビーズ（対照実験）によって
３〜７週毎の間隔で免疫感作した。表１に示すような種
々の投与経路を使用した。アジュバントを使用した場合
（対照実験）には、１回目の注射を完全フロインドアジ
ュバントを用いて実施し、以後の注射には不完全フロイ
ンドアジュバントを用い、最終ブースターはアジュバン
ト非使用で行った。
（本発明）または５×１０7細胞に等価のＴＣＲ／ＣＤ
３複合体を充填した常磁性ビーズ（対照実験）によって
３〜７週毎の間隔で免疫感作した。表１に示すような種
々の投与経路を使用した。アジュバントを使用した場合
（対照実験）には、１回目の注射を完全フロインドアジ
ュバントを用いて実施し、以後の注射には不完全フロイ
ンドアジュバントを用い、最終ブースターはアジュバン
ト非使用で行った。
【００４６】抗クロノタイプＭＡｂの産生 ６週齢のＢＡＬＢ／ＣマウスにＰＢＳ中の休止Ｔ細胞を
毎回５×１０6の量で３〜７週毎の間隔で腹膜組織内に
４回注射した。最終注射の５日後に、マウスを殺して、
赤血球及び単球の欠失した脾臓細胞集団を従来に記載の
手順（参考文献２３，２４）で調製した。この結果、Ｂ
細胞が富化した細胞画分が得られたが、本発明の段階２
による他の非特異的Ｂ細胞に比べて細胞表面抗原に特異
的なＢ細胞の富化は得られなかった。
毎回５×１０6の量で３〜７週毎の間隔で腹膜組織内に
４回注射した。最終注射の５日後に、マウスを殺して、
赤血球及び単球の欠失した脾臓細胞集団を従来に記載の
手順（参考文献２３，２４）で調製した。この結果、Ｂ
細胞が富化した細胞画分が得られたが、本発明の段階２
による他の非特異的Ｂ細胞に比べて細胞表面抗原に特異
的なＢ細胞の富化は得られなかった。
【００４７】これらの脾臓細胞集団をヒトＣＤ３または
ＴＣＲアルファベータの定常領域に反応性のＢ細胞に基
づいてプレクリアするために、約３×１０7の細胞を、
無関係のＴ細胞クローン（Ｖアルファ３．Ｖベータ１４
陽性のＴ細胞クローン、ＳＣＲＯ．０８Ａ、但し任意の
他の無関係のＴ細胞でもよい）のＴＣＲ／ＣＤ３複合体
を充填した２０マイクロリットルのＳＡＭビーズと共に
２回インキュベートした。次いで、得られた細胞浮遊液
を問題のＴ細胞クローン（Ｈ．２４３）のＴＣＲ／ＣＤ
３複合体を充填したＳＡＭビーズと共にインキュベート
することによって、ＴＣＲの可変領域に特異的なＢ細胞
を選択した。各インキュベーションを、１０％仔ウシ血
清（Ｈｙｃｌｏｎｅ（登録商標））と０．２％の正常ネ
ズミ血清とを補充したＤＭＥＭ／ＨＡＭのＦ１２中で室
温で９０分間実施した。これらのインキュベーション
中、浮遊液を５分毎に丁寧にホモジェナイズした。最終
インキュベーション後、ＤＭＥＭ／ＨＡＭのＦ１２、１
０％仔ウシ血清でビーズを丁寧に５回洗浄し、同じ培地
に再浮遊させた。
ＴＣＲアルファベータの定常領域に反応性のＢ細胞に基
づいてプレクリアするために、約３×１０7の細胞を、
無関係のＴ細胞クローン（Ｖアルファ３．Ｖベータ１４
陽性のＴ細胞クローン、ＳＣＲＯ．０８Ａ、但し任意の
他の無関係のＴ細胞でもよい）のＴＣＲ／ＣＤ３複合体
を充填した２０マイクロリットルのＳＡＭビーズと共に
２回インキュベートした。次いで、得られた細胞浮遊液
を問題のＴ細胞クローン（Ｈ．２４３）のＴＣＲ／ＣＤ
３複合体を充填したＳＡＭビーズと共にインキュベート
することによって、ＴＣＲの可変領域に特異的なＢ細胞
を選択した。各インキュベーションを、１０％仔ウシ血
清（Ｈｙｃｌｏｎｅ（登録商標））と０．２％の正常ネ
ズミ血清とを補充したＤＭＥＭ／ＨＡＭのＦ１２中で室
温で９０分間実施した。これらのインキュベーション
中、浮遊液を５分毎に丁寧にホモジェナイズした。最終
インキュベーション後、ＤＭＥＭ／ＨＡＭのＦ１２、１
０％仔ウシ血清でビーズを丁寧に５回洗浄し、同じ培地
に再浮遊させた。
【００４８】従来技術に記載されているクローン増量及
び微量電気融合（２３）によって、これらの選択したＢ
細胞からモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを作製
した。簡単に説明すると、選択したＢ細胞を、９６ウェ
ルの平底組織培養プレートで、Ｔ細胞上清（ＴＳＮ）及
び５０，０００個の被照射（２５００ｒａｄ）ＥＬ−４
Ｂ５細胞と混合し、１０％ＦＣＳを補充したＤＭＥＭ
／ＨＡＭのＦ１２で最終容量２００マイクロリットルに
した。８日後に、問題のＴ細胞クローンまたは無関係の
Ｔ細胞クローンを用いる以下に記載の手順の１段階Ｔ細
胞凝集アッセイで上清を試験した。識別可能なＭＡｂを
産生するＢ細胞培養物を微量電気融合手順で処理した。
これらのＢ細胞培養物の内容を１０6のＮＳ−１骨髄腫
細胞（２５）と混合し、ＤＭＥＭ／ＨＡＭのＦ１２／Ｈ
Ｔで洗浄することによって無血清にした。次に、細胞を
プロナーゼ溶液で３分間処理し、次いで融合培地で洗浄
した。電気融合は、５０マイクロリットルの融合室で、
２ＭＨｚ、４００Ｖ／ｃｍの交流電界を３０秒、次いで
３ｋＶ／ｃｍの矩形の高電界パルスを１０マイクロ秒、
２ＭＨｚ、４００Ｖ／ｃｍの交流電界を再度３０秒印加
することによって実施した。最後に、融合室の内容物を
２０ｍｌの選択培地に移し、９６ウェルのマイクロタイ
タープレートで平板培養した。融合の８日後に、培養物
のハイブリドーマ増殖を観察し、１段階Ｔ細胞凝集アッ
セイで再度スクリーニングした。
び微量電気融合（２３）によって、これらの選択したＢ
細胞からモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを作製
した。簡単に説明すると、選択したＢ細胞を、９６ウェ
ルの平底組織培養プレートで、Ｔ細胞上清（ＴＳＮ）及
び５０，０００個の被照射（２５００ｒａｄ）ＥＬ−４
Ｂ５細胞と混合し、１０％ＦＣＳを補充したＤＭＥＭ
／ＨＡＭのＦ１２で最終容量２００マイクロリットルに
した。８日後に、問題のＴ細胞クローンまたは無関係の
Ｔ細胞クローンを用いる以下に記載の手順の１段階Ｔ細
胞凝集アッセイで上清を試験した。識別可能なＭＡｂを
産生するＢ細胞培養物を微量電気融合手順で処理した。
これらのＢ細胞培養物の内容を１０6のＮＳ−１骨髄腫
細胞（２５）と混合し、ＤＭＥＭ／ＨＡＭのＦ１２／Ｈ
Ｔで洗浄することによって無血清にした。次に、細胞を
プロナーゼ溶液で３分間処理し、次いで融合培地で洗浄
した。電気融合は、５０マイクロリットルの融合室で、
２ＭＨｚ、４００Ｖ／ｃｍの交流電界を３０秒、次いで
３ｋＶ／ｃｍの矩形の高電界パルスを１０マイクロ秒、
２ＭＨｚ、４００Ｖ／ｃｍの交流電界を再度３０秒印加
することによって実施した。最後に、融合室の内容物を
２０ｍｌの選択培地に移し、９６ウェルのマイクロタイ
タープレートで平板培養した。融合の８日後に、培養物
のハイブリドーマ増殖を観察し、１段階Ｔ細胞凝集アッ
セイで再度スクリーニングした。
【００４９】Ｔ細胞凝集アッセイ 抗−Ｔ細胞抗体に関するハイブリドーマ培養物のスクリ
ーニング及び他のＴ細胞とＭＡｂとの交差反応性の決定
を、１段階凝集アッセイで実施した。半分の面積のマイ
クロタイタープレートを使用し、５０マイクロリットル
のハイブリドーマ上清を、ＤＭＥＭ／ＨＡＭのＦ１２中
にヒツジ抗−マウスＩｇと共有結合した２×１０5の常
磁性ビーズと５×１０4の問題のＴ細胞とを含む２０マ
イクロリットルのビーズ／細胞浮遊液と混合した。３７
℃で２〜３時間インキュベーション後、凝集を検査する
ために細胞及びビーズの凝塊を顕微鏡で観察した。
ーニング及び他のＴ細胞とＭＡｂとの交差反応性の決定
を、１段階凝集アッセイで実施した。半分の面積のマイ
クロタイタープレートを使用し、５０マイクロリットル
のハイブリドーマ上清を、ＤＭＥＭ／ＨＡＭのＦ１２中
にヒツジ抗−マウスＩｇと共有結合した２×１０5の常
磁性ビーズと５×１０4の問題のＴ細胞とを含む２０マ
イクロリットルのビーズ／細胞浮遊液と混合した。３７
℃で２〜３時間インキュベーション後、凝集を検査する
ために細胞及びビーズの凝塊を顕微鏡で観察した。
【００５０】免疫沈降及びウェスタンブロッティング 再刺激の１０〜１４日後、Ｔ細胞を洗浄し、細胞表面タ
ンパク質をビオチンで標識した。簡単に説明すると、Ｐ
ＢＳ中で５×１０6細胞／ｍｌの濃度のＴ細胞と０．５
ｍｇ／ｍｌのＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ（登録商標）スルホ
−ＮＨＳ−ビオチンとを室温で３０分間インキュベート
した。次いで、細胞を再度洗浄し、前述の手順で可溶化
した。免疫沈降実験に使用する前に、細胞溶解物をＳＡ
Ｍ−常磁性ビーズと共にインキュベートすることによっ
