NO327047B1

NO327047B1 - Fremgangsmate for fremstilling av monoklonalt antistoff, monoklonalt antistoff og farmasoytisk blanding

Info

Publication number: NO327047B1
Application number: NO19975714A
Authority: NO
Inventors: Petrus Gerardus Antonius Steenbakkers
Original assignee: Organon Nv
Priority date: 1996-12-06
Filing date: 1997-12-05
Publication date: 2009-04-14
Also published as: MX9709446A; HU9702359D0; IL122233A; AU4690897A; CA2221682C; HUP9702359A3; EP0856520A1; JPH10179160A; AU733165B2; PL193821B1; US20020143150A1; NO975714L; ES2262170T3; PL323572A1; KR19980063909A; BR9706236A; KR100543053B1; ATE322507T1; PT856520E; US6392020B1

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører fremgangsmåte for fremstilling av monoklonalt antistoff, monoklonalt antistoff og farmasøytisk blanding

Det beskrives følgelig en fremgangsmåte for fremstilling av et monoklonalt antistoff mot et overflate-antigen, og spesielt et slikt overflate-antigen som utgjør bare en ubetydelig mengde av det totale antigen injisert i et pattedyr og et overflate-antigen som lett taper sin in vivo struktur. Problemet med en ubetydelig mengde av antigen relativt til den totale mengde av antigen setter inn, for eksempel når antigen-materialet brukt til å injisere et pattedyr er avledet fra en annen pattedyrart.

Moretta et al., 1985, Int. J. Cancer, Vol. 36, pp. 253-259 beskriver antistoffer mot T-cellereseptorer, men beskriver ikke en selektiv metode for å fremstille antistoffer til et ønsket overflateantigen uavhengig av mengden av antigen tilgjenglig.

Problemene assosiert med antigenene spesifisert ovenfor blir for eksempel klart når, det er ønsket å lage monoklonale antistoffer mot den spesifisitetsbestemmende delen av en T-cellereseptor (TCR). Slike (monoklonale) antistoffer er kjent som antiklonotype antistoffer fordi de gjenkjenner den antigen-spesifikke delen (eller klonotypstrukturen) av en T-cellereseptor av en spesiell T-celleklon. Mens (murine) monoklonale antiklonotype antistoffer mot musefamiliens T-cellereseptor (TCR) er blitt rapportert bare en sjelden gang, er det enda mindre (mus) mono-klonale antiklonotype antistoffer kjent mot humane T-celle reseptorer. T-celler er vanskelig å dyrke, noe som gjør dem vanskelig å oppnå og å rense passende mengde av antigen, d.v.s. T-celle reseptorprotein. Dette igjen gjør det vanskelig å oppnå en immunrespons og gjør også sortering vanskelig. I et av dé få tilfellene hvor et monoklonalt anti-klonotypt antistoff er tilgjengelig mot en human TCR, oppstår ikke disse problemene fordi antigenet var tilstede på Jurkat leukemiceller (ref. 1). Når leukemiceller kan bli dyrket i ubegrensede mengder, oppstår ikke problemet med mangel på antigen. Derfor, var inntil nå ingen fremgangsmåte tilgjengelig for å fremstille monoklonale antistoffer mot sjeldne og/eller veldig ustabile antigener uten å måtte sortere ut ugunstige store mengder av hybridomkloner.

Hensikten med denne oppfinnelsen er å fremskaffe en fremgangsmåte for fremstilling av et monoklonalt antistoff mot et celleoverflate-antigen under ugunstige forhold som beskrevet ovenfor, nevnte fremgangsmåte reduserer dramatisk antallet av hybridomkloner som skal bli sortert, som gjør fremgangangsmåten ifølge oppfinnelsen mer effektiv eller til og med vellykket der hvor nåværende fremgangsmåter slår feil.

Foreliggende oppfinnelse vedrører følgelig fremgangsmåte for å fremstille et monoklonalt antistoff mot et celleoverflate antigen, som har en konstant del og en variabel del, hvor minst en del av nevnte variable del definerer en spesifisitetsbestemmende del av nevnte overflateantigen,

som omfatter trinnene, kjennetegnet ved at:

1) å injisere et ikke-humant pattedyr med celleoverflate antigen-omfattende materiale, nevnte materiale er valgt fra gruppen som består av i) hele celler og ii) en membran-fraksjon oppnådd ved å behandle hele celler; 2) å isolere en B-celle-inneholdende cellefraksjon fra milt av nevnte pattedyr; 3) å anrike nevnte cellefraksjon oppnådd i trinn 2 i B-celler spesifikke for nevnte overflateantigen ved å sette cellefraksjonen i kontakt med bærer-bundet materiale av celler relatert til nevnte hele celler, nevnte bærer-bundet relaterte materiale av celler som mangler nevnte overflateantigen, og å separere B-.celler bundet til bærer-bundet materiale av relaterte celler fra den anrikete ubundete B-celle inneholdende cellefraksjon for bruk i neste trinn; 4) å kontakte cellefraksjonen med bærer-bundet celleoverflateantigen omfattende materiale valgt fra gruppe av j) hele celler jj) en membranfraksjon oppnådd fra nevnte hele celler og jjj) vesentlig renset celleoverflateantigen, og deretter å separere B-celler ikke bundet til nevnte bærer-bundet materiale fra B-celler bundet til nevnte bærer-bundet materiale; 5) å utsette B-celler bundet til nevnte bærer-bundne materiale oppnådd i det tidligere trinn for begrensende fortynning etterfulgt av klonal ekspansjon; 6) å selektere et B-celleklon og å udødliggjøre nevnte selekterte B-celleklon ved å bruke liten-skala fusjonsteknikk; og 7) å selektere og å klone et hybridom som er i stand til å produsere antistoffer som spesifikt binder nevnte celleoverflateantigen, etterfulgt av å isolere en monoklonalt antistoff-omfattende fraksjon fra supernatanten av nevnte hybridom.

Med den hensikt å holde beskrivelsen og kravene leselige og forståelige, er her begrepet celle brukt ikke bare for å indikere pattedyrceller men også virus, og spesielt membran-innholdende virus.

Begrepet bærer-bundet materiale av celler omfatter intakte eller hele celler (og virus), membranfraksjoner av nevnte intakte hele celler (og virus),eller betydelig rensete overflate-antigener eller komplekser derav.

Hvis ikke spesifisert på en annen måte, refererer begrepet hele celler seg til celler som har overflate-antigenet av interesse. Begrepet relaterte celler refererer til celler som helst bare er forskjellige på den måten at de mangler overflate-antigenet av interesse, eller mere spesifikt at de minst mangler den immunologiske determinant mot det som er ønsket for å oppnå et monoklonalt antistoff.

