JPH11264818A - 血栓症の検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 本発明は血栓症の検出手段を提供する。 【解決手段】 ヒトの肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）を免疫
原として得られヒトＨＧＦに特異反応性を有するモノク
ローナル抗体を用いて、血液中のＨＧＦを免疫測定法に
より測定して、血栓症を検出する血栓症の検出方法及び
上記モノクローナル抗体を必須成分として含有する血栓
症診断剤。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ヒト肝細胞増殖因
子に対するモノクローナル抗体を免疫測定法に利用して
血栓症を検出する方法及び該方法に利用される血栓症診
断剤に関する。

【０００２】

【従来の技術】血栓症とは、血液の性状変化、血流のう
っ滞、血管壁の変化等により、心臓又は血管内で血液が
凝固し、血流が止まり、その血管等で養われている部分
に生じる病変をいう。その原因は動脈硬化であることが
多く脳血栓症や心筋梗塞がその極めて重要な疾患であ
る。

【０００３】しかして、上記血栓症の最も代表的な一つ
である心筋梗塞につき詳述すれば、そのうち、急性心筋
梗塞は、その基本的病変として、冠状動脈の比較的近位
部に粥状硬化が生じている部分において粥腫が崩壊し、
その内容物が血管内に一部流出し、内膜面が不安定状態
になり、そこに続発的に血栓が形成され、本来あった狭
窄と相まって比較的容易に内腔閉塞が生じるものと考え
られている。また、上記血栓ができれば、そこにＴＸＡ
₂（トロンボキサンＡ₂）が形成され、それがまた血小板
凝集を惹起し、一方、冠状動脈の攣縮（スパスム）を生
じさせることが知られており、この悪循環が上記心筋梗
塞や狭心症の基本的な病態をなすとも考えられている。

【０００４】急性心筋梗塞がＣＣＵにて治療されるよう
になり、心電図モニターや心肺蘇生術の導入、抗不整脈
薬や心臓ペースメーカーの応用等が急性期死亡率の減少
に大きく貢献した。また、近年急性期死亡の大部分を占
める急性心不全、あるいはショック症候群に対しても、
より効果的な治療法開発のための努力がなされている。

【０００５】心筋梗塞に伴う急性心不全に対してより合
理的且つ有効な治療を行い、虚血の進展を予防しつつ心
機能の維持、改善を図るには、まず個々の梗塞例におけ
る血行力学的障害の程度を正しく把握することが必要で
あり、また心筋障害の推移をモニターしつつ、変遷する
障害の程度に応じて適切な治療法を選択する慎重さが要
求される。

【０００６】最近まで、心筋梗塞剖検症例での冠動脈血
栓頻度が２１％から９７％と研究者により著しい差が見
られる故に、両者の因果関係について議論が絶えなかっ
た。それは、当然のごとく検索対象及び方法上に差があ
ることは勿論のこと、臨床的な意味での心筋梗塞と剖検
上形態学的に確認されたそれとのギャップ、更に病理学
的にも種々の梗塞型があること等が絡み合っての結果で
あると推考される。

【０００７】しかしながら、最近になって、急性心筋梗
塞に対する積極的な臨床的診断法・治療法の開発により
この議論には終止符が打たれようとしている。即ち、ド
ウッド（DeWood）らによると、発症後２４時間以内の５
１７例の貫壁性心筋梗塞例での冠動脈造影等による臨床
的検索で、冠動脈血栓が７３％に認められ、６時間以内
例では８０％、６〜１２時間例では５９％、１２〜２４
時間例では５４％であり、冠動脈血栓溶解療法の広い応
用の妥当性をも含めて、心筋梗塞発症因子としての冠動
脈血栓の重要性が改めて認識されている。

【０００８】急性心筋梗塞の発症に伴って、壊死心筋よ
り血中に流出する物質、特に心筋逸脱酵素をとらえて生
化学的診断を行うという試みは、心筋梗塞時に血清中の
ＧＯＴ（glutamic oxaloacetic transaminase）、ＬＤ
Ｈ（lactic deydrogenase）等が上昇することを、１９
５４年にカーメン（karmen）らが初めて報告したことに
始まる。その後、ＨＢＤ（α-hydroxybutyrate dehydro
genase）、ＣＰＫ（creatine phosphokinase、国際呼
称：creatine kinase, CK）等の酵素の上昇が知られる
ようになり、臨床診断に広く応用されている。

