JPH0954090A - 新規検査方法 - Google Patents
新規検査方法Info
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- JPH0954090A JPH0954090A JP21070595A JP21070595A JPH0954090A JP H0954090 A JPH0954090 A JP H0954090A JP 21070595 A JP21070595 A JP 21070595A JP 21070595 A JP21070595 A JP 21070595A JP H0954090 A JPH0954090 A JP H0954090A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】本発明の目的は，単球／マクロファージの異常
蓄積や活性化につながる因子を測定することを特徴とす
る急性心筋梗塞、ＰＴＣＡ後の再灌流傷害や再狭窄の診
断に有用な検査方法を提供することにある。 【解決手段】ＭＣＡＦに対する特異抗体を使用して、免
疫測定法により単球／マクロファージの異常蓄積や活性
化につながる因子を測定することを特徴とする急性心筋
梗塞、ＰＴＣＡ後の再灌流障害や再狭窄の検査方法。
蓄積や活性化につながる因子を測定することを特徴とす
る急性心筋梗塞、ＰＴＣＡ後の再灌流傷害や再狭窄の診
断に有用な検査方法を提供することにある。 【解決手段】ＭＣＡＦに対する特異抗体を使用して、免
疫測定法により単球／マクロファージの異常蓄積や活性
化につながる因子を測定することを特徴とする急性心筋
梗塞、ＰＴＣＡ後の再灌流障害や再狭窄の検査方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、急性心筋梗塞、経
皮経管冠動脈形成術（percutaneous transluminal coro
nary angioplasty以下ＰＴＣＡと略す）施行後の再灌流
傷害や再狭窄の診断に有用な検査方法を提供する。詳し
くは、単球走化活性化因子（monocyte chemotactic and
activating factor,又はmonocyte chemoattractant p
rotein-1，以下ＭＣＡＦと略す）に対する特異抗体を用
いて、検体中のＭＣＡＦを測定することよりなる急性心
筋梗塞、ＰＴＣＡ施行後の再灌流傷害や再狭窄の検査方
法に関する。
皮経管冠動脈形成術（percutaneous transluminal coro
nary angioplasty以下ＰＴＣＡと略す）施行後の再灌流
傷害や再狭窄の診断に有用な検査方法を提供する。詳し
くは、単球走化活性化因子（monocyte chemotactic and
activating factor,又はmonocyte chemoattractant p
rotein-1，以下ＭＣＡＦと略す）に対する特異抗体を用
いて、検体中のＭＣＡＦを測定することよりなる急性心
筋梗塞、ＰＴＣＡ施行後の再灌流傷害や再狭窄の検査方
法に関する。
【０００２】
【従来の技術】近年、冠動脈内視鏡により冠動脈病変を
内腔側から観察が可能になったこと、また冠動脈超音波
法により冠動脈硬化病変の全体像が検出できるようにな
り、心筋梗塞の発症に冠動脈血栓が重要な役割を果たし
ていること、また冠動脈血栓は冠動脈硬化症の進展と関
連することが明らかになりつつある。冠動脈血栓の原因
となる冠動脈硬化症は、これまでの色々な研究成果か
ら、先ず初期にfatty streakと呼ばれる脂質を貪食した
マクロファージの集積からなる脂肪沈着が血管内膜下に
起こり、次いでマクロファージに加えて、平滑筋細胞の
増殖を伴い、繊維性プラーク（fibrous plaque）へと成
長していく過程が明らかになりつつある。さらに詳しく
説明すると、動脈硬化症の発症・進展機構は次のように
考えられている。
内腔側から観察が可能になったこと、また冠動脈超音波
法により冠動脈硬化病変の全体像が検出できるようにな
り、心筋梗塞の発症に冠動脈血栓が重要な役割を果たし
ていること、また冠動脈血栓は冠動脈硬化症の進展と関
連することが明らかになりつつある。冠動脈血栓の原因
となる冠動脈硬化症は、これまでの色々な研究成果か
ら、先ず初期にfatty streakと呼ばれる脂質を貪食した
マクロファージの集積からなる脂肪沈着が血管内膜下に
起こり、次いでマクロファージに加えて、平滑筋細胞の
増殖を伴い、繊維性プラーク（fibrous plaque）へと成
長していく過程が明らかになりつつある。さらに詳しく
説明すると、動脈硬化症の発症・進展機構は次のように
考えられている。