Overraskende, viste det seg å være mulig å anrike cellefraksjonen i B-cellene spesifikke for celleoverflate-antigen uten bruk av celleoverflate-antigen ved å sette de isolerte B-celler-inneholdende cellefraksjonen i kontakt med materiale av celler fra samme arter som celleoverflate-antigen-innholdende materiale som var avledet fra, men manglet celleoverflate-antigenet. Med andre ord, ved å bringe B-celler i forbindelse med irrelevante relaterte celler eller cellemateriale og å flytte bundete B-celler ble det oppnådd en anrikelse.

På den måten er det mulig å fremstille et monoklonalt antistoff mot et mindre celleoverflate-antigen, selv om nevnte celleoverflate-antigen gjennomgår strukturell instabilitet.

Europeisk patent EP 0 488 470 og ref. 3, som er basert på dette europeiske patentet, beskriver en fremgangsmåte hvor I) et pattedyr er injisert med et antigen, n) en B-celle-omfattende fraksjon er isolert, ni) B-celler spesifikke for antigenet er selektert, IV) den anrikete fraksjon er gjort til gjenstand for klonal utvidelse og etter V) å selektere et B-celleklon og gjordt udødlig ved å bruke en liten-skala fusjonsteknikk og VI) hybridom er selektert og klonet etterfulgt av isolering av en monoklonalt antistoff-omfattende fraksjon. I trinn ni er B-cellene selektert ved å binde dem på en antigendekket plastikkoverflate eller ved at de danner rosetter med antigen-dekkete paramagnetiske kuler. De ikke-spesifikke B-cellene er fjernet ved vasking. Således, bort sett fra andre forskjeller, avhenger denne fremgangsmåten av den store tilgjengelighet og bruk av antigen - hvor under seleksjonen 2 ug/ml antigen er brukt til å dekke platene med antigen -, mens denne oppfinnelsen løser problemet i det tilfelle hvor antigenet er tilgjengelig i veldig begrensete mengder og til og med er meget urent.

En foretrukket utførelse er karakterisert ved at pattedyret injisert med overflateantigen er av en forskjellig art enn pattedyrarten overflateantigenet stammer fra.

Fremgangsmåten ifølge denne oppfinnelsen er meget egnet for å fremstille monoklonale antistoffer når mange antigener som er i stand til å fremkalle en immunrespons er tilstede.

Denne situasjonen eksisterer spesielt når overflateantigenet har en konstant del og en variabel del, hvor minst en del av nevnte variable del definerer en spesifisitetsbestemmende del av nevnte overflateantigen.

Ifølge en foretrukket utførelse er reseptormolekyl-omfattende materiale brukt som det celleoverflateantigen-omfattende materiale.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er spesielt egnet for å fremstille monoklonale antistoffer mot den spesifisitetsbestemmende delen av et reseptor-m ole kyl. Den spesifisitetsbestemmende delen av reseptormolekylet er bare en liten del av reseptormolekylet, som i seg selv er en liten bestanddel av alle molekylene- og dermed antigenene - på overflaten av en celle.

Et foretrukket mål ifølge oppfinnelsen er en T-celleklon, hvor T-celleklonen er brukt til å fremstille reseptormolekyl-inneholdende materiale.

En T-celle kan bli brukt som en hel celle, eller brukt til fremstillingen av en membranfraksjon derav. Dermed, kan i det tidligere tilfelle begrepet fremstille, her relateres til kun isoleringen av en T-celle eller resuspenderingen i et annet medium.

I følge foretrukkete utførelser er membranfraksjonen i trinn 1 oppnådd ved mekanisk behandling av hele celler, og celleoverflateantigen-omfattende materiale er injisert i pattedyret i fravær av en adjuvans.

Begge mål hjelper til å forhindre tap av in vivo strukturen av overflateantigenet.

Dernest er den anrikete B-celle-inneholdende cellefraksjonen fortrinnsvis videre anriket (trinn 3) ved å bringe i forbindelse cellefraksjonen med bærer-bundet celleoverflateantigen som omfatter materiale valgt fra gruppen av j) helle celler jj) en membranfraksjon oppnådd fra nevnte hele celler og jjj) betraktelig rensete celleoverflateantigen, og deretter å separere B-cellene som ikke er bundet til nevnte bærer-bundete materiale fra B-cellene bundet til nevnte bærer-bundete materiale som omfatter den videre anrikete cellefraksjonen.

Denne ytterligere anriking kan bli betegnet som en positiv seleksjonsteknikk, som selekterer spesielt spesifikke B-celler. På den måten, selv om nesten ingen antigen er tilgjengelige, kan videre anriking bli oppnådd.

I følge en foretrukket utførelse er paramagnetiske kuler fordelaktig brukt som bæreren.

Bruken av paramagnetiske kuler under anriking fremmer separasjonen av ønskete og uønskete B-celler.

En ubetydelig mengde av antigen representerer også et problem under sorteringen. Ifølge en foretrukket utførelse, er seleksjonen i minst et av trinnene 5 og 6 forbundet ved å bruke en agglutinasjonsananlyse hvor supernatanten av B-celleklonen er i kontakt med en bærer dekket med antistoffer som er i stand til å binde antistoffer av arten av det injiserte pattedyr brukt i trinn 1 og hele celler som bærer celleoverflateantigenet, og hvor agglutinering er påvist.

Ved ganske enkelt å blande B-cellekultursupernatant, hele celler og en bærer dekket med antistoffer som er i stand til å binde antistoffer av pattedyrarten anvendt i trinn 1, tillater en veldig sensitiv og rask deteksjon av passende kloner mens vasking ikke er påkrevet.

Fordelaktige hele celler relatert til de hele cellene som mangler overflate-antigen kan bli brukt som en kontroll.

Dette åpner muligheten for reinjeksjonen av falske positive kloner, og sparer tid for å unngå "superfluous" liten-skala fusjoner.

Ifølge en foretrukket utførelse av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, er den selekterte B-celleklon i trinn 5 blandet med myelomceller og underlagt mini-elektrofusjon.

Mini-elektrofusjon åpner muligheten for den effektive fusjonen av et veldig lite antall (f.eks. hundrevis) av celler.

Denne oppfinnelsen vedrører også en farmasøytisk blanding kjennetegnet ved at den omfatter et monoklonalt antistoff i overensstemmelse med hvilken som helst av kravene 11 til 12 blandet med et passende hjelpestoff, passende for behandlingen av reumatisk artritt.

