KR100543053B1 - 모노클로널항체,이의 제조방법 및 이를 함유하는 약학조성물 및 진단시약 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 세포 및 비루스의 표면 항원에 대한 모노클로널 항체 생산의 효과적인 방법에 관한 것이다. 이 방법에는 비교적 소량으로 존재하는 항원이나, 단지 극소량만이 이용가능한 항원 또는 생체내에서 그 구조(conformation)를 쉽게 상실하는 항원을 포함한다. 따라서, 본 발명에 기재된 방법은 표면 항원-함유 물질을 주입한 포유류로부터 유래된 B-세포를 상대적인 수의 특이적 B-세포에 대하여 농축시키는 단계 및 소량 융합 기법을 포함하는 단계를 함유하는 일련의 단계를 포함한다.
Description
본 발명은 표면 항원, 구체적으로 포유류에 주입된 총 항원중 단지 소량만을 차지하는 표면 항원 및 생체내 구조(conformation)를 쉽게 상실하는 표면 항원에 대한 모노클로널 항체를 제조하는 방법에 관한 것이다. 항원의 총량에 비해 소량으로 함유된 항원이 나타내는 문제점은 예컨대 포유류에 주입하는데 사용된 항원 물질이 다른 포유류 종으로부터 유래되는 경우에 나타난다.
전술한 항원과 연관된 문제점은 예컨대 T-세포 수용체(TCR)의 특이성 결정부에 대한 모노클로널 항체를 제조할 필요가 있을 때 표면화된다. 이러한 (모노클로널) 항체는 하나의 특정 T-세포 클론의 T-세포 수용체가 가진 항원-특이성 부(또는 클론형 구조)를 인식하는 항-클론형 항체라고 알려져 있다. 뮤린 T-세포 수용체(TCR)에 대한 뮤린 모노클로널 항-클론형 항체는 때로 보고된 바 있지만, 인체 T-세포 수용체에 대한 공지의 뮤린 모노클로널 항-클론형 항체는 훨씬 적게 보고되었다. T-세포는 배양하기가 힘들어 충분한 양의 항원, 즉 T-세포 수용체 단백질을 얻어서 정제하는 것은 어렵다. 따라서, 즉 면역반응을 얻기가 어렵고 또한 선택도 어려워진다. 모노클로널 항-클론형 항체가 인간 TCR에 대하여 유효한 몇몇 경우중에서는, 항원이 주르카트 백혈병 세포상에 존재하였기 때문에 상기와 같은 문제점이 발생하지 않았다(참조문헌 1). 백혈병 세포는 무한량으로 배양할 수 있기 때문에 항원 부족의 문제는 나타나지 않았다. 따라서, 바람직하지 않은 다수의 하이브리도마 클론을 선별해야할 필요없이 희귀하고/거나 매우 불안정한 항원에 대한 모노클로널 항체를 제조할 수 있는 어떤 유용한 방법도 제시된 바 없다.
본 발명의 목적은 전술한 바와 같이 바람직하지 않은 상황하에서 세포 표면 항원에 대한 모노클로널 항체를 제조하는 방법을 제공하는 것이며, 이 방법은 선별해야 할 하이브리도마 클론의 수를 현저하게 줄여, 당해 기술 수준에 따른 방법이 성공을 거두지 못한 경우에도 보다 효과적이고 성공적인 본 발명에 따른 방법을 제공한다.
이러한 목적을 달성하기 위하여 본 발명에 따른 방법은
1) i) 전세포(whole cells) 및 ii) 전세포를 처리하여 얻은 막 분획으로 구성된 군중에서 선택되는 세포 표면 항원-함유 물질을 포유류에 주입하는 단계;
2) 상기 포유류의 비장으로부터 B-세포 함유 세포 분획을 분리하는 단계;
3) 단계 2)에서 얻은 세포 분획을, 상기 세포 표면 항원이 없는, 상기 전세포와 관련있는 세포의 캐리어-결합 물질과 접촉시켜 상기 세포 표면 항원에 특이적인 B-세포를 농축시키고, 다음 단계에 사용될 농축 비결합 B-세포 함유 세포 분획으로부터 상기 관련 세포의 캐리어-결합 물질에 결합된 B-세포를 분리하는 단계;
4) 상기 단계에서 얻은 농축된 B-세포 함유 세포 분획을 한계 희석시킨 다음 클론 증식시키는 단계;
5) B-세포 클론을 선택하고 이와 같이 선택된 B-세포 클론을 소규모 융합 기법을 사용하여 불멸화(immortalising)시키는 단계; 및
6) 상기 세포 표면 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 생산할 수 있는 하이브리도마를 선택하고 클로닝한 다음, 이 하이브리도마의 상청액으로부터 모노클로널 항체-함유 분획을 분리하는 단계를 포함한다.
본원 명세서와 특허청구의 범위를 읽기 쉽고 명료하게 하기 위해, 사용된 세포라는 용어는 포유류 세포 뿐만 아니라 비루스, 구체적으로 막-함유 비루스를 나타낸다는 것을 밝히는 바이다.
세포의 캐리어-결합 물질이라는 용어는 본래의 세포 또는 전세포(및 비루스), 이러한 본래의 전세포(및 비루스)의 막 분획 또는 실질적으로 정제된 표면 항원 또는 이것의 복합물을 포함한다.
별다른 기재가 없는 한, 전세포라는 용어는 목적 표면 항원을 가진 세포를 의미한다. 관련 세포라는 용어는 바람직하게는 목적 표면-항원이 없다는 점만이 다르거나, 또는 보다 구체적으로는 적어도 모노클로널 항체를 얻는데 필요한 면역학적 결정인자가 없다는 점만이 다른 세포를 의미한다.
놀라운 것은, 분리된 B-세포 함유 세포 분획과, 세포 표면 항원-함유 물질이 유래된 동일 종에서 얻은 것이나 세포 표면 항원이 없는 세포 물질을 접촉시켜 세포 표면 항원을 사용함이 없이 세포 표면 항원에 특이적인 B-세포로 세포 분획을 농축시키는 것이 가능해졌다는 것이다. 다른 말로 하면, B-세포를 이와 무관한 관련 세포 또는 세포 물질과 접촉시키고 결합 B-세포를 제거하면 농축화를 이룰 수 있다.
따라서, 세포 표면 항원이 구조적 불안정성을 나타낼 지라도 소수의 세포 표면 항원에 대한 모노클로널 항체를 제조하는 것이 가능하다.
유럽 특허 EP 0 488 470 호 및 이 유럽 특허 문헌에 근거한 참조 문헌 3은 I) 포유류에 항원을 주입하는 단계, II) B-세포 함유 분획을 분리하는 단계, III) 상기 항원에 특이적인 B-세포를 선택하는 단계, IV) 농축된 분획을 클론 증식시키는 단계, V) B-세포 클론을 선택하고 소규모 융합 기법을 사용하여 불멸화시키는 단계 및 VI) 하이브리도마를 선택하고 클론화한 다음 모노클로널 항체를 함유하는 분획을 분리하는 단계로 구성되는 방법을 기재하고 있다. 단계 III에서 B-세포는 이것을 항원-피복된 플라스틱 표면에 결합시키거나 또는 B-세포를 항원 피복된 상자성 비드로 로제트화(roset)하여 선택한다. 비특이적 B-세포는 세척하여 제거한다. 따라서, 다른 차이들은 차치하고라도, 이 방법은 항원의 충분한 이용가능성 및 용도에 좌우되는 반면(선택시, 평판을 항원으로 피복하는 데에는 2㎍/ml의 항원이 사용된다), 본 발명은 사용가능한 항원이 극미량인 경우와 매우 불순한 경우의 문제점을 해결하기 위한 것이다.
