PL193821B1 - Sposób wytwarzania przeciwciała monoklonalnego, przeciwciało monoklonalne, kompozycja farmaceutyczna i odczynnik diagnostyczny - Google Patents

Sposób wytwarzania przeciwciała monoklonalnego, przeciwciało monoklonalne, kompozycja farmaceutyczna i odczynnik diagnostyczny

Info

Publication number
PL193821B1
PL193821B1 PL323572A PL32357297A PL193821B1 PL 193821 B1 PL193821 B1 PL 193821B1 PL 323572 A PL323572 A PL 323572A PL 32357297 A PL32357297 A PL 32357297A PL 193821 B1 PL193821 B1 PL 193821B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
cell
bound
surface antigen
cells
lymphocytes
Prior art date
Application number
PL323572A
Other languages
English (en)
Other versions
PL323572A1 (en
Inventor
Petrus Gerardus Antonius Steenbakkers
Original Assignee
Akzo Nobel Nv
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Akzo Nobel Nv filed Critical Akzo Nobel Nv
Publication of PL323572A1 publication Critical patent/PL323572A1/xx
Publication of PL193821B1 publication Critical patent/PL193821B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2809—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against the T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/04—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length on carriers
    • C07K1/042—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length on carriers characterised by the nature of the carrier
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
    • C12N5/16—Animal cells
    • C12N5/163—Animal cells one of the fusion partners being a B or a T lymphocyte
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/74—Inducing cell proliferation
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/10—Musculoskeletal or connective tissue disorders
    • G01N2800/101—Diffuse connective tissue disease, e.g. Sjögren, Wegener's granulomatosis
    • G01N2800/102—Arthritis; Rheumatoid arthritis, i.e. inflammation of peripheral joints

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Mycology (AREA)

Abstract

1. Sposób wytwarzania przeciwcia la monoklonalnego przeciw antygenowi powierzchniowemu komórki maj ace- mu cz es c sta la i cz esc zmienn a, przy czym przynajmniej fragment cz esci zmiennej stanowi fragment zapewniaj acy swoisto sc tego antygenu powierzchniowego, znamienny tym, ze obejmuje etapy: 1) wstrzykiwania ssakowi nieb edacemu cz lowiekiem materia lu obejmuj acego antygen powierzchniowy komórki, który jest wybrany z grupy sk ladaj acej si e z i) ca lych komórek i ii) frakcji b lon uzyskanej przez przetwarzanie ca lych komórek; 2) izolowania frakcji komórkowej zawieraj acej limfocyty B ze sledziony ssaka; 3) wzbogacania frakcji komórkowej uzyskanej w etapie 2) w limfocyty B swoiste wobec antygenu powierzchnio- wego komórki przez doprowadzanie do kontaktu pomi edzy frakcj a komórkow a i zwi azanym z no snikiem materia lem komórkowym pokrewnym z materia lem ca lych komórek, przy czym materia l komórkowy zwi azany z no snikiem jest pozbawiony antygenu powierzchniowego komórki, i oddzielania limfocytów B zwi azanych z materia lem komórek po- krewnych zwi azanym z no snikiem od wzbogaconej niezwi azanej frakcji komórkowej zawieraj acej limfocyty B, która ma by c zastosowana w nast epnym etapie; 4) doprowadzenia do kontaktu frakcji komórkowej ze zwi azanym z no snikiem materia lem zawieraj acym po- wierzchniowy antygen komórkowy wybranym z grupy a) ca lych komórek, b) frakcji b lonowej uzyskanej z tych ca lych komórek c) zasadniczo oczyszczonego antygenu powierzchniowego komórki, a nast epnie oddzielenie limfocytów B niezwi azanych z materia lem zwi azanym z no snikiem od limfocytów B zwi azanych z tym materia lem zwi azanym z no sni- kiem; 5) poddania limfocytów B zwi azanych z materia lem zwi azanym z no snikiem otrzymanym we wcze sniejszym eta- pie rozcie nczeniem granicznym, a nast epnie namno zeniu klonalnemu; 6) selekcjonowania klonu limfocytów B i unie smiertelniania wyselekcjonowanego klonu limfocytów B z zastoso- waniem techniki fuzji na ma la skal e; i 7) selekcjonowania i klonowania hybrydoma zdolnej do wytwarzania przeciwcia l, które swoi scie wi aza antygen powierzchniowy komórki, a nast epnie izolowanie frakcji zawieraj acej przeciwcia la monoklonalne z supernatantu tych hybrydoma. PL PL PL