Videre omfatter denne oppfinnelsen monoklonalt antistoff som har reaksjonsevne med klonotypiske strukturer av en T-cellereseptor, kjennetegnet ved at nevnte monoklonale antistoff er reaktivt med T-cellereseptoren av en HC gp-39 reaktiv T-celleklon.

Det monoklonale antistoffet er følkgelig reaktivt med den klonotypiske strukturen av en T-cellereseptor.

Slike monoklonale antistoffer kan bli anvendt til diagnostiske formål så vel som til fremstillingen av en farmasøytisk blanding.

Mere spesifikt er T-cellereseptoren en T-cellereseptor assosiert med en autoimmun sykdom, og spesielt reumatisk artritt.

Fortrinnsvis er det monoklonale antistoffet reaktivt med T-cellereseptoren av en Hc gp-39 reaktive med T-celleklonet, og spesielt med T-celleklonet H.243 (ECACC aksesjonsnr. 96103122).

Spesifikke eksempler på passende monoklonale antistoffer er de som er produsert av en hybridom valgt fra gruppen som består av TCR 69 (ECACC aksesjonsnr. 96103118), TCR 70 (aksesjonsnr. 96103119), TCR 72 (ECACC aksesjonsnr. 96103120) og TCR 83 (ECACC aksesjonsnr. 96103121).

Som indikert ovenfor, vedrører oppfinnelsen også en farmasøytisk blanding som omfatter et monoklonalt antistoff som ifølge oppfinnelsen er blandet med et passende hjelpestoff, passende for behandlingen av reumatisk artritt.

Nå vil oppfinnelsen bli forklart mer i detalj med referanse til det følgende eksempel. Nevnte eksempel viser den beste måten å utføre oppfinnelsen angående fremstillingen av et musemonoklonalt antistoff spesifikt for en klonotyp av en human T-cellereseptor.

TEKST TIL FIGURENE

Figur 1: Identifikasjonen av H.243 T-celleoverflatemolekyl immunopresipitert ved MAb rettet mot H.243. SDS/PAGE ble utført under ikke-reduserende forhold (felt 2,3 og 4) eller under reduserende forhold (felt 5, 6 og 7) i en 10% gel.

Fil 1:10 kD stigemarkør; fil 2 og 5: kontroll MAb; fil 3 og 6: TCR 83; fil 4 og 7: anti CD3, OKT3.

Figur 2: Anti-klonotyp MAb gjenkjenner TCRap i Western blot.

Immunpresipitert TCR/CD3 komplekser av H.243 ble løst opp på en 10% SDS-PAGE gel under ikke-reduserende forhold og deretter overført til PVDF-membraner. Membranene ble inkubert med MAb og til slutt ble det bundete MAb avdekket ved å bruke en alkalisk fosfatase-konjugert geit anti-mus lg antistoff nummer to.

Fil 1:10 kD stigemarkør, fil 2: TCR 64, fil 3: TCR 66, fil 4: TCR 69, fil 5: TCR 70, fil 6 TCR 72, fil 7: TCR 73, fil 8 TCR 76, fil 9: TCR 78, fil 10 TCR 79, fil 11: TCR 83, fil 12: kontroll MAb, fil 13 mediumkontroll. Figur 3: Immobilisert anti-TCR MAb stimulerer proliferasjon av humant T-celleklon H.243. Proliferasjon indusert av MAb rettet mot H. 243 (TCR 64 til TCR 83) ble sammenlignet med MAb som indikert og til TCR 44 som er en anti-klonotyp MAb rettet mot en annen TCR. Hver verdi representerer gjennomsnittstellinger per 5 min av firedoble kulturer +/- standard avvik. Figur 4: Pre-inkubasjon med anti-TCR MAb inhiberer eller blokkerer antigen-dreven proliferasjon av humant T-celleklon H. 243. a) Inhibisjon av MAb rettet mot H. 243 (TCR 64 til TCR 83) ble sammenlignet med kontroll MAb som indikert og til TCR 44 som er en anti-klonotyp MAb rettet mot en annen TCR. Hver verdi representerer gjennomsnittstellinger per 5 min av firedoble kulturer +/- standard avvik, b) dose respons kurver av sterkt inhiberende MAb; TCR (åpene sirkler), TCR 70 (lukkete triangler), TCR 78 (åpne firkanter), TCR 83 (lukkete firkanter) og kontroll MAb 1 (lukkete sirkler). Hver verdi representerer gjennomsnittstellinger per 5 minutter av triplikate kulturer.

Figur 5

Anti-klonotyp MAb indusert anergi (mangel på evne til å reagere på antigen) i human Th1-klon H.243.

Immobilisert anti-klonotyp MAb eller kontroll MAb 1 ble inkubert overnatt med H.243 T celler. Etter fjerning av cellene fra den anergiske stimulans, ble cellene gitt en full stimulans av økende konsentrasjoner av peptid og DRB1 *0401 tilpasset APC. Proliferasjonen ble målt ved 3H-tymidininkorperering. Hver verdi representerer gjennomsnittstellinger av triplikate kulturer +/- standard avvik.

Figur 6

Anergiske H.243 T celler undertrykker responsen av ikke-anergiske H.243 T celler. Immobiliserte TCR 76 eller kontroll MAb 1 ble inkubert over natten med H. 243 T celler. Deretter ble begge T-cellepopulasjonene brukt i en prolifereringsanalyse med økende konsentrasjoner av peptid (eller PHA) og APC ved å bruke 2 x 10<4> T celler per brønn. I tillegg, ble variable mengder av anergiske celler resulterende fra inkubasjon med TCR 76 blandet med 2 x 10<4> ikke-anergiske celler som et resultat fra inkubasjon med MAb 1 og en proliferasjonsanalyse ble utført. A/N: ratio av anergiske celler versus ikke-anergiske celler; 1= 2 x 104 celler. Proliferasjon ble målt ved <3>H-tymidininkorporering. Hver verdi representerer gjennomsnittstellinger per 5 min av triplikate kulturer +/- standard avvik.

EKSEMPLER

Materialer og metoder

Reagenser

Dyrkningsmedium : DM EM/HAM's F12 (Gibco kat nr. 32500) supplert med 2500 mg/l natriumbikarbonat, 2.3 mg/l 2-merkaptoetanol, 55 mg/l natriumpyrovat, 1,22 mg/l etanolamin, 360 mg/l L-glutamin, 4,5 x 10"<4> mg/l natriumselenit, 62,5 mg/l natriumpenicillin og 62,5 mg/l streptomycinsulfat. I fusjonseksperimentene, ble mediet ytterligere supplert med 13,61 mg/l hypoxantin og 3,83 mg/l tymidin. Dette medet er referert til som DM<E>M/HAM<*>s F12/HT. Seleksjon av hybridomer ble utført i DMEM/HAM's F12/HT supplert med 1% (v/v) av IL-6 inneholdene supernatant av en human blærekarsinomcellelinje T24 (T24CM) og 0,4 ^iM aminopterin. Fusjonsmedium: 280 mM inositol, 0,1 mM kalsiumacetat, 0,5 mM magnesiumacetat og 1 mM histidin; spesifikk resistanse 1,11'104Q cm. Ingrediensene ble løst i Milli-Q vann og deretter ble ledningsevnen justert til 90 uS/cm med Milli-Q vann eller en løsning inneholdene 1 mM kalsiumacetat og 5 mM magnesiumacetat.