【０００９】しかしながら、診断確度の向上と重症度の
推定のためには、更に改善が求められ、ＣＰＫアイソザ
イムであるＣＰＫ−ＭＢや構造蛋白であるミオシン軽鎖
等の測定が行われるようになってきている。

【００１０】ＧＯＴは心臓と肝臓に最も多く含まれてい
る酵素であり、更に、骨格筋、腎、膵臓等にも存在す
る。ＧＯＴの上昇は心筋梗塞の診断には欠かせないが、
肝疾患との鑑別が問題となることがある。最高値は１２
〜３０時間後に出現し、３〜５日間上昇する。しかしＧ
ＯＴは肝炎、肝鬱血、外科手術でも上昇することから、
之を指標とする心筋梗塞診断の特異性は低い。

【００１１】ＬＤＨは腎、心臓に最も多く含まれている
が、骨格筋、赤血球、膵、脾、肝、脳、肺にも広く分布
するため、ＧＯＴと同様に他疾患との鑑別が必要であ
る。ＬＤＨはＧＯＴと同様に９０％以上の症例で上昇す
るが、肝臓、骨格筋、赤血球にも多く含まれるため、同
様に特異性が低い。

【００１２】ＨＢＤはＬＤＨアイソザイムの内、α−hy
droxybutyrateに親和性の高い分画で、ＬＤＨ₁、ＬＤＨ
₂とほぼ同様の酵素であり、心筋に対する特異性が高
い。ＨＢＤ／ＬＤＨ比が０．８１以上の時は心筋梗塞の
可能性が高いといわれている。

【００１３】ＣＫは骨格筋に最も多く、次に心臓、脳、
腸管、胃の順に多く含まれているが、肝、腎、血液には
殆ど含まれていないことより、之を指標とする検査は、
心筋梗塞の診断に最も特異的な検査法と考えられ、梗塞
サイズの推定も可能である。該ＣＫは心筋梗塞の診断以
外で、筋肉注射、電気ショック、外科手術、心原性ショ
ック等で上昇をきたし問題となるが、之等の場合、ＣＫ
のアイソザイムであるＣＫ−ＭＢを測定することによ
り、鑑別可能である。

【００１４】上記ＣＫのアイソザイムには、ＭＭ、Ｂ
Ｂ、ＭＢの３つが知られていて、ＭＭは骨格筋、ＢＢは
脳、ＭＢは心筋にそれぞれ特異的である。心筋には、１
０〜４０％のＣＫ−ＭＢが含まれ、残りがＣＫ−ＭＭで
あるが、骨格筋のＣＫ−ＭＢの含量は３％以下である。
ＣＫの上昇が見られる場合、成人では、総ＣＫ値に対し
てＣＫ−ＭＢが５％以上あれば心筋由来と考えてよいと
いわれている。

【００１５】しかしながら、該ＣＫの値は、測定法と測
定用の分析器によって大きく異なり、同一サンプルを測
定しても、施設間の測定値の差はときに４倍程度にもな
ることが知られており、それ故、異なる施設で測定され
た値を比較することはできない欠点がある。

【００１６】上記のように心筋梗塞を始めとする血栓症
を簡便に、より確実に検出する方法は、いまだなく、か
かる検出法の確立が斯界で要望されている。

【００１７】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は上記斯界で要望されている血栓症の検出法を確立する
ことにある。

【００１８】本発明者らは、上記目的より鋭意研究を重
ねた結果、ヒトの肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）を免疫原と
して得られヒトＨＧＦに特異反応性を有するモノクロー
ナル抗体を利用して、例えば患者血清中のＨＧＦを測定
するときには、測定値がよく血栓症を反映することを見
いだし、ここに本発明を完成するに至った。

【００１９】

【課題を解決するための手段】即ち、本発明によれば、
ヒトＨＧＦを免疫原として得られヒトＨＧＦに特異反応
性を有するモノクローナル抗体を用いて、血液中のＨＧ
Ｆを免疫測定法により測定して、血栓症を検出すること
を特徴とする血栓症の検出方法、及びヒトＨＧＦを免疫
原として得られヒトＨＧＦに特異反応性を有するモノク
ローナル抗体を必須成分として含有することを特徴とす
る血栓症診断剤が提供される。

