JPH09322775A - 高分子マイクロ遺伝子重合体の作成方法 - Google Patents

高分子マイクロ遺伝子重合体の作成方法

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JPH09322775A
JPH09322775A JP8147184A JP14718496A JPH09322775A JP H09322775 A JPH09322775 A JP H09322775A JP 8147184 A JP8147184 A JP 8147184A JP 14718496 A JP14718496 A JP 14718496A JP H09322775 A JPH09322775 A JP H09322775A
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Abstract

(57)【要約】 【解決手段】 少なくとも一部の配列が互いに相補して
いるオリゴヌクレオチドＡ及びオリゴヌクレオチドＢ
に、ＤＮＡポリメラーゼを作用させてポリメラーゼ連鎖
反応を行うことを特徴とする高分子マイクロ遺伝子重合
体の作成方法。 【効果】 本発明により、効率的かつ単純に作成された
マイクロ遺伝子の繰り返し重合体が得られる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ＤＮＡポリメラー
ゼを用いた高分子マイクロ遺伝子重合体の作成方法に関
する。
【０００２】
【従来の技術】進化分子工学の誕生により、生命反応の
根幹を形成する酵素（タンパク質）、あるいはそれらを
コードする遺伝子ＤＮＡを、実験室の中で創り出すこと
が可能となった。この技術により、自然には存在しない
新たな活性を持った酵素・タンパク質を産み出すことが
可能となり、医療領域や工学領域への様々な応用が期待
されている。
【０００３】酵素（タンパク質）又はそれをコードする
遺伝子は、それぞれアミノ酸又はヌクレオチドをブロッ
ク単位としたそれらの重合体により構成されている。進
化分子工学では、これらのアミノ酸、ヌクレオチドのブ
ロック単位のランダムな重合体プールの中から、目的と
する活性を持つ分子を選び出す操作を行う。
【０００４】しかしながら、全ての組み合せの重合体を
作ろうとしても、合成できる化合物の物理的量に限度が
あるため、連結できるブロックの数に制限があり、その
結果その結果あまり大きなタンパク質や遺伝子を創成す
ることができない。さらに、核酸の重合体からタンパク
質を翻訳させるような試験管内進化系を考えるときに
は、翻訳を停止させる「停止コドン」の出現が大きな問
題となってくる。従って、大きなタンパク質をコードす
る遺伝子を作成する方法として、ある程度の大きさを持
ったマイクロ遺伝子をブロック単位として用いるのが望
ましい。
【０００５】ところで、大きな遺伝子は小さな遺伝子
（マイクロ遺伝子）が繰り返し重合して誕生したのでは
ないかという仮説がある（S.Ohno & J.T.Epplen, Proc.
Natl.Acad.Sci.U.S.A.80:3391-3395) 。単純な繰り返し
構造に富むポリペプチドは安定な二次構造を取りやすい
と考えられるので、大きなタンパク質や遺伝子を対象と
する進化分子工学では、短い構造単位を繰り返し重合さ
せ巨大分子を合成する技術が要求されている（Nature 3
67:323-324,1994)。現在、短いＤＮＡ単位の繰り返し重
合体を得る方法として、ローリング・サークル合成法が
報告されている（PNAS 92:4641-4645,1995) 。
【０００６】しかし、この方法は、リン酸化反応、連結
反応、重合反応、二本鎖形成反応などのステップを何段
階も経なければならないため、反応系が複雑であるとい
う問題点がある。そこで、遺伝子の重合体をより単純に
作成する反応系の開発が求められていた。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、効率的かつ
単純にマイクロ遺伝子の繰り返し重合体を作成する方法
を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題に
基づいて鋭意研究を行った結果、少なくとも一部の配列
が互いに相補しているオリゴヌクレオチドにＤＮＡポリ
メラーゼを作用させることにより、効率的かつ単純に高
分子マイクロ遺伝子重合体を作成することに成功し、本
発明を完成するに至った。
【０００９】すなわち、本発明は、少なくとも一部の配
列が互いに相補しているオリゴヌクレオチドＡ及びオリ
ゴヌクレオチドＢに、ＤＮＡポリメラーゼを作用させて
ポリメラーゼ連鎖反応を行うことを特徴とする高分子マ
イクロ遺伝子重合体の作成方法である。ＤＮＡポリメラ
