JPH09507244A - ペプチドまたはたんぱく質を有する低分子量ヒアルロン酸 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明はヒアルロン酸の分子量を好ましくは５００００ないし２０００００Ｄａの間にし、少なくとも１つのペプチドまたはたんぱく質を含有する低分子量ヒアルロン酸またはその塩の凍結乾燥した柔軟で、撓み易くかつ連続するマトリクスに関する。本発明はまた少なくとも１つのペプチドまたはたんぱく質を含有する凍結乾燥した低分子量ヒアルロン酸を特徴とする層の形状の薬剤組成物に関する。薬物は好ましくはＧＨ，ＩＧＦ−Ｉ，ＩＧＦ−ＩＩおよび／またはＥＧＦの少なくとも１つから選ばれかつ抗生物質と混合され得る。このマトリクスの製造方法および傷治療用薬物の製造のために薬剤組成物を使用する方法にも関するものである。本発明は層を形成するために低分子量ヒアルロン酸およびペプチドまたはたんぱく質からなる水溶液を凍結乾燥することを特徴とする局部的に投与可能な薬物の予め定めた投与量を正確に得る方法を開示している。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の名称 ペプチドまたはたんぱく質を有する低分子量ヒアルロン酸 技術分野 本発明は、薬剤組成物として有用な、少なくとも１つのペプチドまたはたんぱ く質を含有する低分子量ヒアルロン酸またはその塩の凍結乾燥した柔軟な、可撓 性のあるかつ連続するマトリクスに関する。 背景技術の説明 ヒアルロン酸（ＨＡ）はグルクロン酸およびＮ−アセチル−グルコサミンの反 復ユニツトの直線状重合体からなる自然発生のグリコサミノグリカンである。分 子量は出所に依存して広い範囲にわたつて変化することができる。ＨＡは、商業 規模の抽出に十分に高い濃度において、動物の幾つかの組織、および雄鶏のとさ かのごとき幾つかの器官に存在する。かかる組織は広い範囲の分子量を含みそし て抽出、純化および殺菌工程の複雑な系列中に、高い分子量鎖が多少弱められて かなり狭い分子量範囲を有する最終製品を生じる。 この点において最終製品の特性を決定する重要なパラメータは原材料中のＨＡ の分子量分布、純化および殺菌過程中のＨＡ鎖の劣化度および低分子量ＨＡを除 去する有効性である。 市場で入手し得るヒアルロン酸は約４００００００ダルトンの平均分子量を有 するヘアロン（スウェーデン国、ウプサラに 所在のカビ・フアーマシア社の登録商標）である。この製品は米国特許第４，１ ４１，９７３号明細書に略述されたように製造されかつ超高純度の製品である。 眼科用途におけるＨＡの粘弾性製品の使用および化学的に変性されたＨＡの調製 を含む、かかる製品の調製に関しては多数の参考文献がある。 ＨＡは遅緩解放調合剤において公知でありそして国際特許出願公開第ＷＯ９０ ／０５５２２号公報においてＨＡは、例えば、ＧＨまたはＩＧＦ用の結合たんぱ く質とともに遅緩解放担体として記載されている。 米国特許第４，７７２，４１９号明細書には実際的には非膨張の水−膨張可能 な状態でありそして、架橋かつ派生されたＨＡまたはその塩に基礎を置いた成形 物品は少なくとも６５重量％の乾燥物質含量を有しておりそして１００Ｎ／ｃｍ² より大きい引っ張り強さが開示されている。ＨＡは高い分子量、すなわち、３ ００００００Ｄａからなっている。物品は凍結乾燥により製造され得る。ペーパ ー状の構造またはセロフアン状構造の薄いシートが得られた。物品は組織の癒着 および融合を防止するのに使用され得る。 低分子量のヒアルロン酸（ＬＭＷＨＡ）は酸または酵素加水分解およびその後 の分別により製造され得る。