て１回プレクリアした。１０7細胞に等価のプレクリア
した溶解物を、ＭＡｂ（１ｍｌのハイブリドーマ上清）
を予め充填した１５マイクロリットルのＳＡＭ−常磁性
ビーズと共に３〜４時間インキュベートすることによっ
て免疫沈降を実施した。次に、免疫沈降物をＰＢＳで３
回洗浄し、サンプルバッファ中で沸騰させ、Ｌａｅｍｍ
ｌｉの方法（参考文献５）及びＭｉｎｉ−ｐｒｏｔｅａ
ｎ ＩＩ ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏｒａｄ）を用いて還元
性条件下または非還元性条件下で１０％ゲルのＳＤＳ−
ＰＡＧＥで処理した。ＰＶＤＦ膜を用いてＴｏｗｂｉｎ
ら（参考文献６）の手順でイムノブロッティングを実施
した。０．５％のトウィーン２０を補充したＰＢＳ中の
５％スキムミルクと共に膜をインキュベートすることに
よって非特異的結合部位をブロックした。洗浄後、ブロ
ットをＰＢＳ中のストレプトアビジン−アルカリ性ホス
ファターゼ、０．５％トウィーン２０、１％ＢＳＡ、１
％正常ヤギ血清中によって室温で１時間プローブした。
最後に、ＢＣＩＰ及び色素産生基質としてＮＢＴを用い
てブロットを発色させた。ウェスタンブロット試験のた
めには、免疫沈降用抗体としてＯＫＴ３を用い正常Ｔ細
胞溶解物を用いて上述の手順で常磁性ＳＡＭ−ビーズに
ＴＣＲ／ＣＤ３複合体を充填した。還元性条件下または
非還元性条件下で１０％ＰＡＡ−ゲルでＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ処理後、ブロットを２．５ｍｌのハイブリドーマ上清
と共にインキュベートした。アルカリ性ホスファターゼ
に結合させたヤギ抗マウス−Ｉｇ及び上記のＢＣＩＰ／
ＮＢＴを用いて結合抗体を検出した。
ンパク質をビオチンで標識した。簡単に説明すると、Ｐ
ＢＳ中で５×１０6細胞／ｍｌの濃度のＴ細胞と０．５
ｍｇ／ｍｌのＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ（登録商標）スルホ
−ＮＨＳ−ビオチンとを室温で３０分間インキュベート
した。次いで、細胞を再度洗浄し、前述の手順で可溶化
した。免疫沈降実験に使用する前に、細胞溶解物をＳＡ
Ｍ−常磁性ビーズと共にインキュベートすることによっ
て１回プレクリアした。１０7細胞に等価のプレクリア
した溶解物を、ＭＡｂ（１ｍｌのハイブリドーマ上清）
を予め充填した１５マイクロリットルのＳＡＭ−常磁性
ビーズと共に３〜４時間インキュベートすることによっ
て免疫沈降を実施した。次に、免疫沈降物をＰＢＳで３
回洗浄し、サンプルバッファ中で沸騰させ、Ｌａｅｍｍ
ｌｉの方法（参考文献５）及びＭｉｎｉ−ｐｒｏｔｅａ
ｎ ＩＩ ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏｒａｄ）を用いて還元
性条件下または非還元性条件下で１０％ゲルのＳＤＳ−
ＰＡＧＥで処理した。ＰＶＤＦ膜を用いてＴｏｗｂｉｎ
ら（参考文献６）の手順でイムノブロッティングを実施
した。０．５％のトウィーン２０を補充したＰＢＳ中の
５％スキムミルクと共に膜をインキュベートすることに
よって非特異的結合部位をブロックした。洗浄後、ブロ
ットをＰＢＳ中のストレプトアビジン−アルカリ性ホス
ファターゼ、０．５％トウィーン２０、１％ＢＳＡ、１
％正常ヤギ血清中によって室温で１時間プローブした。
最後に、ＢＣＩＰ及び色素産生基質としてＮＢＴを用い
てブロットを発色させた。ウェスタンブロット試験のた
めには、免疫沈降用抗体としてＯＫＴ３を用い正常Ｔ細
胞溶解物を用いて上述の手順で常磁性ＳＡＭ−ビーズに
ＴＣＲ／ＣＤ３複合体を充填した。還元性条件下または
非還元性条件下で１０％ＰＡＡ−ゲルでＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ処理後、ブロットを２．５ｍｌのハイブリドーマ上清
と共にインキュベートした。アルカリ性ホスファターゼ
に結合させたヤギ抗マウス−Ｉｇ及び上記のＢＣＩＰ／
ＮＢＴを用いて結合抗体を検出した。
【００５１】抗体媒介性Ｔ細胞増殖 ４０マイクログラム／ｍｌの濃度のヒツジ抗−マウスＩ
ｇを含む１００マイクロリットルのＰＢＳを用いて平底
マイクロタイターウェルをコート（一夜、室温）した。
ウェルを１回洗浄し、次いで２マイクログラム／ｍｌの
濃度のＭＡｂを含む１００マイクロリットルのＰＢＳと
共に２時間インキュベートした。余剰の遊離ＭＡｂを洗
浄によって除去し、１０％のＮＨＳを補充した２００マ
イクロリットルのＤＭＥＭ／ＨＡＭのＦ１２中で２．５
×１０4の休止Ｔ細胞を添加した。３７℃で２日間イン
キュベーション後、細胞を０．５マイクロＣｉ〔3Ｈ〕
−チミジンによってパルスし、更に１６〜１８時間イン
キュベートした。最後に、細胞をガラス繊維フイルター
に収集し、〔3Ｈ〕−チミジン取込みを、Ｍａｔｒｉｘ
９６（登録商標）（Ｐａｃｋａｒｄ）上のベータカウ
ンティングによって測定した。各変数を４つの重複試験
で測定した。
ｇを含む１００マイクロリットルのＰＢＳを用いて平底
マイクロタイターウェルをコート（一夜、室温）した。
ウェルを１回洗浄し、次いで２マイクログラム／ｍｌの
濃度のＭＡｂを含む１００マイクロリットルのＰＢＳと
共に２時間インキュベートした。余剰の遊離ＭＡｂを洗
浄によって除去し、１０％のＮＨＳを補充した２００マ
イクロリットルのＤＭＥＭ／ＨＡＭのＦ１２中で２．５
×１０4の休止Ｔ細胞を添加した。３７℃で２日間イン
キュベーション後、細胞を０．５マイクロＣｉ〔3Ｈ〕
−チミジンによってパルスし、更に１６〜１８時間イン
キュベートした。最後に、細胞をガラス繊維フイルター
に収集し、〔3Ｈ〕−チミジン取込みを、Ｍａｔｒｉｘ
９６（登録商標）（Ｐａｃｋａｒｄ）上のベータカウ
ンティングによって測定した。各変数を４つの重複試験
で測定した。
【００５２】抗原誘発性増殖の抗体媒介性阻害 平底マイクロタイタープレートのウェルに、２０マイク
ロリットルのハイブリドーマ上清と、１０％ＮＨＳを補
充した１５０マイクロリットルのＤＭＥＭ／ＨＡＭのＦ
１２中の２×１０4の休止Ｔ細胞及び１×１０5の組織適
合性ＭＮＣとを接種した。３７℃で３時間インキュベー
ション後、５０マイクロリットルのペプチドＲＳＦＴＬ
ＡＳＳＥＴＧＶＧ（１６マイクログラム／ｍｌ）を培養
物に添加した。培養物を３７℃で更に２日間インキュベ
ートし、上述のように〔3Ｈ〕−チミジン取込みを測定
した。各変数を４つの重複試験で測定した。
ロリットルのハイブリドーマ上清と、１０％ＮＨＳを補
充した１５０マイクロリットルのＤＭＥＭ／ＨＡＭのＦ
１２中の２×１０4の休止Ｔ細胞及び１×１０5の組織適
合性ＭＮＣとを接種した。３７℃で３時間インキュベー
ション後、５０マイクロリットルのペプチドＲＳＦＴＬ
ＡＳＳＥＴＧＶＧ（１６マイクログラム／ｍｌ）を培養
物に添加した。培養物を３７℃で更に２日間インキュベ
ートし、上述のように〔3Ｈ〕−チミジン取込みを測定
した。各変数を４つの重複試験で測定した。
【００５３】クロノタイプ特異的ＭＡｂを用いたアネル
ギーの誘発 ４０マイクログラム／ｍｌの濃度のヒツジ抗−マウスＩ
ｇを含む１ｍｌのＰＢＳを用いて２４ウェルの培養プレ
ートをコートした（一夜、室温）。ウェルを１回洗浄
し、次いで、２マイクログラム／ｍｌの濃度のＭＡｂを
含む１ｍｌのＰＢＳと共に２時間インキュベートした。
余剰の遊離ＭＡｂを洗浄によって除去し、２×１０6の
洗浄した休止Ｔ細胞を、１０％ＮＨＳを加えた２ｍｌの
ＤＭＥＭ／ＨＡＭのＦ１２に添加した。指示があるとき
は、サイクロスポリンＡ（Ｓａｎｄｏｚ，Ｂａｚｅｌ
Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ガンマＩＬ−２、シクロヘ
キシミド（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳ
Ａ）またはＨＬＡ−ＤＲＢ１*０４０１適合性ＡＰＣ
（被照射量３０００ラド）を培養開始の時点で添加し
た。一夜のインキュベーション後、プレートを氷冷し、
Ｔ細胞をピペット操作によって再浮遊させた。細胞を完
全培養培地で１回洗浄し、Ｔ細胞増殖アッセイ、サイト
カイン分析及び後述するようなＦＡＣＳ分析に使用し
た。
ギーの誘発 ４０マイクログラム／ｍｌの濃度のヒツジ抗−マウスＩ
ｇを含む１ｍｌのＰＢＳを用いて２４ウェルの培養プレ
ートをコートした（一夜、室温）。ウェルを１回洗浄
し、次いで、２マイクログラム／ｍｌの濃度のＭＡｂを
含む１ｍｌのＰＢＳと共に２時間インキュベートした。