【００２０】本発明は、心筋梗塞や脳血栓で代表される
血栓症患者の検出、特に早期診断を初めて可能としたも
のであり、その臨床的価値は非常に高い。

【００２１】

【発明の実施の形態】以下、本発明に利用するモノクロ
ーナル抗体及び該抗体の利用による免疫測定法につき順
次詳述する。

【００２２】本発明に利用する抗体は、ヒトＨＧＦを免
疫原として得られ、ヒトＨＧＦに特異反応性を有するモ
ノクローナル抗体より適宜選択することができる。ここ
で免疫抗原として利用されるヒトＨＧＦは、ヒト由来の
天然のＨＧＦである必要はなく、遺伝子工学的手法によ
り得られる組み換え型ＨＧＦやそれらの部分構造を有す
る同効物（断片）であってもよい。また上記ＨＧＦやそ
の断片をハプテンとして利用して、通常の免疫抗原の製
造技術に従って之等を結合試薬により担体と結合させて
得られるものも利用することができる。之等は適当なヒ
ト細胞等より別途単離、調製してもよく、また公知のも
のを適宜入手、利用することもできる。

【００２３】之等を免疫抗原として利用した所望モノク
ローナル抗体の製造は、より具体的には、例えば上記免
疫抗原で免疫した哺乳動物の形質細胞（免疫細胞）と哺
乳動物の形質細胞腫細胞（ミエローマ細胞）との融合細
胞（ハイブリドーマ、hybridoma)を作成し、これより所
望のＨＧＦを認識する抗体（モノクローナル抗体）を産
生するクローンを選択し、該クローンを培養することに
より実施できる。かかるモノクローナル抗体の製造は、
基本的には常法に従うことができる〔例えばHanfland,
P., Chem.Phys.Lipids, 15, 105 (1975) : Hanfland,
P., Chem.Phys.Lipids, 10, 201 (1976) : Koscielak,
J., Eur.J.Biochem., 37, 214 (1978)等参照〕。

【００２４】該方法において、免疫抗原で免疫される哺
乳動物としては、特に制限はないが細胞融合に使用され
る形質細胞腫細胞との適合性を考慮すれば、一般には、
マウス、ラット等が有利に用いられる。免疫は一般的方
法により、例えば上記免疫抗原を哺乳動物に静脈内、皮
内、皮下、腹腔内注射等により投与することにより実施
できる。より具体的には、例えばマウスの場合、免疫抗
原を生理食塩水含有リン酸緩衝液（ＰＢＳ）や生理食塩
水等で適当濃度に希釈し、所望により通常のアジュバン
トと併用して、供試動物に２〜１４日毎に数回投与し、
総投与量が約１００〜５００μｇ／マウス程度になるよ
うにするのが好ましい。上記アジュバントとしては、百
日咳ワクチン、完全フロインドアジュバント、アラム等
を好ましく利用できる。また免疫抗原としては、上記最
終投与の約３日後に摘出した脾細胞を使用するのが好ま
しい。

【００２５】上記免疫細胞と融合される他方の親細胞と
しての哺乳動物の形質細胞腫細胞としては、既に公知の
種々のもの、例えばｐ３／×６３−Ａｇ８（Ｘ６３）
〔Nature, 256, 495-497 (1975) 〕、ｐ３／Ｘ６３−Ａ
ｇ８．Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）〔Current Topics in Microbio
logy and Imunology, 81, 1-7 (1978)〕、Ｐ３／ＮＳＩ
−１−Ａｇ４−１（ＮＳ−１）〔Eur. J．Immunol., 6,
511-519 (1976) 〕、Ｓｐ２／０−Ａｇ１４（Ｓｐ２／
０）〔Nature, 276, 269-270 (1978) 〕、ＦＯ〔J. Imm
unol. Meth., 35, 1-21 (1980) 〕等や、ラットにおけ
る２１０．ＲＣＹ３．Ａｇ１．２．３．（Ｙ３）〔Natu
re，277, 131-133 (1979) 〕等の骨髄腫細胞等を使用で
きる。