【０００３】動脈壁を構成する血管内皮細胞が種々の刺
激により傷害を受けると、傷害部位に単球やリンパ球が
接着、内皮下に浸潤し、種々の生理活性物質（増殖因
子、サイトカイン等）を産生すると共に、さらに単球は
活性化されてマクロファージに分化し、脂質を取り込み
泡抹細胞化し、fatty streakを形成する。また、傷害部
位には血小板も付着、活性化され、種々の生理活性物質
を産生する。これらの生理活性物質は平滑筋細胞の遊
走，増殖をもたらし繊維性プラークへの成長を促進する
と共に、相互に細胞を活性化しあうネットワークを形成
する。一方、冠動脈血栓は、この繊維性プラークが破綻
し、血小板凝集および血管壁における血栓形成を起こす
ためと考えられている。血栓による血管の閉塞が大きい
場合は、心筋梗塞または突然死、また非閉塞性の血栓で
は不安定狭心症を発症する原因となる。 現在、心筋梗
塞、特に急性心筋梗塞の内科的侵襲治療法として、ＰＴ
ＣＡが最も安全な治療法として広く普及し、わが国でも
年間３万数千例に対して実施されている。しかし、ＰＴ
ＣＡには、施行後３〜４ケ月頃から２０〜４０％の患者
に再狭窄を起こすという大きな問題があるが、未だ臨床
での再狭窄予防の有効な解決策は得られていない。その
病理組織上の特徴は著明な内膜肥厚であり、血管平滑筋
細胞の増殖と細胞外マトリックスの蓄積が主たる要因で
あると考えられている。
激により傷害を受けると、傷害部位に単球やリンパ球が
接着、内皮下に浸潤し、種々の生理活性物質（増殖因
子、サイトカイン等）を産生すると共に、さらに単球は
活性化されてマクロファージに分化し、脂質を取り込み
泡抹細胞化し、fatty streakを形成する。また、傷害部
位には血小板も付着、活性化され、種々の生理活性物質
を産生する。これらの生理活性物質は平滑筋細胞の遊
走，増殖をもたらし繊維性プラークへの成長を促進する
と共に、相互に細胞を活性化しあうネットワークを形成
する。一方、冠動脈血栓は、この繊維性プラークが破綻
し、血小板凝集および血管壁における血栓形成を起こす
ためと考えられている。血栓による血管の閉塞が大きい
場合は、心筋梗塞または突然死、また非閉塞性の血栓で
は不安定狭心症を発症する原因となる。 現在、心筋梗
塞、特に急性心筋梗塞の内科的侵襲治療法として、ＰＴ
ＣＡが最も安全な治療法として広く普及し、わが国でも
年間３万数千例に対して実施されている。しかし、ＰＴ
ＣＡには、施行後３〜４ケ月頃から２０〜４０％の患者
に再狭窄を起こすという大きな問題があるが、未だ臨床
での再狭窄予防の有効な解決策は得られていない。その
病理組織上の特徴は著明な内膜肥厚であり、血管平滑筋
細胞の増殖と細胞外マトリックスの蓄積が主たる要因で
あると考えられている。
【０００４】再狭窄の機序は複雑で未だ不明な点が多い
が、ＰＴＣＡ等の冠動脈形成術は冠動脈に大きな傷害を
与えるため（物理的な傷害および再灌流時に発生するス
ーパーオキサイドによる傷害）、傷害を受けた血管内皮
細胞により血小板やマクロファージ（動脈硬化巣部位に
多い）が活性化され、活性化に伴って分泌されるサイト
カインや増殖因子等の生理活性物質（ＰＤＧＦ，ＴＧＦ
β，ＴＮＦα，ＦＧＦ，ＥＧＦ，ＩＬ−１，ＩＬ−６
等）が平滑筋細胞の活性化，遊走，増殖をもたらし、内
膜肥厚へと進展し、再狭窄を起こすと考えられている。
が、ＰＴＣＡ等の冠動脈形成術は冠動脈に大きな傷害を
与えるため（物理的な傷害および再灌流時に発生するス
ーパーオキサイドによる傷害）、傷害を受けた血管内皮
細胞により血小板やマクロファージ（動脈硬化巣部位に
多い）が活性化され、活性化に伴って分泌されるサイト
カインや増殖因子等の生理活性物質（ＰＤＧＦ，ＴＧＦ
β，ＴＮＦα，ＦＧＦ，ＥＧＦ，ＩＬ−１，ＩＬ−６
等）が平滑筋細胞の活性化，遊走，増殖をもたらし、内
膜肥厚へと進展し、再狭窄を起こすと考えられている。
【０００５】現在、心筋梗塞診断の臨床化学検査法とし
ては、心筋細胞の壊死に伴い、組織から血中に遊出して
くる成分，クレアチンキナーゼ（ＣＫ），ＣＫアイソザ
イム（ＣＫ−ＭＭ，ＣＫ−ＭＢ，ＣＫ−ＢＢ），心筋ミ
オシン軽鎖，トロポニンＴ等を測定する検査法が採用さ
れている。また最近、急性心筋梗塞において血中に増加
するサイトカインとして、ＩＬ−１，ＴＮＦα（A.Mats
umori,T.Yamada,H.Suzuki,Y.Matoba & S.Sasayama; Br.
Heart J.,72,561-566(1994)) ，ＩＬ−６(Y.Miyao,H.Y
asue,H.Ogawa,I.Misumi,T.Masuda ,T.Sakamoto & E.Mor
ita; Am.HeartJ.,126,1299-1304(1993)), ＩＬ−８(Y.