Description

Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania przeciwciała monoklonalnego, przeciwciało monoklonalne, kompozycja farmaceutyczna i odczynnik diagnostyczny.
Wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania przeciwciała monoklonalnego przeciwko antygenowi powierzchniowemu komórki, a konkretnie takiemu antygenowi powierzchniowemu, który stanowi tylko nieznaczną część całkowitego antygenu wstrzykiwanego ssakowi i antygenowi powierzchniowemu, który łatwo traci swą konformację in vivo. Problem nieznacznej ilości antygenu względem całkowitej ilości antygenu pojawia się w przypadku, przykładowo, gdy antygen stosowany do wstrzykiwania ssakowi pochodzi z innego gatunku ssaka.
Problemy związane z antygenami opisanymi powyżej stają się faktem gdy, przykładowo, pożądane jest wytworzenie przeciwciał monoklonalnych przeciwko części receptora limfocyta T (TCR), która określa swoistość. Takie przeciwciała (monoklonalne) znane są jako przeciwciała antyklonotypowe, ponieważ rozpoznają one część swoistą antygenowo (albo strukturę klonotypową) receptora limfocyta T konkretnego klonu limfocytów T. O ile monoklonalne (mysie) przeciwciała antyklonotypowe przeciwko receptorom mysich limfocytów T (TCR) opisywane są sporadycznie, istnieje jeszcze mniej znanych (mysich) monoklonalnych przeciwciał antyklonotypowych przeciwko receptorom ludzkich limfocytów T. Limfocyty T są trudne w hodowli, utrudniając uzyskanie i oczyszczenie wystarczającej ilości antygenu, tj. białka receptora limfocytów T. To z kolei utrudnia uzyskanie odpowiedzi odpornościowej, jak również utrudnia badanie przesiewowe. W jednym z nielicznych przypadków, gdzie dostępne jest monoklonalne przeciwciało antyklonotypowe przeciwko ludzkiemu TCR, problemy te nie powstały, ponieważ antygen obecny był na komórkach białaczkowych Jurkat (odn. 1). Ponieważ komórki białaczki mogą być hodowane w ilości nieograniczonej, nie powstał problem braku antygenu. Do tej pory nie było jednak dostępnej metody wytwarzania przeciwciał monoklonalnych przeciwko rzadkim i/lub bardzo niestabilnym antygenom bez potrzeby przesiewania wielkiej liczby klonów hybrydoma.
Wynalazek niniejszy dostarcza sposobu wytwarzania przeciwciała monoklonalnego przeciw antygenowi powierzchniowemu komórki mającemu część stałą i część zmienną, przy czym przynajmniej fragment części zmiennej stanowi fragment zapewniający swoistość tego antygenu powierzchniowego, obejmującego etapy:
1) wstrzykiwania ssakowi niebędącemu człowiekiem materiału obejmującego antygen powierzchniowy komórki, który jest wybrany z grupy składającej się z i) całych komórek i ii) frakcji błon uzyskanej przez przetwarzanie całych komórek;
2) izolowania frakcji komórkowej zawierającej limfocyty B ze śledziony ssaka;
3) wzbogacania frakcji komórkowej uzyskanej w etapie 2) w limfocyty B swoiste wobec antygenu powierzchniowego komórki przez doprowadzanie do kontaktu pomiędzy frakcją komórkową i związanym z nośnikiem materiałem komórkowym pokrewnym z materiałem całych komórek, przy czym materiał komórkowy związany z nośnikiem jest pozbawiony antygenu powierzchniowego komórki, i oddzielania limfocytów B związanych z materiałem komórek pokrewnych związanym z nośnikiem od wzbogaconej niezwiązanej frakcji komórkowej zawierającej limfocyty B, która ma być zastosowana w nastę pnym etapie;
4) doprowadzenia do kontaktu frakcji komórkowej ze związanym z nośnikiem materiałem zawierającym powierzchniowy antygen komórkowy wybranym z grupy a) całych komórek, b) frakcji błonowej uzyskanej z tych całych komórek c) zasadniczo oczyszczonego antygenu powierzchniowego komórki, a następnie oddzielenie limfocytów B niezwiązanych z materiałem związanym z nośnikiem od limfocytów B związanych z tym materiałem związanym z nośnikiem;
5) poddania limfocytów B związanych z materiałem związanym z nośnikiem otrzymanym we wcześniejszym etapie rozcieńczeniom granicznym, a następnie namnożeniu klonalnemu;
6) selekcjonowania klonu limfocytów B i unieśmiertelniania wyselekcjonowanego klonu limfocytów B z zastosowaniem techniki fuzji na małą skalę; i
7) selekcjonowania i klonowania hybrydoma zdolnej do wytwarzania przeciwciał, które swoiście wiążą antygen powierzchniowy komórki, a następnie izolowanie frakcji zawierającej przeciwciała monoklonalne z supernatantu tych hybrydoma.
Korzystnie ssak, któremu wstrzykuje się antygen, jest innego gatunku niż gatunek ssaka z którego pochodzi antygen.
Korzystnie, jako materiał zawierający antygen powierzchniowy stosuje się materiał zawierający cząsteczkę receptora.
PL 193 821 B1
Korzystnie do wytworzenia materiału zawierającego cząsteczkę receptora stosuje się klon limfocytów T.
Korzystnie frakcję błon w etapie 1) uzyskuje się przez mechaniczną obróbkę całych komórek.
Korzystnie materiał zawierający antygen powierzchniowy komórki wstrzykuje się ssakowi bez adiuwantu.
Korzystnie jako nośniki stosowane są paramagnetyczne perełki.
Korzystnie selekcję w przynajmniej jednym z etapów 6) i 7) przeprowadza się stosując test aglutynacji, w którym supernatant klonu limfocytów B kontaktuje się z nośnikiem pokrytym przeciwciałami zdolnymi do wiązania przeciwciał gatunku takiego jak ssak poddany iniekcji wykorzystany w etapie 1) i cał ymi komórkami niosą cymi antygen powierzchniowy, i wykrywa się aglutynację .
Szczególnie korzystnie jako kontrolę stosuje się całe komórki jak w teście aglutynacji ale pozbawione antygenu powierzchniowego.
Korzystnie selekcjonowany klon limfocytów B w etapie 6) miesza się z komórkami szpiczaka i poddaje minielektrofuzji.
Wynalazek dotyczy też przeciwciała monoklonalnego, które jest wytwarzane przez hybrydoma wybraną z grupy składającej się z następujących zdeponowanych hybrydoma: ECACC nr dostępu 96103118; ECACC nr dostępu 96103119; ECACC nr dostępu 96103120 i TCR 83 ECACC nr dostępu 96103121.
W zakres wynalazku wchodzi też kompozycja farmaceutyczna zawierają ca substancję czynną i odpowiednią zaróbkę , przy czym jako substancję czynną zawiera przeciwciał o monoklonalne określone powyżej, i jest odpowiednia do leczenia reumatoidalnego zapalenia stawów.
Wynalazek dotyczy również odczynnika diagnostycznego obejmującego przeciwciało monoklonalne określone powyżej.
Stosowane tu określenie „komórka” obejmuje nie tylko komórkę ssaka, ale również wirusy, zaś w szczególnoś ci wirusy zawierają ce bł onę .
Określenie „materiał komórkowy związany z nośnikiem” obejmuje nienaruszone albo całe komórki (i wirusy), frakcje błonowe tych nienaruszonych komórek (i wirusów) albo zasadniczo oczyszczone antygeny powierzchniowe albo ich kompleksy.
O ile nie zaznaczono inaczej, określenie „całe komórki” dotyczy komórek posiadających antygen powierzchniowy będący przedmiotem zainteresowania. Określenie „komórki pokrewne” dotyczy komórek, które korzystnie różnią się tylko tym, że nie posiadają interesującego antygenu powierzchniowego, albo bardziej szczegółowo, pozbawione są determinanty antygenowej, przeciwko której jest pożądane uzyskanie przeciwciała monoklonalnego.
Nieoczekiwanie okazało się, że możliwe jest wzbogacenie frakcji komórkowej limfocytów B swoistych wobec antygenu powierzchniowego, bez stosowania antygenu powierzchniowego, przez doprowadzenie do kontaktu izolowanej frakcji zawierającej limfocyty B z materiałem komórkowym od tego samego gatunku co materiał zawierający antygen powierzchniowy komórki, ale pozbawionym antygenu powierzchniowego komórki. Innymi słowy, przez doprowadzenie do kontaktu limfocytów B z innymi pokrewnymi komórkami (dalej określanymi jako „nieistotne”) albo materiałem komórkowym i usuwanie związanych limfocytów B uzyskuje się wzbogacenie.
Tak więc, możliwe jest wytworzenie przeciwciała monoklonalnego przeciwko antygenowi powierzchniowemu komórek znajdującemu się w iniekcji w mniejszej ilości, nawet gdy antygen powierzchniowy charakteryzuje się niestabilnością konformacyjną.
W patencie europejskim EP 0 488 470 i odnośniku 3, opartym na tym patencie europejskim, opisano sposób, w którym I) ssakowi wstrzykuje się antygen, II) izoluje się frakcję zawierającą limfocyty B, III) selekcjonuje się limfocyty B swoiste wobec antygenu, IV) wzbogaconą frakcję poddaje się namnożeniu klonalnemu i po V) selekcji klonu limfocytów B i unieśmiertelnieniu techniką fuzji na małą skalę VI) selekcjonuje się i klonuje hybrydoma, po czym izoluje się frakcję zawierającą przeciwciało monoklonalne. W etapie III, selekcjonuje się limfocyty B przez wiązanie ich z podłożem plastikowym pokrytym antygenem albo przez rozetkowanie z perełkami paramagnetycznymi pokrytymi antygenem.