【００２６】上記免疫細胞と形質細胞腫細胞との融合反
応は、公知の方法、例えばマイルスタイン（Milstein）
らの方法〔Method in Enzymology, 73, 3 (1981)〕等に
準じて行なうことができる。より具体的には、上記融合
反応は、通常の融合促進剤、例えばポリエチレングリコ
ール（ＰＥＧ）、センダイウイルス（ＨＶＪ）等の存在
下に、通常の培地中で実施され、培地には更に融合効率
を高めるためにジメチルスルホキシド等の補助剤を必要
に応じて添加することもできる。また、電気処理（電気
融合）による方法等を適宜採用することもできる。免疫
細胞と形質細胞腫細胞との使用比は、通常の方法と変り
はなく、例えば形質細胞腫細胞に対して免疫細胞を約１
〜１０倍程度用いるのが普通である。融合反応時の培地
としては、上記形質細胞腫細胞の増殖に通常使用される
各種のもの、例えばＲＰＭＩ−１６４０培地、ＭＥＭ培
地、その他のこの種細胞培養に一般に利用されるものを
例示でき、通常之等培地は牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血
清補液を抜いておくのがよい。融合は上記免疫細胞と形
質細胞腫細胞との所定量を、上記培地内でよく混合し、
予め３７℃程度に加温したＰＥＧ溶液、例えば平均分子
量１０００〜６０００程度のものを、通常培地に約３０
〜６０Ｗ／Ｖ％の濃度で加えて混ぜ合せることにより行
なわれる。以後、適当な培地を逐次添加して遠心分離
し、上清を除去する操作を繰返すことにより所望のハイ
ブリドーマが形成される。

【００２７】得られる所望のハイブリドーマの分離は、
通常の選別用培地、例えばＨＡＴ培地（ヒポキサンチ
ン、アミノプテリン及びチミジンを含む培地）で培養す
ることにより行なわれる。該ＨＡＴ培地での培養は、目
的とするハイブリドーマ以外の細胞（未融合細胞等）が
死滅するのに充分な時間、通常数日〜数週間行なえばよ
い。かくして得られるハイブリドーマは、通常の限界希
釈法により目的とする抗体の検索及び単一クローン化に
供される。

【００２８】目的抗体産生株の検索は、例えばＥＬＩＳ
Ａ法〔Engvall,E., Meth.Enzymol.,70, 419-439 (198
0)〕、プラーク法、スポット法、凝集反応法、オクタロ
ニー（uchterlony ）法、ラジオイムノアッセイ（ＲＩ
Ａ）法等の一般に抗体の検出に用いられている種々の方
法〔「ハイブリドーマ法とモノクローナル抗体」、株式
会社Ｒ＆Ｄプラニング発行、第30-53 頁、昭和５７年３
月５日〕に従い実施することができ、この検索には前記
免疫抗原が利用できる。

【００２９】かくして得られるＨＧＦを認識する所望の
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、通常
の培地で継代培養することができ、また液体窒素中で長
期間保存することができる。上記ハイブリドーマからの
モノクローナル抗体の採取は、該ハイブリドーマを常法
に従って培養してその培養上清として得る方法やハイブ
リドーマをこれと適合性のある哺乳動物に投与して増殖
させ、その腹水として得る方法等が採用される。前者の
方法は、高純度の抗体を得るのに適しており、後者の方
法は、抗体の大量生産に適している。

【００３０】上記方法に従い得られる抗体産生ハイブリ
ドーマ培養上清やマウス腹水は、之等をそのまま粗製抗
体液として用いることができ、また之等は常法に従っ
て、硫酸アンミモニウム分画、塩析、ゲル濾過法、イオ
ン交換クロマトグラフィー、プロテインＡカラムクロマ
トグラフィー等のアフィニテイクロマトグラフィー等に
より精製して、精製抗体とすることができる。特に好ま
しい、上記モノクローナル抗体の一具体例としては、例
えば特公平５−６０３５９号公報記載のものを例示する
ことができる。

【００３１】次いで、本発明の血栓症検出のための免疫
測定法につき詳述すれば、これは、例えば通常の酵素免
疫検定法としてのサンドイッチ法等に従うことができ、
また通常の競合法、サンドイッチ法等によるＲＩＡ法、
ＥＬＩＳＡ法、凝集法等に従うこともできる。之等各方
法の操作、手順等は常法に従うことができる。