Cellekulturer

T-celleklon H.243 ble avledet fra en pasient som led av reumatisk arteritt. Denne Th1-lignende T-celleklon gjenkjenner epitopen RSFTLASSETGVG (SEKV ID Nr: 1) fra human brusk gp-39 (Hc gp-39) i kontekst av DBR1 *0401 (tilhører MHC klasse II). TCRen av denne klonen er karakterisert som Va8 og VS9 positive. Cellene ble rutinemessig dyrket i DM EM/HAM's F12 supplert med 10% FCS, 20 U/ml IL-2, 5 U/ml IL-4 og periodevis restimulert med antigen og histokompatible antigen-presenterende celler (APC) eller med phytohemagglutinin (PHA) og materceller. For proliferasjonsanalysen ble kalvefoster serum (FCF) byttet med normalt humant serum

(NHS).

Fremstilling av T- cellelysat og ladning av kuler med TCR/ CD3 komplekser

Ti til fjorten dager etter restimulering, ble T-cellene vasket med PBS og oppløst ved inkubasjon (30 min, 0aC) av dem ved en konsentrasjon på 10<8> celler/ml i ekstraksjonsbuffer ifølge Oettgen et al (ref. 2) (10 mM trietanolamin, 150 mM NaCI, 1 mM Na2EDTA, 1% digitonin, 10 ug/ml leupeptin, 10 ug/nl aprotinin, 1 ug/ml pepstatin, 1 mM Pefabloc® AEBSF og 1,8 mg/ml jodacetamin pH 7,8). Den milde detergenten digitonin tillater ekstraksjon av intakte TCR/CD3 komplekser. Nukleære og cellulære nedbrytningsprodukter ble fjernet ved sentrifugering ved 16,000 g i 15 min. ved 4°C og supernatanten ble lagret i porsjoner ved -20°C inntil den ble brukt til seleksjon av B-celler eller immunopresipitering.

For seleksjon av spesifikke B-celler, ble paramagnetiske kuler dekket med TCR/CD3 komplekser.

Kort og godt, 100 |il sau anti-mus lg koblete paramagnetiske kuler (SAM-kuler; Dynabeads® 110,02) ble inkubert (over natten , 4°C) med 22 |ig anti-CD3, OKT3, i PBS med 0,1% BSA. Etter å ha vasket kulene med PBS/BSA, ble 1,4 x 10<8> celleekvivalenter av T-cellelysat og et likt volum (1,4 ml) PBS/BSA med 1% normalt museserum tilsatt. Den sistnevnte ble tilsatt for å forhindre binding av B-celler for å frigjøre SAM bindingsseter på kulene. Kulesuspensjonen ble inkubert i 2 til 4 timer ved 4°C og vasket med PBS/BSA før bruk.

Immunisering

Seks uker gamle hunkjønn BALB/C mus ble immunisert ved 3- til 7 ukers intervaller med enten 5 x 10<6> hele T-celler (oppfinnelse) eller paramagnetiske kuler dekket med TCR/CD3 komplekser av 5x 10<7> celle ekvivalenter (kontroll- eksperiment). Forskjellige administrasjonmåter ble brukt som indikert i tabell 1.1 tilfelle hvor adjuvans ble brukt (kontrolleksperiment), ble den første injeksjonen utført med fullstendig Freund^s adjuvans, etterfølgende injeksjon med ufullstendig Freund<*>s adjuvans og den siste innsprøytning uten adjuvans.

Dannelse av anti- klonotype MAb

Hunkjønn BALB/C mus, 6 uker gamle, ble injisert intraperitonalt 4 ganger med 3- til 7-ukers intervaller, hver gang med 5 x 10<6> hvilende T-celler i PBS. Fem dager etter den siste injeksjonen, ble musene avlivet og erytrocyttene og monocytt-uttynnet miltcellepopulasjoner ble fremstilt som beskrevet tidligere (ref. 23, 24). Dette resulterte i en cellefraksjon anriket med B-celler, men resulterte ikke i anriking av B-celler spesifikke for nevnte celleoverflate-antigen hva angår andre ikke-spesifikke B-celler ifølge trinn 2 av denne oppfinnelsen.

For å forhåndsklarere denne miltcellepopulasjonen for B-celler reaktive til humane CD3 eller det konstante område av TCRa(3, ble ca. 3 X 10<7> celler inkubert to ganger med 20 |xl SAM kuler dekket med TCR/CD3 komplekser av en irrelevant T-celleklon (Va3. V|314 positiv T-celleklon, SCRO.08A, men hvilken som helst annen irrelevant T-celle er tilstrekkelig). Deretter ble B-celler spesifikke for det variable område av TCRen selektert ved å inkubere den resulterende cellesuspensjonen med SAM kuler belagt med TCR/CD3 komplekser av T-celleklonen av interesse (H.243). Hver inkubasjon ble utført i 90 min. ved romtemperatur i DM EM/HAM's F12 supplert med 10% kalveserum (Hyclone®) og 0.2% normalt museserum. Under disse inkubasjonene, ble suspensjonen forsiktig homogenisert hvert 5 min. Etter siste inkubasjon, ble kulene forsiktig vasket fem ganger med DMEM/HAM<x>s F12,10% kalveserum og resuspendert i det samme medium.