余剰の遊離ＭＡｂを洗浄によって除去し、２×１０6の
洗浄した休止Ｔ細胞を、１０％ＮＨＳを加えた２ｍｌの
ＤＭＥＭ／ＨＡＭのＦ１２に添加した。指示があるとき
は、サイクロスポリンＡ（Ｓａｎｄｏｚ，Ｂａｚｅｌ
Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ガンマＩＬ−２、シクロヘ
キシミド（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳ
Ａ）またはＨＬＡ−ＤＲＢ１*０４０１適合性ＡＰＣ
（被照射量３０００ラド）を培養開始の時点で添加し
た。一夜のインキュベーション後、プレートを氷冷し、
Ｔ細胞をピペット操作によって再浮遊させた。細胞を完
全培養培地で１回洗浄し、Ｔ細胞増殖アッセイ、サイト
カイン分析及び後述するようなＦＡＣＳ分析に使用し
た。
【００５４】Ｔ細胞の抗原特異的増殖応答を、１０％Ｎ
ＨＳを加えた２００マイクロリットルのＤＭＥＭ／ＨＡ
ＭのＦ１２中に２×１０4のＴ細胞と１×１０5のＨＬＡ
−ＤＲＢ１*０４０１整合性の被照射（３０００ｒａ
ｄ）ＰＢＭＣと可変濃度の抗原とを含む平底マイクロウ
ェル培養物中で評価した。３７℃で２日間インキュベー
ション後、細胞を０．５マイクロＣｉ〔3Ｈ〕−チミジ
ンでパルスし、更に１６〜１８時間インキュベートし
た。最後に、細胞をガラス繊維フィルターに収集し、〔
3Ｈ〕−チミジン取込みをＭａｔｒｉｘ９６（Ｐａｃｋ
ａｒｄ，Ｍｅｒｉｄｅｎ，ＣＴ，ＵＳＡ）上のガスシン
チレーションによって測定した。各変数を３つの重複試
験で測定した。
ＨＳを加えた２００マイクロリットルのＤＭＥＭ／ＨＡ
ＭのＦ１２中に２×１０4のＴ細胞と１×１０5のＨＬＡ
−ＤＲＢ１*０４０１整合性の被照射（３０００ｒａ
ｄ）ＰＢＭＣと可変濃度の抗原とを含む平底マイクロウ
ェル培養物中で評価した。３７℃で２日間インキュベー
ション後、細胞を０．５マイクロＣｉ〔3Ｈ〕−チミジ
ンでパルスし、更に１６〜１８時間インキュベートし
た。最後に、細胞をガラス繊維フィルターに収集し、〔
3Ｈ〕−チミジン取込みをＭａｔｒｉｘ９６（Ｐａｃｋ
ａｒｄ，Ｍｅｒｉｄｅｎ，ＣＴ，ＵＳＡ）上のガスシン
チレーションによって測定した。各変数を３つの重複試
験で測定した。
【００５５】結果 免疫感作 アジュバントを用いた免疫感作（対照実験）は無関係の
Ｔ細胞とＨ．２４３とを識別できる抗体を含む血清を全
く産生しなかった（表１；免疫グループＩＩ，ＩＩＩ及
びＩＶ）。グループＶの血清の抗体価は低かったが（凝
集アッセイで１：１００）、グループＩ及びＩＩの血清
の抗体価は高かった（１：１２００）。
Ｔ細胞とＨ．２４３とを識別できる抗体を含む血清を全
く産生しなかった（表１；免疫グループＩＩ，ＩＩＩ及
びＩＶ）。グループＶの血清の抗体価は低かったが（凝
集アッセイで１：１００）、グループＩ及びＩＩの血清
の抗体価は高かった（１：１２００）。
【００５６】抗クロノタイプＭＡｂの産生 グループＩの脾臓細胞を使用し、常磁性ビーズに充填さ
れた無関係のＴ細胞クローン、この場合はＨ．２５８に
由来のＴＣＲ／ＣＤ３複合体と共にインキュベーション
すると、多数のロゼット形成細胞は生じなかった。これ
は、多数のＣＤ３−及びＴＣＲアルファベータ−反応性
Ｂ細胞の除去に成功したことを示す。ロゼット非形成細
胞を、同じＴ細胞クローンに由来の無関係のＴＣＴ／Ｃ
Ｄ３複合体によって第二プレクリア処理すると、ロゼッ
ト形成細胞はほとんど観察されなかった。
れた無関係のＴ細胞クローン、この場合はＨ．２５８に
由来のＴＣＲ／ＣＤ３複合体と共にインキュベーション
すると、多数のロゼット形成細胞は生じなかった。これ
は、多数のＣＤ３−及びＴＣＲアルファベータ−反応性
Ｂ細胞の除去に成功したことを示す。ロゼット非形成細
胞を、同じＴ細胞クローンに由来の無関係のＴＣＴ／Ｃ
Ｄ３複合体によって第二プレクリア処理すると、ロゼッ
ト形成細胞はほとんど観察されなかった。
【００５７】問題のＴ細胞クローンを含む常磁性ビーズ
と共にインキュベーションした後の顕微鏡観察によれ
ば、観察可能なロゼット形成は生じていなかった。特異
的Ｂ細胞の予測頻度からすれば、この結果は意外ではな
い。限定希釈及びクローン増量後に、３６のＢ細胞上清
がＨ．２４３を凝集させたが、無関係のＴ細胞クローン
Ｈ．２５８を凝集させないことが判明した（表ＩＩ）。
いくつかのＢ細胞上清は双方のクローンを凝集させるこ
とができたが、これは、これらの上清がプレクリア処理
を受けなかったことを示す。
と共にインキュベーションした後の顕微鏡観察によれ
ば、観察可能なロゼット形成は生じていなかった。特異
的Ｂ細胞の予測頻度からすれば、この結果は意外ではな
い。限定希釈及びクローン増量後に、３６のＢ細胞上清
がＨ．２４３を凝集させたが、無関係のＴ細胞クローン
Ｈ．２５８を凝集させないことが判明した（表ＩＩ）。
いくつかのＢ細胞上清は双方のクローンを凝集させるこ
とができたが、これは、これらの上清がプレクリア処理
を受けなかったことを示す。
【００５８】更に、表ＩＩからは、いかなるＴ細胞にも
反応しないＢ細胞も産生されるので大部分の特異的Ｂ細
胞培養物はクローン産生性でないと推論できる。しかし
ながら、微量電気融合後にはハイブリドーマがこれらの
非特異的Ｂ細胞から選別されるのでこれは問題ではなか
った。１８の特異的Ｂ細胞培養物を微量電気融合で処理
した。いくつかの融合物はＴ細胞特異的ハイブリドーマ
を生じていなかった。いくつかの他の融合物は安定な細
胞系となるまでクローニングすることができなかった。
最終的に安定なハイブリドーマは、１８の微量電気融合
物のうちの１１から得られた。これらの１１のＭＡｂを
更に特性決定した。これらのＭＡｂのアイソタイプを表
ＩＩＩに示す。
反応しないＢ細胞も産生されるので大部分の特異的Ｂ細
胞培養物はクローン産生性でないと推論できる。しかし
ながら、微量電気融合後にはハイブリドーマがこれらの
非特異的Ｂ細胞から選別されるのでこれは問題ではなか
った。１８の特異的Ｂ細胞培養物を微量電気融合で処理
した。いくつかの融合物はＴ細胞特異的ハイブリドーマ
を生じていなかった。いくつかの他の融合物は安定な細
胞系となるまでクローニングすることができなかった。
最終的に安定なハイブリドーマは、１８の微量電気融合
物のうちの１１から得られた。これらの１１のＭＡｂを
更に特性決定した。これらのＭＡｂのアイソタイプを表
ＩＩＩに示す。
【００５９】ＭＡｂの特異性 ＭＡｂの特異性を更に検討するために、免疫沈降試験及
びＴ細胞凝集試験とウェスタンブロットとを実施した。
びＴ細胞凝集試験とウェスタンブロットとを実施した。
【００６０】非還元性条件下及び変性条件下のＳＤＳ／
ＰＡＧＥは、全部のＭＡｂが約８５ｋＤの主要バンド及
び２１ｋＤの少数バンドをＴ細胞クローンＨ．２４３の
ジギトニン溶解物から免疫沈降させ得ることを示した。
これは、ＴＣＲアルファベータ複合体及びＣＤ３鎖イプ
シロン／デルタの夫々の分子量と一致する。還元性条件
下では８５ｋＤのバンドが４０ｋＤ及び５０ｋＤの２つ
のバンドに解離する。これはＴＣＲのアルファ鎖及びベ
ータ鎖の夫々の分子量に一致する。抗−Ｈ．２４３特異
的ＭＡｂの１つの免疫ブロットを、陽性対照であるＯＫ
Ｔ３及び陰性対照である無関係ＭＡｂと共に図１に示
す。
ＰＡＧＥは、全部のＭＡｂが約８５ｋＤの主要バンド及
び２１ｋＤの少数バンドをＴ細胞クローンＨ．２４３の
ジギトニン溶解物から免疫沈降させ得ることを示した。
これは、ＴＣＲアルファベータ複合体及びＣＤ３鎖イプ
シロン／デルタの夫々の分子量と一致する。還元性条件
下では８５ｋＤのバンドが４０ｋＤ及び５０ｋＤの２つ
のバンドに解離する。これはＴＣＲのアルファ鎖及びベ
ータ鎖の夫々の分子量に一致する。抗−Ｈ．２４３特異
的ＭＡｂの１つの免疫ブロットを、陽性対照であるＯＫ
Ｔ３及び陰性対照である無関係ＭＡｂと共に図１に示
す。
【００６１】表ＩＩＩは、ＭＡｂと６つのＶベータ９陽
性Ｔ細胞クローンと、２つのＶアルファ８陽性Ｔ細胞ク
ローンと、種々のＶアルファ及びＶベータをもつ残りの
８つのＴ細胞クローンとの交差反応性を示す。抗体ＴＣ
Ｒ７４は、全部のＶベータ９陽性Ｔ細胞を凝集させその
他を凝集させないのでＶベータ９特異的であると考える
べきである。Ｖアルファ８、Ｖベータ９、ＴＣＲアルフ
ァベータの定常領域、ＣＤ３及び他の共通Ｔ細胞表面分
子との反応を除外すると、残りのＴＣＲ抗体はＨ．２４
３とだけ反応するので、これらの抗体はＨ．２４３の抗
原結合部位に対する抗体である可能性が大きい。図２
は、ハイブリドーマクローンＴＣＲ６４、ＴＣＲ６６、