【００３２】殊に本発明方法は、ＨＧＦモノクローナル
抗体を用いた３ステップサンドイッチ法によるのが、高
感度であり好ましい。この方法は、例えば代表的には以
下の如くして実施される。即ち、９６ウェルプレート等
の適当な担体に固相化させたＨＧＦモノクローナル抗体
を第１抗体として用い、これとＨＧＦ標準溶液及び測定
物質（実験サンプル等の検体）とを、室温にて一夜静置
反応させ〔第１ステップ〕、次いで、第２抗体としての
抗ＨＧＦ家兎血清（家兎抗ＨＧＦポリクローナル抗体）
を上記プレートに加え、室温で２時間程度反応させるこ
とにより、該第２抗体と第１ステップでの反応物（モノ
クローナル抗体と被測定物質との反応物）とを反応させ
〔第２ステップ〕、更に酵素標識抗家兎ＩｇＧ抗体等の
標識抗体の一定量を、上記第２ステップでの反応物（モ
ノクローナル抗体と被測定物質と第２抗体との反応複合
体）と室温にて２時間程度反応させ〔第３ステップ〕、
次いで上記第３ステップで得られた反応複合体と標識抗
体との結合体から非結合標識抗体を分離除去した後、発
色溶液を加えて発色反応させ、２Ｎ硫酸にて発色反応を
停止させ、得られる発色反応液の吸光度を測定すること
により実施される。かくして検体中のＨＧＦを定量する
ことができる。

【００３３】上記において、用いる各抗体の固相化（不
溶化）は、常法に従い之等の抗体を不溶性担体に物理的
又は化学的に結合させることにより実施できる。上記不
溶化のための担体としては、例えばポリスチレン、セフ
ァデックス、イオン交換樹脂、プラスチックチューブ、
アミノ共重合体等を使用でき、不溶化は共有結合法とし
てのジアゾ法、ペプチド法、アルキル化法、架橋試薬に
よる担体結合法、Ｕｇｉ反応による担体結合法等の化学
反応、或はイオン交換樹脂のような担体を用いるイオン
結合法、ガラスビーズ等の多孔性ガラスを担体として用
いる物理的吸着法等によって行なうことができる。

【００３４】上記ポリクローナル抗体としては、ＨＧＦ
を認識するものである限り、特に限定はなく、前記した
本発明抗体もしくは該抗体の製造において開示した免疫
抗原を哺乳動物に投与して生体内に産生される抗血清を
利用でき、これは常法に従い採取できる。

【００３５】また、上記において標識に用いられる標識
抗体としては、公知のものでよく、例えば既に市販のマ
ウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ウ
マ、ウシ等の動物に免疫して得られる抗血清を、パーオ
キシダーゼ（ＰＯＤ）、アルカリホスファターゼ、β−
Ｄ−ガラクトシダーゼ、酸性ホスファターゼ等で酵素で
標識した抗イムノグロブリン抗体、即ち、ＰＯＤ標識抗
家兎ＩｇＧ抗体、ＰＯＤ標識抗マウスＩｇＧ抗体等を使
用することができる。この酵素標識は、常法に従って実
施できる。

【００３６】本発明検出法において、検体としては、例
えば血清もしくは血漿形態の血液が好ましいが、他に細
胞組織液、リンパ液、胸腺水、腹水、羊水、胃液、尿、
膵臓液、骨髄液、唾液等の各種体液を用いることもでき
る。また、上記血漿は、クエン酸血漿、ＥＤＴＡ血漿、
メシル酸ナフアモスタット血漿等であってもよい。

【００３７】上記測定系に利用される溶媒としては、反
応に悪影響を与えない通常の各種のものをいずれも利用
でき、例えばクエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、トリス塩
酸緩衝液、酢酸緩衝液等のｐＨが約５．０〜９．０程度
の緩衝液の利用が好ましい。尚、本発明においては、上
記溶媒に、約０．１〜３０ｗ／ｖ％程度の血清（測定対
象のＨＧＦが含まれていないもの）及び／又は約０．１
〜２Ｍ程度のＮａＣｌを含ませるのが、上記検定法の目
的により合致していて好ましい。

【００３８】免疫検定の際の免疫反応条件は、特に制限
はなく、通常のこの種測定法と同様のものとすることが
できる。一般には約４５℃以下、好ましくは約４〜４０
℃程度の温度条件下に、約１〜８０時間程度を要して免
疫反応を行なえばよい。

【００３９】本発明検出法では、免疫反応終了後の固相
−液相（前記３ステップサンドイッチでの反応複合体と
標識抗体との結合体−非結合標識抗体）の分離を、例え
ば遠心分離、濾別、デカンテーション、洗浄等の通常の
方法により行なうことができる。