Nieswoiste limfocyty B usuwa się przez odpłukanie. Tak więc, pomijając inne różnice, sposób ten opiera się na dostępności i zastosowaniu antygenu - podczas selekcji zużywa się 2 μg/ml antygenu do opłaszczania płytek, podczas gdy niniejszy wynalazek rozwiązuje ten problem w przypadkach gdy antygen jest dostępny w bardzo ograniczonej ilości i nawet bardzo zanieczyszczony.
Sposób według niniejszego wynalazku jest bardzo przydatny do wytwarzania przeciwciał monoklonalnych, gdy obecnych jest wiele antygenów zdolnych do wywołania odpowiedzi odpornościowej.
PL 193 821 B1
Ta sytuacja występuje w szczególności, gdy antygen powierzchniowy ma część stałą i część zmienną, gdzie przynajmniej fragment części zmiennej stanowi część określająca swoistość antygenu powierzchniowego.
Sposób według niniejszego wynalazku jest szczególnie przydatny do wytwarzania przeciwciał monoklonalnych przeciwko części określającej swoistość cząsteczki receptora. Część określająca swoistość cząsteczki receptora stanowi jedynie małą część cząsteczki receptora, która sama w sobie stanowi jedynie małą część całych cząsteczek - a stąd antygenów - na powierzchni komórki.
Korzystny cel według wynalazku stanowi klon limfocytów T, który jest stosowany do wytworzenia materiału zawierającego cząsteczkę receptora.
Limfocyt T może być stosowany jako cała komórka, albo może być stosowany do wytworzenia jej frakcji błonowej. Tak więc, w tym pierwszym przypadku określenie „wytworzenie” może oznaczać izolowanie limfocytów T albo zawieszanie ich w innej pożywce.
Według korzystnego wykonania, frakcja błonowa w etapie 1) uzyskiwana jest przez mechaniczne przetwarzanie całych komórek, a materiał zawierający antygen powierzchniowy komórki jest wstrzykiwany ssakowi bez adiuwantu.
Oba sposoby zapobiegają utracie konformacji in vivo antygenu powierzchniowego.
Ponadto, frakcja komórkowa zawierająca limfocyty B jest korzystnie dalej wzbogacana (etap 3)) przez doprowadzenie do kontaktu frakcji komórkowej z materiałem zawierającym antygen powierzchniowy związanym z nośnikiem, wybranym z grupy obejmującej a) całe komórki, b) frakcję błonową uzyskaną z całych komórek i c) zasadniczo oczyszczony antygen powierzchniowy komórki, a następnie oddzielenie limfocytów B niezwiązanych z materiałem związanym z nośnikiem od limfocytów B związanych z materiałem związanym z nośnikiem, przy czym limfocyty B związane z materiałem związanym z nośnikiem stanowią dalej wzbogacaną frakcję komórkową.
Dalsze wzbogacanie może być prowadzone techniką selekcji pozytywnej, selekcjonującej konkretnie swoiste limfocyty B. Tak więc, mimo trudności z dostępnością antygenu możliwe jest dalsze wzbogacanie.
Zastosowanie perełek paramagnetycznych podczas wzbogacania ułatwia oddzielanie pożądanych i niepożądanych limfocytów B.
Nieznaczna ilość antygenu stanowi również problem podczas badania przesiewowego.
Proste mieszanie supernatantu z hodowli limfocytów B, całych komórek i nośnika pokrytego przeciwciałami zdolnymi do wiązania przeciwciał gatunku ssaka zastosowanego w etapie 1) umożliwia bardzo czułe i szybkie wykrywanie przydatnych klonów, przy czym nie jest konieczne płukanie.
Poniżej wynalazek zostanie objaśniony szczegółowo w odniesieniu do poniższych przykładów, które pokazują najlepszy sposób przeprowadzenia wynalazku, zastosowany do wytworzenia mysiego przeciwciała monoklonalnego swoistego wobec klonotypu receptora ludzkich limfocytów T.
Opis do Figur
Figura 1. Identyfikacja cząsteczek powierzchniowych H.243 limfocytów T, immunoprecypitowanych przeciwciałami monoklonalnymi skierowanymi przeciwko H.243. SDS/PAGE wykonano w warunkach nieredukujących (ścieżka 2, 3 i 4) albo w warunkach redukujących (ścieżka 5, 6 i 7) na żelu 10%. Ścieżka 1: wzorzec 10 kDa; ścieżka 2 i 5: Mab kontrolne; ścieżka 3 i 6: TCR 83; ścieżka 4 i 7: antyCD3, OKT3.
Figura 2. Antyklonotypowe MAb rozpoznają TCRae w badaniu Western blot.
Immunoprecypitowane kompleksy TCR/CD3 H.243 rozdzielono na 10% żelu SDS/PAGE w warunkach nieredukujących, a następnie przeniesiono na membrany PVDF. Membrany inkubowano z MAb i wykrywano związane MAb przy użyciu wtórnego przeciwciała koziego przeciwko mysim Ig sprzęgniętego z fosfatazą alkaliczną.
Ścieżka 1: wzorzec 10 kDa, ścieżka 2: TCR 64, ścieżka 3: TCR 66, ścieżka 4: TCR 69, ścieżka 5: TCR 70, ścieżka 6: TCR 72, ścieżka 7: TCR 73, ścieżka 8: TCR 76, ścieżka 9: TCR 78, ścieżka 10:
TCR 79, ścieżka 11: TCR 83, ścieżka 12: MAb kontrolne, ścieżka 13: kontrola pożywki.
Figura 3: Unieruchomione MAb przeciwko TCR pobudzają proliferację klonu H.243 ludzkich limfocytów T. Proliferację wywołaną przez MAb skierowane przeciwko H.243 (TCR 64 do 83) porównano z MAb kontrolnymi jak to zaznaczono oraz TCR 44, które są MAb antykionotypowymi skierowanymi przeciwko innym TCR. Każda wartość stanowi średnią zliczeń na 5 minut poczwórnych powtórzeń hodowli ± odchylenie standardowe.
Figura 4. Preinkubacja z MAb przeciwko TCR hamuje albo blokuje proliferację wywołaną antygenem klonu ludzkich limfocytów T H.243. a) Zahamowanie przez MAb skierowane przeciwko H.243
PL 193 821 B1 (TCR 64 do TCR 83) porównano z MAb kontrolnymi, jak to zaznaczono, i TCR 44, które są MAb antyklonotypowymi skierowanymi przeciwko innym TCR. Każda wartość stanowi średnią zliczeń na 5 minut poczwórnych powtórzeń hodowli ± odchylenie standardowe. B) Krzywe odpowiedzi na dawkę silnie hamujących MAb; TCR 64 (puste kółka), TCR 70 (wypełnione trójkąty), TCR 78 (puste kwadraty), TCR 83 (wypełnione kwadraty) i MAb kontrolne 1 (wypełnione kółka). Każda wartość stanowi średnią zliczeń na 5 minut potrójnych powtórzeń hodowli.
Figura 5. Antyklonotypowe MAb wywołują anergię u klonu H.243 przeciwko ludzkim Th1. Unieruchomione MAb antyklonotypowe albo kontrolne MAb 1 inkubowano przez noc z limfocytami T H.243. Po usunięciu komórek z bodźca anergicznego, komórkom podano pełny bodziec rosnących stężeń peptydu i APC dobranych pod względem DRB1*0401. Proliferację oceniano przez wbudowywanie 3H-tymidyny. Każda wartość stanowi średnią zliczeń na 5 minut potrójnych powtórzeń hodowli ± odchylenie standardowe.
Figura 6. Anergiczne limfocyty T H.243 hamują odpowiedź nieanergicznych limfocytów T H.243.
Unieruchomione TCR 76 albo kontrolne MAb 1 inkubowano przez noc z limfocytami T H.243. Następnie, obie populacje limfocytów T zastosowano w teście proliferacji z rosnącymi stężeniami peptydu (albo PHA) i APC, stosując 2 x 104 limfocytów T na studzienkę. Oprócz tego, różne ilości anergicznych komórek powstałych podczas inkubacji z TCR 76 mieszano z 2 x 104 komórek nieanergicznych powstałych na skutek inkubacji z MAb 1 i wykonywano test proliferacji. A/N: stosunek komórek anergicznych do komórek nieanergicznych; 1 = 2 x 104 komórek. Proliferację określano przez wbudowywanie 3H-tymidyny. Każda wartość stanowi średnią zliczeń na 5 minut potrójnych powtórzeń hodowli ± odchylenie standardowe.
P r z y k ł a d y
Materiały i Metody
Reagenty
Pożywka hodowlana: DMEM/HAM F12 (Gibco, nr kat. 32500) z dodatkiem 2500 mg/l diwęglanu sodu, 2,3 mg/l 2-merkaptoetanolu, 55 mg/l pirogronianu sodu, 1,22 mg/l etanoloaminy, 360 mg/l L-glutaminy, 4,5 x10-4 mg/l selenianu sodu, 62,5 mg/l penicyliny i 62,5 mg/l siarczanu streptomycyny. W doświadczeniach nad fuzją, pożywkę uzupełniano dodatkowo 13,61 mg/l hipoksantyny i 3,83 mg/l tymidyny. Pożywkę tę określano jako DMEM/HAM F12/HT. Selekcję hybrydoma wykonywano w DMEM/HAM F12/HT z dodatkiem 1% (obj./obj.) supernatantu zawierającego IL-6 ludzkiej linii komórkowej raka pęcherza T24 (T24CM) i 0,4 μΜ aminopteryny.
Pożywka do fuzji: 280 mM inozytolu, 0,1 M octanu wapnia, 0,5 mM octanu magnezu 1 mM histydyny; oporność właściwa: 1,11 x 104 Ω x cm. Składniki rozpuszczono w wodzie Milli-Q, a następnie ustalono przewodnictwo na 90 μS/cm przy użyciu wody Milli-Q albo roztworu zawierającego 1 mM octanu wapnia i 5 mM octanu magnezu.
Hodowle komórkowe:
Klon limfocytów T H.243 pozyskano od pacjenta cierpiącego na reumatoidalne zapalenie stawów. Ten klon limfocytów T przypominający Th1 rozpoznawał epitop RSFTLASSETGVG (Identyfikator Sekw. Nr 1) z gp-39 chrząstki ludzkiej (HC gp-39) w kontekście DRB1*0401 (MHC klasy II). TCR tego klonu charakteryzuje się tym, że jest Va8- i Ve9-pozytywny. Komórki rutynowo hodowano w DMEM/HAM F12 z dodatkiem 10% FCS, 20 U/ml IL-2, 5 U/ml IL-4 i okresowo pobudzano je antygenem i zgodnymi tkankowo komórkami prezentującymi antygen (APC) albo fitohemaglutyniną (PHA) i komórkami odżywczymi. Do testów proliferacji FCS zastępowano normalną surowicą ludzką (NHS).
Wytwarzanie lizatu limfocytów T i opłaszczanie perełek kompleksami TCR/CD3