Monoklonalt antistoff som produserer hybridomer ble dannet fra disse selekterte B-cellene ved klonal ekspansjon og mini-elektrofusjon som beskrevet tidligere (23). Kort fortalt, selekterte B-celler ble blandet med T-cellesupernatant (TSN) og 50,000 bestrålte (2500 rad) EL-4 B5-celler ved et sluttvolum på 200 |il DMEM/HAM<*> F12 supplert med 10% FCS i 96-brønners flatbunnet vevskultur- plater. På dag 8, ble supernatantene testet i en ett-trinns T-celleagglutineringsanalyse som beskrevet nedenfor ved å bruke enten den aktuelle T-celleklonen eller en irrelevant T-celleklon. B-cellekulturene som produserte diskriminerende MAb ble underlagt en mini-elektrofusjonsprosedyre. Innholdet av disse B-cellekulturene ble blandet med 10<6 >NS-1 myelomceller (25) og gitt tilbake serumfritt ved å vaske med DMEM/HAM<* >F12/HT. Deretter ble cellene behandlet med pronaseløsning i 3 min. og deretter vasket med fusjonsmedium. Elektrofusjon ble utført i en 50 jllI fusjonskammer ved et vekslende elektrisk felt på 30 s, 2 MHz, 400 V/cm etterfulgt av en firkant, høyfeltpuls på 10 us, 3 kV/cm og igjen et vekslende elektrisk felt på 30 s, 2 MHz, 400 V/cm. Til slutt ble innholdet av fusjonskammeret overført til 20 ml seleksjonsmedium og sådd ut på en 96-brønners mikrotiterplate. På dag 8 etter fusjonen, ble kulturene under-søkt for hybridomvekst og igjen sortert i en ett-trinns T-celleagglutineringsanalyse.

T- celleagglutineringsanalyse

Sortering av hybridomkulturer for anti-T-celle antistoffer og bestemmelse av kryssreaktivitet av MAb med andre T-celler ble utført i en ett-trinns agglutineringsanalyse. Ved å bruke halvareal mikrotiterplater ble 50 u.1 av hybridomsupernatant blandet med 20 (il kule/cellesuspensjon som inneholder 2 x 10<5> paramagnetiske kuler med kovalent bundet sau anti-mus lg og 5 x 10<4> T-celler av aktuelle DM EM/HAM's F12. Etter 2 til 3 timers inkubasjon ved 37°C, ble agglutineringen undersøkt under mikroskop ved å se etter aggregater av celler og kuler.

Immunopresipitering og Western blotting

Ti til fjorten dager etter restimulering, ble T-celler vasket og celleoverflate-proteiner ble merket med biotin. Kort sagt, ble T-cellene inkubert ved en konsentrasjon på 5 x 10<6> celler/ml med 0,5 mg/ml ImmunoPure® sulfo-NHS-biotin i PBS i 30 min. ved romtemperatur. Deretter, ble cellene igjen vasket og oppløst som beskrevet ovenfor. Før bruk i et immunopresipiteringseksperiment, ble cellelysatet forhåndsklarert en gang ved å inkubere med SAM-paramagnetiske kuler. Immuno-presipiteringen ble utført ved å inkubere 10<7> celleekvivalenter av forhåndsklarert lysat i 3 -4 timer med 15 jllI SAM-paramagnetiske kuler forhåndsladet med MAb (1 ml hybridomsupernatant). Deretter ble immunopresipitatet vasket tre ganger med PBS, kokt i prøvebuffer og overført til SDS-PAGE på en 10% gel enten under reduserende forhold eller ikke-reduserende forhold, ved å bruke fremgangsmåten til Laemmli (ref.

5) og Mini-protean II systemet (Biorad). Immunoblotting ble utført i samsvar med Towin et. al. (ref. 6) ved å bruke PVDF membraner. Ikke-spesifikke bindingsseter ble blokkert ved å inkubere membranene med 5% skummet melk i PBS supplert med 0,5% Tween 20. Etter vasking, ble blottene probet med streptavidinalkalisk fosfatase i PBS, 0,5% Tween 20,1% BSA, 1% normalt geiteserum i 1 time ved romtemperatur. Til slutt ble blottene fremkalt med BCIP og NBT som et kromogenisk substrat. For Western blot studiene ble paramagnetiske SAM-kuler ladet med TCR/CD3 komplekser som beskrevet ovenfor ved å bruke OKT3 som det immunopresipiterende antistoff og normalt T-cellelysat. Etter SDS-PAGE på en 10% PAA-gel under reduserende eller ikke-reduserende forhold, ble blottene inkubert med 2,5 ml hybridomsupernatant. Bundete antistoffer ble detektert ved å bruke alkaliskfosfatase-konjugerte geit anti-mus lg og BCIP/NBT som beskrevet ovenfor.

Antistoff mediert T- celleproliferasjon

Flatbunnet mikrotiter brønner ble dekket (over natten, romtemperatur) med 100 |il sau anti-mus lg ved 40 |ig/ml i PBS. Brønnene ble vasket en gang og deretter inkubert med 100 |xl MAb ved konsentrasjon på 2 |ig/ml i PBS i 2 timer. Overskudd av fritt MAb ble fjernet ved vasking, og 2,5 x 104 hvilende T-celler ble tilsatt i 200 DM EM/HAM's F12 supplert med 10% NHS. Etter to dagers inkubasjon ved 37°C, ble cellene pulsert med 0,5 \ iC'\ [<3>H]-tymidin og inkubert i ytterligere 16 til 18 timer. Til slutt ble cellene høstet ut på glassfiber filtre og [<3>H]-tymidininkorporering ble målt ved betatelling på en Matrix 96™ (Packard). Hver variabel ble testet i fire eksemplarer.

Antistoff mediert inhibering av antigen- indusert proliferasjon

Flatbunnet mikrotiter brønner ble inokulert med 20 uJ hybridomsupernatant, 2 x 10<4> hvilende T-celler og 1 x 10<5> histokompatible MNC i 150 ^l DMEM/HAM^s F12 supplert med 10% NHS. Etter 3 timer inkubasjon ved 37°C, ble 50 (il av peptid RSFTLASSETGVG (16 (ig/ml) tilsatt til kulturene. Kulturene ble inkubert i ytterligere to dager ved 37°C og [<3>H]-tymidininkorporering ble bestemt som beskrevet ovenfor. Hver variabel ble testet i fire eksemplarer.

Induksjon av anergi ved å bruke klono- spesifikt MAb

Firogtyve brønners dyrkningsplater ble dekket (over natten, romtemperatur) med 1 ml sau anti-mus lg ved 40 rø/ml i PBS. Brønnene ble vasket en gang og deretter inkubert med 1 ml MAb ved en konsentrasjon på 2 ug/ml i PBS i 2 timer. Overskudd av fritt MAb ble fjernet ved vasking og 2 x 10<6> vaskete, hvilende T celler ble tilsatt i 2 ml DMEM/HAIVTs F12,10% NHS. Når påkrevet ble cyclosporin A (Sandoz, Basel, Sveits), rlL-2, cykloheximid (Sigma, St Louis, Mo, USA) eller HLA-DRB1*0401 tilpasset APC (3000 rad bestrålt) tilsatt ved begynnelsen av dyrkningen. Etter en natts inkubasjon, ble platene avkjølt på is og T-cellene ble resuspendert ved pipitering. Cellene ble vasket en gang med komplett dyrkningsmedium og brukt til en T-celleproliferasjonsanalyse, cytokinanalyse og FACSanalyse som beskrevet nedenfor.