본 발명의 바람직한 일 양태는 표면 항원을 주입한 포유류가 표면 항원을 얻은 포유류 종과 다른 종이라는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 방법은 면역반응을 유도할 수 있는 많은 항원이 존재하는 경우 모노클로널 항체를 제조하는데 매우 적합하다.
이러한 상황은 특히 표면 항원이 불변부와 가변부를 가지고 있고, 이 가변부의 일부분 이상이 표면 항원의 특이성 결정부를 나타낼 때이다.
바람직한 일 양태에 따라, 수용체 분자-함유 물질은 세포 표면 항원-함유 물질로서 사용한다.
본 발명에 따른 방법은 특히 수용체 분자의 특이성 결정부에 대한 모노클로널 항체를 제조하는데 적합하다. 수용체 분자의 특이성 결정부는 수용체 분자의 단지 소역부이고, 실질적으로 세포 표면상에 존재하는 모든 분자- 즉 항원의 부성분이다.
본 발명에 따른 바람직한 표적은 T-세포 클론이고, 이 T-세포 클론은 수용체 분자-함유 물질을 제조하는데 사용된다.
T-세포는 전세포로서 사용하거나, 또는 그 막 분획 제조에 사용될 수 있다. 따라서, 전자의 경우에, "제조한다"라는 용어는 T-세포를 단순 분리하는 것 또는 다른 매질중에 재현탁하는 것을 의미할 것이다.
바람직한 양태에 따르면, 단계 1)에서 막 분획은 전세포를 기계적 처리하여 얻고, 세포 표면 항원-함유 물질은 보조제 없이 포유류에 주입한다.
상기 두가지 수단은 표면 항원이 생체내 구조를 상실하는 것을 방지한다.
또한, 농축된 B-세포 함유 세포 분획은 이 세포 분획을, j) 전세포, jj) 이 전세포로부터 얻은 막 분획 및 jjj) 실질적으로 정제된 세포 표면 항원으로 구성된 군중에서 선택된 캐리어-결합 세포 표면 항원 물질과 접촉시킨 후, 이 캐리어-결합물질에 결합되지 않은 B-세포를 상기 캐리어-결합 물질에 결합된 B-세포로부터 분리함으로써 상기 농축된 B-세포 함유 세포 분획을 더욱 농축시키고(단계 3), 상기 캐리어 결합 물질에 결합된 B-세포는 단계 4)에서 사용되는 더욱 농축된 세포 분획을 함유하는 것이 바람직하다.
이러한 추가 농축화는 특정 B-세포를 특이적으로 선별하는 양성 선별 기법이라고도 할 수 있다. 따라서, 어떤 항원이 거의 이용가능하지 않을지라도 이러한 추가 농축화는 수행할 수 있다.
바람직한 일 양태에 따르면, 캐리어로서 상자성 비드를 사용하는 것이 바람직하다.
농축화동안 상자성 비드를 사용하면 필요한 B-세포와 불필요한 B-세포를 용이하게 분리할 수 있다.
또한, 소량의 항원은 선택 과정에 있어서 문제점을 나타낸다. 바람직한 양태에 따르면, 단계 5 및 6중 적어도 한 단계중의 선택 공정은 B-세포 클론의 상청액을, 단계 1에서 사용된 주입된 포유류종의 항체에 결합할 수 있는 항체 피복된 캐리어 및 세포 표면 항원 함유 전세포와 접촉시키고, 응집반응을 검측하는 응집 분석법을 사용하여 수행한다.
상기에서, B-세포 상청액, 전세포 및 단계 1에서 사용된 포유류종의 항체에 결합할 수 있는 항체 피복된 캐리어를 단순 혼합하면 세척을 필요로 하지 않으면서 적합한 클론을 신속하고 매우 높은 감수성으로 검측할 수 있다.
전세포와 관련이 있으나 표면 항원이 없는 전세포는 대조군으로서 사용하는 것이 바람직하다.
이 방법은 허위-양성 클론을 배제시키며 불필요한 소규모 융합 단계를 제거하여 시간을 절감할 수 있다.
본 발명에 따른 방법의 바람직한 양태에 있어서, 단계 5에서 선택된 B-세포 클론은 골수종 세포와 혼합되어 미소-전기융합법으로 처리된다.
미소-전기융합법은 극소수(예, 수백개)의 세포에 효과적인 융합법이다.
또한, 본 발명은 적합한 부형제와 혼합된 본 발명에 따라 제조된 모노클로널 항체를 함유하는 약학 조성물에 관한 것이다.
또, 본 발명은 T-세포 수용체의 클론형 구조와 반응하는 모노클로널 항체에 관한 것이다.
이러한 모노클로널 항체는 진단용으로서 뿐만 아니라 약학 조성물의 제조용으로서 사용할 수 있다.
보다 구체적으로 T-세포 수용체는 자가면역 질환, 특히 류마티스성 관절염과 관련이 있는 T-세포 수용체이다.
모노클로널 항체는 HC gp-39 반응성 T-세포 클론의 T-세포 수용체, 특히 T-세포 클론 H.243(ECACC 기탁 번호 96103122)과 반응하는 것이 바람직하다.
적합한 모노클로널 항체의 구체적인 예는 TCR 69(ECACC 기탁 번호 96103118), TCR 70(ECACC 기탁 번호 96103119), TCR 72(ECACC 기탁 번호 96103120) 및 TCR 83(ECACC 기탁 번호 96103121)으로 구성된 군중에서 선택된 하이브리도마에 의해 생산된 것이다.
전술한 바와 같이, 또한 본 발명은 류마티스성 관절염을 치료하는데 적합한, 본 발명에 따른 모노클로널 항체를 적당한 부형제와 혼합한 약학 조성물에 관한 것이다.
마지막으로, 본 발명은 본 발명에 따른 방법을 사용하여 제조한 모노클로널 항체 및 본 발명에 따른 모노클로널 항체로 구성된 군중에서 선택되는 모노클로널 항체의 진단학적 용도에 관한 것이다. 또한, 본 발명의 일 양태는 상기 항체를 함유하는 진단 시약이다.
이하에는, 인간 T-세포 수용체의 클론형에 특이적인 뮤린 모노클로널 항체를 제조하는데 사용된 본 발명을 수행하는 최상의 양태를 제시한 하기 실시예를 참조로 하여 본 발명을 보다 상세하게 설명하고자 한다.
도면에 대한 범례
도 1은 H.243에 대한 MAb에 의해 면역침전된 H.243 T-세포 표면 분자를 규명하기 위한 SDS/PAGE이다. 이 SDS/PAGE는 10% 겔중에서 비환원 조건(레인 2, 3 및 4) 또는 환원 조건(레인 5, 6 및 7)하에서 수행하였다. 레인 1: 10 kD 래더 마커; 레인 2 및 5: 대조용 MAb; 레인 3 및 6: TCR 83; 레인 4 및 7: 항-CD3, OKT3.