Abe, M.Kawakami,M.Kuroki,T.Yamamoto,M.Fujii,H.Koba
yashi,T.Yaginuma,A.Kashii,M.Saito & K.Matsushima;
Br. Heart J.,70,132-134(1993)) が報告されている。
ては、心筋細胞の壊死に伴い、組織から血中に遊出して
くる成分，クレアチンキナーゼ（ＣＫ），ＣＫアイソザ
イム（ＣＫ−ＭＭ，ＣＫ−ＭＢ，ＣＫ−ＢＢ），心筋ミ
オシン軽鎖，トロポニンＴ等を測定する検査法が採用さ
れている。また最近、急性心筋梗塞において血中に増加
するサイトカインとして、ＩＬ−１，ＴＮＦα（A.Mats
umori,T.Yamada,H.Suzuki,Y.Matoba & S.Sasayama; Br.
Heart J.,72,561-566(1994)) ，ＩＬ−６(Y.Miyao,H.Y
asue,H.Ogawa,I.Misumi,T.Masuda ,T.Sakamoto & E.Mor
ita; Am.HeartJ.,126,1299-1304(1993)), ＩＬ−８(Y.
Abe, M.Kawakami,M.Kuroki,T.Yamamoto,M.Fujii,H.Koba
yashi,T.Yaginuma,A.Kashii,M.Saito & K.Matsushima;
Br. Heart J.,70,132-134(1993)) が報告されている。
【０００６】以上のように、現在、急性心筋梗塞の診断
に用いられる検査方法としては、冠動脈閉塞に伴う心筋
細胞の懐死により血中に増加する心筋組織由来の成分
（ＣＫ，ＣＫ−ＭＭ，ＣＫ−ＭＢ，ＣＫ−ＢＢ，心筋ミ
オシン軽鎖，トロポニンＴ等）を測定する方法、炎症反
応の初期に出現する蛋白質（ＣＲＰ，ＩＬ−１，ＴＮＦ
−α，ＩＬ−６等）を測定する方法、あるいは好中球走
化活性因子（ＩＬ−８）を測定する方法が知られている
が、心筋梗塞の発症に関係する動脈硬化巣部位の繊維性
プラークを構成する主たる細胞であり、またＰＴＣＡ施
行後の再灌流傷害や再狭窄に重要な働きをしていると思
われる単球／マクロファージの異常集積や活性化を測定
する方法はこれまで知られていない。
に用いられる検査方法としては、冠動脈閉塞に伴う心筋
細胞の懐死により血中に増加する心筋組織由来の成分
（ＣＫ，ＣＫ−ＭＭ，ＣＫ−ＭＢ，ＣＫ−ＢＢ，心筋ミ
オシン軽鎖，トロポニンＴ等）を測定する方法、炎症反
応の初期に出現する蛋白質（ＣＲＰ，ＩＬ−１，ＴＮＦ
−α，ＩＬ−６等）を測定する方法、あるいは好中球走
化活性因子（ＩＬ−８）を測定する方法が知られている
が、心筋梗塞の発症に関係する動脈硬化巣部位の繊維性
プラークを構成する主たる細胞であり、またＰＴＣＡ施
行後の再灌流傷害や再狭窄に重要な働きをしていると思
われる単球／マクロファージの異常集積や活性化を測定
する方法はこれまで知られていない。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、従来
の心筋梗塞の検査方法では有効なものがなかった単球／
マクロファージの異常集積や活性化につながる因子を測
定し、急性心筋梗塞、ＰＴＣＡ施行後の再灌流障害や再
狭窄の診断に有効な検査方法を提供するところにある。
の心筋梗塞の検査方法では有効なものがなかった単球／
マクロファージの異常集積や活性化につながる因子を測
定し、急性心筋梗塞、ＰＴＣＡ施行後の再灌流障害や再
狭窄の診断に有効な検査方法を提供するところにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】上記した本発明の課題を
解決するために、本発明者等は鋭意研究を重ねた結果、
単球走化性サイトカインの中で、血管内皮細胞，平滑筋
細胞，繊維芽細胞，単球／マクロファージ等により産生
され、単球／マクロファージの走化活性化因子としての
作用を持つＭＣＡＦを測定することにより、急性心筋梗
塞時の破綻した動脈硬化巣部位およびＰＴＣＡ施行後の
動脈壁傷害部位における単球／マクロファージの異常集
積や活性化につながる因子を測定できることが分り、本
発明を完成させるに至った。
解決するために、本発明者等は鋭意研究を重ねた結果、
単球走化性サイトカインの中で、血管内皮細胞，平滑筋
細胞，繊維芽細胞，単球／マクロファージ等により産生
され、単球／マクロファージの走化活性化因子としての
作用を持つＭＣＡＦを測定することにより、急性心筋梗
塞時の破綻した動脈硬化巣部位およびＰＴＣＡ施行後の
動脈壁傷害部位における単球／マクロファージの異常集
積や活性化につながる因子を測定できることが分り、本