Den antigen-spesifikke proliferasjonsresponsen av T-celler ble bestemt i flatbunnet mikrobrønn kulturer inneholdende 2 x 10<4> T celler, 1 x 10<5> HLA-DRBI*0401 tilpasset, bestrålt (3000 rad) PBMC og variable antigen konsentrasjoner i 200 uJ DMEM/HAIvTs F12,10% NHS. Etter to dagers inkubasjon ved 37°C, ble cellene pulsert med 0,5 |xCi [<3>H]-tymidin og inkubert i ytterligere 16-18 timer. Til slutt, ble cellene høstet opp på glassfiberfiltere og [<3>H]-tymidininkorporering ble målt ved gasscintillasjon på en Matrix 96 (Packard, Meriden, CT, USA). Hver variabel ble testet i triplikater.

RESULTATER

Immuniseringer

Immuniseringene ved å bruke adjuvans (kontrolleksperiment) gav ikke noe serum som inneholdt antistoffer som var i stand til å skille mellom H.243 og irrelevante T-celler (tabell 1; Immun, gruppe II, III, og IV). Titret av serumet av gruppe V ble lavt (1:100 i agglutineringsanalysen), mens de i gruppe I og II ble mye høyere (1:1200).

Dannelse av anti- klonotype MAb

Ved å bruke miltceller fra gruppe I, inkubasjon med TCR/CD3 komplekser fra en irrelevant T-celleklon, her H.258, ladete paramagnetiske kuler resulterte i mange rosettceller, som indikerer en vellykket fjerning av mange CD3- og TCRot|3-reaktive B-celler. Når celler som ikke dannet rosett ble underlagt en andre forhåndsklarering med irrelevant TCR/CD3-komplekser fra den samme T-celle klon, var nesten ingen rosettene celler synlig.

Mikroskopisk undersøkelse etter inkubasjon med paramagnetiske kuler med den aktuelle T-celleklonen, resulterte ikke i synlig rosettformasjon. Gitt den forventete frekvens av spesifikke B-celler, er dette ikke overraskende. Etter begrenset fortynning og klonal ekspansjon 36 B-cellesupernatanter ble funnet å agglutinere H.243 og ikke den irrelevante T-celleklon H.258 (tabell II). Noen B-cellesupernatanter var i stand til å agglutinere begge klonene, som indikerer at de hadde unnsloppet forhåndsrensningsprosedyren.

Videre kan det bli utledet fra tabell II at hoveddelen av de spesifikke B-cellekulturene ikke er klonale fordi også B-cellene hadde vokset ut slik at de ikke reagerte med noen av T-cellene. Imidlertid, dette var ikke et problem fordi hybridomer fra disse ikke-spesifikke B-cellene kunne bli selektert ut etter mini-elektrofusjon. Atten av de spesifikke B-cellekulturene ble underlagt en mini-elektrofusjon. Noen fusjoner resulterte ikke i T-cellespesifikke hybridomer og noen andre kunne ikke bli klonet til stabile cellelinjer. Til sist ble stabile hybridomer oppnådd i 11 ut av 18 mini-elektrofusjoner. Disse 11 MAb ble videre karakterisert. Isotypene av disse MAb er vist i tabell III.

Spesifisitet av MAb

For ytterligere å undersøke spesifisiteten av MAb, ble immunopresipitering og T-celleagglutineringstester så vel som Western blot utført.

SDS/PAGE under ikke-reduserende og denatureringsforhold viste at alle MAb var i stand til å immunopresipitere et hovedbånd på omtrent 85 kD og et mindre bånd på 21 kD fra et digitoninlysat av T-cellklon H.243. Dette er i overensstemmelse med molekylvekten av TCRap-komplekset av CD3 kjedene henholdsvis e/5. Under reduserende forhold dissosierer 85 kD båndet i to bånd av 40 og 50 kD som er i overensstemmelse med molekylvekten av henholdsvis TCR a- og p-kjedene. Immunoblottet av et av anti-H.243 spesifikke Mab er vist i figur 1, sammen med OKT3 som en positiv kontroll og en irrelevant MAb som en negativ kontroll.

Tabell III viser kryssreaktivitet av det MAb med seks V(39 positive T-cellekloner, to Va8 positive T-cellekloner og åtte andre T-cellekloner med forskjellige Va og Vp"er. Antistoff TCR 74 burde bli betraktet som V|39 spesifikt fordi det aggutinerer alle de V(39 positive T-celler og ikke de andre. De andre TCR anti-stoffene reagerer bare med H.243 så det er veldig lite sannsynlig at disse anti-stoffene er rettet mot antigen-bindingsdelen av H.243 fordi reaksjon med Va8, Vp9, konstant område av TCRocp, CD3 og andre vanlige T-celleoverflatemolekyler er ekskludert. Figur 2 viser at antistoffer fra hybridomklonene TCR 64, TCR 66, TCR 69, TCR 70, TCR 73, og TCR 76 MAb er i stand til å farge TCRen på et ikke-reduserende Western blot (85 kD bånd). De ikke-spesifikke tunge båndene på toppen av figuren har beveget seg fra de immunopresipiterende antistoffene SAM og OKT3. Ingen farging med antiklonotyp MAb ble oppnådd i Western blot kjørt under reduserende forhold (resultater ikke vist), noe som tyder på at MAb gjenkjenner en strukturepitop dannet av det intakte TCRap* komplekset.

MAb indusert T- celleproliferasjon

For å undersøke hvorvidt MAb er i stand til å indusere proliferasjon av H. 243 T-celler, ble MAb immobilisert på flatbunnede mikrotiterplater og inkubert med T-celler. Til tross for at det er store forskjeller mellom MAb, viser figur 2 at alle kan indusere proliferasjon av H.243 celler. Proliferasjon lik anti-CD3 (OKT3) ble oppnådd med TCR 64, TCR 66, TCR 70, TCR 76 og TCR 79. Ingen proliferasjon ble oppnådd med TCR 44, som er en anti-klonotyp MAb for en annen TCR.