도 2는 TCRαβ 를 인식하는 항-클론형 MAb의 웨스턴 블롯팅이다. 먼저, 비환원 조건하의 10% SDS-PAGE 겔을 사용하여 H.243의 면역침전된 TCR/CD3 복합체를 분리하고, 이어서 PVDF 막으로 이동시킨다. 이 막을 MAb와 함께 항온처리하고 마지막으로 알칼리성 포스파타제-결합된 염소 항-마우스 Ig 제 2 항체를 사용하여 검측하였다.
레인 1: 10 kD 래더 마커, 레인 2: TCR 64, 레인 3: TCR 66, 레인 4: TCR 69, 레인 5: TCR 70, 레인 6: TCR 72, 레인 7: TCR 73, 레인 8: TCR 76, 레인 9: TCR 78, 레인 10: TCR 79, 레인 11: TCR 83, 레인 12: 대조용 MAb, 레인 13: 배지 대조군.
도 3은 고정화된 항-TCR MAb에 의한 인간 T-세포 클론 H.243의 증식 자극성을 도시한 것이다. H.243(TCR 64 내지 TCR 83)에 대한 MAb에 의해 유도된 증식을 표시된 바와 같은 대조군 MAb 및 다른 TCR에 대한 항-클론형 MAb인 TCR44와 비교하였다. 각 수치는 4반복 배양물의 5분당 평균 계수치 ± 표준 편차로 나타내었다.
도 4는 항-TCR MAb와의 예비배양에 의한 인간 T-세포 클론 H.243의 항원-유도된 증식의 억제성 또는 차단성을 도시한 것이다. a)는 H.243(TCR 64 내지 TCR 83)에 대한 MAb에 의한 억제성을 표시된 바와 같은 대조용 MAb와 다른 TCR에 대한항-클론형 MAb인 TCR 44와 비교한 것이다. 각 수치는 4반복 배양물의 5분당 평균 계수치 +/- 표준편차를 나타낸다. b)는 강한 억제성 MAb의 용량 응답 곡선이다; TCR 64(빈 원), TCR 70(채워진 삼각형), TCR 78(빈 사각형), TCR 83(채워진 사각형) 및 대조용 MAb 1(채워진 원). 각 수치는 3반복 배양물의 5분당 평균 계수치를 나타낸 것이다.
도 5는 항-클론형 MAb에 의한 인간 Th1-클론 H.243에 있어서의 아네르기(anergy) 유도성을 도시한 것이다. 고정화한 항-클론형 MAb 또는 대조용 MAb 1을 H.243 T 세포와 함께 하룻밤동안 항온처리하였다. 아네르기성 자극으로부터 세포를 분리한 후, 세포에 증가량의 펩티드 및 DRB1*0401 조합 APC 농도로 완전한 자극을 가했다. 증식은 3H-티미딘 병입량으로 평가하였다. 각 수치는 3반복 배양물의 5분당 평균 계수치 ± 표준 편차를 나타낸 것이다.
도 6은 아네르기성 H.243 T 세포에 의한 비-아네르기성 H.243 T 세포의 응답 반응 억제성을 도시한 것이다. 고정화된 TCR 76 또는 대조용 MAb1을 H.243 T 세포와 하룻밤동안 항온처리하였다. 그 다음, 이 2가지 T-세포 군을 웰당 2 x 104 T 세포량으로 사용하여 증가량의 펩티드(또는 PHA) 및 APC 농도에 대해 증식 분석하였다. 또한, TCR 76과의 항온처리로부터 얻은 다양한 양의 아네르기성 세포를, MAb 1과의 항온처리로부터 얻은 비-아네르기성 세포 2 x 104과 함께 혼합하고 증식 분석하였다. 비-아네르기성 세포에 대한 아네르기성 세포 비, A/N은 1= 2 x 104 세포이다. 증식은 3H-티미딘 병입량으로 평가하였다. 각 수치는 3반복 배양물의 5분당 평균 계수치 + 표준 편차를 나타낸 것이다.
실시예
재료 및 방법
시약
배양 배지 : 중탄산 나트륨 2500 mg/l, 2-머캅토에탄올 2.3 mg/l, 피루브산 나트륨 55 mg/l, 에탄올아민 1.22 mg/l, L-글루타민 360 mg/l, 아셀렌산 나트륨 4.5 x 10-4 mg/l, 페니실린 나트륨 62.5 mg/l 및 스트렙토마이신 황산염 62.5 mg/l를 보충한 DMEM/HAM의 F12(기브코 목록 번호 32500). 융합 실험에서는, 이 배지에 하이포크산틴 13.61 mg/l 및 티미딘 3.83 mg/l을 추가 보충하였다. 이러한 배지는 DMEM/HAM F12/HT라고도 한다. 하이브리도마의 선택은 인간 방광 암종 세포주 T24(T24CM)의 IL-6 함유 상청액 1%(v/v) 및 아미노프테린 0.4 μM를 보충한 DMEM/HAM F12/HT중에서 수행하였다.
융합 배지: 이노시톨 280 mM, 아세트산 칼슘 0.1 mM, 아세트산 마그네슘 0.5 mM 및 히스티딘 1 mM; 비저항도: 1.11·104 Ω·cm. 상기 성분들을 밀리-Q 수에 용해시키고 이어서 밀리-Q 수 또는 칼슘 아세테이트 1 mM 및 아세트산 마그네슘 5 mM을 함유하는 용액을 사용하여 전도율을 90μS/cm로 조정하였다.
세포 배양물
T-세포 클론 H.243은 류마티스성 관절염을 겪는 환자로부터 얻었다. 이 Th1-유사 T-세포 클론은 DRB1*0401(MHC 제II군에 속함)의 환경하에서 인간 연골 gp-39(HC gp-39) 유래의 에피토프 RSFTLASSETGVG(서열 번호 1)를 인식한다. 이 클론의 TCR은 Vα 8 및 Vβ 9 양성인 것을 특징으로 한다. 세포는 10% FCS, 20 U/ml의 IL-2, 5U/ml의 IL-4를 보강한 DMEM/HAM F12중에서 통상적으로 배양하고 항원과 조직친화성 항원 발현 세포(APC) 또는 식물성적혈구응집소(PHA) 및 공급세포로 주기적으로 재자극하였다. 증식 분석에서는 태내 송아지 혈청(FCS) 대신에 정상인 혈청(NHS)을 사용하였다.
T-세포 용해물의 제조 및 비드에 TCR/CD3 복합체의 로딩
재자극 후 10 내지 14일째, T-세포를 PBS로 세정하고 이 세포를 웨트겐등(참조문헌 2)에 따른 추출 완충액(10mM 트리에탄올아민, 150 mM NaCl, 1 mM Na2EDTA, 1% 디기토닌, 10㎍/ml 류펩틴, 10㎍/nl 아프로티닌, 1㎍/ml 펩스타틴, 1 mM Pefabloc(등록상표명) AEBSF 및 1.8 mg/ml 요오도아세트아민 pH 7.8)중에서 108 세포/ml의 농도로 항온배양(30분, 0℃)하여 용해시켰다. 연성 세정제 디기토닌은 본래 TCR/CD3 복합체를 추출시킬 수 있다. 핵 및 세포 잔사는 16,000 g에서 15분동안 4℃하에 원심분리하여 제거하고 그 상청액은 B-세포 선택용이나 면역침전반응시에 사용할 때까지 일정량으로 -20℃에 저장하였다.
특이적 B-세포를 선택하기 위해, 상자성 비드에 TCR/CD3 복합체를 로딩하였다.