発明を完成させるに至った。
【０００９】
【発明の実施の形態】ＭＣＡＦは、生体内では単球／マ
クロファージ，リンパ球などの血球系の細胞の他に、繊
維芽細胞，血管内皮細胞，平滑筋細胞，各種腫瘍細胞な
ど種々の細胞から、ＩＬ−１，ＴＮＦ，ＬＰＳなどの刺
激により産生されることが報告されている。この他、血
管内皮細胞や平滑筋細胞は、酸化ＬＤＬ刺激によりＭＣ
ＡＦを産生することが報告されており、動脈硬化との関
連が示唆されている。また、活性化血小板，血管内皮細
胞，マクロファージ，平滑筋細胞等により産生されるＰ
ＤＧＦ（Platelet derived growth factor：血小板由来
増殖因子）は平滑筋細胞の遊走および増殖活性を示すと
共に、繊維芽細胞からのＭＣＡＦ産生も誘導することか
ら、心筋梗塞発症時の循環血流中からの単球の動脈壁傷
害部位への異常集積や活性化にも作用していると考えら
れる。さらに、ＰＤＧＦは平滑筋細胞からのＭＣＡＦ産
生を誘導することが報告されている。以上のように、Ｍ
ＣＡＦは種々の刺激により、冠動脈壁を構成する血管内
皮細胞および平滑筋細胞、また心筋組織を構成する繊維
芽細胞により産生されると共に、冠動脈の傷害時に動員
される単球／マクロファージによっても産生されるの
で、患者検体中のＭＣＡＦを測定することにより、急性
心筋梗塞の診断、ＰＴＣＡ後の再灌流傷害や再狭窄の診
断に有効な検査法を提供できると考えられる。一方、Ｉ
Ｌ−８は産生細胞や産生刺激の大部分がＭＣＡＦと共通
し、急性心筋梗塞において一過性に増加するという報告
（前記 Y.Abe 等の報告）もあるが、繊維芽細胞をＰＤ
ＧＦで刺激してもＩＬ−８は産生されないことが知られ
ており、この点がＭＣＡＦとは異なっている。
クロファージ，リンパ球などの血球系の細胞の他に、繊
維芽細胞，血管内皮細胞，平滑筋細胞，各種腫瘍細胞な
ど種々の細胞から、ＩＬ−１，ＴＮＦ，ＬＰＳなどの刺
激により産生されることが報告されている。この他、血
管内皮細胞や平滑筋細胞は、酸化ＬＤＬ刺激によりＭＣ
ＡＦを産生することが報告されており、動脈硬化との関
連が示唆されている。また、活性化血小板，血管内皮細
胞，マクロファージ，平滑筋細胞等により産生されるＰ
ＤＧＦ（Platelet derived growth factor：血小板由来
増殖因子）は平滑筋細胞の遊走および増殖活性を示すと
共に、繊維芽細胞からのＭＣＡＦ産生も誘導することか
ら、心筋梗塞発症時の循環血流中からの単球の動脈壁傷
害部位への異常集積や活性化にも作用していると考えら
れる。さらに、ＰＤＧＦは平滑筋細胞からのＭＣＡＦ産
生を誘導することが報告されている。以上のように、Ｍ
ＣＡＦは種々の刺激により、冠動脈壁を構成する血管内
皮細胞および平滑筋細胞、また心筋組織を構成する繊維
芽細胞により産生されると共に、冠動脈の傷害時に動員
される単球／マクロファージによっても産生されるの
で、患者検体中のＭＣＡＦを測定することにより、急性
心筋梗塞の診断、ＰＴＣＡ後の再灌流傷害や再狭窄の診
断に有効な検査法を提供できると考えられる。一方、Ｉ
Ｌ−８は産生細胞や産生刺激の大部分がＭＣＡＦと共通
し、急性心筋梗塞において一過性に増加するという報告
（前記 Y.Abe 等の報告）もあるが、繊維芽細胞をＰＤ
ＧＦで刺激してもＩＬ−８は産生されないことが知られ
ており、この点がＭＣＡＦとは異なっている。
【００１０】本発明に用いる抗体は、哺乳動物をＭＣＡ
Ｆで免疫して得られる抗血清から精製されるポリクロー
ナル抗体およびＭＣＡＦで免疫された哺乳動物から取り
出した抗体産生細胞をミエローマ細胞と融合して得られ
るハイブリドーマから産生されるモノクローナル抗体の
いずれもが使用できる。中でも特異性の高いモノクロー
ナル抗体が好ましく用いられる。ＭＣＡＦに対するモノ
クローナル抗体は、常法に従って作製することができ
る。すなわち、マウスなど適当な動物をＭＣＡＦで免疫
したのち、脾細胞をミエローマ細胞と融合して得られた
ハイブリドーマの中からＭＣＡＦと特異的に結合する抗
体を産生するクローンを酵素免疫測定法などの手法を用
いて選択する。高感度な測定系を確立するためには、こ
の段階でできるだけ抗原との親和性の高い抗体を選ぶこ
とが重要である。
Ｆで免疫して得られる抗血清から精製されるポリクロー
ナル抗体およびＭＣＡＦで免疫された哺乳動物から取り
出した抗体産生細胞をミエローマ細胞と融合して得られ
るハイブリドーマから産生されるモノクローナル抗体の
いずれもが使用できる。中でも特異性の高いモノクロー
ナル抗体が好ましく用いられる。ＭＣＡＦに対するモノ