ＴＣＲ６９、ＴＣＲ７０、ＴＣＲ７３及びＴＣＲ７６
ＭＡｂに由来の抗体が非還元ウェスタンブロット上のＴ
ＣＲ（８５ｋＤバンド）を染色できることを示す。図の
上部の非特異的な大きいバンドは免疫沈降性抗体ＳＡＭ
及びＯＫＴ３から沈降する。還元性条件下のウェスタン
ブロット処理では抗クロノタイプＭＡｂによる染色は得
られなかった（結果は示していない）。これは、ＭＡｂ
が完全形のＴＣＲアルファベータ複合体によって形成さ
れたコンホメーションエピトープを認識することを示唆
する。
性Ｔ細胞クローンと、２つのＶアルファ８陽性Ｔ細胞ク
ローンと、種々のＶアルファ及びＶベータをもつ残りの
８つのＴ細胞クローンとの交差反応性を示す。抗体ＴＣ
Ｒ７４は、全部のＶベータ９陽性Ｔ細胞を凝集させその
他を凝集させないのでＶベータ９特異的であると考える
べきである。Ｖアルファ８、Ｖベータ９、ＴＣＲアルフ
ァベータの定常領域、ＣＤ３及び他の共通Ｔ細胞表面分
子との反応を除外すると、残りのＴＣＲ抗体はＨ．２４
３とだけ反応するので、これらの抗体はＨ．２４３の抗
原結合部位に対する抗体である可能性が大きい。図２
は、ハイブリドーマクローンＴＣＲ６４、ＴＣＲ６６、
ＴＣＲ６９、ＴＣＲ７０、ＴＣＲ７３及びＴＣＲ７６
ＭＡｂに由来の抗体が非還元ウェスタンブロット上のＴ
ＣＲ（８５ｋＤバンド）を染色できることを示す。図の
上部の非特異的な大きいバンドは免疫沈降性抗体ＳＡＭ
及びＯＫＴ３から沈降する。還元性条件下のウェスタン
ブロット処理では抗クロノタイプＭＡｂによる染色は得
られなかった（結果は示していない）。これは、ＭＡｂ
が完全形のＴＣＲアルファベータ複合体によって形成さ
れたコンホメーションエピトープを認識することを示唆
する。
【００６２】ＭＡｂ誘発性Ｔ細胞増殖 ＭＡｂがＨ．２４３ Ｔ細胞の増殖を誘発できるか否か
を試験するために、ＭＡｂを平底マイクロタイタープレ
ートに固定化し、Ｔ細胞と共にインキュベートした。Ｍ
Ａｂ間で大きい違いは存在するが、図２は、全部のＭＡ
ｂがＨ．２４３細胞の増殖を誘発できることを示す。Ｔ
ＣＲ６４、ＴＣＲ６６、ＴＣＲ７０、ＴＣＲ７６及びＴ
ＣＲ７９によって抗−ＣＤ３（ＯＫＴ３）と同様の増殖
が得られた。別のＴＣＲに対する抗クロノタイプＭＡｂ
であるＴＣＲ４４では増殖が全く得られなかった。
を試験するために、ＭＡｂを平底マイクロタイタープレ
ートに固定化し、Ｔ細胞と共にインキュベートした。Ｍ
Ａｂ間で大きい違いは存在するが、図２は、全部のＭＡ
ｂがＨ．２４３細胞の増殖を誘発できることを示す。Ｔ
ＣＲ６４、ＴＣＲ６６、ＴＣＲ７０、ＴＣＲ７６及びＴ
ＣＲ７９によって抗−ＣＤ３（ＯＫＴ３）と同様の増殖
が得られた。別のＴＣＲに対する抗クロノタイプＭＡｂ
であるＴＣＲ４４では増殖が全く得られなかった。
【００６３】抗原誘発性Ｔ細胞増殖のＭＡｂ媒介性阻害 更に、ＭＡｂのパネルがＨ．２４３ Ｔ細胞の抗原誘発
性増殖を阻害できるか否かを試験した。この実験では、
ＭＡｂをＴ細胞及びＡＰＣと共にプレインキュベート
し、３時間後に種々の濃度のペプチドでパルスした。図
４は、ＴＣＲ６４、ＴＣＲ７０、ＴＣＲ７６、ＴＣＲ７
８及びＴＣＲ８３が抗原誘発性増殖を強力に阻害するこ
とを示す。ＴＣＲ８３では９８％までの阻害が観察され
た。用量応答曲線は、ＴＣＲ６４、ＴＣＲ７０及びＴＣ
Ｒ８３では１００ｎｇ／ｍｌという低濃度で最大阻害が
得られることを示す。ＴＣＲ７８の力価はほぼ１／１０
である。阻害パターンは亜最適濃度または飽和濃度のペ
プチドを添加したか否かには左右されなかった（結果は
示していない）。他のＴＣＲ（ＴＣＲ４４）に対する抗
クロノタイプＭＡｂは阻害を全く示さなかった。
性増殖を阻害できるか否かを試験した。この実験では、
ＭＡｂをＴ細胞及びＡＰＣと共にプレインキュベート
し、３時間後に種々の濃度のペプチドでパルスした。図
４は、ＴＣＲ６４、ＴＣＲ７０、ＴＣＲ７６、ＴＣＲ７
８及びＴＣＲ８３が抗原誘発性増殖を強力に阻害するこ
とを示す。ＴＣＲ８３では９８％までの阻害が観察され
た。用量応答曲線は、ＴＣＲ６４、ＴＣＲ７０及びＴＣ
Ｒ８３では１００ｎｇ／ｍｌという低濃度で最大阻害が
得られることを示す。ＴＣＲ７８の力価はほぼ１／１０
である。阻害パターンは亜最適濃度または飽和濃度のペ
プチドを添加したか否かには左右されなかった（結果は
示していない）。他のＴＣＲ（ＴＣＲ４４）に対する抗
クロノタイプＭＡｂは阻害を全く示さなかった。
【００６４】抗クロノタイプＭＡｂは抗原及びＡＰＣに
よる後刺激に対するヒトＴ細胞クローンＨ．２４３の非
応答性を誘発する。
よる後刺激に対するヒトＴ細胞クローンＨ．２４３の非
応答性を誘発する。
【００６５】共刺激の非存在下のＴ細胞レセプターの存
在はアネルギーを誘発することが知られている。Ｈ．２
４３に対する固定化抗−クロノタイプＭＡｂがこのクロ
ーンのＴＣＲを機能的にトリガし得ることは発明者らが
以前に知見していた。従って、同じ抗体がアネルギーを
誘発したか否かを試験することは重要であった。この目
的で、異なる１０種類の抗クロノタイプＭＡｂを２４ウ
ェルのプレートに固定化し、アネルギー性刺激を与える
ためにＨ．２４３ Ｔ細胞と共に一夜インキュベートし
た。次に、Ｔ細胞をプレートから取出して、被照射ＤＲ
Ｂ１*０４０１適合性ＡＰＣによって提示された漸増濃
度のＨＣ ｇｐ−３９262-277（配列３）に反応したか
否かを試験した。図５は、１０種類のＭＡｂのうちの８
種類でこの応答が完全に阻害されていたが、対照ＭＡｂ
１と共にインキュベートしたＨ．２４３細胞はＡＰＣに
よって提示されたペプチドに十分に応答したことを示
す。ＴＣＲ６９及びＴＣＲ８３と共にインキュベートし
たＴ細胞の応答は有意に減少していたが、ペプチド濃度
が高い場合には完全には阻害されなかった。
在はアネルギーを誘発することが知られている。Ｈ．２
４３に対する固定化抗−クロノタイプＭＡｂがこのクロ
ーンのＴＣＲを機能的にトリガし得ることは発明者らが
以前に知見していた。従って、同じ抗体がアネルギーを
誘発したか否かを試験することは重要であった。この目
的で、異なる１０種類の抗クロノタイプＭＡｂを２４ウ
ェルのプレートに固定化し、アネルギー性刺激を与える
ためにＨ．２４３ Ｔ細胞と共に一夜インキュベートし
た。次に、Ｔ細胞をプレートから取出して、被照射ＤＲ
Ｂ１*０４０１適合性ＡＰＣによって提示された漸増濃
度のＨＣ ｇｐ−３９262-277（配列３）に反応したか
否かを試験した。図５は、１０種類のＭＡｂのうちの８
種類でこの応答が完全に阻害されていたが、対照ＭＡｂ
１と共にインキュベートしたＨ．２４３細胞はＡＰＣに
よって提示されたペプチドに十分に応答したことを示
す。ＴＣＲ６９及びＴＣＲ８３と共にインキュベートし
たＴ細胞の応答は有意に減少していたが、ペプチド濃度
が高い場合には完全には阻害されなかった。
【００６６】アネルギー性細胞は非アネルギー性細胞の
応答を抑圧する。
応答を抑圧する。
【００６７】また、アネルギー性Ｈ．２４３細胞が非ア
ネルギー性Ｈ．２４３細胞の応答を抑圧できるか否かも
試験した。アネルギーはＴＣＲ７６によって誘発され、
非アネルギー細胞は対照ＭＡｂ１とのインキュベーショ
ンによって得られた。次いで、種々のＴ細胞集団、即
ち、ウェルあたり２×１０4のアネルギー性Ｔ細胞、ウ
ェルあたり２×１０4の非アネルギー性Ｔ細胞、また
は、ウェルあたり漸減濃度（４×１０4、２×１０4、１
×１０4及び０．５×１０4）のアネルギー性Ｔ細胞と２
×１０4の非アネルギー性Ｔ細胞との混合物を用いてペ
プチドＨＣ ｇｐ−３９261-275（配列２）と共に増殖
アッセイを実施した。非アネルギー性細胞の応答は、ア
ネルギー性細胞の添加によって用量関連的に有意に減少
した（図６）。抗原濃度１マイクログラム／ｍｌ及びア
ネルギー性細胞対非アネルギー性細胞の比２：１で約９
０％の増殖低下が得られた。より高い抗原濃度では、増
殖低下が鈍化していた（５マイクログラム／ｍｌで７２
％、２５マイクログラム／ｍｌで３９％）。
ネルギー性Ｈ．２４３細胞の応答を抑圧できるか否かも
試験した。アネルギーはＴＣＲ７６によって誘発され、
非アネルギー細胞は対照ＭＡｂ１とのインキュベーショ
ンによって得られた。次いで、種々のＴ細胞集団、即
ち、ウェルあたり２×１０4のアネルギー性Ｔ細胞、ウ
ェルあたり２×１０4の非アネルギー性Ｔ細胞、また
は、ウェルあたり漸減濃度（４×１０4、２×１０4、１
×１０4及び０．５×１０4）のアネルギー性Ｔ細胞と２
×１０4の非アネルギー性Ｔ細胞との混合物を用いてペ
プチドＨＣ ｇｐ−３９261-275（配列２）と共に増殖