간단히 설명하면, 양의 항-마우스 Ig 결합된 상자성 비드(SAM-비드; Dynabeads(등록상표명) 110.02) 100㎕를 0.1% BSA가 함유된 PBS중에서 22㎍의 항-CD3, OKT3과 항온처리하였다(하룻밤, 4℃). 이 비드를 PBS/BSA로 세정한 후, T-세포 용해물의 1.4 x 108 세포 등가물과 이와 동량(1.4 ml)의 1% 정상 마우스 혈청을 함유한 PBS/BSA를 첨가하였다. 이 1% 정상 마우스 혈청을 함유한 PBS/BSA는 비드상의 자유 SAM 결합 부위에 B-세포가 결합하지 않도록 하기 위해 첨가한 것이다. 이 비드 현탁액을 4℃에서 2 내지 4 시간동안 항온처리하고 사용하기 전에 PBS/BSA로 세정하였다.
면역화
6주령의 암컷 BALB/C 마우스를 3 내지 7주 간격으로 5 x 106 의 전 T-세포(본 발명) 또는 5 x 107 세포 등가량의 TCR/CD3 복합체를 로딩한 상자성 비드(대조 실험)로 면역화하였다. 투여 경로는 표 1에 나타낸 바와 같이 여러 경로를 사용하였다. 보조제를 사용한 경우(대조 실험)에 있어서 1차 주입시에는 완전 프로인트 보조액을 사용하고 그 다음의 주입시에는 불완전 프로인트 주입액을, 최종 추가항원자극시에는 보조제를 사용하지 않았다.
항-클론형 MAb의 생산
6주령의 암컷 BALB/C 마우스에 PBS중의 휴지성 T-세포 5 x 106을 3주 내지 7주 간격으로 4회 복강내 주입하였다. 최종 주입후 5일째 마우스를 죽이고 적혈구 및 단핵구-결핍된 비장 세포군을 종래 개시된 바와 같이 제조하였다(참조문헌 23, 24). 이에 따라 B-세포가 농축된 세포 분획을 얻었으나, 본 발명의 단계 2에 따라 다른 비특이적인 B-세포에 비하여 상기 세포 표면 항원에 특이적인 B-세포를 농축하지는 않았다.
인간 CD3 또는 TCRαβ 의 불변부에 반응성인 B-세포에 대하여 상기 비장 세포군을 예비청정화하기 위해, 약 3 x 107 세포와 무관련성 T-세포 클론(Vα 3.Vβ 14 양성 T-세포 클론, SCRO.08A, 하지만 다른 어떤 무관련성 T-세포의 사용도 가능함)의 TCR/CD3 복합체를 로딩한 SAM 비드 20㎕를 2회 항온처리하였다. 이와 같이 얻어진 세포 현탁액을 목적하는 T-세포 클론(H.243)의 TCR/CD3 복합체를 로딩한 SAM 비드와 함께 항온처리하여 TCR의 가변부에 특이적인 B-세포를 선택하였다. 각 항온처리는 10% 송아지 혈청(Hyclone(등록상표명)) 및 0.2% 정상 뮤린 혈청을 보충한 DMEM/HAM F12중에서 실온하에 90분동안 실시하였다. 이 항온처리동안, 현탁액은 5분마다 조심스럽게 균질화시켰다. 최종 항온처리 후, 비드를 DMEM/HAM F12, 10% 송아지 혈청으로 5회 조심스럽게 세정하고 동일 배지중에 재현탁하였다.
이와 같이 선택된 B-세포를 종래 개시된 바와 같은(23) 클론 증식 및 미소-전기융합시켜 모노클로널 항체 생산 하이브리도마를 생산하였다. 이것을 간략히 요약하면, 먼저 선택한 B-세포를 T-세포 현탁액(TSN) 및 50,000개의 방사능조사된(2500 rad) EL-4 B5-세포와 함께 96웰의 평면 바닥의 조직 배양판중에서 10% FCS를 보충한 DMEM/HAM F12로 최종 부피가 200㎕가 되도록 하여 혼합하였다. 8일 후, 상청액을 목적 T-세포 클론 또는 무관련성 T-세포 클론을 사용하여 하기 기재하는 바와 같이 1단계 T-세포 응집 분석법으로 시험하였다. 판별용 MAb를 생산하는 B-세포 배양물은 미소-전기융합 절차로 처리하였다. 이 B-세포 배양물의 함유물을 106 NS-1 골수종 세포(25)와 혼합하고 DMEM/HAM F12/HT로 세정하여 혈청을 제거하였다. 그 다음, 세포를 프로나제 용액으로 3분동안 처리하고 이어서 융합 배지로 세정하였다. 전기융합은 50㎕의 융합챔버내에서 30s, 2MHz, 400V/cm의 교번 전기장으로, 그 다음에는 10μs, 3 kV/cm의 직각 고역 펄스로, 다시 30s, 2MHz, 400V/cm의 교번 전기장으로 실시하였다. 마지막으로, 융합 챔버의 함유물을 20 ml 선택 배지로 옮기고, 96웰의 미량역가 평판에 도말하였다. 융합 8일 후, 배양물을 하이브리도마 증식에 대해 조사하고 다시 1단계 T-세포 응집 분석법으로 선별하였다.
T-세포 응집 분석법
항-T-세포 항체에 대한 하이브리도마 배양물의 선별 및 다른 T-세포와 MAb의 교차반응성 측정은 1단계 응집 분석법으로 실시하였다. 미량역가 평판의 반쪽 구역을 사용하여 하이브리도마 상청액 50㎕를, DMEM/HAM F12중에 5 x 104 의 목적하는 T-세포와 2 x 105 의 양의 항-마우스 Ig이 공유 결합된 상자성 비드를 함유하는 20㎕의 비드/세포 현탁액과 혼합하였다. 37℃에서 2 내지 3시간 항온처리한 후, 세포와 비드의 응집물을 찾아서 현미경으로 응집반응을 조사하였다.
면역침전법 및 웨스턴 블롯팅
재자극한지 10 내지 14일 후, T-세포를 세정하고 세포 표면 단백질을 비오틴으로 표지하였다. 간략히 설명하면, T-세포를 5 x 106 세포/ml의 농도로 PBS중의 0.5 mg/ml ImmunoPure(등록상표명) 설포-NHS-비오틴과 실온에서 30분동안 항온처리하였다. 이어서, 세포를 다시 세정하고 상기 기재한 바와 같이 용해시켰다. 면역침전 실험에 사용하기 전에 세포 용해물을 SAM-상자성 비드와 함께 항온처리하여 즉시 예비청정화시켰다. 면역침전은 107 세포 등가물의 예비청정된 용해물을 3 내지 4 시간동안 MAb(1 ml 하이브리도마 상청액)가 예비로딩된 15㎕의 SAM-상자성 비드와 함께 항온처리하여 수행하였다. 그 다음, 면역침전물을 PBS로 3회 세정하고 시료 완충액중에서 가열한 다음, 환원 조건 또는 비환원 조건하의 10% 겔상에서 SDS-PAGE 처리하였다(램리법(참조문헌 5) 및 Mini-Protean II 시스템(Biorad) 사용). 면역블롯팅은 PVDF 막을 사용하여 토우빈등(참조문헌 6)에 따라 수행하였다. 비특이적 결합 부위는 0.5% Tween 20을 보강한 PBS중의 5% 스킴 밀크와 막을 항온처리하여 차단시켰다. 이것을 세척한 후, 블롯은 PBS, 0.5% Tween 20, 1% BSA, 1% 정상 염소 혈청중의 스트립트아비딘-알칼리성 포스파타제로 실온에서 1시간동안 탐침시켰다. 마지막으로, 블롯은 발색원 기질로서 BCIP 및 NBT를 사용하여 발색시켰다. 웨스턴 블롯 연구에는, 면역침전 항체로서 OKT3과 정상 T-세포 용해물을 사용하여 전술한 바와 같은 TCR/CD3 복합체를 상자성 SAM-비드에 로딩시켰다. 환원 조건 또는 비환원 조건하에 10% PAA-겔 상에서 SDS-PAGE한 후, 블롯을 2.5ml의 하이브리도마 상청액과 항온처리하였다. 결합 항체는 알칼리성 포스파타제-결합된 염소 항-마우스 Ig과 전술한 바와 같은 BCIP/NBT를 사용하여 검측하였다.