これらの方法は当該技術において知られている。 ＬＭＷＨＡは薬剤活性剤用担体としてかつまたそれ自体薬剤活性として知られ ている。 ヨーロツパ特許第１３８，５７２号明細書には５００００〜１０００００のＭ ｗを有するＨＡからなる製品が傷治療に有用であると記載されそして５００００ ０〜７３００００のＭｗを有するＨＡは眼球内および関節内注入に有用である。 目薬において、薬物用担体としてのＨＡの断片、例えば、ＥＧＦがまた開示され ている。 ヨーロッパ特許第１９７，７１８号明細書において３００００〜７３００００ 間の異なるＭｗを有するＨＡは眼科および皮膚科の分野において有用である。Ｅ ＧＦを有するＬＭＷＨＡが例として記載されている。化粧および皮膚疾患用水と ともに５００〜８０００００のＭｗを有するＨＡが英国特許第２，２２８，７３ ６号明細書から公知である。 米国特許第５，０７９，２３６号明細書には骨関節症および関節機能の治療用 のＭｗ５００００〜２０００００を有するＨＡが開示されておりそして日本国特 許第１，２９０，６３１号明細書には関節炎、糖尿病網膜症の治療用のＭｗ５０ ０００〜３００００００を有するＨＡが記載されている。 国際特許出願公開第ＷＯ９３／１６７３２号公報および同第ＷＯ９３／１６７ ３３号公報はＨＡまたはその断片（例えば＜７５００００）および、例えば抗炎 症性ＮＳＡＩＤ、ジクロフエナツク、ナプロクサン、抗ガン剤、とくに皮膚に局 所的にで有用な薬物を開示している。 英国特許第２，２３５，２０４号明細書にはヒアルロン酸が 真空中で凍結乾燥されるとき化粧品に使用のための水溶性のフイルムまたはシー トが形成されることが開示されている。使用されるヒアルロン酸は水中で粘性溶 液を付与する１２０００００の分子量を有する。マグネシウム−Ｌ−アスコルビ ルフオスフェートを含有する層は顔マスク用の化粧用シートとして使用されてい る。この組成物に関しては、皮膚の湿りけ、皮膚の張りおよび皮膚を白くする作 用が示された。 ヨーロッパ特許第５２２，４９１号明細書はヒアルロン酸およびポリペプチド からなる凍結乾燥された組成物を開示しており、該ポリペプチドはその組成物の 再組成後注入により投与される。 発明の開示 本発明の組成物は薬物の投与に使用されるとき予期しない好都合な効果を付与 する低分子量のヒアルロン酸およびペプチドまたはたんぱく質からなっている。 柔軟で、可撓性がありかつ連続しそして好ましくは層の形式であるマトリクス の製造のために、分子内の特別な結合力および相互作用を必要とする。高分子量 を有するＨＡは低分子量ヒアルロン酸の分子構造と比較され得ない分子の特殊な 構造を有する。当業者は低分子量ヒアルロン酸が凍結乾燥されるときどのように 反応し得るかを予測することができなかつた。 薬物を局部に投与するとき、問題は如何に多くの薬物が一定の時間中に解放さ れるかを知ることであり、その結果患者は常 に時間単位当たりの正しい投与量を受ける。 漬瘍に滴下状に薬物を付与するとき、合計量が良好に定められるが全体表面上 にわたって定められた量で行なう薬物の投与に困難がありそしてこの方法は通常 臨床的介護を必要とする。 薬物をペーストベースにおいて付与するとき、薬物の正確な量を計算しかつ塗 布するのは困難である。舌下または頬用組成物に関する困難は例えばベースの親 水性特性による安定の問題または解放時間の計算である。 架橋されないペプチドまたはたんぱく質およびＬＭＷＨＡの水溶掖を凍結乾燥 するときケーキの形式の層が網目紙または濾過紙のごとき構造で形成されること を見出した。その「紙」は多孔性で、中実かつ同質である。この「紙」は所望の 形状に切断させることができ、引き裂くことが可能でそして容易に取り扱われる 。