クローナル抗体は、常法に従って作製することができ
る。すなわち、マウスなど適当な動物をＭＣＡＦで免疫
したのち、脾細胞をミエローマ細胞と融合して得られた
ハイブリドーマの中からＭＣＡＦと特異的に結合する抗
体を産生するクローンを酵素免疫測定法などの手法を用
いて選択する。高感度な測定系を確立するためには、こ
の段階でできるだけ抗原との親和性の高い抗体を選ぶこ
とが重要である。
【００１１】次に、得られたハイブリドーマを培養し、
その培養上清又はハイブリドーマを適当な動物に接種し
て得られる腹水を材料として、モノクローナル抗体を精
製することができる。
その培養上清又はハイブリドーマを適当な動物に接種し
て得られる腹水を材料として、モノクローナル抗体を精
製することができる。
【００１２】上述の手法により得られるモノクローナル
抗体の中でも特開平６−２０５６９０に示されるＭＥ１
２０，ＭＩ４４６の２種が好ましく用いられる。なお、
ＭＥ１２０を産生するハイブリドーマは微工研菌寄第１
３２９３号として、またＭＩ４４６を産生するハイブリ
ドーマは微工研菌寄第１３２９４号として微生物工業技
術研究所に寄託されている。さらに、これら抗体を各種
修飾し用いることもできる。
抗体の中でも特開平６−２０５６９０に示されるＭＥ１
２０，ＭＩ４４６の２種が好ましく用いられる。なお、
ＭＥ１２０を産生するハイブリドーマは微工研菌寄第１
３２９３号として、またＭＩ４４６を産生するハイブリ
ドーマは微工研菌寄第１３２９４号として微生物工業技
術研究所に寄託されている。さらに、これら抗体を各種
修飾し用いることもできる。
【００１３】以下に本発明の具体的な方法を説明する。
【００１４】（１）抗ＭＣＡＦ抗体、望ましくはモノク
ローナル抗体を担体に物理吸着等により固定化する。抗
体を固定化する担体としては、マイクロプレート、マイ
クロビーズ、磁性マイクロビーズ等が使用される。
ローナル抗体を担体に物理吸着等により固定化する。抗
体を固定化する担体としては、マイクロプレート、マイ
クロビーズ、磁性マイクロビーズ等が使用される。
【００１５】（２）ＭＣＡＦを測定しようとする試料と
（１）の抗体固定化担体とを反応させる。
（１）の抗体固定化担体とを反応させる。
【００１６】（３）未反応の反応液を分離する。
【００１７】（４）次いで、（１）に使用した抗体とは
抗原認識部位の異なる第２抗体を用いて標識された、望
ましくは酵素標識（西洋ワサビパーオキシダーゼ，アル
カリ性フォスファターゼ，β−ガラクトシダーゼ等）さ
れた標識抗体を加え、反応させる。
抗原認識部位の異なる第２抗体を用いて標識された、望
ましくは酵素標識（西洋ワサビパーオキシダーゼ，アル
カリ性フォスファターゼ，β−ガラクトシダーゼ等）さ
れた標識抗体を加え、反応させる。
【００１８】（５）未反応の標識抗体を分離する。
【００１９】（６）酵素標識抗体の場合、酵素基質を加
え、反応後の酵素反応生成物を測定し、予め既知濃度の
標準ＭＣＡＦで作成した検量線から、試料中のＭＣＡＦ
濃度を測定する。標識物が放射性同位元素の場合は、放
射活性を測定する。
え、反応後の酵素反応生成物を測定し、予め既知濃度の
標準ＭＣＡＦで作成した検量線から、試料中のＭＣＡＦ
濃度を測定する。標識物が放射性同位元素の場合は、放
射活性を測定する。
【００２０】本発明で用いられる検体は特に限定される
ものではないが、例えば血液、血清、血漿が挙げられ
る。
ものではないが、例えば血液、血清、血漿が挙げられ
る。
【００２１】本発明者等は、このようにして作製した酵
素免疫測定試薬を用いて、急性心筋梗塞、拡張型心筋症
および肥大型心筋症の患者検体を測定した。その結果、
急性心筋梗塞患者でＰＴＣＡ施行後１０時間後から増加
し、以後約４日間高値に維持されること、ＰＴＣＡを施
行しなかった患者検体では発症後約２日間高値に維持さ
れることが分かった。一方、拡張型心筋症および肥大型
心筋症の患者ではＭＣＡＦの増加は全く認められなかっ
た。このように急性心筋梗塞発症後に、血中のＭＣＡＦ
が増加し、比較的長期に維持されることは、血流からの
心筋傷害部位への単球／マクロファージの異常集積・活
性化を反映していると考えられ、又発症後にＰＴＣＡを
施行された患者で、施行後約１０時間後から血中ＭＣＡ
Ｆの増加が認められたことは、血管傷害部位への単球／
マクロファージの異常集積・活性化を反映し、再灌流傷
害や再狭窄の原因となると考えられる。
素免疫測定試薬を用いて、急性心筋梗塞、拡張型心筋症
および肥大型心筋症の患者検体を測定した。その結果、
急性心筋梗塞患者でＰＴＣＡ施行後１０時間後から増加
し、以後約４日間高値に維持されること、ＰＴＣＡを施