10-14 dni po ponownej stymulacji, limfocyty T płukano w PBS i rozpuszczano przez inkubację (30 minut, 0°C) w gęstości 108 komórek/ml w buforze ekstrakcyjnym według Oettgen i in., (2) (10 mM trietanoloamina, 150 mM NaCl, 1 mM Na2EDTA, 1% digitonina, 10 μg/ml leupeptyny, 10 μg/ml aprotyniny, 1 μg/ml pepstatyny, 1 mM Pefabloc® AEBSF i 1,8 mg/ml jodoacetaminy pH 7,8). Digitonina - łagodny detergent - umożliwiała ekstrakcję całych kompleksów TCR/CD3. Resztki jąder i komórek usunięto przez odwirowanie przy 16000 g przez 15 minut w 4°C i przechowywano supernatant w porcjach w -20°C do momentu zastosowania do selekcji limfocytów B albo immunoprecypitacji.
Do selekcji swoistych limfocytów B, paramagnetyczne perełki opłaszczano kompleksami TCR/CD3.
100 μl perełek opłaszczonych owczym przeciwciałem przeciwko mysim Ig (SAM-beads; Dynabeads® 110.02) inkubowano (przez noc, 4°C) z 22 μg anty-CD3, OKT3, w PBS z 0,1% BSA. Po płukaniu perełek PBS/BSA, dodano lizat będący ekwiwalentem 1,4 x 108 limfocytów T i równą objętość
PL 193 821 B1 (1,4 ml) PBS/BSA z 1% normalną surowicą mysią, którą dodano w celu zapobieżenia wiązaniu limfocytów B z wolnymi miejscami wiążącymi na perełkach SAM. Zawiesinę perełek inkubowano przez 2-4 godziny w 4°C i płukano PBS/BSA przed zastosowaniem.
Immunizacja
Sześciotygodniowe samice myszy BALB/c immunizowano w odstępach 3-7 tygodni 5 x 106 całych limfocytów T (wynalazek) albo perełkami paramagnetycznymi pokrytymi kompleksami TCR/CD3 będącymi zamiennikiem 5 x 107 (doświadczenie kontrolne). Zastosowano różne drogi podania, jak to zaznaczono na Tabeli I. W przypadku stosowania adiuwantu (doświadczenie kontrolne) pierwsze wstrzyknięcie wykonywano z kompletnym adiuwantem Freunda, następne wstrzyknięcia z niekompletnym adiuwantem Freunda i końcowe wstrzyknięcie przypominające bez adiuwantu.
Wywołanie Mab antyklonotypowych
Samicom myszy BALB/c, w wieku 6 tygodni, wstrzykiwano dootrzewnowo 4-krotnie w odstępach 3-7 tygodni po 5 x 106 spoczynkowych limfocytów T w PBS. Pięć dni po ostatnim wstrzyknięciu, myszy zabito i wytworzono populacje splenocytów pozbawione erytrocytów i monocytów, jak to opisano wcześniej (23, 24). Dało to frakcję komórek wzbogaconą w limfocyty B, ale nie dało wzbogacenia w limfocyty B swoiste wobec antygenu powierzchniowego w odniesieniu do komórek niebę dących limfocytami B, według etapu 2 niniejszego wynalazku.
W celu sklarowania populacji splenocytów pod ką tem limfocytów B reagują cych na ludzką CD3 albo region stały TCRae, około 3 x 107 komórek inkubowano dwukrotnie z 20 μΐ perełek SAM opłaszczonych kompleksami TCR/CD3 nieistotnego klonu limfocytów T (Va3.Ve14-pozytywny klon limfocytów T, SCRO.08A, ale można zastosować dowolny nieistotny klon limfocytów T). Następnie, limfocyty B swoiste wobec regionu zmiennego TCR selekcjonowano przez inkubowanie powstałej zawiesiny komórkowej z perełkami SAM opłaszczonymi kompleksem TCR/CD3 interesującego klonu limfocytów T (H.243). Każdą inkubację wykonywano przez 90 minut w temperaturze pokojowej w DMEM/HAM F12 z dodatkiem 10% surowicy cielęcej (Hyclone®) i 0,2% normalnej surowicy mysiej. Podczas tych inkubacji, zawiesinę dokładnie homogenizowano co 5 minut. Po ostatniej inkubacji, perełki dokładnie płukano pięciokrotnie w DMEM/HAM F12, 10% surowicy cielęcej i zawieszano w tej samej pożywce.
Hybrydomy produkujące przeciwciało monoklonalne wytworzono z tych selekcjonowanych limfocytów B przez namnażanie klonów i minielektrofuzję, jak to opisano wcześniej (23). Wyselekcjonowane limfocyty B zmieszano z supernatantem limfocytów T (TSN) i 50000 naświetlonych (2500 radów) limfocytów B, EL-4, w objętości końcowej 200 μl DMEM/HAM F12 z dodatkiem 10% FCS w płaskodennych płytkach 96-studzienkowych. W 8 dniu, supernatanty badano w 1-etapowym teście aglutynacji limfocytów T, jak to opisano poniżej, stosując interesujący klon limfocytów T albo nieistotny klon limfocytów T. Hodowle limfocytów B wytwarzające rozróżniające MAb poddano procedurze minielektrofuzji. Zawartość tych hodowli limfocytów B zmieszano z 106 komórek szpiczaka NS-1 (25) i usunięto surowice przez płukanie w DMEM/HAM F12/HT. Następnie komórki traktowano pożywką fuzyjną. Elektrofuzję wykonywano w 50 μl komorze fuzyjnej w zmiennym polu elektrycznym przez 30 sekund, 2 MHz, 400 V/cm, a następnie kwadratowym pulsem o dużym napięciu przez 10 μβ, 3 kV/cm i ponownie zmiennym polem elektrycznym przez 30 sekund, 2 MHz, 400 V/cm. Na koniec, zawartość komory fuzyjnej przeniesiono do 20 ml pożywki selekcyjnej i wysiano na 96-studzienkową płytkę do mikromiareczkowania. 8 dni po fuzji, hodowle badano na wzrost hybrydoma i badano przesiewowo ponownie w jednoetapowym teście aglutynacji limfocytów T.
Test aglutynacji limfocytów T
Przesiewanie hodowli hybrydoma pod kątem przeciwciał przeciwko limfocytom T i określenie reaktywności krzyżowej MAb wobec innych limfocytów T wykonano w jednoetapowym teście aglutynacji. Przy użyciu płytek do mikromiareczkowania 50 μl supernatantu hybrydoma zmieszano z 20 μl zawiesiny perełek/komórek, zawierającej 2 x 105 perełek paramagnetycznych ze związanym kowalencyjnie owczym przeciwciałem przeciwko mysim Ig i 5 x 104 interesujących limfocytów T w DMEM/HAM F12. Po 2-3 godzinach inkubacji w 37°C, badano aglutynację pod mikroskopem przez poszukiwanie agregatów komórek i perełek.
Immunoprecypitacja i badanie Western blot
10-14 dni po restymulacji, limfocyty T płukano i znakowano powierzchniowe białka przy użyciu biotyny. Pokrótce, limfocyty T inkubowano w stężeniu 5 x 106 komórek/ml z 0,5 mg/ml ImmunoPure® sulfo-NHS-biotyny w PBS przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Następnie, komórki płukano ponownie i solubilizowano jak to opisano wyżej. Przed zastosowaniem w doświadczeniu nad immunoprecypitacją, lizat komórkowy klarowano przez inkubowanie z perełkami paramagnetycznymi SAM.
PL 193 821 B1
Immunoprecypitację wykonano przez inkubowanie przez 3-4 godzin lizatu będącego równoważnikiem
107 komórek z 15 μΐ perełek SAM opłaszczonych MAb (1 ml supernatantu hybrydoma) przez 3-4 godziny. Następnie, immunoprecypitaty płukano trzykrotnie PBS, gotowano w buforze do próbek i poddawano SDS-PAGE na 10% żelu w warunkach redukujących albo nieredukujących, stosując metodę Laemmli (5) i układ Mini-Protean II (BioRad). Badanie immunoblot wykonano według Towbin i in., (6) stosując membranę PVDF. Miejsca wiązania nieswoistego blokowano przez inkubowanie membran z 5% odtłuszczonym mlekiem w PBS z dodatkiem 0,5% Tween 20. Po płukaniu membrany sondowano streptawidyną-fosfatazą alkaliczną w PBS, 0,5% Tween 20, 1% BSA, 1% normalną surowicą kozią przez godzinę w temperaturze pokojowej. Na koniec, membrany wywoływano BCIP i NBT jako substratem chromogennym. Do badania western blot, paramagnetyczne perełki SAM opłaszczano kompleksami TCR/CD3 jak to opisano wyżej stosując OKT3 jako przeciwciało immunoprecypitujące i lizaty normalnych limfocytów T. Po SDS-PAGE na 10% żelu PAA w warunkach redukujących albo nieredukujących, membrany inkubowano z 2,5 ml supernatantu hybrydoma. Związane przeciwciała wykrywano stosując kozie przeciwciało przeciwko mysim Ig sprzęgnięte z fosfatazą alkaliczną i BCIP/NBT jak opisano powyżej.
Proliferacja limfocytów T zależna od przeciwciała
Płaskodenne studzienki do mikromiareczkowania pokrywano (przez noc, temperatura pokojowa) 100 ul owczego przeciwciała przeciwko mysim Ig w stężeniu 40 μg/ml PBS. Studzienki płukano raz, a następnie inkubowano ze 100 μl MAb w stężeniu 2 μg/ml w PBS przez 2 godziny. Nadmiar wolnego MAb usuwano przez płukanie i dodawano 2,5 x 104 limfocytów T w 200 μl DMEM/HAM F12 z dodatkiem 10% NHS. Po dwóch dniach inkubowania w 37°C, komórki pulsowano przy użyciu 0,5 lc [3H]-tymidyny i inkubowano przez dalsze 16-18 godzin. Na koniec, komórki zebrano na filtry z włókna szklanego i badano wbudowywanie [3H]-tymidyny przez pomiar beta na Matrix 96™ (Packard). Każdą zmienną badano w poczwórnym powtórzeniu.
Zahamowanie przez przeciwciała proliferacji wywołanej antygenem
Płaskodenne studzienki do mikromiareczkowania inokulowano 20 μl supernatantu hybrydoma, 2 x 104 spoczynkowych limfocytów T i 1 x 105 zgodnych tkankowo MNC w 150 μl DMEM/HAM F12 z dodatkiem 10% NHS. Po 3 godzinach inkubacji w 37°C, do hodowli dodano 50 μl peptydu RSFTLASSETGVG (16 μg/ml). Hodowle inkubowano przez dalsze dwa dni w 37°C i określano wbudowywanie [3H]-tymidyny jak to opisano wyżej. Każdą zmienną badano w poczwórnym powtórzeniu.
Indukcja anergii przy użyciu swoistych klonotypowo MAb