ーゼとしては、エクソヌクレアーゼ、特に３’末端から
５’末端方向に作用するエクソヌクレアーゼを含むもの
が挙げられる。また、ＤＮＡポリメラーゼは耐熱性のも
のが好ましい。
【００１０】さらに、本発明の高分子マイクロ遺伝子重
合体の作成方法において、オリゴヌクレオチドＡ及び／
又はオリゴヌクレオチドＢの３’末端に、相手のオリゴ
ヌクレオチドとは塩基対を形成できない塩基を少なくと
も１ヌクレオチド含めることができる。以下、本発明を
詳細に説明する。
【００１１】
【発明の実施の形態】図１ａに示す通り、本発明のポリ
メラーゼ連鎖反応を行うにあたり、まず、互いに少なく
とも一部が相補的な領域をもつ２種類のオリゴヌクレオ
チド（オリゴヌクレオチドＡ及びオリゴヌクレオチド
Ｂ）を合成する。本発明では、特にオリゴヌクレオチド
の３’側配列が互いに相補的であるように合成する。互
いに相補鎖を形成するオリゴヌクレオチド数自体に特に
制限はないが、相補的な塩基は、少なくとも６塩基以
上、特に８塩基以上が好ましい。
【００１２】但し、オリゴヌクレオチドＡとオリゴヌク
レオチドＢのいずれか一方、又は両方の３’末端には、
相手のオリゴヌクレオチドとは塩基対を形成できない塩
基が１ヌクレオチド以上（好ましくは１〜３塩基）存在
するように合成することもできる。この操作により、反
応の効率を上昇させることができる。
【００１３】また、本発明は、自然には存在しないよう
な全く新しい遺伝子の重合体を創作することを目的の一
つとしているため、２種類のオリゴヌクレオチドは、そ
の少なくとも一部の配列が互いに相補的であれば特に限
定されず、任意に設定することができる。合成されたオ
リゴヌクレオチドは、上記相補的な領域間で相補してそ
の部分のみ二本鎖が形成される。
【００１４】ここで、「相補的」とは、ヌクレオチドＡ
とヌクレオチドＢとが相補鎖を形成する限り、アデニン
とチミンとの関係、グアニンとシトシンとの関係に限ら
ず、グアニンとチミンのような場合も許容されてもよい
ことを意味する。
【００１５】これら２つのオリゴヌクレオチドＡとオリ
ゴヌクレオチドＢは、相補した領域がＰＣＲを行うため
のプライマーとして機能する（図１ａの二本鎖の部
分）。そして、オリゴヌクレオチドＡの一本鎖の部分
（オリゴヌクレオチドＢと二本鎖を形成していない部
分）がオリゴヌクレオチドＢを合成するための鋳型とな
り、オリゴヌクレオチドＢの一本鎖の部分（オリゴヌク
レオチドＢと二本鎖を形成していない部分）がオリゴヌ
クレオチドＡを合成するための鋳型となる（図１ａ）。
このような２種類のオリゴヌクレオチドに、例えば３’
→５’エクソヌクレアーゼ活性を含む耐熱性ＤＮＡポリ
メラーゼを作用させてＰＣＲ反応を行うと、繰り返し単
位である二本鎖ＤＮＡが合成される（図１ｂ）。ＰＣＲ
をさらに続けることにより、繰り返し単位が連続した大
きなＤＮＡが合成される（図１ｃ）。
【００１６】ＰＣＲの条件は、ポリメラーゼ（例えばTa
q ポリメラーゼ) を用いて、例えば94℃で10秒〜120
秒、及び69℃で10秒〜120 秒を１サイクルとしてこれを
30〜６５サイクル、並びに６９℃で３分〜７分行う。Ｐ
ＣＲを効率的に行うため、上記サイクルを行う前に、更
に94℃で10分及び69℃で10分の反応を行うのが好まし
い。
【００１７】このようにして、２つのオリゴヌクレオチ
ドの相補する部分が自分自身を合成するための自己プラ
イマーとなり、そして相手のオリゴヌクレオチドが鋳型
となり合成された結果、二本鎖ＤＮＡを１つの繰り返し
単位として（図１ｂ）、同じ方向に、非常に多くのコピ
ー数でＤＮＡが重合される（図１ｃ）。なお、本発明で
は、上記繰り返し単位が相補鎖を形成する限り、繰り返
し単位の間においていくつかの塩基の置換、挿入、欠失
が存在してもよい。
【００１８】
【実施例】以下、実施例により本発明をさらに具体的に
説明する。但し、本発明はこれら実施例に限定されな
い。 〔実施例１〕重合の基礎となるオリゴヌクレオチドＡと
してKY-794（配列番号１）、オリゴヌクレオチドＢとし
てKY-795（配列番号２）をそれぞれ合成した。オリゴヌ
クレオチドＡは22ヌクレオチド、オリゴヌクレオチドＢ
は23ヌクレオチドからなり、それぞれのオリゴヌクレオ
チドの３’側の８塩基分の領域が互いに相補的であるよ
うに合成した（KY-794の配列のうち第15〜22番目の配列
と、KY-795の配列のうち第15〜22番目の配列とが相補的
である）。KY-795の３’末端にはKY-794と塩基対を形成
できないようにアデニン（Ａ）を付加させた。
【００１９】上記オリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲの
条件は、50μLの反応容量では以下の通りである。 KY-794（配列番号１） 20 pmol KY-795（配列番号２） 20 pmol dNTP 350 μM MgCl2 1.75 mM Tris-HCl, pH9.2 50 mM (NH4)2SO4 14 mMTaqPol (*1) 2.6 units/50μL *1: Taq ポリメラーゼ Taq ポリメラーゼとしては、ベーリンガー社から販売さ
れているTaq polymeraseとPwo polymeraseのミックスか
らなるExpandTM Long Template PCR system に含まれる
ポリメラーゼを用いた。
【００２０】サイクル反応には、パーキン・エルマー社
の9600、又は2400ＰＣＲシステムを用い、以下のサイク
ル条件でＰＣＲを行った。 94℃ 10分 69℃ 10分 (94℃を10秒、69℃を60秒）×45サイクル 69℃ ７分 酵素は、システムが最初に94℃に上がった時点で加え
た。この条件で得られたＰＣＲ産物について、1.2 ％の
アガロースゲル電気泳動を行った。
【００２１】結果を図２に示す。図２より、数キロ塩基
対以上にもおよぶＤＮＡがこの方法により重合されたこ
とがわかる。このようにして得られた重合体を、プラス
ミドベクターpTZ19R（Mead et al.,Protein Eng.1:67-7
4(1986))にクローニングし、４つのクローン（pSA32 、
pSA33 、pYT5、pYT8）についてその挿入断片の塩基配列
をシークエンサー（パーキンエルマー社）を用いて決定
した。
【００２２】結果を図３に示す。また、各クローンにつ
いて決定された塩基配列を、pSA32については配列番号
３、pSA33 については配列番号４、pYT5については配列
番号５、pYT8については配列番号５に示す。配列番号３
の配列のうち、第１〜36番目の配列、40〜75番目の配
列、77〜112番目の配列はともに同じ配列であることか
ら、KY-794とKY-795から由来する37塩基対の二本鎖を単
位として、これが同じ方向にいくつも連結した重合体が
合成されているのが分かる。配列番号４〜６の配列につ
いても同様である。
【００２３】なお、図３中「Δ」はオリゴヌクレオチド
由来の配列が繰り返し単位の連結部分で欠失していたこ
とを、また、下線部は由来不明の塩基が繰り返し単位の
連結部分で挿入されていたことを示す。
【００２４】〔実施例２〕実施例１（図２）で示した反
応において、KY-795の３’末端には、KY-794と塩基対を
形成できないような塩基が１つ存在していた。このよう
なミスマッチを形成しないオリゴヌクレオチドKY-783
（配列番号７）とKY-794との組み合わせによる重合反応
を行った。ＰＣＲ条件は実施例１と同じである。この条
件で得られたＰＣＲ産物について、1.2％のアガロース
ゲル電気泳動を行った。
【００２５】その結果を結果を図４に示す。図４より、
用いるオリゴヌクレオチドの３’末端に、相手のオリゴ
ヌクレオチドと塩基対を形成できないような塩基が少な
くとも１つ存在することが重合反応の効率を上げること
が分かる（図４，レーン２）。
【００２６】〔実施例３〕図５に示すように、KY-794と
KY-795は８塩基の相補領域を有する。本実施例では、こ
の相補領域をさらに２塩基分短くした（相補領域は６塩
基である）オリゴヌクレオチド KY-845（配列番号８）
とKY-846（配列番号９）とを用いて重合反応を行った。
反応液の組成は実施例２と同じであるが、ＰＣＲは、 条件１： 94℃ 10分 63℃ 10分 （94℃を10秒、63℃を60秒）×45サイクル 63℃ 7分 又は条件２： 94℃ 10分 66℃ 10分 （94℃を10秒、66℃を60秒）×45サイクル 66℃ 7分 のいずれかのサイクル条件で行った。
【００２７】この条件で得られたＰＣＲ産物について、
1.2％のアガロースゲル電気泳動を行った。その結果を
図５に示す。図５において、レーン２及び３は条件１
で、レーン４及び５は条件２でＰＣＲを行った結果であ
る。図５のレーン１及び２より、相補領域が６塩基と短
いオリゴヌクレオチドの組み合わせでもＰＣＲサイクル
のアニーリング温度を63℃へと下げることにより重合反
応が進んでいることが分かる。
【００２８】〔実施例４〕本実施例では、ＰＣＲ用の酵
素として、３’→５’エクソヌクレアーゼ活性を含む耐
熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いた。３’→５’エクソヌ
クレアーゼ活性は重合効率を高める点で重要である。そ
こで、この３’→５’エクソヌクレアーゼ活性の重要性
について、３’→５’エクソヌクレアーゼ活性を欠く耐
熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いて調べた。
