JPH09241177A

JPH09241177A - 腸管保護剤

Info

Publication number: JPH09241177A
Application number: JP8047262A
Authority: JP
Inventors: Makoto Shimizu; 誠清水; Hiroshi Hashimoto; 啓橋本; Toshio Sakurai; 稔夫桜井
Original assignee: Snow Brand Milk Products Co Ltd
Current assignee: Snow Brand Milk Products Co Ltd
Priority date: 1996-03-05
Filing date: 1996-03-05
Publication date: 1997-09-16
Anticipated expiration: 2016-03-05
Also published as: JP3854657B2

Abstract

(57)【要約】【課題】腸管に存在するタイト・ジャンクション(Tig
ht Junction)の弛緩を防止し、アレルゲン物質等の透過
を抑制する腸管保護剤を提供する。【解決手段】ホエー蛋白質、カゼイン、血清アルブミ
ン又はこれらの分解物を有効成分として配合し、タイト
・ジャンクションの弛緩を防止してアレルゲン物質等の
透過を抑制する効果を賦与する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ホエー蛋白質、カ
ゼイン、血清アルブミン又はこれらの分解物を有効成分
とする腸管保護剤に関する。本発明の腸管保護剤は、腸
管に存在するタイト・ジャンクション(Tight Junction)
の弛緩を打ち消す作用を有し、アレルゲン物質等の透過
を抑制するので、アレルギー疾患等の予防や治療に有用
である。

【０００２】

【従来の技術】腸管の上皮細胞間には、粘膜表層細胞同
士を洩れなくシールし、表層細胞の周囲を鉢巻き状に取
り囲んでいるタイト・ジャンクションが存在しており、
イオン等の低分子物質は、このタイト・ジャンクション
の間を通り抜けて体内に吸収されることが知られてい
る。また、消化されずに残った細菌、ウイルス、蛋白質
等の巨大分子も腸管の上皮細胞間を通り抜けて体内に吸
収される場合があり、これが感染症や食物アレルギーを
誘発し、増悪する要因の一つと考えられている。特に、
乳幼児においては、腸管及びそれに付属する器官の発達
が充分でないので、巨大分子が腸管の上皮細胞間を通り
抜けて体内に吸収されてしまう機会が多く、これが感染
症や食物アレルギーの原因となっている。そこで、先に
本発明者らは、経口的に摂取することができ、タイト・
ジャンクションの形成を促進するような物質を有効成分
とする腸管透過抑制剤を提案した (特願平6-234282号公
報) 。

【０００３】一方、食品成分中には、グルコース、サイ
トカラシンＤ等のようにタイト・ジャンクションを弛緩
する作用を有するものがある。また、アレルギー性炎症
においては炎症性サイトカイン等、生体側の炎症作用に
よってもタイト・ジャンクションが弛緩されると考えら
れる。このように、タイト・ジャンクションは食品成分
や炎症作用により弛緩される危険に常に曝されている。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、食品成
分や炎症作用による腸管上皮細胞間のタイト・ジャンク
ションの弛緩を防止し、感染症や食物アレルギーの予防
及び治療を行うという観点から、タイト・ジャンクショ
ンの弛緩を防止することができる物質を求めて鋭意研究
を進めたところ、ホエー蛋白質、カゼイン、血清アルブ
ミン及びこれらの分解物にタイト・ジャンクションの弛
緩を防止する作用があることを見出した。そして、これ
らの物質を使用して動物実験を行ったところ、タイト・
ジャンクションの弛緩を防止してアレルゲン物質の透過
を抑制することができることを見出し、本発明を完成す
るに至った。したがって、本発明は、ホエー蛋白質、カ
ゼイン、血清アルブミン又はこれらの分解物を有効成分
とする、食品成分や炎症作用によるタイト・ジャンクシ
ョンの弛緩を防止し、アレルゲン物質の透過を抑制して
感染症や食物アレルギーを予防及び治療する効果を有す
る腸管保護剤を提供することを課題とする。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明では、食品成分や
炎症作用によるタイト・ジャンクションの弛緩を防止
し、アレルゲン物質の透過を抑制して感染症や食物アレ
ルギーを予防及び治療する効果を有する腸管保護剤の有
効成分として、ホエー蛋白濃縮物（ＷＰＣ）やホエー蛋
白単離物（ＷＰＩ）、β−ラクトグロブリン等のホエー
蛋白質、β−カゼイン等のカゼイン、入手容易なウシ血
清アルブミン（ＢＳＡ）等の血清アルブミン又はこれら
の分解物を使用する。そして、本発明の腸管保護剤を調
製するに際しては、これらの物質から選択される一種以
上の物質を配合すれば良い。また、ホエー蛋白質、カゼ
イン又は血清アルブミンの分解物は、通常行われている
ように、蛋白質加水分解酵素で蛋白質を加水分解するこ
とにより調製しても良いし、酸やアルカリを使用して調
製しても良い。