항체 매개 T-세포 증식
평면 바닥의 미량역가 웰을 PBS중에 40㎍/ml농도로 함유된 양의 항-마우스 Ig 100㎕로 코팅시켰다(하룻밤, 실온). 이 웰을 즉시 세정한 다음, PBS중에 2㎍/ml의 농도로 함유된 MAb 100㎕와 2시간동안 항온처리하였다. 과잉의 유리 MAb는 세척하여 제거하고 2.5 x 104 의 휴지기의 T-세포를 10% NHS가 보충된 DMEM/HAM F12, 200㎕중에 첨가하였다. 이것을 37℃에서 2일간 항온처리한 후, 세포를 0.5μCi[3H]-티미딘으로 펄스화하고 16 내지 18 시간동안 추가 항온처리하였다. 마지막으로, 세포를 유리 섬유 필터상에 수거하고 [3H]-티미딘 병입량을 Matrix 96TM(팩카드) 상에서 베타 계수법으로 측정하였다. 각 변수는 4반복 실험으로 시험하였다.
항원-유도 증식의 항체 매개 억제성
평면 바닥의 미량역가 웰에, 10% NHS가 보충된 DMEM/HAM F12 150㎕중에 함유된 20㎕ 하이브리도마 상청액, 2 x 104 휴지기의 T-세포 및 1 x 105 조직친화성 MNC를 주입하였다. 37℃에서 3시간동안 항온처리한 후, 이 배양물에 펩티드 RSFTLASSETGVG(16㎍/ml) 50㎕를 첨가하였다. 이 배양물은 추가 2일동안 37℃에서 항온처리하고 전술한 바와 같이 [3H]-티미딘 병입량을 측정하였다. 각 변수는 4반복 실험으로 시험하였다.
클론형-특이적 MAb에 의한 아네르기 유도성
PBS중에 40㎍/ml로 용해된 양의 항-마우스 Ig 1 ml로 24 웰 배양판을 피복시켰다(하룻밤, 실온). 이 웰을 즉시 세정하고 그 다음 PBS중에 2㎍/ml의 농도로 함유된 MAb 1 ml와 2 시간동안 항온처리하였다. 과잉의 유리 MAb를 세척하여 제거하고, 이와 같이 세척된 휴지기의 T-세포 2 x 106을 2 ml의 DMEM/HAM F12, 10% NHS중에 첨가하였다. 그 다음, 시클로스포린 A(스위스 바젤에 소재하는 산도스 제품), rIL-2, 시클로헥시미드(미국, 미주리, 세인트 루이스에 소재하는 시그마 제품) 또는 HLA-DRB1*0401 조합 APC(300 rad 방사선조사됨)를 표시된 곳에 항온처리 개시시에 첨가한다. 하룻밤동안 항온처리한 후 배양판을 얼음상에서 냉각시키고 T 세포를 피펫팅으로 재현탁시켰다. 이 세포를 완전 배양액으로 일회 세정하고 하기 기재되는 바와 같은 T-세포 증식 분석법, 시토킨 분석법 및 FACS 분석법에 사용하였다.
T 세포의 항원-특이적 증식 응답반응은 DMEM/HAM F12 200㎕, 10% NHS중에 함유된 2 x 104 T 세포, 1 x 105 HLA-DRB1*0401 조합, 방사선 조사된(3000 rad) PBMC 및 다양한 농도의 항원을 포함하는 평면 바닥의 마이크로웰 배양물중에서 평가하였다. 37℃에서 2일동안 항온처리한 후, 이 세포를 0.5μCi의 [3H]-티미딘으로 펄스화하고 추가 16 내지 18 시간동안 항온처리하였다. 마지막으로, 세포를 유리 섬유 필터상에 수거하고 [3H]-티미딘 병입량을 Matrix 96(미국 코네티컷, 매리덴에 소재하는 팩카드 제품)상에서 가스신틸레이션하여 측정하였다. 각 변수는 삼반복으로 시험하였다.
결과
면역화
보조제를 사용한 면역화(대조 실험)는 H.243과 무관련 T-세포(표 1; 면역화 제II군, 제III군, 및 제IV군) 간을 판별할 수 있는 항체를 함유하는 어떤 혈청도 생산하지 않았다. 제V군의 혈청 역가는 낮은 반면(응집 분석에서 1:100), 제I군 및 제II군의 혈청 역가는 매우 높았다(1:1200).
항-클론형 MAb의 생산
제I군 유래의 비장 세포를 사용하여 무관련성 T-세포 클론, 여기서는 H.258 유래의 TCR/CD3 복합체와 항온처리한 결과, 로딩된 상자성 비드는 많은 로제트형 세포를 생산하였고, 이것은 많은 CD3- 및 TCRαβ -반응성 B-세포의 제거가 성공적이라는 것을 나타낸다. 비-로제트형 세포는 상기와 동일한 T-세포 클론 유래의 무관련성 TCR/CD3-복합체와 2차 예비청정화 처리하였을 때에도, 로제트형 세포는 거의 관찰되지 않았다.
목적하는 T-세포 클론과 상자성 비드를 항온처리한 후 현미경 조사한 결과, 가시성 로제트 형성은 관찰되지 않았다. 이것은 예측된 빈도수의 특정 B-세포가 제공되었다면 놀라운 것이 아니다. 한계 희석과 클론 증식후, 36가지 B-세포 상청액은 H.243을 응집시키나 무관련성 T-세포 클론 H.258은 응집시키지 못하는 것으로 관찰되었다(표 2). 일부 B-세포 상청액은 상기 양 클론을 모두 응집시킬 수 있는데, 이에 따라 예비청정화 절차는 필요치 않게 된다.
또한, 표 2로부터 특정 B-세포 배양물의 대부분은 B-세포가 증식했을 때 클론성이 아니어서 어떤 T-세포와도 반응하지 않는다는 것을 알 수 있다. 그러나, 이것은 상기 비특이적 B-세포의 하이브리도마의 선택이 미소-전기융합 후에 이루어지기 때문에 문제가 되지 않는다. 특이적인 B-세포 배양물중 18가지는 미소-전기융합법으로 처리하였다. 일부 융합물은 T-세포 특이적인 하이브리도마를 생산하지 않았고 일부 다른 융합물은 안정한 세포주로 클론화될 수 없었다. 결과적으로, 18가지 미소-전기융합물중 11가지에서 안정한 하이브리도마를 얻었다. 이러한 11가지 MAb를 추가 특성규명하였다. 이러한 MAb의 동형(isotype)은 표 3에 나타낸다.