【００２９】オリゴヌクレオチドは、 KY-794（配列番
号１）と KY-785（配列番号２）を用いた。ＰＣＲ反応
液は実施例１と同じ組成で、酵素のみをストラタジーン
社から販売されている耐熱性ポリメラーゼPfu DNA Poly
merase、あるいは、３’→５’エクソヌクレアーゼ活性
を持たないとされているExo- Pfu DNA Polymeraseを1.9
units/50μLの濃度で用いた。ＰＣＲは、実施例１と同
様のサイクル条件で行った。この条件で得られたＰＣＲ
産物について、２％のアガロースゲル電気泳動を行っ
た。
【００３０】結果を図６に示す。図６より、３’→５’
エクソヌクレアーゼ活性を持たないとされているExo- P
fu DNA Polymerase を用いた場合は（レーン３）、３’
→５’エクソヌクレアーゼ活性を持つPfu DNA Polymera
se を用いた場合（レーン２）に比べ、重合効率が落ち
ていることが分かる。
【００３１】〔実施例５〕本実施例では、種々の配列を
もつオリゴヌクレオチドを用いて重合を行った。図７に
示すとおり、 KY-808（配列番号10）と KY-809（配列番
号11）とは、８塩基分の互いに相補的な領域の配列を有
し、 KY-794（配列番号１）と KY-795（配列番号２）と
が相補鎖を形成する配列の数と同一であるが、ヌクレオ
チドの組成については、KY-794 と KY-795との間で形成
される相補的な領域の配列と比較して大きく異なってい
る。
【００３２】また、 KY-827（配列番号12）、 KY-828
（配列番号13）、 KY-829（配列番号14）及び KY-830
（配列番号15）は、 KY-794（配列番号１）の配列を一
部変換したものであり、KY-831（配列番号16）、KY-832
（配列番号17）、KY-833（配列番号18）、KY-834（配列
番号19）及びKY-835（配列番号20）は、KY-795 （配列
番号２）の配列を一部変換したものである。
【００３３】KY-794（配列番号１）： KY-795（配列番
号２）、KY-808（配列番号10）： KY-809（配列番号1
1）、KY-827（配列番号12）： KY-795（配列番号２）、
KY-828（配列番号13）： KY-795（配列番号２）、KY-82
9（配列番号14）： KY-795（配列番号２）、 KY-830
（配列番号15）： KY-795（配列番号２）、 KY-794（配
列番号１）： KY-831（配列番号16）、KY-794（配列番
号１）：KY-832（配列番号17）、KY-794（配列番号
１）：KY-833（配列番号18）、KY-794（配列番号１）：
KY-834（配列番号19）、KY-794（配列番号１）：KY-835
（配列番号20）の各オリゴヌクレオチドの組み合わせに
より、実施例１と同じ条件でＰＣＲ反応を行った。この
条件で得られたＰＣＲ産物について、２％のアガロース
ゲル電気泳動を行った。
【００３４】結果を図７、図８に示す。図７、図８よ
り、用いたオリゴヌクレオチドの配列の範囲では、効率
の差はあるものの、重合反応はいずれの組み合わせにお
いても進んでいることが分かる。
【００３５】〔実施例６〕得られる重合体の配列に多様
性を持たせるために、部分的にランダマイズさせたオリ
ゴヌクレオチドを用いた重合反応を行った。プライマー
としては、KY-812（配列番号21）と、KY-795（配列番号
２）を用いた。KY-812（配列番号21）は、第３、第１１
塩基の２箇所の部分にＡ、Ｔ、Ｇ又はＣのいずれかが配
置されるように合成されたオリゴヌクレオチドである。
ＰＣＲの反応は、実施例１と同様に行った。反応後、得
られた重合体をプラスミドベクターpTZ19Rにクローニン
グし、４つのクローン（pYT15, pYT16, pYT20, pYT21）
についてその挿入断片の塩基配列を決定した。
【００３６】その結果を、図９に示す。また、各クロー
ンについて決定された塩基配列を、pYT15 については配
列番号22、 pYT16については配列番号23、pYT20 につい
ては配列番号24、 pYT22については配列番号25に示す。
図９より、第３塩基は、Ｃを好むものの、第１１塩基に
はＡ、Ｔ、Ｇ又はＣがいずれも出現しており、重合体の
配列に多様性を与えていることが分かる。
【００３７】〔実施例７〕得られた重合体がコードする
タンパク質を大腸菌の中で発現させることができる。 K
Y-794（配列番号１）と KY-795（配列番号２）との組み
合わせから得られた重合体、及びKY-812（配列番号21）
と、KY-795（配列番号２）との組み合わせから得られた
重合体を、それぞれ発現ベクターpET23bにクローニング
し、組み換え体pYT32 、pYT33 を得た。 pYT32及びpYT3