【０００６】なお、これらの物質の腸管保護効果につい
ては、先に本発明者らが確立したタイト・ジャンクショ
ンの物質透過性を定量する実験系を用いて行った。以
下、その実験系について説明する。

【０００７】ヒト結腸癌由来の培養細胞株であるCaco-2
（ATCC HTB37）を 100μg/ml濃度のタイプＩコラーゲン
（新田ゼラチン製）溶液でコーティングした透過性膜
（ミリセルＣＭ、ポアサイズ;0.4μm, 0.6cm² 、ミリポ
ア製）上に撒き、10％ウシ胎児血清（バイオセラム製）
を含むＤＭＥＭ培地（日水製薬製）で一定期間培養した
後、培地を洗浄してハンクス液に置き換え、ミリセルＥ
ＲＳ（ミリポア製）で経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）を測
定したところ、培養開始48時間で 550Ω・cm² となっ
た。これは、タイト・ジャンクションが形成されて安定
化したことを示す。

【０００８】次に、ハンクス液に10mM過酸化水素水を加
えて形成されたタイト・ジャンクションを30分間処理し
たところ、ＴＥＥＲは７割以下にまで低下し、タイト・
ジャンクションが弛緩した状態となった。なお、タイト
・ジャンクションを弛緩する物質として過酸化水素水を
使用した理由は、腸管内で発生した炎症で生じたケミカ
ルメディエーターによりタイト・ジャンクションが弛緩
されるのと同様の状況を想定したためである。すなわ
ち、炎症においては、炎症部位周辺の細胞は炎症性サイ
トカインやケミカルメディエーターを放出するが、特
に、この際に細胞から放出される過酸化水素水は腸管壁
に影響を及ぼし、タイト・ジャンクションを弛緩する。
そして、弛緩したタイト・ジャンクションの間を通り抜
けてアレルゲンが体内に吸収され、食物アレルギーが発
症又は増幅する。

【０００９】そこで、過酸化水素水をハンクス液に加え
る前に、タイト・ジャンクションの弛緩を防止する作用
を有する物質の検索に供する物質をハンクス液に加えて
形成されたタイト・ジャンクションを30分間処理した
後、ハンクス液に10mM過酸化水素水を加えてタイト・ジ
ャンクションを30分間処理し、ＴＥＥＲを測定して、タ
イト・ジャンクションの弛緩が抑制されたか否かを調べ
た。なお、ＴＥＥＲを測定する実験系のモデルを図１に
示す。

【００１０】

【試験例１】β−カゼイン、カゼイン、β−ラクトグロ
ブリン、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及びホエー蛋白
濃縮物 (ＷＰＣ）を使用してタイト・ジャンクションの
弛緩を防止する作用を調べた。すなわち、上記した実験
系により、ハンクス液に、10μM β−カゼイン、２％カ
ゼイン、10μM β−ラクトグロブリン、10μM ＢＳＡ又
は２％ＷＰＣを加えて形成されたタイト・ジャンクショ
ンを30分間処理した後、ハンクス液に10mM過酸化水素水
を加えてタイト・ジャンクションを30分間処理し、ＴＥ
ＥＲを測定した。また、過酸化水素水をハンクス液に加
える前に処理を行わなかったものを対照とした。その結
果を図２に示す。なお、図にある相対ＴＥＥＲとは、タ
イト・ジャンクションを過酸化水素水で処理する前のＴ
ＥＥＲ値に対する過酸化水素水で処理した後のＴＥＥＲ
値である。