この「紙」については面積当たりの薬物の正確な量を知ることができる。これ は「紙」の面積を知れば、投与量を正確に知ることができることを意味する。。 この「紙」を局部的に、舌下でまたは頬に塗布するとき、薬物の全体量が迅速 に解放されることを見出した。 薬物は安定でありかつ貯蔵中この調合剤内の活性を維持する。 本発明の調合剤は人間に塗布されるとき生物学的適合性がありかつ異なる種類 の漬瘍の治療のための完全な手段である。 「紙」または「ケーキ」は潰瘍に直接塗布され得る。又は口中 に付与することができる。薬物はそれにより膿汁または唾液により迅速に解放さ れる。 薬物が低分子量ＨＡとともに凍結乾燥されるとき高い濃度で存在し得ることを 見出した。 本発明はかくして少なくとも１つのペプチドまたはたんぱく質を含有する低分 子量ヒアルロン酸またはその塩の凍結乾燥された、柔軟な、可撓性かつ連続する マトリクスに関する。 低分子量ヒアルロン酸の分子量は好ましくは５００００および２０００００Ｄ ａの間である。 本発明はまた少なくとも１つのペプチドまたはたんぱく質を含有する凍結乾燥 された低分子量ヒアルロン酸を特徴とした層の形式の薬剤組成物に関する。薬物 は例えばＧＨ，ＩＧＦ−Ｉ，ＩＧＦ−ＩＩまたはＥＧＦまたはその混合物にする ことができる。ＧＨは成長ホルモンまたはその作用的類似物を意味し、ＩＧＦは ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ両方ともインシユリン状成長因子またはその作用 的類似物を意味し、そしてＥＧＦは表皮性成長因子またはその作用的類似物を意 味する。 抗生物質が傷に塗布されるとき成長ホルモンまたは成長因子と混合され得る。 作用的類似物にはペプチドまたはたんぱく質と同一の生物学的活性を有しかつ ペプチドまたはたんぱく質と少なくとも６５％の均質性を有する物質を意味する 。 本発明はまた、低分子量ヒアルロン酸およびペプチドまたは たんぱく質からなる水溶液を層に凍結乾燥することを特徴としたマトリクスまた は薬剤組成物の製造方法に関する。この凍結乾燥および薬剤物品のさらに他の製 造は殺菌されねばならない。 本発明はまた層の形状に凍結乾燥させた低分子量ヒアルロン酸をペプチドまた はたんぱく質用の担体として使用する方法に関する。 この使用方法は好ましくは薬物の正確な投与のためである。 本発明はまた傷治療用の医薬品の製造のために本発明の薬剤組成物を使用する 方法に関しそして層を形成するために低分子量ヒアルロン酸およびペプチドまた はたんぱく質からなる水溶液を凍結乾燥することを特徴とする局部的に投与可能 なペプチドまたはたんぱく質の予め定めた投与量を正確に獲得する方法に関する 。 低分子量は１００００００Ｄ以下かつ好ましくは５００００および２００００ ０Ｄの間を意味する。 層は１〜４０ｍｍの間にすることができかつ好ましくは２〜１２ｍｍである。 ＧＨは１〜２００ＩＵ／ｍｌの濃度にすることができかつ好ましくは５〜１２０ ＩＵ／ｍｌである。 ｐＨは凍結乾燥する前に水溶液中で６．０ないし８．２間にすることができる 。 成長ホルモンはここでは本発明の有用性のために例として使用されるが、請求 の範囲による保護の範囲を制限しない。 たんぱく質の安定性 たんぱく質の安定性はたんぱく質の化学的および物理的特性に依存する。 種々の劣化経路は脱アミノ反応、酸化、分裂および凝集として知られている。 脱アミノ反応および酸化はたんぱく質の最初の構造の変化からなる共通の化学 的反応である。脱アミノ反応はとくに水溶液中で発生するが、溶液の低い温度お よび低いｐＨが脱アミノ反応を抑制する。 