3がコードする重合体由来のタンパク質を大腸菌BL21(DE
3)株内で発現後、細胞抽出液を15-25％グラジュエント
ゲルを用いたＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で
解析した。
【００３８】結果を図10に示す。分子量マーカーは、大
きいものより97,400、66,267、42,400、30,000、20,10
0、14,400である。図10から、重合体に由来した分子量
約１６Ｋのタンパク質が発現しているのが分かる。
【００３９】
【発明の効果】本発明により、効率的かつ単純に作成さ
れたマイクロ遺伝子の繰り返し重合体が得られる。
【００４０】
【配列表】
配列番号：１ 配列の長さ：２２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： GACGGTCACC TGCACAAAGG CG 22
【００４１】配列番号：２ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： CGGGATCCAC TGCACGCCTT TGA 23
【００４２】配列番号：３ 配列の長さ：１８５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： GACGGTCACCTGCACAAAGGCGTGCAGTGGATCCCG GACGGTCACCTGCACAAAGGCGTGCAGTGGATCCCGCGG GACGGTCACCTGCACAAAGGCGTGCAGTGGATCCCGCCCC GACGGTCACCTGCACAAAGGCGTGCAGTGGATCC GACGGTCACCTGCACAAAGGCGTGCAGTGGATCCCG 185
【００４３】配列番号：４ 配列の長さ：１６２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： GACGGTCACCTGCACAAAGGCGTGCAGTGGATCCCGGCG GACGGTCACCTGCACAAAGGCGTGCAGTGGATCCCGT GACGGTCACCTGCACAAAGGCGTGCAGTGGATCCCGCCA GACGGTCACCTGCACAAAGGCGTGCAGTGGATCCGCCA GACGGTCAC 162
【００４４】配列番号：５ 配列の長さ：２８０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： GACGGTCACCTGCACAAAGGCGTGCAGTGGATCCCGCCGG GACGGTCACCTGCACAAAGGCGTGCAGTGGATCCCGT GACGGTCACCTGCACAAAGGCGTGCAGTGGATCCCG GACGGTCACCTGCACAAAGGCGTGCAGTGGATCCCGCCGG GACGGTCACCTGCACAAAGGCGTGCAGTGGATCCC GACGGTCACCTGCACAAAGGCGTGCAGTGGATCCC GACGGTCACCTGCACAAAGGCGTGCAGTGGATCCCGCCGG GACGGTCACCTGCACAA 280
【００４５】配列番号：６ 配列の長さ：２４６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： GACGGTCACCTGCACAAAGGCGTGCAGTAGATCCCGCCCG GACGGTCACCTGCACAAAGGCGTGCAGTGGATCCCG GACGGTCACCTGCACAAAGGCGTGCAGTGGATCCCGC GACGGTCACCTGCACAAAGGCGTGCAGTGGATCCCGCCGG GACGGTCACCTGCACAAAGGCGTGCAGTGGATCCC GACGGTCACCTGCACAAAGGCGTGCAGTGGATCCCG GACGGTCACCTGCACAAAGGCG 646
【００４６】配列番号：７ 配列の長さ：２２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： CGGGATCCAC TGCACGCCTT TG 22
【００４７】配列番号：８ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： GACGGTCACC TGCACAGGCG 20
【００４８】配列番号：９ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： CGGGATCCAC TGCACGCCTG A 21
【００４９】配列番号：１０ 配列の長さ：２２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： GACGGACACC TGCAAACGGA GC 22