行しなかった患者検体では発症後約２日間高値に維持さ
れることが分かった。一方、拡張型心筋症および肥大型
心筋症の患者ではＭＣＡＦの増加は全く認められなかっ
た。このように急性心筋梗塞発症後に、血中のＭＣＡＦ
が増加し、比較的長期に維持されることは、血流からの
心筋傷害部位への単球／マクロファージの異常集積・活
性化を反映していると考えられ、又発症後にＰＴＣＡを
施行された患者で、施行後約１０時間後から血中ＭＣＡ
Ｆの増加が認められたことは、血管傷害部位への単球／
マクロファージの異常集積・活性化を反映し、再灌流傷
害や再狭窄の原因となると考えられる。
【００２２】従って、血中ＭＣＡＦの測定は急性心筋梗
塞の診断および急性心筋梗塞の治療として行われるＰＴ
ＣＡ後の再灌流傷害や再狭窄の治療・予防に有効な検査
法を提供できると考えられる。
塞の診断および急性心筋梗塞の治療として行われるＰＴ
ＣＡ後の再灌流傷害や再狭窄の治療・予防に有効な検査
法を提供できると考えられる。
【００２３】一方、本発明者等は同一の患者検体を用い
て、ＩＬ−８を測定したが、前記Y.Abe 等の報告と同様
に、一過性の増加は認められたが、ＭＣＡＦと異なり血
中からの消失が早いことが分かった。
て、ＩＬ−８を測定したが、前記Y.Abe 等の報告と同様
に、一過性の増加は認められたが、ＭＣＡＦと異なり血
中からの消失が早いことが分かった。
【００２４】
【実施例】以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に
説明する。もちろん、これによって本発明が制限される
ものではない。
説明する。もちろん、これによって本発明が制限される
ものではない。
【００２５】［実施例１］酵素免疫測定試薬の作製 （１）抗体固定化マイクロプレートの作製 ９６穴マイクロプレート（ヌンク社製）の各ウエルに
０．５μｇ／ｍｌの特開平６−２０５６９０号公報に記
載の抗ＭＣＡＦモノクローナル抗体（ＭＥ１２０抗体：
東レ株式会社製）ＰＢＳ溶液１００μｌを入れ、４℃で
一晩固相化を行った。０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液でブ
ロッキング後、各ウェルを洗浄液（０．０５％Ｔｗｅｅ
ｎ２０を含むＰＢＳ）で洗浄した。
０．５μｇ／ｍｌの特開平６−２０５６９０号公報に記
載の抗ＭＣＡＦモノクローナル抗体（ＭＥ１２０抗体：
東レ株式会社製）ＰＢＳ溶液１００μｌを入れ、４℃で
一晩固相化を行った。０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液でブ
ロッキング後、各ウェルを洗浄液（０．０５％Ｔｗｅｅ
ｎ２０を含むＰＢＳ）で洗浄した。
【００２６】（２）ＨＲＰ標識抗体の作製 １ｍｇ／ｍｌの特開平６−２０５６９０号公報記載の抗
ＭＣＡＦモノクローナル抗体（ＭＩ４４６抗体：東レ株
式会社製）の０．１Ｍクエン酸ナトリウム（pH3.5)溶液
に対して、同じ溶液に溶解した１ｍｇ／ｍｌのペプシン
（シグマ社製）を１／１００容量加え、３７℃で１時間
反応させ、Ｆ（ａｂ´）2 フラグメントとした。生成し
たＦ（ａｂ´）2 フラグメントの西洋ワサビパーオキシ
ダーゼ（ＨＲＰ）標識は、マレイミド・ヒンジ法を用い
て常法に従って行った。反応後の標識抗体の精製は、ヒ
ドロキシアパタイトカラムＨＰＬＣを用いて行った。
ＭＣＡＦモノクローナル抗体（ＭＩ４４６抗体：東レ株
式会社製）の０．１Ｍクエン酸ナトリウム（pH3.5)溶液
に対して、同じ溶液に溶解した１ｍｇ／ｍｌのペプシン
（シグマ社製）を１／１００容量加え、３７℃で１時間
反応させ、Ｆ（ａｂ´）2 フラグメントとした。生成し
たＦ（ａｂ´）2 フラグメントの西洋ワサビパーオキシ
ダーゼ（ＨＲＰ）標識は、マレイミド・ヒンジ法を用い
て常法に従って行った。反応後の標識抗体の精製は、ヒ
ドロキシアパタイトカラムＨＰＬＣを用いて行った。
【００２７】（３）抗原ＭＣＡＦの標準品の作製 ヒト正常繊維芽細胞をポリＩ：Ｃ刺激して得た培養上清
より、シリカクロマトグラフィー、ヘパリンカラムクロ
マトグラフィーおよび逆相ＨＰＬＣの手法で均一に精製
した。なお、ＭＣＡＦは、Ｏ型糖鎖構造の違いにより、
ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分子量９ｋＤおよび１３ｋＤの位置
に泳動される２種の主要な分子種が存在するが、本発明
で使用した標品は、それぞれの分子種を約２：１で含む
混合物であった。
より、シリカクロマトグラフィー、ヘパリンカラムクロ