MAb mediert inhibisjon av antigen- indusert proliferasjon av T- celler

Det ble ytterligere undersøkt hvorvidt gruppen av MAb kunne inhibere antigen-dreven proliferasjon av H.243 T-celler. I dette eksperimentet, ble MAb preinkubert med T-celler og APC og tre timer senere pulsert med forskjellige konsentrasjoner av peptid. Figur 4 viser at TCR 64, TCR 70, TCR 76, TCR 78 og TCR 83 sterkt inhiberer antigen-dreven proliferasjon. Opp til 98% inhibering ble observert med TCR 83. Doseresponskurver viser at maksimal inhibering kunne bli oppnådd med så lite som 100 ng/ml TCR 64, TCR 70 og TCR 83. TCR 78 var omtrent ti ganger mindre potent. Inhiberingssmønsteret var ikke avhengig av hvorvidt suboptimale eller mettede konsentrasjoner av peptid ble tilsatt (resultater ikke vist). En anti-klonotyp MAb rettet mot en annen TCR (TCR 44) viste ingen inhibering.

Anti- klonotyp MAb induserer passivitet av humant T- celle klon H. 243 for påfølgende stimulering med antigen APC

T-cellereseptor tilegnelse i fraværet av kostimulering er kjent for å indusere anergi. Tidligere hadde vi funnet at immobiliserte anti-klonotype MAb til H.243 funksjonelt utløse kan TCRet av dette klonet. Derfor, var det interessant å undersøke hvorvidt de samme antistoffer kunne indusere anergi. I denne hensikt, ble 10 forskjellige anti-klonotype MAb immobilisert på 24-brønners plater og inkubert natten over med H.243 T-celler for å gi anergisk stimulans. Deretter ble T-cellene fjernet fra platene og det ble testet hvorvidt de kunne respondere på økende konsentrasjoner av HC gp-39<262>"<277> (SEKV ID NR: 3) presentert ved bestrålte, DRB*0401- tilpasset APC. Figur 5 viser at denne responsen ble helt opphevet ved 8 av 10 MAb mens H.243 celler inkubert med kontroll MAb 1 fortsatt responderte bra til peptid presentert ved APC. Responsen av T-celler inkubert med TCR 69 og TCR 83 ble signifikant redusert men ikke fullstendig opphevet ved høyere peptidkonsentrasjoner.

Anergiske celler undertrykker responsen av ikke- anergiske celler

Det ble også undersøkt hvorvidt anergiske H.243 celler var i stand til å undertrykke responsen av ikke-anergiske H.243 celler. Anergi ble indusert med TCR 76 og ikke-anergiske celler ble oppnådd fra inkubasjon med kontroll MAb 1. Deretter, ble proliferasjonsanalysene utført med peptid HC gp-39<261>'<275> (SEKV ID NR: 2) ved å bruke forskjellige T-cellepopulasjoner dvs. 2 x 104 anergiske T-celler per brønn, 2 x 10<4> ikke-anergiske T-celler per brønn eller blandinger av synkende konsentrasjoner av anergiske T-celler (4 x 104, 2 x 104 1 x 10<4> og 0,5 x 104) og 2 x 10<4> ikke-anergiske T-celler per brønn. Responsen av ikke-anergiske celler ble signifikant redusert på en doserelatert måte ved tilsetningen av anergiske celler (figur 6). Omtrent 90 % reduksjon av proliferasjon ble oppnådd ved en antigenkonsentrasjon på 1 ug/ml og en ratio anergiske celle versus ikke-anergiske celler på 2:1. Ved høyere antigenkonsentrasjoner ble mindre reduksjon av proliferasjon observert (72% ved 5 (ig/ml og 39% ved 25 ug/ml). Dermed viser dette eksemplet at det er mulig å danne anti-klonotype monoklonale antistoffer mot humane T-cellereseptorer. Dette eksperimentet resulterte i ti hybridomer, fire som var avsatt med ECACC (Salisbury, UK), som indikert i tabell III. Strategien krevet ikke stort antall av T-celler eller store mengder av renset TCR. Fremgangsmåten i følge oppfinnelsen er et attraktivt alternativ for kjedelige rekombinante prosedyrer hvor løslig TCR av TCR uttrykt på syngene museceller er dannet for å bli brukt i immuniseringsprosedyren. Dermed er også mulige problemer med strukturell stabilitet unngått. Således viste de monoklonale antistoffene forskjellige responser i en test for antistoffindusert T-celleproliferasjon og en test for antistoffmediert inhibering av antigendrevet T-celleproliferasjon (opp til 98% inhibisjon ble observert), dette antyder at forskjellige epitoper er gjenkjent på den samme klonotypiske strukturen.

Dersom de var kryss-bundne var anti-klonotype monoklonale antistoffer i stand til å indusere proliferasjon av H.243 T-celler.

Det er påvist at små mengder av immobilisert anti-klonotype MAb kan indusere anergi i det autoreaktive klonet. Etter anergistimulans, klarte ikke T-cellene å proliferere under restimulering som et resultat av en mangel på IL-2 gen-transkripsjon. I tillegg, ble en redusert IFNg produksjon funnet.

FACS-analyse av anergiske celler indikerte at anergi ikke ble et resultat av TCR nedmodulasjon eller fraværet av fritt TCR. I samkultureksperimentene, ble anergiske

T-celler funnet å undertrykke responsen av reaktive celler fra den samme klon. Denne "tilskuer"-undertrykkelsen ledet til 90% inhibering av proliferasjon. Materialet viste det anergiske potensialet av klonotypespesifikke antstoffer in vitro. Slike MAb kan bli brukt for induksjon og opprettholdelsen av antigen-spesifikk T-celle toleranse i reumatisk arteritt.

I serum av mus som er immunisert ved å injisere helst rene TCR/CD3 immunkomplekser er koplet til paramagnetiske kuler (tabell I; immuniseringsgruppe IV). Serumet av musene viste seg mer positiv for den spesifikke T-celle som ble brukt for immunisering enn en irrelevant T-celle. Men, det var ikke mulig å oppnå hybridomproduserende anti-klonotype monoklonal antistoffer. Selv i serum av mus immunisert med mengder av hele T-celler kunne ingen spesifisitet for T-cellen av interesse versus en irrelevant T-celle bli vist. Ifølge fremgangsmåten av oppfinnelsen ga hybridomer som var i stand til å produsere anti-klonotype monoklonale antistoffer.

Det går uten å si at antigenbindingsfragmenter kan bli laget av monoklonale antistoffer ifølge oppfinnelsen, for eksempel ved å bruke papain. Også de monoklonale antistoffene eller antigenbindingsfragmenter derav kan bli merket for å lette deteksjonen og rekkevidden av denne oppfinnelsen som omfatter alle disse formene.

Det går også uten å si at irrelevante celler brukt til å fjerne ikke-spesifikke B-celler, fortrinnsvis er så like som celleoverflateantigenbærende celler.

28 x 10<6> lymfocytter ble underlagt en immunokule-seleksjonsprosedyre for seleksjonen av anti-klonotype spesifikke B-celler.