【００５０】配列番号：１１ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： CGGGATCCAC TGCAGCTCCG TTA 23
【００５１】配列番号：１２ 配列の長さ：２２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： CTGGGTCACC TGCACAAAGG CG ２２
【００５２】配列番号：１３ 配列の長さ：２２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： GACCCACACC TGCACAAAGG CG 22
【００５３】配列番号：１４ 配列の長さ：２２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： GACGGTGTGC TGCACAAAGG CG 22
【００５４】配列番号：１５ 配列の長さ：２２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： GACGGTCACG ACCACAAAGG CG 22
【００５５】配列番号：１６ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： CGGGATCCAC TCGTCGCCTT TGA 23
【００５６】配列番号：１７ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： CGGGATCCTG AGCACGCCTT TGA 23
【００５７】配列番号：１８ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： CGGGAAGGAC TGCACGCCTT TGA 23
【００５８】配列番号：１９ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： CGCCTTCCAC TGCACGCCTT TGA 23
【００５９】配列番号：２０ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： GCGGATCCAC TGCACGCCTT TGA 23
【００６０】配列番号：２１ 配列の長さ：２２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： GANGGTCACC NGCACAAAGG CG 22
【００６１】配列番号：２２ 配列の長さ：３１４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： GACGGTCGCCGGCACAAAGGCGTGCAGTGGATCCCG GACGGTCACCCGCACAAAGGCGTGCAGTGGATCCCG GACGGTCACCGGCACAAAGGCGTGCAGTGGATCCCG GACGGTCACCTGCACAAAGGCGTGCAGTGGATCCCG GATGGTCACCAGCACAAAGGCGTGCAGTGGATCCC GACGGTCACCCGCACAAAGGCGTGCAGTGGATCCCG GACGGTCACCTGCACAAAGGCGTGCAGTGGATCCC GACGGTCACCAGCACAAAGGCGTGCAGTGGATCCCG GACGGTCACCTGCACAAAGGCGTGCAGG 314
【００６２】配列番号：２３ 配列の長さ：４０８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： GACGGTCACCTGCACAAAGGCGTGCAGTGGATCCCG GACGGTCACCTGCACAAAGGCGTGCAGTGGATCCCG GACGGTCACCAGCACAAAGGCGTGCAGTGGATCCC GACGGTCACCCGCACAAAGGCGTGCAGTGGATCCCG GATGGTCACCGGCACAAAGGCGTGCAGTGGATCCC GACGGTCACCTGCACAAAGGCGTGCAGTGGATCCCGCGT GAGGGTCACCTGCACAAAGGCGTGCAGTGGATCCC GACGGTCACCTGCACAAAGGCGTGCAGTGGATCCC GACGGTCACCTGCACAAAGGCGTGCAGTGGATCCCGCCGG GACGGTCACCTGCACAAAGGCGTGCAGTGGATCCCG GACGGTCACCGGCACAAAGGCGTGCAGTGGATCCCG GACGGTCAC 408