【００４０】またかくして分離された各物質の酵素標識
活性の測定は、使用した酵素の種類に応じて、公知の各
種方法に従い実施することができる。その際用いられる
発色溶液としては、通常のもの、例えばパーオキシダー
ゼを用いる場合には、ｏ−フェニレンジアミン（ＯＰ
Ｄ）等を用いることができ、発色反応の停止も常法に従
い例えば反応液に１〜４Ｎの硫酸等の適当な酵素活性阻
害剤を添加することにより実施できる。

【００４１】かくして、本発明方法によれば、検体中の
ＨＧＦを高精度、高感度をもって、しかも簡便な操作で
定量でき、これによって血栓症を検出することができ
る。

【００４２】即ち、健常人のＨＧＦ値は平均０．１９±
０．０５ｎｇ／ｍｌであり、男女間での有意差は認めら
れず、劇症肝炎での平均値は１０．１７±２４．７７ｎ
ｇ／ｍｌであり、劇症肝炎「亜急性型」と類似の病態を
呈する亜急性肝炎での平均値は２．７１±２．５２ｎｇ
／ｍｌであり、更に急性肝炎（０．４０±０．１６ｎｇ
／ｍｌ）、慢性肝炎（０．３５±０．１６ｎｇ／ｍ
ｌ）、肝硬変（０．６０±０．３５ｎｇ／ｍｌ）、肝ガ
ン（０．５６±０．３６ｎｇ／ｍｌ）等は低値を示すの
に対して、本発明方法に従い測定された心筋梗塞患者の
結果によれば、該患者では１６．３９±１６．０５ｎｇ
／ｍｌと高値を示し、しかもこの値は約１５時間持続
し、２日後でもなお１．９１±１．７２ｎｇ／ｍｌであ
った。また、本発明方法によれば、上記心筋梗塞患者に
限らず、各種血栓症患者でも、略同様の高値を示した。

【００４３】これらのことから、本発明方法によれば、
血栓症患者の検出が行い得ることは勿論のこと、心筋梗
塞患者において、発作後時間の経過した症例の場合も容
易にその診断が可能であり、各種血栓症の診断、予後の
経過の観察をも行い得る利点のあることが明らかとなっ
た。

【００４４】本発明はまた上記免疫測定に適した血栓症
診断剤をも提供する。

【００４５】該診断剤は、ＨＧＦモノクローナル抗体を
必須の試薬成分として含有し、他に例えば前記３ステッ
プ法を例にとれば、標識抗体や第２抗体を含有すること
ができる。該診断剤中のモノクローナル抗体試薬中に
は、例えばグリセロールや牛血清蛋白等の安定化剤及び
／又は保存剤を添加存在させることもできる。この抗体
試薬は、好ましくは凍結乾燥したものであるのがよく、
診断剤中には水溶性もしくは水と混和し得る溶媒を含有
させることもできる。更に抗体試薬には再構成された試
薬系を一定のｐＨに保つための緩衝液や試料が悪化する
のを防止するための保存剤及び／又は安定剤を配合する
ことができる。緩衝液としては本測定法を実施する際に
ｐＨを約５．０〜９．０とするものを用いるのが好まし
い。また再構成剤は、好ましくは水を含んだものである
が、該水の一部又は全部を水と混和し得る溶媒で置き換
えることもできる。この水と混和し得る溶媒としては、
よく知られている例えばグリセリン、アルコール類、グ
リコールエーテル類等を例示できる。

【００４６】

【発明の効果】本発明によれば、心筋梗塞や脳血栓等の
血栓症の診断、検出、特に早期診断の可能な診断剤及び
検出法が提供される。

【００４７】

【実施例】以下、実施例を挙げて本発明を更に詳述する
が、本発明は之等に限定されるものではない。

【００４８】

【実施例１】 心筋梗塞患者の検出 ３０分以上続く胸痛、心電図上２つの誘導異常でのＳＴ
の０．１ｍＶ以上の上昇及び血清中のＣＰＫの上昇をも
とに心筋梗塞と判断された患者９名について、胸痛発症
後、３、９、１５、２４及び４８時間後にそれぞれ採血
し、得られた血清中のＨＧＦを次の通り測定した。