De selekterte B-cellene ble utviklet ved forskjellig platekledninstettheter i en EL-4 B-celle dyrkningssystem og på dag 8, ble supernatantene testet for agglutineringsantistoffer med T-cellene av interesse (H. 243) og irrelevante T celler

(H. 258)

x: underdeterminert antall av selekterte celler

LITTERATUR

1. Moretta, A., et al. (1985) Selection and characterization of monoclonal antibodies to the idiotype-like structure of an interleukin-2-producing human

leukaemia T-cell line. Int. J. Cancer 36: p. 253-259.

2. Oetgen, H.C. et al. (1986) A T3 -like protein complex associated with antigen the receptor on murine T cells. Nature 320: p. 272-275. 3. Steenbakkers, P.G.A., et al (1994) Efficient generation of monoclonal antibodies from preselected antigen-specific B cells. Molecular Biology

Reports 19, p. 125-134.

4. Steenbakkers, P.G.A. et al (1992) A new approach to the generation of human and murine antibody producing hybridomas. J. Immunol. Methods 152, p.69-77. 5. Laemmli, U. K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of a bacteriophage T4. Nature 227: p. 680-685. 6. Towbin, H. et al. (1979) Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and some applications. Proe. Nati. Acad. Sei. USA 76: P. 4350-4354.

Forkortelser

PBS fosfatbufferet saltvann

BCIP 5-brom-4-klor-3-indoylfasfat p-toludin salt

NBT f-nitro blå tetrazoliumklorid

BSA okseserum albumin

FCS kalvefosterserum

SAM sau anti-mus

TSN T-cellesupernatant

MAb monoklonalt antistoff (antistoffer)

Produsenter

Biorad, Richmond, CA, USA.

Gibco, Paisley, Scotland

Hyclone, Logan, USA.

Packard, Meriden, CT, USA.

Claims

1. Fremgangsmåte for å fremstille et monoklonalt antistoff mot et celleoverflate antigen, som har en konstant del og en variabel del, hvor minst en del av nevnte variable del definerer en spesifisitetsbestemmende del av nevnte overflateantigen, som omfatter trinnene, karakterisert ved at: 1) å injisere et ikke-humant pattedyr med celleoverflate antigen-omfattende materiale, nevnte materiale er valgt fra gruppen som består av i) hele celler og ii) en membran-fraksjon oppnådd ved å behandle hele celler; 2) å isolere en B-celle-inneholdende cellefraksjon fra milt av nevnte pattedyr; 3) å anrike nevnte cellefraksjon oppnådd i trinn 2 i B-celler spesifikke for nevnte overflateantigen ved å sette cellefraksjonen i kontakt med bærer-bundet materiale av celler relatert til nevnte hele celler, nevnte bærer-bundet relaterte materiale av celler som mangler nevnte overflateantigen, og å separere B- .celler bundet til bærer-bundet materiale av relaterte celler fra den anrikete ubundete B-celle inneholdende cellefraksjon for bruk i neste trinn; 4) å kontakte cellefraksjonen med bærer-bundet celleoverflateantigen omfattende materiale valgt fra gruppe av j) hele celler jj) en membranfraksjon oppnådd fra nevnte hele celler og jjj) vesentlig renset celleoverflateantigen, og deretter å separere B-celler ikke bundet til nevnte bærer-bundet materiale fra B-celler bundet til nevnte bærer-bundet materiale; 5) å utsette B-celler bundet til nevnte bærer-bundne materiale oppnådd i det tidligere trinn for begrensende fortynning etterfulgt av klonal ekspansjon; 6) å selektere et B-celleklon og å udødliggjøre nevnte selekterte B-celleklon ved å bruke liten-skala fusjonsteknikk; og 7) å selektere og å klone et hybridom som er i stand til å produsere antistoffer som spesifikt binder nevnte celleoverflateantigen, etterfulgt av å isolere en monoklonalt antistoff-omfattende fraksjon fra supernatanten av nevnte hybridom.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at pattedyret injisert med overflateantigen er av en forskjellig art enn den pattedyrarten hvor overflateantigenet stammer fra.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at reseptormolekyl-omfattende materiale er brukt som overflateantigen-omfattende materiale.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 3, karakterisert ved at en T-celleklon er brukt for å lage reseptormolekyl-omfattende materiale.

5. Fremgangsmåte ifølge hvilken som helst av de forutgående kravene, karakterisert ved at membranfraksjonen i trinn 1 er oppnådd ved mekanisk behandling av hele celler. ,

6. Fremgangsmåte ifølge hvilken som helst av de forutgående kravene, karakterisert ved at celleoverflateantigen-omfattende materiale er injisert i pattedyret i fravær av en adjuvans.

7. Fremgangsmåte ifølge hvilken som helst av de forutgående kravene, karakterisert ved at paramagnetiske kuler er brukt som bæreren.

8. Fremgangsmåte ifølge hvilken som helst av de forutgående kravene, karakterisert ved at seleksjonen i minst et av trinnene 6 og 7 er utført ved å bruke en agglutineringsanalyse hvor supernatanten av B-celleklonen er i kontakt med en bærer dekket med antistoffer som er i stand til å binde antistoffer av artene av det injiserte pattedyr brukt i trinn 1 og hele celler som bærer celleoverflateantigenet, og agglutinering er påvist.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 8, karakterisert ved at hele celler relatert til nevnte hele celler men som mangler nevnte overflateantigen er brukt som en kontroll.

10. Fremgangsmåte ifølge hvilke som helst av de forutgående kravene, karakterisert ved at det selekterte B-celleklon i trinn 6 er blandet med myelomceller og gjort til gjenstand for mini-elektrofusjon.

11. Monoklonalt antistoff som har reaksjonsevne med klonotypiske strukturer av en T-cellereseptor, karakterisert ved at nevnte monoklonale antistoff er reaktivt med T-cellereseptoren av en HC gp-39 reaktiv T-celleklon.

12. Monoklonalt antistoff ifølge krav 11, karakterisert ved at T-celleklonen er ECACC aksesjonsnr. 96103122.

13. Monoklonalt antistoff ifølge krav 12, karakterisert ved at det er produsert ved et hybridom valgt fra gruppen bestående av ECACC aksesjonsnr. 96103118, ECACC aksesjonsnr. 96103119, ECACC aksesjonsnr. 96103120 og ECACC aksesjonsnr. 96103121.

14. Farmasøytisk blanding, karakterisert ved at den omfatter et monoklonalt antistoff i overensstemmelse med hvilken som helst av kravene 11 til 12 blandet med et passende hjelpestoff, passende for behandlingen av reumatisk artritt.