マトグラフィーおよび逆相ＨＰＬＣの手法で均一に精製
した。なお、ＭＣＡＦは、Ｏ型糖鎖構造の違いにより、
ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分子量９ｋＤおよび１３ｋＤの位置
に泳動される２種の主要な分子種が存在するが、本発明
で使用した標品は、それぞれの分子種を約２：１で含む
混合物であった。
【００２８】［実施例２］酵素免疫測定試薬によるＭＣ
ＡＦ測定法 実施例１で得られた抗体固定化マイクロプレートの各ウ
エルに反応緩衝液（０．２５％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗ
ｅｅｎ２０および４０μｇ／ｍｌ正常マウスＩｇＧを含
む０．１Ｍトリス塩酸緩衝液ｐＨ８．０）１００μｌお
よび検体２０μｌを入れ、２５℃で１時間反応を行っ
た。各ウェルを洗浄後、０．５μｇ／ｍｌの上記ＨＲＰ
標識抗体溶液（０．２５％ＢＳＡ，０．０５％Ｔｗｅｅ
ｎ２０を含むＰＢＳ溶液で希釈）１００μｌを入れ、２
５℃で３０分間反応を行い、さらに各ウェルを洗浄後、
基質液（０．００６％過酸化水素および０．２ｍｇ／ｍ
ｌ３，３´，５，５´−テトラメチルベンジジン（ＴＭ
Ｂ）を含む０．１Ｍ酢酸クエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ
４．５）１００μｌを分注して、２５℃で３０分間発色
反応を行った。なお、反応中は常時マイクロプレート振
盪器を用いてプレートの振盪を行った。最後に１００μ
ｌの１Ｎ硫酸を入れて反応を停止し、４５０ｎｍ（対照
波長５９５ｎｍ）の吸光度を測定した。
ＡＦ測定法 実施例１で得られた抗体固定化マイクロプレートの各ウ
エルに反応緩衝液（０．２５％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗ
ｅｅｎ２０および４０μｇ／ｍｌ正常マウスＩｇＧを含
む０．１Ｍトリス塩酸緩衝液ｐＨ８．０）１００μｌお
よび検体２０μｌを入れ、２５℃で１時間反応を行っ
た。各ウェルを洗浄後、０．５μｇ／ｍｌの上記ＨＲＰ
標識抗体溶液（０．２５％ＢＳＡ，０．０５％Ｔｗｅｅ
ｎ２０を含むＰＢＳ溶液で希釈）１００μｌを入れ、２
５℃で３０分間反応を行い、さらに各ウェルを洗浄後、
基質液（０．００６％過酸化水素および０．２ｍｇ／ｍ
ｌ３，３´，５，５´−テトラメチルベンジジン（ＴＭ
Ｂ）を含む０．１Ｍ酢酸クエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ
４．５）１００μｌを分注して、２５℃で３０分間発色
反応を行った。なお、反応中は常時マイクロプレート振
盪器を用いてプレートの振盪を行った。最後に１００μ
ｌの１Ｎ硫酸を入れて反応を停止し、４５０ｎｍ（対照
波長５９５ｎｍ）の吸光度を測定した。
【００２９】［実施例３］患者検体のＭＣＡＦ濃度測定 急性心筋梗塞にてＣＣＵ（集中治療室）に入院した患者
を対象に発症後３時間毎に採血し、その血液を検体とし
て用い、実施例２記載の方法により血中ＭＣＡＦを測定
した。
を対象に発症後３時間毎に採血し、その血液を検体とし
て用い、実施例２記載の方法により血中ＭＣＡＦを測定
した。
【００３０】図１に急性心筋梗塞患者のＰＴＣＡ非施行
群（６例）、図２にＰＴＣＡ施行群（９例）の血中ＭＣ
ＡＦ濃度を示す。これから、急性心筋梗塞発症後または
ＰＴＣＡ施行約１０時間後から顕著にＭＣＡＦが増加
し、長期にわたって正常値（８０±３５ｐｇ／ｍｌ）よ
り高値に維持されることが分かる。
群（６例）、図２にＰＴＣＡ施行群（９例）の血中ＭＣ
ＡＦ濃度を示す。これから、急性心筋梗塞発症後または
ＰＴＣＡ施行約１０時間後から顕著にＭＣＡＦが増加
し、長期にわたって正常値（８０±３５ｐｇ／ｍｌ）よ
り高値に維持されることが分かる。
【００３１】一方、同一患者の血中ＩＬ−８濃度を測定
した結果を図３および図４に示すが、これから、急性心
筋梗塞発症又はＰＴＣＡ施行後に血中ＩＬ−８の一過性
の増加は認められるが、高値に維持されることはなく、
正常値（６．３ｐｇ／ｍｌ以下：検出限界）付近まで低
下することが分かる。
した結果を図３および図４に示すが、これから、急性心
筋梗塞発症又はＰＴＣＡ施行後に血中ＩＬ−８の一過性
の増加は認められるが、高値に維持されることはなく、
正常値（６．３ｐｇ／ｍｌ以下：検出限界）付近まで低
下することが分かる。
【００３２】又、拡張型心筋症患者（２１例）および肥
大型心筋症患者（２１例）の血中ＭＣＡＦ濃度および血
中ＩＬ−８濃度を測定した。拡張型心筋症ではＭＣＡ