アッセイを実施した。非アネルギー性細胞の応答は、ア
ネルギー性細胞の添加によって用量関連的に有意に減少
した（図６）。抗原濃度１マイクログラム／ｍｌ及びア
ネルギー性細胞対非アネルギー性細胞の比２：１で約９
０％の増殖低下が得られた。より高い抗原濃度では、増
殖低下が鈍化していた（５マイクログラム／ｍｌで７２
％、２５マイクログラム／ｍｌで３９％）。
【００６８】従って、この実施例は、ヒトＴ細胞レセプ
ターに対する抗クロノタイプモノクローナル抗体の産生
が可能であることを示す。この実験で１０個のハイブリ
ドーマが得られたが、そのうちの４つは表ＩＩＩに示す
ようにＥＣＡＣＣ（Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ，ＵＫ）に寄託
した。この手法では多数のＴ細胞または大量の精製ＴＣ
Ｒを必要としなかった。本発明方法は、免疫感作手順で
使用するために同系マウス細胞で発現されたＴＣＲの可
溶性ＴＣＲを産生させる冗長な組換え手順に代替し得る
優れた方法である。従って、コンホメーション安定性に
関して予想される問題も回避できる。抗体誘発性Ｔ細胞
増殖試験及び抗原誘発性Ｔ細胞増殖の抗体媒介性阻害試
験（９８％までの阻害が観察された）においてモノクロ
ーナル抗体が種々の応答を示したので、これは同じクロ
ノタイプ構造上で異なるエピトープが認識されることを
示唆する。
ターに対する抗クロノタイプモノクローナル抗体の産生
が可能であることを示す。この実験で１０個のハイブリ
ドーマが得られたが、そのうちの４つは表ＩＩＩに示す
ようにＥＣＡＣＣ（Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ，ＵＫ）に寄託
した。この手法では多数のＴ細胞または大量の精製ＴＣ
Ｒを必要としなかった。本発明方法は、免疫感作手順で
使用するために同系マウス細胞で発現されたＴＣＲの可
溶性ＴＣＲを産生させる冗長な組換え手順に代替し得る
優れた方法である。従って、コンホメーション安定性に
関して予想される問題も回避できる。抗体誘発性Ｔ細胞
増殖試験及び抗原誘発性Ｔ細胞増殖の抗体媒介性阻害試
験（９８％までの阻害が観察された）においてモノクロ
ーナル抗体が種々の応答を示したので、これは同じクロ
ノタイプ構造上で異なるエピトープが認識されることを
示唆する。
【００６９】架橋している場合には、全部の抗クロノタ
イプモノクローナル抗体がＨ．２４３ Ｔ細胞の増殖を
誘発することが可能であった。
イプモノクローナル抗体がＨ．２４３ Ｔ細胞の増殖を
誘発することが可能であった。
【００７０】少量の固定化抗−クロノタイプＭＡｂが自
己反応性クローン中でアネルギーを誘発できることが証
明された。アネルギー性刺激の後、ＩＬ−２遺伝子転写
の欠如の結果として再刺激によるＴ細胞の増殖は生じな
かった。更に、ＩＦＮｇの産生も減少することが知見さ
れた。
己反応性クローン中でアネルギーを誘発できることが証
明された。アネルギー性刺激の後、ＩＬ−２遺伝子転写
の欠如の結果として再刺激によるＴ細胞の増殖は生じな
かった。更に、ＩＦＮｇの産生も減少することが知見さ
れた。
【００７１】アネルギー細胞のＦＡＣＳ（ｆｌｕｏｒｅ
ｓｃｅｎｃｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄｃｅｌｌ ｓｏｒｔ
ｅｒ、蛍光活性化セルソーター）分析は、アネルギーが
ＴＣＲの下方調節または遊離ＴＣＲの不在の結果ではな
いことを示した。共生培養実験では、アネルギー性Ｔ細
胞が同じクローンからの反応性細胞の応答を抑圧するこ
とが知見された。この傍系抑圧が９０％の増殖阻害を達
成した。データは、ｉｎ ｖｉｔｒｏのクロノタイプ特
異的抗体のアネルギー力価を示す。このようなＭＡｂは
リューマチ様関節炎で抗原特異的Ｔ細胞の寛容性を誘発
及び維持するために使用できる。
ｓｃｅｎｃｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄｃｅｌｌ ｓｏｒｔ
ｅｒ、蛍光活性化セルソーター）分析は、アネルギーが
ＴＣＲの下方調節または遊離ＴＣＲの不在の結果ではな
いことを示した。共生培養実験では、アネルギー性Ｔ細
胞が同じクローンからの反応性細胞の応答を抑圧するこ
とが知見された。この傍系抑圧が９０％の増殖阻害を達
成した。データは、ｉｎ ｖｉｔｒｏのクロノタイプ特
異的抗体のアネルギー力価を示す。このようなＭＡｂは
リューマチ様関節炎で抗原特異的Ｔ細胞の寛容性を誘発
及び維持するために使用できる。
【００７２】常磁性ビーズに結合させたかなり純粋なＴ
ＣＲ／ＣＤ３免疫複合体を注射することによって免疫感
作したマウスの血清中では（表Ｉ；免疫感作群ＩＶ）、
試験マウスの血清は、無関係のＴ細胞に対するよりも免
疫感作に使用した特異的Ｔ細胞に対して高度に陽性であ
った。しかしながら、抗クロノタイプモノクローナル抗
体を産生するハイブリドーマを得ることは可能ではなか
った。少量の全Ｔ細胞で免疫感作したマウスの血清中で
は無関係のＴ細胞に比べて問題のＴ細胞に対する特異性
が証明されなかったとしても、本発明方法によって抗ク
ロノタイプモノクローナル抗体を産生できるハイブリド
ーマが得られた。
ＣＲ／ＣＤ３免疫複合体を注射することによって免疫感
作したマウスの血清中では（表Ｉ；免疫感作群ＩＶ）、
試験マウスの血清は、無関係のＴ細胞に対するよりも免
疫感作に使用した特異的Ｔ細胞に対して高度に陽性であ
った。しかしながら、抗クロノタイプモノクローナル抗
体を産生するハイブリドーマを得ることは可能ではなか
った。少量の全Ｔ細胞で免疫感作したマウスの血清中で
は無関係のＴ細胞に比べて問題のＴ細胞に対する特異性
が証明されなかったとしても、本発明方法によって抗ク
ロノタイプモノクローナル抗体を産生できるハイブリド
ーマが得られた。
【００７３】勿論、例えばパパインを用いて本発明のモ
ノクローナル抗体から抗原結合フラグメントを作製し得
る。また、検出を容易にするために、モノクローナル抗
体またはその抗原結合フラグメントを標識することもで
き、これらのすべての形態は本発明の範囲に包含され
る。
ノクローナル抗体から抗原結合フラグメントを作製し得
る。また、検出を容易にするために、モノクローナル抗
体またはその抗原結合フラグメントを標識することもで
き、これらのすべての形態は本発明の範囲に包含され
る。
【００７４】勿論、非特異的Ｂ細胞を除去するために使
用される無関係の細胞は細胞表面抗原を含む細胞に極め
て類似しているのが好ましい。
用される無関係の細胞は細胞表面抗原を含む細胞に極め
て類似しているのが好ましい。
【００７５】
【表１】
【００７６】表Ｉの脚注：２つのＢＡＬＢ／Ｃマウスの
群を全Ｔ細胞または常磁性ビーズに結合させたＴＣＲ／
ＣＤ３複合体によって免疫感作した。指定したようにア
ジュバントの存在下または非存在下で免疫感作を実施し
た。種々の経路で免疫感作した。即ち、ｉｐ＝腹膜組織
内；ｉｍ＝筋肉内；ｓｃ＝皮下；ｉｓ＝脾臓内。
群を全Ｔ細胞または常磁性ビーズに結合させたＴＣＲ／
ＣＤ３複合体によって免疫感作した。指定したようにア
ジュバントの存在下または非存在下で免疫感作を実施し
た。種々の経路で免疫感作した。即ち、ｉｐ＝腹膜組織
内；ｉｍ＝筋肉内；ｓｃ＝皮下；ｉｓ＝脾臓内。
【００７７】マウスの血清の結合特性を、Ｔ細胞凝集ア
ッセイ、ＦＡＣＳ−染色及びウェスタンブロットで決定
した。機能性キャラクタリゼーションは、抗体媒介性Ｔ
細胞増殖アッセイ及び抗原誘発性Ｔ細胞増殖の抗体媒介
性阻害試験で実施した。
ッセイ、ＦＡＣＳ−染色及びウェスタンブロットで決定
した。機能性キャラクタリゼーションは、抗体媒介性Ｔ
細胞増殖アッセイ及び抗原誘発性Ｔ細胞増殖の抗体媒介
性阻害試験で実施した。
【００７８】*Ｔ細胞１＝免疫感作に使用したＴ細胞ク
ローン；Ｔ細胞２＝無関係のＴ細胞クローン# ＋はＴ細胞増殖の阻害を意味する。
ローン；Ｔ細胞２＝無関係のＴ細胞クローン# ＋はＴ細胞増殖の阻害を意味する。
【００７９】
【表２】
【００８０】表ＩＩの脚注：抗−クロノタイプ特異的Ｂ
細胞を選択するために２８×１０6のリンパ球をイムノ
ビーズ選択手順で処理した。選択したＢ細胞をＥＬ−４
Ｂ細胞培養システム中で種々の平板培養密度で増量さ
せ、８日目に、問題のＴ細胞（Ｈ．２４３）及び無関係
のＴ細胞（Ｈ．２５８）に関して上清の抗体凝集を試験
した。
細胞を選択するために２８×１０6のリンパ球をイムノ
ビーズ選択手順で処理した。選択したＢ細胞をＥＬ−４
Ｂ細胞培養システム中で種々の平板培養密度で増量さ
せ、８日目に、問題のＴ細胞（Ｈ．２４３）及び無関係