24-studzienkowe płytki pokryto (przez noc, temperatura pokojowa) 1 ml owczego przeciwciała przeciwko mysim Ig w stężeniu 40 μg/ml w PBS. Studzienki płukano raz i inkubowano z 1 ml MAb w stężeniu 2 μg/ml w PBS przez godzinę. Nadmiar MAb usuwano i dodawano 2 x 106 płukanych, spoczynkowych limfocytów T w 2 ml DMEM/HAM F12, 10% NHS. Jeżeli zaznaczono, dodawano do hodowli w oznaczonym czasie cyklosporynę A (Sandoz, Bazylea), rlL-2, cykloheksimid (Sigma, St. Louis) albo APC dobrane pod względem HLA-DRB1*0401 (naświetlone 3000 radów). Po całonocnej inkubacji płytki schłodzono na lodzie i zawieszono limfocyty T przez pipetowanie. Komórki płukano w kompletnej pożywce i zastosowano w teście proliferacji limfocytów T, analizie cytokin i analizie FACS, jak to opisano niżej.
Odpowiedź proliferacyjną limfocytów T swoistą antygenowo oceniano w płaskodennych studzienkach hodowlanych zawierających 2 x 104 limfocytów T, 1 x 105 dobranych HLA-DRB1*0401, naświetlonych 3000 radów) PBMC i różne stężenia antygenu w 200 μl DMEM/HAM F12, 10% NHS. Po dwóch dniach, inkubacji w 37°C, komórki pulsowano 0,5 LiCi [3H]-tymidyny i inkubowano przez kolejne 16-18 godzin. Na koniec komórki zebrano na filtry z włókna szklanego i mierzono wbudowywanie [3H]-tymidyny przez scyntylacje gazową na Matrix 96™ (Packard, Meriden CT, USA). Każdą zmienną badano w potrójnym powtórzeniu.
Wyniki
Immunizacje
Immunizacje z użyciem adiuwantu (doświadczenie kontrolne) nie dały żadnej surowicy zawierającej przeciwciała zdolne do rozróżnienia pomiędzy H.243 i nieistotnym klonem limfocytów T (Tabela 1; grupy immunizacji II, III i IV). Miano surowicy grupy V było niskie (1:100 w teście aglutynacji), podczas gdy surowice grup I i II były znacznie wyższe (1:1200).
Wywołanie MAb antyklonotypowych
Przy użyciu splenocytów z grupy I, podczas inkubacji z kompleksami TCR/CD3 z nieistotnego klonu limfocytów T, tu H.258, opłaszczonymi na perełkach paramagnetycznych wytworzyły się liczne
PL 193 821 B1 rozetki komórkowe, co wskazuje na pomyślne usunięcie wielu limfocytów B reaktywnych wobec CD3 i TCRae. Gdy nierozetkujące komórki poddano drugiemu oczyszczaniu na nieistotnych kompleksach TCR/CD3 z tego samego klonu limfocytów T, prawie nie było widocznych żadnych rozetek komórkowych.
Badanie mikroskopowe po inkubacji z perełkami paramagnetycznymi interesującego klonu limfocytów T nie spowodowało widocznego tworzenia rozetek. Nie jest to zaskakujące w świetle oczekiwanej częstości występowania swoistych limfocytów B. Po skrajnym rozcieńczaniu i namnażaniu klonów 36 klonów limfocytów B, stwierdzono że supernatanty aglutynują H.243 a nie nieistotny klon limfocytów T H.258 (Tabela 2). Niektóre supernatanty limfocytów B były zdolne do aglutynacji obu klonów, co wskazuje, że uniknęły one procedury oczyszczania.
Dalej, można wywnioskować z Tabeli 2, że większa część swoistych kultur limfocytów B nie była klonalna, ponieważ limfocyty B nie reagowały z żadnymi limfocytami T. Jednakże, nie stanowiło to problemu, ponieważ hybrydoma z tych nieswoistych limfocytów B nie mogły być wyselekcjonowane po minielektrofuzji. 18 hodowli swoistych limfocytów B poddano minielektrofuzji. Niektóre fuzje nie dały hybrydom swoistych wobec limfocytów T zaś niektóre nie mogły być klonowane jako stabilne linie komórkowe. Całkowicie stabilne hybrydoma uzyskano w 11 spośród 18 mikroelektrofuzji. 11 MAb dalej charakteryzowano. Izotypy tych MAb pokazano na Tabeli III.
Swoistość MAb
W celu dalszego badania swoistości MAb, wykonano testy immunoprecypitacji i testy aglutynacji limfocytów T, jak również badania Western blot.
SDS-PAGE w warunkach nieredukujących i denaturujących wykazała, że wszystkie MAb są zdolne do immunoprecypitacji większego prążka wielkości około 85 kDa i mniejszego prążka wielkości 21 kDa z lizatów digitoninowych klonu H.243 limfocyta T. Było to zgodne z ciężarem cząsteczkowym kompleksu TCRae i odpowiednio łańcuchów ε/δ CD3. W warunkach redukujących, prążek 85 kDa rozdzielił się na dwa prążki 40 kDa i 50 kDa, co jest zgodne z ciężarami cząsteczkowymi łańcucha α i β TCR. Badanie immunologiczne jednego z MAb swoistych wobec H.243 pokazano na Fig. 1, wraz z OKT3 jako kontrolą pozytywną i nieistotnym MAb jako kontrolą negatywną.
Tabela 3 pokazuje aktywność krzyżową MAb z sześcioma klonami limfocytów T pozytywnymi wobec Ve9, dwoma pozytywnymi wobec Va8 i ośmioma klonami limfocytów T Va i Ve-pozytywnymi. Przeciwciało TCR 74 może być uważane za Ve9-swoiste ponieważ aglutynuje wszystkie limfocyty T Ve9-pozytywne a nie inne. Inne przeciwciała przeciwko TCR reagują wyłącznie z H.243, a więc jest bardzo możliwe, że przeciwciała te są skierowane przeciwko części wiążącej antygen H.243, ponieważ reakcja z Va8, Ve9, regionem stałym TCRae, CD3 i innymi powierzchniowymi wspólnymi antygenami limfocytów T jest wykluczona. Na Figurze 2 pokazano, że przeciwciała z klonów hybrydoma TCR 64, TCR 66, TCR 69, TCR 70, TCR 73 i TCR 76 są zdolne do znakowania TCR na nieredukujących Western blot (prążek 85 kDa). Nieswoiste prążki na górze figury pochodzą z immunoprecypitacji przeciwciałami SAM i OKT3. Nie uzyskano znakowania tymi przeciwciałami w badaniach Western blot w warunkach redukujących (wyniki nie pokazane), co wskazuje, że te MAb rozpoznają epitop konformacyjny wytworzony przez kompleks TCRae.
Proliferacja limfocytów T wywołana MAb
W celu badania, czy MAb są zdolne do wywołania proliferacji limfocytów T H.243, MAb unieruchomiono na płaskodennych płytkach do mikromiareczkowania i inkubowano z limfocytami T. Jakkolwiek występowały duże różnice pomiędzy MAb, na Figurze 2 pokazano, że wszystkie one mogą wywoływać proliferację limfocytów H.243. Proliferację podobną do uzyskanej z anty-CD3 (OKT3) uzyskano z przeciwciałami TCR 64, TCR 66, TCR 70, TCR 76 i TCR 79. Nie uzyskano proliferacji z przeciwciałami TCR 44, które są antyklonotypowe wobec innego TCR.
Zahamowanie proliferacji limfocytów T wywołanej antygenem przez MAb
Dalej, badano czy panel MAb może zahamować proliferację limfocytów H.243 wywołaną antygenem. W tym doświadczeniu MAb inkubowano uprzednio z limfocytami T i APC, i trzy godziny później pulsowano różnymi stężeniami peptydu. Na Figurze 4 pokazano że TCR 64, TCR 70, TCR 76 i TCR 83 silnie hamują proliferację wywołaną antygenem. Ponad 98% zahamowanie obserwowano w przypadku TCR 83. Krzywe odpowiedzi na dawkę wskazują, że maksymalne zahamowanie może być uzyskane przy użyciu już 100 mg/ml TCR 64, TCR 70 i TCR 83. TCR 83 było około 10-krotnie słabsze. Wzorce zahamowania nie były zależne od stężeń suboptymalnych czy nasycających dodanego peptydu (wyniki nie pokazane). Antykionotypowe MAb skierowane przeciwko innym TCR (TCR 44) nie wykazywały zahamowania.
PL 193 821 B1
Antyklonotypowe MAb wywołuje brak reaktywności ludzkich limfocytów T klon H.243 na pobudzenie antygenem i APC
Wiadomo, że zajęcie receptora limfocyta T pod nieobecność kostymulacji indukuje anergię. Uprzednio stwierdzono, że unieruchomione antyklonotypowe MAb przeciwko H.243 pobudzają klonalnie TCR tego klonu. Stąd, interesujące było czy te same przeciwciała mogą wywołać anergię. W tym celu 10 różnych MAB antyklonotypowych unieruchomiono na płytce 24-studzienkowej i inkubowano przez noc z limfocytami T H.243 dając bodziec anergiczny. Następnie, limfocyty T pobierano z płytek i badano czy potrafią odpowiedzieć na rosnące stężenia HC gp-39262-277 (Identyfikator Sekw. Nr 3) po prezentacji przez naświetlone APC dobrane pod względem HLA-DRB1*0401. Na Figurze 5 pokazano, że ta odpowiedź była całkowicie zniesiona w 8 spośród 10 MAb, podczas gdy komórki H.243 inkubowane z przeciwciałem kontrolnym 1 wciąż reagowały na peptyd prezentowany przez APC. Odpowiedź limfocytów T inkubowanych z TCR 69 i TCR 83 była znacznie zredukowana, ale nie całkowicie zniesiona w wyższych stężeniach peptydu.
Komórki anergiczne hamują odpowiedź komórek nieanergicznych
Badano również, czy anergiczne limfocyty H.243 są zdolne do hamowania odpowiedzi nieanergicznych H.243. Anergię wywołano przy użyciu TCR 76, zaś komórki nieanergiczne uzyskano przez inkubowanie z kontrolnym MAb 1. Następnie, wykonano test proliferacji przy użyciu peptydu HC gp39261-275 (Identyfikator Sekw. Nr 2) przy użyciu różnych populacji limfocytów T w stosunku do 2 x 104 anergicznych limfocytów T na studzienkę, 2 x 104 limfocytów nieanergicznych na studzienkę albo mieszanin zmniejszających się stężeń anergicznych limfocytów T (4 x 104, 2 x 104, 1 x 104 i 0,5 x 104) i 2 x 104 nieanergicznych limfocytów T na studzienkę. Odpowiedź nieanergicznych limfocytów T była istotnie zmniejszona w sposób zależny od dawki dodanych anergicznych limfocytów T (Fig. 6). Uzyskano około 90% zmniejszenie proliferacji w stężeniu antygenu równym 1 μg/ml i stosunku komórek anergicznych do nieanergicznych równym 2:1. W wyższych stężeniach antygenu obserwowano mniejsze zmniejszenie (72% przy 5 μg/ml i 39% przy 25 μg/ml).