MAb의 특이성
MAb의 특이성을 추가 연구하기 위해, 면역침전법 및 T-세포 응집 시험 뿐만 아니라 웨스턴 블롯을 수행하였다.
비환원 및 변성 조건하에서 SDS/PAGE한 결과, 모든 MAb는 T-세포 클론 H.243의 디기토닌 용해물로부터 약 85 kD의 주 밴드와 21 kD의 부 밴드를 면역침전시킬 수 있는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 각각 TCRαβ-복합체와 CD3 쇄 ε/δ의 분자량과 일치하였다. 환원 조건하에서, 85 kD 밴드는 각각 TCR α쇄 및 β쇄의 분자량과 일치하는 40 kD 및 50 kD의 2개의 밴드로 해리하였다. 항-H.243 특이적인 MAb중의 하나와의 면역블롯은 도 1에 도시하였고, 양성 대조군으로서 OKT3을, 음성 대조군으로서 무관련성 MAb를 사용하였다.
표 3은 6개의 Vβ 9 양성 T-세포 클론, 2개의 Vα 8 양성 T-세포 클론 및 상이한 Vα 및 Vβ를 가진 8개의 다른 T-세포 클론과 상기 MAb의 교차 반응성을 나타낸 것이다. 항체 TCR 74는 모든 Vβ 9 양성 T-세포는 응집시키나 다음 세포는 응집시키지 못하는 것과 같이 Vβ 9 특이성이 있는 것으로 간주되어야 한다. 다른 TCR 항체들은 H.243과만 반응하며, 이에 따라 이 항체들은 H.243의 항원-결합부에 대한 것일 가능성이 높고, 따라서 항원Vα 8, Vβ 9, TCRαβ의 불변부, CD3 및 다른 공통적인 T-세포 표면 분자와는 반응하지 않는다. 도 2는 하이브리도마 클론 TCR64, TCR66, TCR69, TCR70, TCR73 및 TCR 76 MAb 유래의 항체가 비환원성 웨스턴 블롯상에서 TCR(85 kD 밴드)을 염색할 수 있다는 것을 나타내고 있다. 이 도면에서 상부에 있는 비특이적 중쇄 밴드는 면역침전성 항체 SAM 및 OKT3으로부터 전개된 것이다. 환원 조건하에 진행된 웨스턴 블롯에서는 항클론형 MAb로 전혀 염색되지 않았는데, 따라서 이것은 상기 MAb가 본래 TCRα β 복합체에 의해 형성된 배위의 에피토프를 인식한다는 것을 암시하는 것이다.
MAb 유도된 T-세포 증식성
MAb가 H.243 T-세포의 증식을 유도할 수 있는지를 조사하기 위해, MAb는 평면바닥의 미량역가 평판상에 고정시키고 T-세포와 항온처리하였다. 도 2는 MAb 간에 큰 차이는 없지만, 이들 모두가 H.243 세포의 증식을 유도할 수 있다는 것을 보여주고 있다. 항-CD3(OKT3)과 유사한 증식은 TCR 64, TCR 66, TCR 70, TCR 76 및 TCR 79로도 얻어졌다. 다른 TCR의 항-클론형 MAb인 TCR 44로는 증식이 전혀 일어나지 않았다.
T-세포에 의한 항원-유도 증식의 MAb 매개 억제성
추가로 MAb의 패널이 H.243 T-세포의 항원-유도 증식을 억제할 수 있는지를 연구하였다. 이 실험에서는, MAb를 T-세포 및 APC와 예비-항온처리하고, 3 시간 후 여러 농도의 펩티드로 펄스화하였다. 도 4는 TCR 64, TCR 70, TCR 76, TCR 78 및 TCR 83이 항원-유도 증식을 강하게 억제한다는 것을 보여준다. TCR 83으로 98% 까지의 억제율을 얻었다. 용량 응답 곡선은 100 ng/ml 만큼 소량의 TCR 64, TCR 70 및 TCR 83으로 최대 억제율이 얻어질 수 있다는 것을 보여주고 있다. TCR 78은 그 역가가 대략 10 배 미만이었다. 억제 패턴은 최적량이하 농도 또는 포화 농도의 펩티드를 첨가했는지에는 무관하다(결과는 도시하지 않음). 다른 TCR(TCR 44)에 대한 항-클론형 MAb는 어떤 억제율도 나타내지 않았다.
항-클론형 MAb에 의한 항원 및 APC로의 연속 자극시 인간 T-세포 클론 H.243의 무응답 유도성
동시자극 없이 T-세포 수용체를 점유하면 아네르기를 유도하는 것으로 알려져 있다. 이전에 설명한 바와 같이, 본 발명자들은 H.243에 대해 고정된 항-클론형 MAb가 이 클론의 TCR을 기능적으로 자극할 수 있다는 것을 발견하였다. 따라서, 동일 항체가 아네르기를 유도할 수 있는지가 관심의 대상이 되었다. 이러한 목적으로, 24웰 평판에 10가지 다른 항-클론형 MAb를 고정시키고 H.243 T 세포와 하룻밤동안 항온처리하여 아네르기성 자극을 가했다. 그 다음, T 세포를 평판으로 부터 분리하여 이 T 세포가 방사선조사된 DRB1*0401-조합 APC에 의해 나타나는 HC gp-39262-277(서열 번호 3)의 농도 증가량에 응답반응할 수 있는지를 시험하였다. 도 5는 이 응답반응이 10개의 MAb중 8개에서 완전하게 없어지는 반면, 대조용 MAb 1과 항온처리된 H.243 세포는 APC에 의해 발현된 펩티드에 여전히 잘 응답 반응한다는 것을 보여주고 있다. TCR 69 및 TCR 83과 항온처리된 T 세포의 응답 반응은 현저히 감소되나 보다 높은 펩티드 농도에서 완전히 없어지지는 않았다.
아네르기 세포에 의한 비-아네르기성 세포의 응답 반응 억제성
본 발명자들은 또한 아네르기성 H.243 세포가 비-아네르기성 H.243 세포의 응답반응을 억제할 수 있는지를 연구하였다. 아네르기는 TCR 76으로 유도하였고, 비-아네르기성 세포는 대조용 MAb 1과 항온배양하여 얻었다. 이어서, 여러 T 세포 개체군, 즉 2 x 104 아네르기성 T 세포/웰, 2 x 104 비-아네르기성 T 세포/웰, 또는 점감 농도의 아네르기성 T 세포(4 x 104, 2 x 104, 1 x 104, 및 0.5 x 104)와 2 x 104 비-아네르기성 T 세포의 혼합물/웰을 사용하여 펩티드 HC gp-39261-275 (서열 번호 2)에 대한 증식 분석을 실시하였다. 비-아네르기성 세포의 응답반응은 아네르기성 세포를 첨가했을 때 용량 관련 방식으로 현저하게 감소하였다(도 6). 항원 농도 1㎍/ml과 아네르기성 세포 대 비-아네르기성 세포의 비를 2:1로 사용했을 때 약 90%의 증식 감소율이 얻어졌다. 항원 농도를 보다 증가시켰을 때 증식 감소율은 저하하였다(5 ㎍/ml에서 72%, 25 ㎍/ml에서 39%).