のＴ細胞（Ｈ．２５８）に関して上清の抗体凝集を試験
した。
【００８１】ｘ：未決定数の選択細胞
【００８２】
【表３】
【００８３】表ＩＩＩの脚注：参考文献 １．Ｍｏｒｅｔｔａ，Ａ．ら（１９８５），インターロ
イキン−２−産生ヒト白血病Ｔ細胞系のイディオタイプ
様構造に対するモノクローナル抗体の選択及びキャラク
タリゼーション（Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａ
ｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎ
ａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ ｔｈｅ ｉｄｉｏ
ｔｙｐｅ−ｌｉｋｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ａｎ
ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ
ｈｕｍａｎ ｌｅｕｋａｅｍｉａＴ−ｃｅｌｌ ｌｉｎ
ｅ），Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ３６：ｐ．２５３−
２５９． ２．Ｏｅｔｇｅｎ，Ｈ．Ｃ．ら（１９８６），ネズミの
Ｔ細胞の抗原レセプターに関連したＴ３様タンパク質複
合体（Ａ Ｔ３−ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐ
ｌｅｘ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ａ
ｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｏｎ ｍｕｒｉｎｅ
Ｔ ｃｅｌｌｓ），Ｎａｔｕｒｅ ３２０：ｐ．２７
２−２７５． ３．Ｓｔｅｅｎｂａｋｋｅｒｓ，Ｐ．Ｇ．Ａ．ら（１９
９４），予選択された抗原特異的Ｂ細胞からのモノクロ
ーナル抗体の効率的な産生（Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｇｅｎ
ｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔ
ｉｂｏｄｉｅｓｆｒｏｍ ｐｒｅｓｅｌｅｃｔｅｄ ａ
ｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｂｃｅｌｌｓ），Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｐｏｒｔｓ
１９，ｐ．１２５−１３４． ４．Ｓｔｅｅｎｂａｋｋｅｒｓ，Ｐ．Ｇ．Ａ．ら（１９
９２），ヒト及びネズミの抗体産生ハイブリドーマの新
規な作製方法（Ａ ｎｅｗ ａｐｐｒｏａｃｈｔｏ ｔ
ｈｅ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ａｎ
ｄ ｍｕｒｉｎｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｒｏｄｕｃｉ
ｎｇ ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．
Ｍｅｔｈｏｄｓ １５２，ｐ．６９−７７． ５．Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｕ．Ｋ．（１９７０），Ｔ４バク
テリオファージの頭部の組立中の構造タンパク質の開裂
（Ｃｌｅａｖａｇｅ ｏｆ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｐ
ｒｏｔｅｉｎｓ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ａｓｓｅｍｂ
ｌｙ ｏｆ ｔｈｅ ｈｅａｄ ｏｆ ａ ｂａｃａｔ
ｅｒｉｏｐｈａｇｅ Ｔ４），Ｎａｔｕｒｅ ２２７：
ｐ．６８０−６８５． ６．Ｔｏｗｂｉｎ，Ｈ．ら（１９７９），ポリアクリル
アミドゲルからニトロセルロースシートへのタンパク質
の電気泳動転移：手順及び応用（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏ
ｒｅｔｉｃ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ
ｓ ｆｒｏｍ ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ
ｓ ｔｏ ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅｓｈｅｅｔ
ｓ：Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ａｎｄ ｓｏｍｅ ａｐｐｌ
ｉｃａｔｉｏｎｓ），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７６：ｐ．４３５０−４３５４． 略号 ＰＢＳ リン酸塩緩衝生理食塩水 ＢＣＩＰ ５−ブロモ−４−クロロ−３−インドイルホ
スフェートｐ−トルイジン塩 ＮＢＴ ｐ−ニトロブルーテトラゾリウムクロリド ＢＳＡ ウシ血清アルブミン ＦＣＳ ウシ胎仔血清 ＳＡＭ ヒツジ抗マウス ＴＳＮ Ｔ細胞上清 ＭＡｂ モノクローナル抗体 製造業者 Ｂｉｏｒａｄ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ，Ｕ．Ｓ．Ａ． Ｇｉｂｃｏ，Ｐａｉｓｌｅｙ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，Ｕ．Ｓ．Ａ． Ｐａｃｋａｒｄ，Ｍｅｒｉｄｅｎ，ＣＴ，Ｕ．Ｓ．Ａ．
イキン−２−産生ヒト白血病Ｔ細胞系のイディオタイプ
様構造に対するモノクローナル抗体の選択及びキャラク
タリゼーション（Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａ
ｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎ
ａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ ｔｈｅ ｉｄｉｏ
ｔｙｐｅ−ｌｉｋｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ａｎ
ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ
ｈｕｍａｎ ｌｅｕｋａｅｍｉａＴ−ｃｅｌｌ ｌｉｎ
ｅ），Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ３６：ｐ．２５３−
２５９． ２．Ｏｅｔｇｅｎ，Ｈ．Ｃ．ら（１９８６），ネズミの
Ｔ細胞の抗原レセプターに関連したＴ３様タンパク質複
合体（Ａ Ｔ３−ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐ
ｌｅｘ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ａ
ｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｏｎ ｍｕｒｉｎｅ
Ｔ ｃｅｌｌｓ），Ｎａｔｕｒｅ ３２０：ｐ．２７
２−２７５． ３．Ｓｔｅｅｎｂａｋｋｅｒｓ，Ｐ．Ｇ．Ａ．ら（１９
９４），予選択された抗原特異的Ｂ細胞からのモノクロ
ーナル抗体の効率的な産生（Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｇｅｎ
ｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔ
ｉｂｏｄｉｅｓｆｒｏｍ ｐｒｅｓｅｌｅｃｔｅｄ ａ
ｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｂｃｅｌｌｓ），Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｐｏｒｔｓ
１９，ｐ．１２５−１３４． ４．Ｓｔｅｅｎｂａｋｋｅｒｓ，Ｐ．Ｇ．Ａ．ら（１９
９２），ヒト及びネズミの抗体産生ハイブリドーマの新
規な作製方法（Ａ ｎｅｗ ａｐｐｒｏａｃｈｔｏ ｔ
ｈｅ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ａｎ
ｄ ｍｕｒｉｎｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｒｏｄｕｃｉ
ｎｇ ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．
Ｍｅｔｈｏｄｓ １５２，ｐ．６９−７７． ５．Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｕ．Ｋ．（１９７０），Ｔ４バク
テリオファージの頭部の組立中の構造タンパク質の開裂
（Ｃｌｅａｖａｇｅ ｏｆ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｐ
ｒｏｔｅｉｎｓ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ａｓｓｅｍｂ
ｌｙ ｏｆ ｔｈｅ ｈｅａｄ ｏｆ ａ ｂａｃａｔ
ｅｒｉｏｐｈａｇｅ Ｔ４），Ｎａｔｕｒｅ ２２７：
ｐ．６８０−６８５． ６．Ｔｏｗｂｉｎ，Ｈ．ら（１９７９），ポリアクリル
アミドゲルからニトロセルロースシートへのタンパク質
の電気泳動転移：手順及び応用（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏ
ｒｅｔｉｃ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ
ｓ ｆｒｏｍ ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ
ｓ ｔｏ ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅｓｈｅｅｔ
ｓ：Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ａｎｄ ｓｏｍｅ ａｐｐｌ
ｉｃａｔｉｏｎｓ），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７６：ｐ．４３５０−４３５４． 略号 ＰＢＳ リン酸塩緩衝生理食塩水 ＢＣＩＰ ５−ブロモ−４−クロロ−３−インドイルホ
スフェートｐ−トルイジン塩 ＮＢＴ ｐ−ニトロブルーテトラゾリウムクロリド ＢＳＡ ウシ血清アルブミン ＦＣＳ ウシ胎仔血清 ＳＡＭ ヒツジ抗マウス ＴＳＮ Ｔ細胞上清 ＭＡｂ モノクローナル抗体 製造業者 Ｂｉｏｒａｄ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ，Ｕ．Ｓ．Ａ． Ｇｉｂｃｏ，Ｐａｉｓｌｅｙ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，Ｕ．Ｓ．Ａ． Ｐａｃｋａｒｄ，Ｍｅｒｉｄｅｎ，ＣＴ，Ｕ．Ｓ．Ａ．
【００８４】
配列番号：１ 配列の長さ：１３ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 フラグメント型：中間部フラグメント 配列Arg Ser Phe Thr Leu Ala Ser Ser Glu Thr Gly Val Gly 1 5 10 配列番号：２ 配列の長さ：１５ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 フラグメント型：中間部フラグメント 配列Phe Gly Arg Ser Phe Thr Leu Ala Ser Ser Glu Thr Gly Val Gly 1 5 10 15 配列番号：３ 配列の長さ：１６ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 フラグメント型：中間部フラグメント 配列Gly Arg Ser Phe Thr Leu Ala Ser Ser Glu Thr Gly Val Gly Ala Pro 1 5 10 15
【図１】Ｈ．２４３に対するＭＡｂによって免疫沈降し
たＨ．２４３ Ｔ細胞表面分子の同定を示す電気泳動の
写真である。１０％ゲル中で非還元性条件下（レーン
２、３及び４）または還元性条件下（レーン５、６及び
７）でＳＤＳ／ＰＡＧＥを実施した。レーン１：１０ｋ
Ｄの梯子形マーカー；レーン２及び５：対照ＭＡｂ；レ
ーン３及び６：ＴＣＲ８３；レーン４及び７：抗−ＣＤ
３、ＯＴＫ３。
たＨ．２４３ Ｔ細胞表面分子の同定を示す電気泳動の
写真である。１０％ゲル中で非還元性条件下（レーン
２、３及び４）または還元性条件下（レーン５、６及び
７）でＳＤＳ／ＰＡＧＥを実施した。レーン１：１０ｋ
Ｄの梯子形マーカー；レーン２及び５：対照ＭＡｂ；レ
ーン３及び６：ＴＣＲ８３；レーン４及び７：抗−ＣＤ
３、ＯＴＫ３。
【図２】抗クロノタイプＭＡｂはウェスタンブロッティ
ングでＴＣＲアルファベータを認識することを示す電気
泳動写真である。免疫沈降したＨ．２４３のＴＣＲ／Ｃ
Ｄ３複合体を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで非還元性条
件下に分解し、次いでＰＶＤＦ膜に転移させた。膜をＭ
Ａｂと共にインキュベートし、最後に、アルカリ性ホス
ファターゼ結合ヤギ抗−マウスＩｇ第二抗体を用いて結
合ＭＡｂを検出した。レーン１：１０ｋＤの梯子形マー
カー、レーン２：ＴＣＲ６４、レーン３：ＴＣＲ６６、
レーン４：ＴＣＲ６９、レーン５：ＴＣＲ７０、レーン
６：ＴＣＲ７２、レーン７：ＴＣＲ７３、レーン８：Ｔ
ＣＲ７６、レーン９：ＴＣＲ７８、レーン１０：ＴＣＲ
７９、レーン１１：ＴＣＲ８３、レーン１２：対照ＭＡ
ｂ、レーン１３：培地対照。
ングでＴＣＲアルファベータを認識することを示す電気
泳動写真である。免疫沈降したＨ．２４３のＴＣＲ／Ｃ
Ｄ３複合体を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで非還元性条
件下に分解し、次いでＰＶＤＦ膜に転移させた。膜をＭ
Ａｂと共にインキュベートし、最後に、アルカリ性ホス
ファターゼ結合ヤギ抗−マウスＩｇ第二抗体を用いて結
合ＭＡｂを検出した。レーン１：１０ｋＤの梯子形マー
カー、レーン２：ＴＣＲ６４、レーン３：ＴＣＲ６６、
レーン４：ＴＣＲ６９、レーン５：ＴＣＲ７０、レーン
６：ＴＣＲ７２、レーン７：ＴＣＲ７３、レーン８：Ｔ
ＣＲ７６、レーン９：ＴＣＲ７８、レーン１０：ＴＣＲ
７９、レーン１１：ＴＣＲ８３、レーン１２：対照ＭＡ
ｂ、レーン１３：培地対照。
【図３】固定化抗−ＴＣＲ ＭＡｂはヒトＴ細胞クロー
ンＨ．２４３の増殖を刺激することを示すグラフであ
る。Ｈ．２４３に対するＭＡｂ（ＴＣＲ６４〜ＴＣＲ８
３）によって誘発された増殖を、指定した対照ＭＡｂ及
び他のＴＣＲに対する抗−クロノタイプ抗体であるＴＣ
Ｒ４４に比較したグラフである。各値は、４つの重複培
養物の５分間あたりの平均カウント数±標準偏差を表
す。
ンＨ．２４３の増殖を刺激することを示すグラフであ
る。Ｈ．２４３に対するＭＡｂ（ＴＣＲ６４〜ＴＣＲ８
３）によって誘発された増殖を、指定した対照ＭＡｂ及
び他のＴＣＲに対する抗−クロノタイプ抗体であるＴＣ
Ｒ４４に比較したグラフである。各値は、４つの重複培
養物の５分間あたりの平均カウント数±標準偏差を表
す。
【図４】抗ＴＣＲ ＭＡｂとのプレインキュベーション
は、ヒトＴ細胞クローンＨ．２４３の抗原誘発性増殖を
阻害またはブロックすることを示すグラフである。
（ａ）Ｈ．２４３に対するＭＡｂ（ＴＣＲ６４〜ＴＣＲ
８３）による阻害を、指定した対照ＭＡｂ及び他のＴＣ
Ｒに対する抗クロノタイプＭＡｂであるＴＣＲ４４に比
較した。各値は、４つの重複培養物の５分間あたりの平
均カウント数±標準偏差を表す。（ｂ）強力な阻害性Ｍ
Ａｂの用量応答曲線；ＴＣＲ６４（白丸）、ＴＣＲ７０
（黒三角）、ＴＣＲ７８（白四角）、ＴＣＲ８３（黒四
角）、対照ＭＡｂ１（黒丸）。各値は３つの重複培養物
の５分間あたりの平均カウント数を表す。
は、ヒトＴ細胞クローンＨ．２４３の抗原誘発性増殖を
阻害またはブロックすることを示すグラフである。
（ａ）Ｈ．２４３に対するＭＡｂ（ＴＣＲ６４〜ＴＣＲ
８３）による阻害を、指定した対照ＭＡｂ及び他のＴＣ
Ｒに対する抗クロノタイプＭＡｂであるＴＣＲ４４に比
較した。各値は、４つの重複培養物の５分間あたりの平
均カウント数±標準偏差を表す。（ｂ）強力な阻害性Ｍ
Ａｂの用量応答曲線；ＴＣＲ６４（白丸）、ＴＣＲ７０
（黒三角）、ＴＣＲ７８（白四角）、ＴＣＲ８３（黒四
角）、対照ＭＡｂ１（黒丸）。各値は３つの重複培養物
の５分間あたりの平均カウント数を表す。
【図５】抗クロノタイプＭＡｂはヒトＴｈ１クローン
Ｈ．２４３のアネルギーを誘発することを示すグラフで
ある。固定化抗−クロノタイプＭＡｂまたは対照ＭＡｂ
１をＨ．２４３ Ｔ細胞と共に一夜インキュベートし