種々の形状の凝集はたんぱく質の物理的不安定性を生じる。 凝集物は溶融可能または溶融不能にすることができそして両形状の結合は共有で あるかまたは非共有にすることができる。 凝集物はオパールのような光彩を放っている溶液を付与することができるが化 学的にのみ示され得る非目視凝集にすることもできる。たんぱく質調合剤中の共 有凝集の阻止はかかる方法が不可逆でありかつ加えて免疫原性である不活性の種 の生成を生ずるので重要である。 主構造の変化はまたたんぱく質の自己関連、凝集、の原因となる配座変化を生 じる。 幾つかの条件下で発生する非共有凝集は沈殿および活性の損失となり得る。 しかしながら、これらの劣化反応を監視することにより、薬物（例においてＧ Ｈ）が十分な生物学的活性を維持することを間接的に立証することができる。（ ブリストウ・エーエフ氏等 著、フアームヨーロツパ、ヒト成長ホルモン、１９９１年３月号、第３巻、第１ 頁乃至第４９頁） 方法 密度評価による等電焦点合わせ（ＩＥＦ） ＩＥＦは脱アミノ反応の範囲がそれにより評価され得る方法である。 ｈＧＨ成分の分離は２つの電極間に確立されかつ担体両性電解質により安定化 されたｐＨ勾配で行なわれる。たんぱく質はそれらが勾配において等電点でそれ ら自体整列するまで移動し、その点においてたんぱく質は正味の全体の電荷を持 たずそしてそれゆえ移動が停止するとき凝縮する。かくして分離は電荷により得 られる。帯電したｈＧＨ形状の相対的な分布はコーマシー・ブルー着色ポリペプ チドの密度走査により定量される。 単量体のより高いパーセンテージ、より少ない脱アミノ反応。 ポリペプチドの大きさ分布（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ） ソマトロピン、ｈＧＨの製造においてたんぱく質は、ＳＤＳ−たんぱく質の負 に帯電された分子複合体を発生するためにナトリウムドデシルサルフエート（Ｓ ＤＳ）により変性された。 分離は次いでＳＤＳの存在においてポリアクリルアミドゲル（ＰＡＧＥ）中の電 気泳動によつて分子の大きさに応じて得られた。ｈＧＨの相対的なポリペプチド の大きさ分布が銀着色ポリペプチド帯片の密度走査により定量された。 目視検査 溶液の外観はＰｈ．Ｅｕｒ．２ｎｄ Ｅｄ．にしたがつて目で検査された。目 盛りはＩ〜ＩＶであり、そしてＩは最も明瞭である。 実施例 例１ 約１５００００ダルトンの分子量を有するヒアルロン酸をＮａ−ヒアロロネー トから製造した。２．５１ｇのＮａ−ヒアロロネート（スウェーデン国に所在の フアーマシア・エービー製）をアルゴン雰囲気中で５００ｍｌの水に溶解させた 。 １６ｍｌのＨＣｌを添加させそして混合物をその後２２〜２３℃で２時間攪拌 した。ｐＨは＜１であつた。溶液を０．５ＭＮａＯＨによりｐＨ７．０に中和し た。その後０．３７ＭＨＣｌを添加させそして溶液をアルゴン雰囲気中で４５℃ で５時間攪拌させた。ｐＨ７．０が次いで０．５ＭＮａＯＨにより達成された。 溶液を蒸留水により透析管を使用することにより透析させた。 便用された管は遮断１２〜１４×１０³Ｄにより１３０８８５／１０３０Ｍであ つた。 ヒアルロン酸の分子量を溶液中で分析しかつヒアルロン酸を凍結乾燥した。 凍結乾燥は−５℃〜−５０℃で回転凍結乾燥機中において３０時間行われた。 例２ 水中で１５００００の分子量を有するヒアルロン酸（ＬＭＷＨＡ）を各ｍ１６ ．５ｍｇ ＬＭＷＨＡと１１０ ＩＵ ＧＨを含むように成長ホルモン（スウェー デン国所在のフアーマシア社のジエノトロピン（登録商標）ＧＨ）と混合させた 。１０ｍｌの溶液をカバー付きの直径７０ｍｍのペトリ皿内に配置させた。溶液 を以下のスキームにしたがつて凍結乾燥した。 