Ｆ：６３±１６ｐｇ／ｍｌ，ＩＬ−８：６．３ｐｇ／ｍ
ｌ以下、肥大型心筋症ではＭＣＡＦ：６７±１４ｐｇ／
ｍｌ，ＩＬ−８：６．３ｐｇ／ｍｌ以下であり、いずれ
も正常値レベルであり、顕著な増加は認められなかっ
た。
大型心筋症患者（２１例）の血中ＭＣＡＦ濃度および血
中ＩＬ−８濃度を測定した。拡張型心筋症ではＭＣＡ
Ｆ：６３±１６ｐｇ／ｍｌ，ＩＬ−８：６．３ｐｇ／ｍ
ｌ以下、肥大型心筋症ではＭＣＡＦ：６７±１４ｐｇ／
ｍｌ，ＩＬ−８：６．３ｐｇ／ｍｌ以下であり、いずれ
も正常値レベルであり、顕著な増加は認められなかっ
た。
【００３３】
【発明の効果】本発明により初めて、これまでの急性心
筋梗塞の検査方法では有効なものがなかった単球／マク
ロファージの異常集積や活性化につながる因子を測定す
ることが可能になり、急性心筋梗塞、ＰＴＣＡ後の再灌
流傷害や再狭窄の診断に有用な検査方法を提供すること
ができるようになった。
筋梗塞の検査方法では有効なものがなかった単球／マク
ロファージの異常集積や活性化につながる因子を測定す
ることが可能になり、急性心筋梗塞、ＰＴＣＡ後の再灌
流傷害や再狭窄の診断に有用な検査方法を提供すること
ができるようになった。
【図面の簡単な説明】
【図１】急性心筋梗塞患者のＰＴＣＡ非施行群（６例）
の血中ＭＣＡＦ濃度を示す。
の血中ＭＣＡＦ濃度を示す。
【図２】急性心筋梗塞患者のＰＴＣＡ施行群（９例）の
血中ＭＣＡＦ濃度を示す。
血中ＭＣＡＦ濃度を示す。
【図３】急性心筋梗塞患者のＰＴＣＡ非施行群（６例）
の血中ＩＬ−８濃度を示す。
の血中ＩＬ−８濃度を示す。
【図４】急性心筋梗塞患者のＰＴＣＡ施行群（９例）の
血中ＩＬ−８濃度を示す。
血中ＩＬ−８濃度を示す。
Claims (6)
- 【請求項１】検体中の単球走化活性化因子を測定するこ
とによる急性心筋梗塞の検査方法。 - 【請求項２】単球走化活性化因子に対する特異抗体を用
いることを特徴とする請求項１記載の検査方法。 - 【請求項３】単球走化活性化因子に対する特異抗体がモ
ノクローナル抗体であることを特徴する請求項２記載の
検査方法。 - 【請求項４】単球走化活性化因子に対する特異抗体とし
てクローンＭＥ１２０およびクローンＭＩ４４６を用い
ることを特徴とする請求項２または３記載の検査方法。 - 【請求項５】測定方法が酵素標識を用いる酵素免疫測定
である請求項１〜４記載の検査方法。 - 【請求項６】経皮経管冠動脈形成術施行後の再灌流障害
もしくは再狭窄を診断することを特徴とする請求項１〜
５記載の検査方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP21070595A JPH0954090A (ja) | 1995-08-18 | 1995-08-18 | 新規検査方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP21070595A JPH0954090A (ja) | 1995-08-18 | 1995-08-18 | 新規検査方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0954090A true JPH0954090A (ja) | 1997-02-25 |
Family
ID=16593743
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP21070595A Pending JPH0954090A (ja) | 1995-08-18 | 1995-08-18 | 新規検査方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0954090A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109374901A (zh) * | 2018-09-30 | 2019-02-22 | 山东大学深圳研究院 | 一种心肌梗死预后风险指数检测装置及心肌梗死预后预警模型的建立方法 |
-
1995
- 1995-08-18 JP JP21070595A patent/JPH0954090A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109374901A (zh) * | 2018-09-30 | 2019-02-22 | 山东大学深圳研究院 | 一种心肌梗死预后风险指数检测装置及心肌梗死预后预警模型的建立方法 |
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