Tak więc Przykład ten pokazuje, że możliwe jest wywołanie antyklonotypowych przeciwciał monoklonalnych przeciwko receptorom ludzkich limfocytów T. W wyniku tego doświadczenia uzyskano 10 hybrydom, spośród których cztery zdeponowano w ECACC (Salisbury, UK), jak to pokazano na Tabeli III. Strategia nie wymaga wielkiej liczby limfocytów T albo znacznych ilości oczyszczonego TCR. Sposób według niniejszego wynalazku jest atrakcyjną alternatywą wobec pracochłonnych technik rekombinacyjnych, w których wytwarza się rozpuszczalne TCR na komórkach mysich wyrażających TCR do zastosowania w technikach immunizacyjnych. Tak więc, unika się ewentualnych problemów ze stabilnością konformacyjną. Ponieważ przeciwciała monoklonalne wykazują różne odpowiedzi w testach proliferacji limfocytów T wywołanej przeciwciałami i wywołanego przeciwciałami zahamowania proliferacji limfocytów T wywołanej antygenem (obserwowane zahamowanie w ponad 98%), wskazuje to, że różne epitopy są rozpoznawane na tej samej strukturze klonotypowej.
Po sieciowaniu, wszystkie monoklonalne przeciwciała antyklonotypowe są zdolne do wywołania proliferacji limfocytów T H. 243.
Wykazano, że nawet małe ilości unieruchomionego antyklonotypowego MAb mogą wywołać anergię w klonie autoreaktywnym. Po bodźcu anergicznym, limfocyty T nie proliferują po restymulacji w wyniku braku transkrypcji genu IL-2. Oprócz tego, stwierdzono zmniejszone wydzielanie IFNy.
Analiza FACS komórek anergicznych wykazała, że anergia nie była spowodowana ujemną modulacją TCR albo nieobecnością wolnych TCR. W doświadczeniach z równoczesną hodowlą, anergiczne limfocyty T hamowały odpowiedź reaktywnych limfocytów T tego samego klonu. Hamowanie przez „efekt widza” wynosiło 90% proliferacji. Dane wskazują na potencjał anergizujący przeciwciał swoistych klonotypowo in vitro. Takie MAb mogą być zastosowane do wywołania i utrzymywania swoistej antygenowo tolerancji limfocytów T w reumatoidalnym zapaleniu stawów.
Myszy immunizowano przez wstrzyknięcie raczej czystych kompleksów TCR/CD3 sprzęgniętych z perełkami paramagnetycznymi (Tabela 1, grupa IV immunizacji). Surowice myszy badanych były bardziej pozytywne wobec swoistych limfocytów T, które wykorzystano do immunizacji, niż wobec nieistotnego klonu limfocytów T. Jednakże, nie było możliwe uzyskanie hybrydoma wytwarzających monoklonalne przeciwciała antyklonotypowe. Nawet gdy w surowicach myszy immunizowanych małą ilością całych limfocytów T nie wykrywano swoistości wobec interesujących limfocytów T w stosunku do nieistotnych limfocytów T, sposobem według niniejszego wynalazku uzyskiwano hybrydoma zdolne do wytwarzania antyklonotypowych przeciwciał monoklonalnych.
PL 193 821 B1
Oczywiste jest, że z przeciwciał monoklonalnych według niniejszego wynalazku możliwe jest uzyskanie fragmentów wiążących antygen, przy użyciu przykładowo papainy. Przeciwciała monoklonalne albo ich fragmenty wiążące antygen mogą być znakowane w celu ułatwienia ich wykrycia, a zakres wynalazku obejmuje wszystkie takie postaci.
Oczywiste jest także, że nieistotne komórki stosowane do usuwania nieswoistych limfocytów B są korzystnie możliwie najbardziej podobne do komórek niosących antygen powierzchniowy.
T a b e l a 1:
Schematy immunizacji i charakterystyka surowicy.
Grupy immunizacji antygen adiu- want droga podania aglutynacja/FACS limfocyty T 1* limfocyty T 2* (immunizacja) (nieistotna) indukcja prolife- racji zahamowa- nie Ag- proliferacja napędzana# Western blot
I limfocyty T nie ip (5x) +++ +++ - ++ -
II limfocyty T; TCR/CD3 tak ip; im; im; ip +++ +++ - ++ -
III TCR/CD3 tak ip; im; im; im; ip; - - +/- - -
IV TCR/CD3 tak sc; sc; sc; ip - - + - -
V TCR/CD3 nie is (5 x) + +/- + - -
zwykła mysia surowica - - - - -
Grupy dwóch myszy BALB/C immunizowano zarówno całymi limfocytami T lub kompleksami TCR/CD3 związanymi na paramagnetycznych koralikach. Immunizację przeprowadzono w nieobecności lub obecności adiuwantu jak to wskazano. Nazwano różne następujące drogi podawania:
ip = dootrzewnowa; im = domięśniowa; sc = podskórna; is = dośledzionowa.
Mysią surowicę scharakteryzowano przez wiązanie limfocytów T w teście aglutynacji, FACS-znakowanie i analiza metodą Western blot. Charakterystykę funkcjonalną przeprowadzono testem proliferacji limfocytów T, w którym pośredniczył antygen i w teście zahamowania napędzanej antygenem proliferacji komórek T, w którym pośredniczył antygen.
*limfocyty T 1 = klon limfocytów T wykorzystywanych w immunizacji; limfocyty T 2 = nieistotny klon limfocytów T # + oznacza zahamowanie proliferacji limfocytów T
T a b e l a 2.
Wzrost swoistych limfocytów B przeciwko limfocytom T w hodowlach limfocytów B El-4.
Liczba zakażonych komórek Gęstość płytkowa Liczba studzienek ze wzrostem limfocytów B Aglutynacja z H.243 Aglutynacja z H.258
384 x 384 68 40
192 1/6 x 171 13 7
192 1/36 x 81 3 1
x 106 limfocytów włączono do procedury selecki immunokoralików w celu wybrania swoistych antyklonotypowych limfocytów. Wybrane limfocyty B wysiano w różnych gęstościach płytkowych na układy hodowlane limfocytów B EL-4 ósmego dnia, supernatant badano w kierunku przeciwciał aglutynujących z limfocytami T skutecznymi (H.243) i nieskutecznymi (H.258).
x: nieokreślona liczba wybranych komórek
PL 193 821 B1
T a b e l a 3:
Aglutynacja różnych rodzajów limfocytów T z anty-TCR mAb.
mAb izotyp aglutynacja limfocytów T z
H.2431) 6 νβ9 dodatnie limfocyty T 2 Va8 dodatnie limfocyty T 8 innych limfocytów T
TCR 64 IgG2a + - - -
TCR 66 IgG1 + - - -
TCR 67 nd + - - -
TCR 69 IgG1 + - - -
TCR 70 IgG2a + - - -
TCR 72 IgM + - - -
TCR 73 IgG1 + - - -
TCR 74 nd + + - -
TCR 76 IgG2a + - - -
TCR 78 IgM + - - -
TCR 79 IgG1 + - - -
TCR 83 IgM + - - -
anty-Vp9 IgG2a + + - -
anty-αβ IgG2b + + + +
kontrolne mAb IgG1 - - - -
1) H.243: Va8 i νβ9 dodatnie
LITERATURA
1. Moretta, A., et al. (1985) Selection and characterization of monoclonal antibodies to the idiotypelike structure of an interleukin-2-producing human leukaemia T-cell line. Int. J. Cancer 36: p. 253-259.
2. Oetgen, H.C. et al. (1986) A T3-like protein complex associated with the antigen receptor on murine T cells. Nature 320: p. 272-275.
3. Steenbakkers, P.G.A., et al. (1994) Efficient generation of monoclonal antibodies from preselected antigen-specific B cells. Molecular Biology Reports 19, p. 125-134.
4. Steenbakkers, P.G.A. et al (1992) A new approach to the generation of human and murine antibody producing hybridomas. J. Immunol. Methods 152, p. 69-77.
5. Laemmli, U.K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of a bacteriophage T4. Nature 227: p. 680-685.
6. Towbin, H. et al. (1979) Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and some applications. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: p. 4350-4354.
Skróty:
PBS - sól fizjologiczna buforowana fosforanem
BCIP - sól 5-bromo-4-chloro-3-indolofosforano p-toluidyny
NBT - błękit chlorku p-nitrotetrazolu
BSA - albumina surowicy bydlęcej
FCS - płodowa surowica cielęca
SAM - owcza anty-mysia
TSN - supernatant limfocytów T
MAb - przeciwciało(a) monoklonalne
Producenci
Biorad, Richmond, CA, USA Gibco, Paisley, Szkocja Hyclone, Logan, USA Packard, Meriden, CT, USA
PL 193 821 B1
LISTA SEKWENCJI:
(1) INFORMACJE OGÓLNE:
(i) ZGŁASZAJĄCY:
(A) NAZWA: Akzo Nobel N.V.
(B) ULICA: Velperweg 76 (C) MIASTO: Arnhem (E) KRAJ: Holandia (F) KOD: 6824 BM (G) TELEFON: 0412 666379 (H) TELEFAX: 0412 650592 (ii) TYTUŁ WYNALAZKU: Sposób wytwarzania przeciwciała monoklonalnego, przeciwciało monoklonalne, kompozycja farmaceutyczna i odczynnik diagnostyczny (iii) LICZBA SEKWENCJI: 3 (iv) POSTAĆ MOŻLIWA DO ODCZYTANIA PRZEZ KOMPUTER:
(A) TYP NOŚNIKA: dyskietka (B) KOMPUTER: IBM PC compatible (C) SYSTEM OPERACYJNY: PC-DOS/MS-DOS (D) OPROGRAMOWANIE: PatentIn Release #1.0, Version #1.30 (EPO) (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR: 1:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 13 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (v) RODZAJ FRAGMENTU: wewnętrzny (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 1:
Arg Ser Phe Thr Leu Ala Ser Ser Glu Thr Gly Val Gly (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR: 2:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 15 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (v) RODZAJ FRAGMENTU: wewnętrzny (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 2:
Phe Gly Arg Ser Phe Thr Leu Ala Ser Ser Glu Thr Gly Val Gly (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR: 3:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 16 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (v) RODZAJ FRAGMENTU: wewnętrzny (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 3:
Gly Arg Ser Phe Thr Leu Ala Ser Ser Glu Thr Gly Val Gly Ala Pro