凍結：３時間中に０〜５℃ ２６時間中に−４５℃ 第１乾燥：０．１ｍバールで２８時間中に−３０℃ 第２乾燥：０．１ｍバールで５〜６時間中に＋２５℃ １ケ月間５〜８℃で貯蔵後ケーキを２ｍｌの蒸留水中に溶解させかつ分析させ た。以下の結果が得られた（表１）。 例３ １５００００の分子量を有するヒアルロン酸（ＬＭＷＨＡ）を以下の方法にお いて成長ホルモン（スウェーデン国所在のカビ・フアーマシア社製のジエノトロ ピン（登録商標）ＧＨ）と混合させた。すなわち、６５ｍｇのヒアルロン酸を２ ．６５ｍｌのジエノトロピン（登録商標）、７６ＩＵ／ｍｌと混合させかつ蒸留 水により１０ｍｌに希釈させ、その結果各ｍｌは６．５ｍｇのＬＭＷＨＡおよび ２０．１ＩＵのＧＨを含む。１０ｍｌの溶液をカバー付きの７０ｍｍ径の直径を 有するペトリ皿に分配させた。溶液を例２に記載されたように凍結乾燥させた。 凍結乾燥されたケーキは屈曲されかつ切断され得るフイルタペーパーのごとく である。直径は６．０ｃｍでかつ厚さは０．５ｃｍである。 １ｃｍ²のケーキが７．１ＩＵのジエノトロピン（商標）および２．３ｍｇの ヒアルロン酸、１５００００ダルトンを含むように調合された。 １ｃｍ²のケーキが切断されかつ分析される。表２を参照。 本発明の調合に関する結果は低分子量ヒアルロン酸の凍結乾燥マトリクス中の 薬物が３０℃において少なくとも１ケ月間室温で貯蔵され得ることを確認した。 この結果は、たんぱく質かつとくにＧＨは通常不安定でかつかかる長期間にわた つて室温で貯蔵することができないので、意外であつた。 生物学的分析評価、比濁分析により、面積単位当たりのＧＨの量が測定された 。成長ホルモンがケーキ中に均一に（同質に）分散されたことが見出された。 これらの結果は、凍結乾燥された低分子量ヒアルロン酸で調合された成長ホル モンの貯蔵後に劣化が僅かに観察されるかまたは観察されないので、成長ホルモ ンが十分な生物学的活性を維持することを間接的に示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）少なくとも１つのペプチドまたはたんぱく質を含有する低分子量ヒアルロ ン酸またはその塩の凍結乾燥した柔軟で、可撓性のある連続するマトリクス。 ２）ヒアルロン酸の分子量を５００００〜２０００００Ｄａの間にしたことを 特徴とする請求の範囲第１項に記載の凍結乾燥マトリクス。 ３）少なくとも１つのペプチドまたはたんぱく質を含有する凍結乾燥した低分 子量ヒアルロン酸を特徴とする層の形状の薬剤組成物。 ４）薬物をＧＨ，ＩＧＦ−Ｉ，ＩＧＦ−ＩＩおよび／またはＥＧＦの少なくと も１つから選んだことを特徴とする請求の範囲第４項に記載の薬剤組成物。 ５）薬物がＧＨ，ＩＧＦ−Ｉ，ＩＧＦ−ＩＩおよび／またはＥＧＦおよび抗生 物質の混合物であることを特徴とする請求の範囲第４項に記載の薬剤組成物。 ６）低分子量のヒアルロン酸およびペプチドまたはたんぱく質からなる水溶液 を層に凍結乾燥することを特徴とする請求の範囲第１項に記載のマトリクスまた は請求の範囲第３項に記載の薬剤組成物の製造方法。 ７）請求の範囲第３項に記載の薬剤組成物を傷治療用医薬品の製造のために使 用する方法。 ８）層の形状の凍結乾燥した低分子量ヒアルロン酸をペプチ ドまたはたんぱく質用の担体として使用する方法。 ９）ペプチドまたはたんぱく質を正確に投与するために使用するための請求の 範囲第７項に記載の方法。 １０）層を形成するために低分子量ヒアルロン酸およびペプチドまたはたんぱ く質からなる水溶液を凍結乾燥することを特徴とする局部的に投与可能なペプチ ドまたはたんぱく質の予め定めた投与量を正確に得る方法。