따라서, 본 실시예는 인간 T-세포 수용체에 대한 항-클론형 모노클로널 항체를 생산할 수 있음을 보여주고 있다. 이 실험은 10개의 하이브리도마를 생산하였고, 이중 4개는 표 3에 기재된 바와 같이 ECACC(영국 살리스베리에 소재)에 기탁하였다. 이 방법은 다수의 T-세포나 다량의 정제된 TCR을 필요로 하지 않는다. 본 발명에 따른 방법은 면역화 절차에 사용하기 위해 동계 마우스 세포상에서 발현된 TCR의 가용성 TCR을 생산해야 하는 불필요하게 긴 재조합 절차의 바람직한 대안방법이다. 따라서 구조 안정성과 관련된 가능한 문제점을 극복할 수 있다. 항체 유도성 T-세포 증식에 대한 시험과 항원-유도된 T-세포 증식의 항체 매개의 억제에 대한 시험(98% 까지의 억제율이 관찰됨)에 있어서 상기 모노클로널 항체는 상이한 응답성을 나타내는데, 이것은 동일한 클론형 구조에 대해 여러 에피토프들이 인식한다는 것을 암시한다.
모든 항-클론형 모노클로널 항체는 가교되어 있다면 H.243 T-세포의 증식을 유도할 수 있었다. 자가반응성 클론에서는 소량의 고정된 항-클론형 MAb가 아네르기를 유도할 수 있는 것으로 증명되었다. 아네르기 자극 후, T 세포는 재자극시 IL-2 유전자 전사 부족으로 인해 증식하지 못하였다. 또한, IFNg 생산도 감소되는 것으로 관찰되었다.
아네르기 세포를 FACS 분석한 결과, 아네르기는 TCR 하향조정이나 유리 TCR의 부재를 초래하지는 않는 것으로 나타났다. 동시배양 실험에서, 아네르기성 T 세포는 동일 클론으로부터의 반응성 세포의 응답 반응을 억제하는 것으로 밝혀졌다. 이러한 방관자 억제성은 90%의 증식 억제율을 유도하였다. 이 데이터는 시험관내 클론형-특이적 항체의 아네르기 잠재성을 입증한 것이다. 따라서, 이러한 MAb는 류마티스양 관절염에 있어서의 항원-특이적 T-세포 내성을 유도 및 유지하는데 사용할 수 있다.
상자성 비드에 결합된 다소 순수한 TCR/CD3 면역 복합체를 주입하여 마우스 혈청을 면역화시켰다(표 1 ; 면역화 군 IV). 이 마우스 혈청은 무관련 T-세포보다 면역화에 사용된 특이적 T-세포에 대해 보다 양성을 나타내는 것으로 시험되었다. 그러나, 항-클론형 모노클로널 항체를 생산하는 하이브리도마를 얻는 것은 불가능하였다. 총 T-세포의 소량으로 면역화된 마우스의 혈청에 있어서 목적 T-세포 대 무관련 T-세포에 대한 어떤 특이성이 증명될 수는 없었지만, 본 발명에 따른 방법은 항-클론형 모노클로널 항체를 생산할 수 있는 하이브리도마를 얻을 수 있다.
따라서, 항원 결합 단편을 본 발명에 따른 모노클로널 항체, 예컨대 파파인을 사용하여 제조할 수 있다는 것은 말할 나위도 없다. 또한, 상기 모노클로널 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 그 검출을 용이하게 하기 위하여 표지화할 수 있으며, 이러한 형태 모두 본 발명의 범위에 포함되는 것이다.
또한, 비특이적 B-세포를 제거하기 위해 사용된 무관련 세포는 세포 표면 항원-운반 세포와 매우 유사한 것이 바람직하다는 것은 당연한 것이다.
[표 1]
면역화 계획 및 혈청 특성
[표 2]
EL-4 B-세포 배양물중에서 항-T-세포 특이적 B 세포의 과성장
[표 3]
항-TCR mAb와 여러 종류의 T 세포의 응집성
본 발명에 따른 방법은 면역화 절차에 사용하기 위해 동계 마우스 세포상에서 발현된 TCR의 가용성 TCR을 생산해야 하는 불필요하게 긴 재조합 절차의 바람직한 대안방법이다. 따라서 구조적 안정성과 관련된 가능한 문제점을 극복할 수 있다.
참조 문헌
1. 모레타, 에이., 등(1985) 인터루킨-2-생산 인간 백혈병 T-세포주의 유전인자형-유사 구조에 대한 모노클로널 항체의 선택 및 특성규명, Int.J.Cancer 36: p. 253-259.
2. 웨트겐, 에이치.씨. 등(1986) 뮤린 T 세포에 대한 항원 수용체에 결합된 T3-유사 단백질 복합체, Nature 320: p. 272-275.
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약어
PBS 인산염 완충 식염수
BCIP 5-브로모-4-클로로-3-인돌일포스페이트 p-톨루이딘 염
NBT p-니트로 블루 테트라졸륨 염화물
BSA 소 혈청 알부민
FCS 태내 송아지 혈청
SAM 양의 항 마우스
TSN T-세포 상청액
MAb 모노클로널 항체(항체들)
제조업자
바이오래드, 미국 캘리포니아 리치몬드 소재
기브코, 스코틀랜드 파이슬리 소재
하이클론, 미국 로간 소재
팩카드, 미국 코네티컷 매리덴 소재
도 1은 H.243에 대한 MAb에 의해 면역침전된 H.243 T-세포 표면 분자를 규명하기 위한 SDS/PAGE이다.
도 2는 TCRαβ 를 인식하는 항-클론형 MAb의 웨스턴 블롯팅이다.
도 3은 고정화된 항-TCR MAb에 의한 인체 T-세포 클론 H.243의 증식 자극성을 도시한 것이다.
도 4는 항-TCR MAb와의 예비배양에 의한 인체 T-세포 클론 H.243의 항원-유도된 증식의 억제성 또는 차단성을 도시한 것이다.
도 5는 항-클론형 MAb에 의한 인체 Th1-클론 H.243의 아네르기 유도성을 도시한 것이다.
도 6은 아네르기성 H.243 T 세포에 의한 비-아네르기성 H.243 T 세포의 응답 반응 억제성을 도시한 것이다.
Claims (33)
- 불변부 및 가변부를 갖는 세포 표면 항원으로서 그 가변부의 일부분 이상이 표면 항원의 특이성 결정부를 나타내는 세포 표면 항원에 대한 모노클로널 항체의 제조 방법으로서,1) i) 전 세포 및 ii) 이 전세포를 처리하여 얻은 막 분획으로 구성된 군중에서 선택되는 세포 표면 항원-함유 물질을 포유류에 주입하는 단계;2) 상기 포유류의 비장으로부터 B-세포 함유 세포 분획을 분리하는 단계;3) 상기 단계 2)에서 얻은 세포 분획을, 세포 표면 항원이 없고 상기 전세포와 관련있는 세포의 캐리어-결합 물질과 접촉시켜 이 세포 분획에서 상기 세포 표면 항원에 특이적인 B-세포를 농축하고, 다음 단계에 사용될 이 농축된 비결합 B-세포-함유 세포 분획으로부터 관련 세포의 캐리어-결합 물질에 결합된 B-세포를 분리하는 단계;4) 상기 세포 분획을 j) 전세포, jj) 이 전세포에서 얻은 막 분획, 및 jjj) 실질적으로 정제된 세포 표면 항원으로 구성된 군중에서 선택된 캐리어-결합 세포 표면 항원 함유 물질과 접촉시키고, 이어서 이 캐리어-결합 물질에 결합되지 않은 B-세포를 상기 캐리어-결합 물질에 결합된 B-세포로부터 분리하는 단계;5) 상기 단계에서 얻은 농축된 B-세포-함유 세포 분획을 한계 희석시킨 다음 클론 증식시키는 단계;6) B-세포 클론을 선택하고, 이 선택한 B-세포 클론을 소규모 융합 기법을 사용하여 불멸화(immmortalising)시키는 단계; 및7) 상기 세포 표면 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 생산할 수 있는 하이브리도마를 선택하고 클로닝한 다음, 이 하이브리도마의 상청액으로부터 얻은 모노클로널 항체-함유 분획을 분리하는 단계를 포함하는 방법.