Claims (13)

1) wstrzykiwania ssakowi niebędącemu człowiekiem materiału obejmującego antygen powierzchniowy komórki, który jest wybrany z grupy składającej się z i) całych komórek i ii) frakcji błon uzyskanej przez przetwarzanie całych komórek;
1. Sposób wytwarzania przeciwciała monoklonalnego przeciw antygenowi powierzchniowemu komórki mającemu część stałą i część zmienną, przy czym przynajmniej fragment części zmiennej stanowi fragment zapewniający swoistość tego antygenu powierzchniowego, znamienny tym, że obejmuje etapy:
PL 193 821 B1
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że ssak, któremu wstrzykuje się antygen, jest innego gatunku niż gatunek ssaka z którego pochodzi antygen.
2) izolowania frakcji komórkowej zawierającej limfocyty B ze śledziony ssaka;
3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że jako materiał zawierający antygen powierzchniowy stosuje się materiał zawierający cząsteczkę receptora.
3) wzbogacania frakcji komórkowej uzyskanej w etapie 2) w limfocyty B swoiste wobec antygenu powierzchniowego komórki przez doprowadzanie do kontaktu pomiędzy frakcją komórkową i związanym z nośnikiem materiałem komórkowym pokrewnym z materiałem całych komórek, przy czym materiał komórkowy związany z nośnikiem jest pozbawiony antygenu powierzchniowego komórki, i oddzielania limfocytów B związanych z materiałem komórek pokrewnych związanym z nośnikiem od wzbogaconej niezwiązanej frakcji komórkowej zawierającej limfocyty B, która ma być zastosowana w następnym etapie;
4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że do wytworzenia materiału zawierającego cząsteczkę receptora stosuje się klon limfocytów T.
4) doprowadzenia do kontaktu frakcji komórkowej ze związanym z nośnikiem materiałem zawierającym powierzchniowy antygen komórkowy wybranym z grupy a) całych komórek, b) frakcji błonowej uzyskanej z tych całych komórek c) zasadniczo oczyszczonego antygenu powierzchniowego komórki, a następnie oddzielenie limfocytów B niezwiązanych z materiałem związanym z nośnikiem od limfocytów B związanych z tym materiałem związanym z nośnikiem;
5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że frakcję błon w etapie 1) uzyskuje się przez mechaniczną obróbkę całych komórek.
5) poddania limfocytów B związanych z materiałem związanym z nośnikiem otrzymanym we wcześniejszym etapie rozcieńczeniem granicznym, a następnie namnożeniu klonalnemu;
6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że materiał zawierający antygen powierzchniowy komórki wstrzykuje się ssakowi bez adiuwantu.
6) selekcjonowania klonu limfocytów B i unieśmiertelniania wyselekcjonowanego klonu limfocytów B z zastosowaniem techniki fuzji na małą skalę; i
7. Sposób zastrz. 1, znamienny tym, że jako nośniki stosuje się paramagnetyczne perełki.
7) selekcjonowania i klonowania hybrydoma zdolnej do wytwarzania przeciwciał, które swoiście wiążą antygen powierzchniowy komórki, a następnie izolowanie frakcji zawierającej przeciwciała monoklonalne z supernatantu tych hybrydoma.
8. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że selekcję w przynajmniej jednym z etapów 6) i 7) przeprowadza się stosując test aglutynacji, w którym supernatant klonu limfocytów B kontaktuje się z nośnikiem pokrytym przeciwciałami zdolnymi do wiązania przeciwciał gatunku takiego jak ssak poddany iniekcji wykorzystany w etapie 1) i całymi komórkami niosącymi antygen powierzchniowy, i wykrywa się aglutynację.
9. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że jako kontrolę stosuje się całe komórki jak w teście aglutynacji ale pozbawione antygenu powierzchniowego.
10. Sposób według zastrz. 1 lub 8, znamienny tym, że wyselekcjonowany klon limfocytów B w etapie 6) miesza się z komórkami szpiczaka i poddaje minielektrofuzji.
11. Przeciwciało monoklonalne, znamienne tym, że jest wytwarzane przez hybrydoma wybraną z grupy składającej się z następujących zdeponowanych hybrydoma: ECACC nr dostępu 96103118; ECACC nr dostępu 96103119; ECACC nr dostępu 96103120 i TCR 83 ECACC nr dostępu 96103121.
12. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca substancję czynną i odpowiednią zaróbkę, znamienna tym, że jako substancję czynną zawiera przeciwciało monoklonalne określone w zastrz. 11 i jest odpowiednia do leczenia reumatoidalnego zapalenia stawów.
13. Odczynnik diagnostyczny, znamienny tym, że obejmuje przeciwciało monoklonalne określone w zastrz. 11.
PL323572A 1996-12-06 1997-12-05 Sposób wytwarzania przeciwciała monoklonalnego, przeciwciało monoklonalne, kompozycja farmaceutyczna i odczynnik diagnostyczny PL193821B1 (pl)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP96203465 1996-12-06
EP97201972 1997-06-27