た。細胞のアネルギー性刺激物質を除去した後、漸増濃
度のペプチドとＤＲＢ１＊０４０１適合性ＡＰＣとから
成る十分な刺激物質を細胞に与えた。3Ｈチミジン取込
みによって増殖を評価した。各値は３つの重複培養物の
５分間あたりの平均カウント数±標準偏差を表す。
Ｈ．２４３のアネルギーを誘発することを示すグラフで
ある。固定化抗−クロノタイプＭＡｂまたは対照ＭＡｂ
１をＨ．２４３ Ｔ細胞と共に一夜インキュベートし
た。細胞のアネルギー性刺激物質を除去した後、漸増濃
度のペプチドとＤＲＢ１＊０４０１適合性ＡＰＣとから
成る十分な刺激物質を細胞に与えた。3Ｈチミジン取込
みによって増殖を評価した。各値は３つの重複培養物の
５分間あたりの平均カウント数±標準偏差を表す。
【図６】アネルギー性Ｈ．２４３ Ｔ細胞は非アネルギ
ー性Ｈ．２４３ Ｔ細胞の応答を抑圧することを示すグ
ラフである。固定化ＴＣＲ７６または対照ＭＡｂ１を
Ｈ．２４３ Ｔ細胞と共に一夜インキュベートした。次
に、双方のＴ細胞集団をウェルあたり２×１０4のＴ細
胞の濃度で用いて、漸増濃度のペプチド（またはＰＨ
Ａ）及びＡＰＣと共に増殖アッセイを実施した。更に、
ＴＣＲ７６とのインキュベーションによって得られた種
々の量のアネルギー性細胞を、ＭＡｂ１とのインキュベ
ーションによって得られた２×１０4の非アネルギー性
細胞と混合し、増殖アッセイを実施した。Ａ／Ｎ：アネ
ルギー性細胞対非アネルギー性細胞の比；１＝２×１０
4細胞。3Ｈ−チミジン取込みによって増殖を評価した。
各値は３つの重複培養物の５分間あたりの平均カウント
数＋標準偏差を表す。
ー性Ｈ．２４３ Ｔ細胞の応答を抑圧することを示すグ
ラフである。固定化ＴＣＲ７６または対照ＭＡｂ１を
Ｈ．２４３ Ｔ細胞と共に一夜インキュベートした。次
に、双方のＴ細胞集団をウェルあたり２×１０4のＴ細
胞の濃度で用いて、漸増濃度のペプチド（またはＰＨ
Ａ）及びＡＰＣと共に増殖アッセイを実施した。更に、
ＴＣＲ７６とのインキュベーションによって得られた種
々の量のアネルギー性細胞を、ＭＡｂ１とのインキュベ
ーションによって得られた２×１０4の非アネルギー性
細胞と混合し、増殖アッセイを実施した。Ａ／Ｎ：アネ
ルギー性細胞対非アネルギー性細胞の比；１＝２×１０
4細胞。3Ｈ−チミジン取込みによって増殖を評価した。
各値は３つの重複培養物の５分間あたりの平均カウント
数＋標準偏差を表す。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｔ Ｇ０１Ｎ 33/50 33/53 Ｋ 33/53 33/564 Ｚ 33/564 33/577 Ｂ 33/577 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (21)
- 【請求項１】 （１）（ｉ）全細胞と、（ｉｉ）全細胞
を処理することによって得られた膜画分、とから成るグ
ループから選択された細胞表面抗原含有材料を哺乳動物
に注射する段階と、（２）前記哺乳動物の脾臓からＢ細
胞含有細胞画分を単離する段階と、（３）前記全細胞に
近縁で前記細胞表面抗原の欠如した細胞の担体結合材料
と該細胞画分とを接触させることによって、段階２で得
られた前記細胞画分中の前記細胞表面抗原特異的Ｂ細胞
を富化し、次いで、近縁細胞の担体結合材料に結合した
Ｂ細胞を、次段階で使用すべき富化された非結合Ｂ細胞
含有画分から分離する段階と、（４）前段階で得られた
富化Ｂ細胞含有細胞画分を限界希釈及びクローン増量で
順次に処理する段階と、（５）Ｂ細胞クローンを選択
し、前記選択されたＢ細胞クローンを小規模融合技術を
用いて不死化する段階と、（６）前記細胞表面抗原に特
異的に結合する抗体を産生し得るハイブリドーマを選択
及びクローニングし、次いでモノクローナル抗体含有画
分を前記ハイブリドーマの上清から単離する段階とから
成る細胞表面抗原に対するモノクローナル抗体の製造方
法。 - 【請求項２】 表面抗原を注射した哺乳動物が表面抗原
の起原となる哺乳動物種とは異なる種であることを特徴
とする請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 表面抗原が定常部と可変部とを有してお
り、前記可変部の少なくとも一部が前記表面抗原の特異
性決定部位を形成していることを特徴とする請求項１ま
たは２に記載の方法。 - 【請求項４】 表面抗原含有材料としてレセプター分子
含有材料を使用することを特徴とする請求項３に記載の
方法。 - 【請求項５】 レセプター分子含有材料を調製するため
にＴ細胞クローンを使用することを特徴とする請求項４
に記載の方法。 - 【請求項６】 段階１の膜画分が全細胞の機械的処理に
よって得られることを特徴とする請求項１から５のいず
れか一項に記載の方法。 - 【請求項７】 細胞表面抗原含有材料をアジュバントの
非存在下で哺乳動物に注射することを特徴とする請求項
１から６のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項８】 段階３で得られた富化Ｂ細胞含有細胞画
分を段階４で使用すべくより高度に富化するために、
（ｊ）全細胞と、（ｊｊ）前記全細胞から得られた膜画
分と、（ｊｊｊ）実質的に精製された細胞表面抗原とか
らなるグループから選択された担体結合細胞表面抗原含
有材料と、細胞画分とを接触させ、次いで前記担体結合
材料に結合したＢ細胞から前記担体結合材料に結合しな
かったＢ細胞を分離し、前記担体結合材料に結合した前
記Ｂ細胞が段階４で使用するためのより高度に富化され
た細胞画分を構成することを特徴とする請求項１から７
のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項９】 担体として常磁性ビーズを使用すること
を特徴とする請求項１から８のいずれか一項に記載の方
法。 - 【請求項１０】 段階５及び６の少なくとも１つにおけ
る選択が凝集アッセイを用いて行われ、前記凝集アッセ
イにおいては、Ｂ細胞クローンの上清を、段階１で使用
した注射哺乳動物種の抗体に結合し得る抗体をコートし
た担体と、細胞表面抗原を含む全細胞とに接触させ、凝
集を検出することを特徴とする請求項１から９のいずれ
か一項に記載の方法。 - 【請求項１１】 前記全細胞に近縁で前記細胞表面抗原
の欠如した全細胞を対照として使用することを特徴とす
る請求項１０に記載の方法。 - 【請求項１２】 段階５で選択されたＢ細胞クローンを
骨髄腫細胞と混合し、微量電気融合で処理することを特
徴とする請求項１から１１のいずれか一項に記載の方
法。 - 【請求項１３】 Ｔ細胞レセプターのクロノタイプ構造
に反応性のモノクローナル抗体。 - 【請求項１４】 Ｔ細胞レセプターが自己免疫疾患に関
連するＴ細胞レセプターであることを特徴とする請求項
１３に記載のモノクローナル抗体。 - 【請求項１５】 自己免疫疾患がリューマチ様関節炎で
あることを特徴とする請求項１４に記載のモノクローナ
ル抗体。 - 【請求項１６】 前記モノクローナル抗体がＨＣ ｇｐ
−３９反応性Ｔ細胞クローンのＴ細胞レセプターに反応
性であることを特徴とする請求項１５に記載のモノクロ
ーナル抗体。 - 【請求項１７】 Ｔ細胞クローンがＨ．２４３（ＥＣＡ
ＣＣ受託番号Ｎｏ．９６１０３１２２）であることを特
徴とする請求項１６に記載のモノクローナル抗体。 - 【請求項１８】 ＴＣＲ６９（ＥＣＡＣＣ受託番号Ｎ
ｏ．９６１０３１１８）、ＴＣＲ７０（ＥＣＡＣＣ受託
番号Ｎｏ．９６１０３１１９）、ＴＣＲ７２（ＥＣＡＣ
Ｃ受託番号Ｎｏ．９６１０３１２０）及びＴＣＲ８３
（ＥＣＡＣＣ受託番号９６１０３１２１）から成るグル
ープから選択されたハイブリドーマによって産生される
ことを特徴とする請求項１７に記載のモノクローナル抗
体。 - 【請求項１９】 請求項１から１２のいずれか一項に記
載の方法で調製されたモノクローナル抗体と適当な賦形
剤とを混合して成る医薬組成物。 - 【請求項２０】 請求項１３から１８のいずれか一項に
記載のモノクローナル抗体と適当な賦形剤とを混合して
成りリューマチ様関節炎の治療に好適な医薬組成物。 - 【請求項２１】 請求項１から１２のいずれか一項に記
載の方法で調製したモノクローナル抗体と請求項１３か
ら１８のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体とか
ら成るグループから選択されたモノクローナル抗体を含
む診断用試薬。
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