【００４９】即ち、９６ウェルの抗体プレートの各ウェ
ルに、洗浄液３５０μｌを加えて３回洗浄し、ペーパー
タオルの上に載せて充分に水分を取り除いた。次に各ウ
ェルにリン酸緩衝液５０μｌを加え、更にＨＧＦ標準液
又は上記検体５０μｌをそれぞれ加え、シールで密封し
た後、シェーカーで振盪しながら室温（２５℃）で１時
間反応させた。反応後、反応液を吸引除去し、洗浄液で
５回洗浄した。洗浄後、第１抗体（抗ＨＧＦモノクロー
ナル抗体）を１００μｌずつ各ウェルに加え、シールで
密閉した後、シェーカーで振盪しながら室温（２５℃）
で１時間反応させた。反応後、反応液を吸引除去し、洗
浄液で５回洗浄した。次に、第２抗体液（抗ＨＧＦポリ
クローナル抗体、ウサギ）を１００μｌずつ各ウェルに
加え、シールで密閉した後、シェーカーで振盪しながら
室温（２５℃）で１時間反応させた。反応液を吸引除去
し、洗浄液で５回洗浄した。洗浄後、各ウェルにＯＰＤ
基質液を１００μｌずつ加えて、室温（２５℃）で１０
分間反応させた。この反応液に反応停止液１００μｌを
加えて反応を停止させ、マイクロプレート用吸光度計を
用いて波長４９２ｎｍで各ウェルの吸光度を測定した。

【００５０】上記の結果を下記表１に示す。

【００５１】

【表１】

【００５２】該表より、本発明ＨＧＦモノクローナル抗
体を利用したＥＬＩＳＡ系によって、心筋梗塞患者の検
出を行い得ることが明らかである。

【００５３】

【実施例２】雄ラット（２５０〜３００ｇ）をペントバ
ルビタールナトリウムで麻酔させ、開胸後、左冠動脈走
行部を結紮し、１時間の虚血の後に再灌流して心筋梗塞
を惹起させ、結紮後１時間、再灌流後１，３，６，１２
及び２４時間後に、血漿を採取し、特殊免疫研究所社製
のラットＨＧＦ ＥＩＡキットにより、ＨＧＦの測定を
行なった。

【００５４】結果（ｎ＝３の平均±ＳＥ）を、下記表２
に示す。

【００５５】

【表２】

【００５６】尚、表２には、結紮、再灌流を行わなかっ
たコントロールの同測定値を併記する。

【００５７】表２より、ラット心筋梗塞モデルにおける
血漿ＨＧＦ量は、再灌流３時間後という非常に早期にお
いて、その最大値を示し、この測定によって、心筋梗塞
の検出、早期診断を行い得ることが明らかとなった。

【００５８】

【実施例３】この試験には、ラット頚動脈内皮細胞を剥
離し狭窄を加えることで血栓を形成させた血栓モデル
（ＳＩＡＴモデル）を使用した〔Circulation Researc
h, Vol.77, No.2, August 1995, pp.310-316〕。 上記施術前（Ｐｒｅ）、施術（内皮細胞剥離＋狭窄処
置）１５分後、６０分後及び１２０分後に、各ラット
（１群４〜５匹）の血漿ＨＧＦ量を、特殊免疫研究所社
製のラットＨＧＦ ＥＩＡ測定キットにより、測定し
た。

【００５９】また、各ラットにつき、頚動脈１３ｍｍ当
りの処置血管重量（Ｌ）及び無処置血管重量（Ｒ）をそ
れぞれ求め、下式に従って血栓重量（ｎ＝５の平均±Ｓ
Ｅ）を算出した。

【００６０】 血栓重量（ｍｇ／１３ｍｍ，平均±ＳＥ）＝〔Ｌ−Ｒ〕 かくして得られた結果を、下記表３に示す。

【００６１】

【表３】

【００６２】表３より、血栓症モデルラットの血漿ＨＧ
Ｆ量と血栓重量とは、よく相関しており、従って、血漿
ＨＧＦ量の測定によって、血栓症の検出、診断が可能で
あることが判る。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】ヒトの肝細胞増殖因子を免疫原として得ら
   れヒト肝細胞増殖因子に特異反応性を有するモノクロー
   ナル抗体を用いて、血液中の肝細胞増殖因子を免疫測定
   法により測定して、血栓症を検出することを特徴とする
   血栓症の検出方法。
2. 【請求項２】血栓症が脳血栓症である請求項１に記載の
   検出方法。
3. 【請求項３】ヒトの肝細胞増殖因子を免疫原として得ら
   れヒト肝細胞増殖因子に特異反応性を有するモノクロー
   ナル抗体を必須成分として含有することを特徴とする血
   栓症診断剤。
4. 【請求項４】血栓症が脳血栓症である請求項３に記載の
   診断剤。