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL323572A1 PL323572A1 (en) 1998-06-08
PL193821B1 true PL193821B1 (pl) 2007-03-30

Family

ID=26143410

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL323572A PL193821B1 (pl) 1996-12-06 1997-12-05 Sposób wytwarzania przeciwciała monoklonalnego, przeciwciało monoklonalne, kompozycja farmaceutyczna i odczynnik diagnostyczny

Country Status (17)

Country Link
US (3) US6020170A (pl)
EP (1) EP0856520B1 (pl)
JP (1) JPH10179160A (pl)
KR (1) KR100543053B1 (pl)
AT (1) ATE322507T1 (pl)
AU (1) AU733165B2 (pl)
BR (1) BR9706236A (pl)
CA (1) CA2221682C (pl)
DE (1) DE69735621T2 (pl)
DK (1) DK0856520T3 (pl)
ES (1) ES2262170T3 (pl)
HU (1) HUP9702359A3 (pl)
IL (1) IL122233A (pl)
NO (1) NO327047B1 (pl)
NZ (1) NZ329314A (pl)
PL (1) PL193821B1 (pl)
PT (1) PT856520E (pl)

Families Citing this family (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1258539C (zh) * 1998-12-22 2006-06-07 雷文生物技术公司 用于产生特定类型细胞的代表性单克隆抗体的组合物及方法
SE9902817D0 (sv) 1999-07-30 1999-07-30 A & Science Invest Ab A method for selective electrofusion of at least two fusion partners having cell-like membranes
MXPA02003520A (es) * 1999-10-18 2002-08-20 Akzo Nobel Nv Imitaciones de peptido y peptidos modificados para utilizarse en inmunoterapia.
US6541225B1 (en) * 2000-01-26 2003-04-01 Raven Biotechnologies, Inc. Methods and compositions for generating human monoclonal antibodies
EP1319184B1 (en) 2000-08-14 2007-07-25 N.V. Organon Use of antibodies against specific mhc-peptide complexes
KR20040053100A (ko) 2001-07-24 2004-06-23 예일 유니버시티 키티나아제, 키티나아제 유사 분자 및 염증성 질환과관련된 방법, 조성물 및 키트
US7018819B2 (en) * 2001-11-30 2006-03-28 Cellectricon Ab Method and apparatus for manipulation of cells and cell-like structures focused electric fields in microfludic systems and use thereof
KR20060002879A (ko) * 2003-03-28 2006-01-09 자이단호진 토야마켄 신세키 산교기코 1개의 항원 특이적 ｂ림프구를 이용한 항원 특이적 항체를생산하는 하이브리도마의 제조방법 및 단일 클론 항체의제조방법
US20060228350A1 (en) * 2003-08-18 2006-10-12 Medimmune, Inc. Framework-shuffling of antibodies
EP1660186B1 (en) 2003-08-18 2013-12-25 MedImmune, LLC Humanization of antibodies
EP1729805A4 (en) * 2004-02-25 2008-11-26 Medimmune Inc METHODS AND COMPOSITIONS RELATED TO CHITINASES AND CHITINASE-MOLECULARS AND MODULATION OF OSTEOCLASTS
CA2595682A1 (en) * 2005-01-31 2006-08-03 Ablynx N.V. Method for generating variable domain sequences of heavy chain antibodies
AU2006227377B2 (en) 2005-03-18 2013-01-31 Medimmune, Llc Framework-shuffling of antibodies
EP1893647A2 (en) 2005-06-23 2008-03-05 MedImmune, Inc. Antibody formulations having optimized aggregation and fragmentation profiles
WO2007027748A2 (en) * 2005-08-31 2007-03-08 Medimmune, Inc. C/clp antagonists and methods of use thereof
PT2926780T (pt) * 2008-01-09 2018-11-07 Alcon Lensx Inc Fragmentação de tecido por laser fotodisruptivo
US20160075766A1 (en) 2013-05-21 2016-03-17 Roche Diagnostics Operations, Inc. Method for producing antibodies using ovine b-cells and uses thereof
EP3717632B1 (en) 2017-11-30 2022-10-26 F. Hoffmann-La Roche AG B-cell cultivation method

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4550086A (en) * 1983-02-16 1985-10-29 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Monoclonal antibodies that recognize human T cells
EP0255547A1 (en) * 1986-07-29 1988-02-10 Kishimoto, Tadamitsu, Prof. Monoclonal antibodies specific to surface receptor for IgE and hybrid cell lines producing these antibodies and use thereof
US5766947A (en) * 1988-12-14 1998-06-16 Astra Ab Monoclonal antibodies reactive with an epitope of a Vβ3.1 variable region of a T cell receptor
US5223426A (en) * 1988-12-15 1993-06-29 T Cell Sciences, Inc. Monoclonal antibodies reactive with defined regions of the t-cell antigen receptor
US5162223A (en) * 1989-02-17 1992-11-10 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Resources Hybridomas and resulting monoclonal antibodies directed against antigens of Bordetella pertussis
IE912528A1 (en) * 1990-07-19 1992-01-29 Scripps Clinic Res Inhabition of mac-1 receptor binding fibrinogen using d30¹homologs
ES2103770T3 (es) * 1990-11-26 1997-10-01 Akzo Nobel Nv Procedimiento de produccion de anticuerpos monoclonales.
NZ331688A (en) * 1996-03-28 2000-02-28 Univ Johns Hopkins Soluble divalent and multivalent heterodimeric analogs of proteins

Also Published As

Publication number Publication date
NO975714D0 (no) 1997-12-05
HU9702359D0 (en) 1998-03-02
CA2221682A1 (en) 1998-06-06
CA2221682C (en) 2011-10-18
AU4690897A (en) 1998-06-11
JPH10179160A (ja) 1998-07-07
US6020170A (en) 2000-02-01
HUP9702359A3 (en) 2001-11-28
DE69735621D1 (de) 2006-05-18
DK0856520T3 (da) 2006-07-31
PL323572A1 (en) 1998-06-08
ATE322507T1 (de) 2006-04-15
KR19980063909A (ko) 1998-10-07
PT856520E (pt) 2006-08-31
EP0856520B1 (en) 2006-04-05
DE69735621T2 (de) 2006-08-24
NZ329314A (en) 1999-02-25
NO327047B1 (no) 2009-04-14
ES2262170T3 (es) 2006-11-16
BR9706236A (pt) 1999-05-04
HUP9702359A2 (hu) 1998-09-28
NO975714L (no) 1998-06-08
IL122233A (en) 2001-04-30
KR100543053B1 (ko) 2006-06-13
US6392020B1 (en) 2002-05-21
EP0856520A1 (en) 1998-08-05
US20020143150A1 (en) 2002-10-03
AU733165B2 (en) 2001-05-10
MX9709446A (es) 1998-07-31
IL122233A0 (en) 1998-04-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
PL193821B1 (pl) Sposób wytwarzania przeciwciała monoklonalnego, przeciwciało monoklonalne, kompozycja farmaceutyczna i odczynnik diagnostyczny
Abney et al. Sequential expression of immunoglobulin on developing mouse B lymphocytes: a systematic survey that suggests a model for the generation of immunoglobulin isotype diversity
Staerz et al. Characterization of a murine monoclonal antibody specific for an allotypic determinant on T cell antigen receptor.
US5658762A (en) DNA molecules, expression vectors and host cells expressing antigenized antibodies
Hohlfeld et al. Myasthenia gravis: stimulation of antireceptor autoantibodies by autoreactive T cell lines
EP1648507A1 (en) Methods and compositions for increasing the efficiency of therapeutic antibodies using nk cell potentiating compounds
GB2398783A (en) A method for producing immortalised human B memory lymphocytes
AU2007298571B2 (en) Modulating regulatory T cell activity via Interleukin 35
Tite et al. The role of B cell surface Ia antigen recognition by T cells in B cell triggering. Analysis of the interaction of cloned helper T cells with normal B cells in differing states of activation and with B cells expressing the xid defect
Niedbala et al. A comparison of three methods for production of human hybridomas secreting autoantibodies
RU2196178C2 (ru) Способ получения моноклонального антитела против антигена поверхности т-клеток, моноклональное антитело, фармацевтическая композиция и диагностический реагент
Milanese et al. Clonal analysis of B cell growth and differentiation activities induced from T lymphocytes upon triggering of T3-Ti and T11 pathways.
US6921846B1 (en) Antibody production methods relating to disruption of peripheral tolerance in B lympho-cytes
JP4563573B2 (ja) 抗原およびこの抗原を識別するモノクローナル抗体
Wasserman et al. In vitro stimulation prior to fusion generates antigen-binding human-human hybridomas
US20100316630A1 (en) Anti-idiotype antibodies of the human monoclonal antibody sc-1, and their production and use
James Human monoclonal antibody technology
Hausman et al. Immunological studies of aging. XI. Age-related changes in idiotype repertoire of suppressor T cells stimulated during tolerance induction.
Conley et al. IgG subclass potential of surface IgM-negative and surface IgM-positive human peripheral blood B cells
Yendle et al. Production of a cytotoxic human monoclonal antibody with specificity for HLA-DR4 and-DRw10 by cells derived from a highly sensitized kidney recipient
MXPA97009446A (en) Method for preparing a monoclonal antibody, monoclonal antibody, a pharmaceutical composition and a diagnost reagent
Kwong Characterization of an antigen-specific T helper cell clone and its products
KR100274972B1 (ko) 비세포분화유도인자의수용체에대한단일클론항체를분비하는융합세포주및그제조방법
Tokonzaba Feasibility of Using the SHM-D33 Heteromyeloma Cell Line for the Production of Human Monoclonal Antibodies Against Gp195
KINCADE et al. Workshop 15 A and B B-cell ontogeny and activation

Legal Events

Date Code Title Description
RECP Rectifications of patent specification
LAPS Decisions on the lapse of the protection rights

Effective date: 20091205