【００６３】配列番号：２４ 配列の長さ：６７４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： GGTCACCGGCACAAAGGCGTGCAGTGGATCCCGCCGG GACGGTCACCTGCACAAAGGCGTGCAGTGGATCCCGCCGG GACGGTCACCTGCACAAAGGCGTGCAGTGGATCCCG GACGGTCACCTGCACAAAGGCGTGCAGTGGATCCCGCCGG GACGGTCACCTGCACAAAGGCGTGCAGTGGATCCCG GACGGTCACCTGCACAAAGGCGTGCAGTGGATCCC GACGGTCACCAGCACAAAGGCGTGCAGTGGATCCC GAAGGTCACCCGCACAAAGGCGTGCAGTGGATCCCG GACGGTCACCGGCACAAAGGCGTGCAGTGGATCCC GACGGTCACCTGCACAAAGGCGTGCAGTGGATCCC GACGGTCACCGGCACAAAGGCGTGCAGTGGATCCCGCCGG GAAGGTCACCTGCACAAAGGCGTGCAGTGGATCCCG GACGGTCACCGGCACAAAGGCGTGCAGTGGATCCCG GAAGGTCACCGGCACAAAGGCGTGCAGTGGATCCC GACGGTCACCAGCACAAAGGCGTGCAGTGGATCCCG GACGGTCACCGGCACAAAGGCGTGCAGTGGATCCCG GACGGTCACCTGCACAAAGGCGTGCAGTGGATCCC GACGGTCACCCGCACAAAGGCGTGCAGTGGATCCCGCCGG GATGGTCACCGGCAC 674
【００６４】配列番号：２５ 配列の長さ：３７３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： GAGGGTCACCCGCACAAAGGCGTGCACTGGATCCCGCCGG GACGGTCACCTGCACAAAGGCGTGCATTGGATCCCGCCGG GACGGTCACCGGCACAAAGGGGTGCAGTGGATCCCG GACGGTCACCTGCACAAAGGCGTGCAGTGGATCCCGCCGG GACGGTCACCGGCACAAAGGCGTGCAGTGGATCCC GATGGTCACCCGCACAAAGGCGTGCAGTGGATCCC GATGGTCACCCGCACAAAGGCGTGCAGTGGATCCCGCCGG GACGGTCACCTGCACAAAGGCGTGCAGTGGATCCC GACGGTCACCTGCACAAAGGCGTGCAGTGGATCCCG GAAGGTCACCGGCACAAAGGCGTGCAGTGGATCCCG 373
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の方法を示す模式図である。
【図２】アガロースゲル電気泳動の結果を示す写真であ
る。
【図３】本発明の方法により合成された遺伝子を示す図
である。
【図４】アガロースゲル電気泳動の結果を示す写真であ
る。
【図５】アガロースゲル電気泳動の結果を示す写真であ
る。
【図６】アガロースゲル電気泳動の結果を示す写真であ
る。
【図７】アガロースゲル電気泳動の結果を示す写真であ
る。
【図８】アガロースゲル電気泳動の結果を示す写真であ
る。
【図９】本発明の方法により合成された遺伝子を示す図
である。
【図１０】ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動の結
果を示す写真である。

Claims (4)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 少なくとも一部の配列が互いに相補して
    いるオリゴヌクレオチドＡ及びオリゴヌクレオチドＢ
    に、ＤＮＡポリメラーゼを作用させてポリメラーゼ連鎖
    反応を行うことを特徴とする高分子マイクロ遺伝子重合
    体の作成方法。
  2. 【請求項２】 ＤＮＡポリメラーゼが、３’末端から
    ５’末端方向に作用するエクソヌクレアーゼを含むもの
    である請求項１記載の高分子マイクロ遺伝子重合体の作
    成方法。
  3. 【請求項３】 ＤＮＡポリメラーゼが耐熱性のものであ
    る請求項１記載の高分子マイクロ遺伝子重合体の作成方
    法。
  4. 【請求項４】 オリゴヌクレオチドＡ及び／又はオリゴ
    ヌクレオチドＢの３’末端が、相手のオリゴヌクレオチ
    ドとは塩基対を形成できない塩基を少なくとも１ヌクレ
    オチド含むものである請求項１記載の高分子マイクロ遺
    伝子重合体の作成方法。
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