- 제1항에 있어서, 표면 항원이 주입되는 포유류가 그 표면 항원을 얻은 포유류종과는 상이한 종인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
- 제1항에 있어서, 수용체 분자-함유 물질이 표면 항원-함유 물질로서 사용되는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
- 제2항에 있어서, 수용체 분자-함유 물질이 표면 항원-함유 물질로서 사용되는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
- 제3항에 있어서, T-세포 클론이 수용체 분자-함유 물질을 제조하는데 사용되는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
- 제4항에 있어서, T-세포 클론이 수용체 분자-함유 물질을 제조하는데 사용되는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
- 제1항, 제2항, 제3항 내지 제6항 중 어느 하나의 항에 있어서, 단계 1)에서 얻은 막 분획이 전 세포를 기계적 처리하므로써 얻어지는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
- 제1항, 제2항, 제3항 내지 제6항 중 어느 하나의 항에 있어서, 세포 표면 항원-함유 물질이 보조제 없이 포유류에 주입되는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
- 제7항에 있어서, 세포 표면 항원-함유 물질이 보조제 없이 포유류에 주입되는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
- 제1항, 제2항, 제3항 내지 제6항 중 어느 하나의 항에 있어서, 캐리어로서 상자성(常磁性) 비드를 사용하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
- 제7항에 있어서, 캐리어로서 상자성 비드를 사용하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
- 제8항에 있어서, 캐리어로서 상자성 비드를 사용하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
- 제9항에 있어서, 캐리어로서 상자성 비드를 사용하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
- 제1항, 제2항, 제3항 내지 제6항, 제11항 내지 제13항 중 어느 하나의 항에 있어서, 단계 6) 및 7)중 하나 이상의 단계에서의 선택은, B-세포 클론의 상청액을 세포 표면 항원 함유 전세포 및 단계 1)에서 사용된 항원주입된 포유류 종들의 항체에 결합할 수 있는 항체로 피복된 캐리어에 접촉시켜 응집반응을 검측하는 응집 분석법으로 수행되는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
- 제7항에 있어서, 단계 6) 및 7)중 하나 이상의 단계에서의 선택은, B-세포 클론의 상청액을 세포 표면 항원 함유 전세포 및 단계 1)에서 사용된 항원주입된 포유류 종들의 항체에 결합할 수 있는 항체로 피복된 캐리어에 접촉시켜 응집반응을 검측하는 응집 분석법으로 수행되는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
- 제8항에 있어서, 단계 6) 및 7)중 하나 이상의 단계에서의 선택은, B-세포 클론의 상청액을 세포 표면 항원 함유 전세포 및 단계 1)에서 사용된 항원주입된 포유류 종들의 항체에 결합할 수 있는 항체로 피복된 캐리어에 접촉시켜 응집반응을 검측하는 응집 분석법으로 수행되는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
- 제9항에 있어서, 단계 6) 및 7)중 하나 이상의 단계에서의 선택은, B-세포 클론의 상청액을 세포 표면 항원 함유 전세포 및 단계 1)에서 사용된 항원주입된 포유류 종들의 항체에 결합할 수 있는 항체로 피복된 캐리어에 접촉시켜 응집반응을 검측하는 것으로 구성되는 응집 분석법으로 수행되는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
- 제10항에 있어서, 단계 6) 및 7)중 하나 이상의 단계에서의 선택은, B-세포 클론의 상청액을 세포 표면 항원 함유 전세포 및 단계 1)에서 사용된 항원주입된 포유류 종들의 항체에 결합할 수 있는 항체로 피복된 캐리어에 접촉시켜 응집반응을 검측하는 응집 분석법으로 수행되는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
- 제14항에 있어서, 세포 표면 항원은 없으나 상기 전세포와 관련있는 전세포를 대조군으로서 사용하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
- 제15항 내지 제18항중 어느 하나의 항에 있어서, 세포 표면 항원은 없으나 상기 전세포와 관련있는 전세포를 대조군으로서 사용하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
- 제1항, 제2항, 제3항 내지 제6항, 제11항 내지 제13항, 제15항 내지 제19항 중 어느 하나의 항에 있어서, 단계 6)에서 선택된 B-세포 클론을 골수종 세포와 혼합한 후, 미소-전기융합법으로 처리하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
- 제7항에 있어서, 단계 6)에서 선택된 B-세포 클론을 골수종 세포와 혼합한 후, 미소-전기융합법으로 처리하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
- 제8항에 있어서, 단계 6)에서 선택된 B-세포 클론을 골수종 세포와 혼합한 후, 미소-전기융합법으로 처리하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
- 제9항에 있어서, 단계 6)에서 선택된 B-세포 클론을 골수종 세포와 혼합한 후, 미소-전기융합법으로 처리하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
- 제10항에 있어서, 단계 6)에서 선택된 B-세포 클론을 골수종 세포와 혼합한 후, 미소-전기융합법으로 처리하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
- 제14항에 있어서, 단계 6)에서 선택된 B-세포 클론을 골수종 세포와 혼합한 후, 미소-전기융합법으로 처리하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
- 제20항에 있어서, 단계 6)에서 선택된 B-세포 클론을 골수종 세포와 혼합한 후, 미소-전기융합법으로 처리하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
- T-세포 수용체의 클론형 구조와 반응성이 있는 모노클로널 항체로서, T 세포 수용체가 T 세포 클론 ECACC 기탁번호 96103122의 것이고 자가 면역 질환과 관련된 것인 모노클로널 항체.
- 제28항에 있어서, 자가면역 질환이 류마티스성 관절염인 것을 특징으로 하는 모노클로널 항체.
- 제29항에 있어서, 모노클로널 항체가 HC gp-39 반응성 T-세포 클론의 T-세포 수용체와 반응성인 것을 특징으로 하는 모노클로널 항체.
- 제30항에 있어서, ECACC 기탁 번호 96103118, ECACC 기탁 번호 96103119, ECACC 기탁 번호 96103120 및 ECACC 기탁 번호 96103121로 구성된 군중에서 선택되는 하이브리도마에 의해 생산되는 것을 특징으로 하는 모노클로널 항체.
- 제28항, 제29항, 제30항 및 제31항 중 어느 하나의 항의 모노클로널 항체와 함께 적합한 부형제를 함유하는, 류마티스성 관절염 치료용 약학 조성물.
- 제28항, 제29항, 제30항 및 제31항 중 어느 하나의 항의 모노클로널 항체로 구성된 군중에서 선택된 모노클로널 항체를 함유하는 진단 시약.
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