【００１１】このように、形成されたタイト・ジャンク
ションをβ−カゼイン、カゼイン、β−ラクトグロブリ
ン、ＢＳＡ又はＷＰＣで処理することにより、ＴＥＥＲ
の低下が抑制されたので、これらの物質が過酸化水素水
によるタイト・ジャンクションの弛緩を抑制することが
判った。

【００１２】

【試験例２】β−ラクトグロブリンを使用してタイト・
ジャンクションの弛緩を防止する作用の濃度依存性を調
べた。すなわち、試験例１と同様の方法により、ハンク
ス液に５〜 500μM の各濃度に調整したβ−ラクトグロ
ブリンを加えて形成されたタイト・ジャンクションを30
分間処理した後、ハンクス液に10mM過酸化水素水を加え
てタイト・ジャンクションを30分間処理し、ＴＥＥＲを
測定した。また、過酸化水素水をハンクス液に加える前
に処理を行わなかったものを対照とした。その結果を図
３に示す。なお、図にあるＴＥＥＲ値の幅は、繰り返し
６回行った実験の標準誤差である。

【００１３】このように、形成されたタイト・ジャンク
ションを５μM β−ラクトグロブリンで処理することに
よってもＴＥＥＲの低下が抑制され、 500μM β−ラク
トグロブリンで処理することによってＴＥＥＲの低下は
完全に抑制されることが判った。なお、ＢＳＡ及びβ−
カゼインを使用して行った実験でもほぼ同様の傾向が見
られた。

【００１４】

【試験例３】10％濃度となるようにＢＳＡを溶解した蟻
酸アンモニウム緩衝液(pH 8.0)に、基質濃度の 1/100量
のトリプシンを添加し、37℃で12時間反応させた後、ト
リプシンと等量の大豆トリプシンインヒビターを添加す
ることにより反応を停止し、ＢＳＡ分解物を調製した。
そして、このＢＳＡ分解物を使用してタイト・ジャンク
ションの弛緩を防止する作用の濃度依存性を調べた。す
なわち、試験例１と同様の方法により、ハンクス液にＢ
ＳＡ換算で５〜 500μM の各濃度に調整したＢＳＡ分解
物を加えて形成されたタイト・ジャンクションを30分間
処理した後、ハンクス液に10mM過酸化水素水を加えてタ
イト・ジャンクションを30分間処理し、ＴＥＥＲを測定
した。また、過酸化水素水をハンクス液に加える前に処
理を行わなかったものを対照とした。その結果を図４に
示す。

【００１５】このように、形成されたタイト・ジャンク
ションを５μM ＢＳＡ分解物で処理することによっても
ＴＥＥＲの低下が抑制され、 500μM ＢＳＡ分解物で処
理することによってＴＥＥＲの低下は完全に抑制される
ことが判った。なお、同様にして調製したβ−ラクトグ
ロブリン分解物及びβ−カゼイン分解物を使用して行っ
た実験でもほぼ同様の傾向が見られた。また、酵素反応
を停止するために使用した大豆トリプシンインヒビター
については、タイト・ジャンクションの弛緩を防止する
作用は認められなかった。

【００１６】

【試験例４】動物実験により、ＷＰＣ、ＢＳＡ、ＢＳＡ
分解物、β−ラクトグロブリン分解物及びβ−カゼイン
分解物を使用して、腸管保護効果を調べた。なお、ＢＳ
Ａ分解物、β−ラクトグロブリン分解物及びβ−カゼイ
ン分解物については、試験例３に示したＢＳＡ分解物の
調製法に準じて調製した。

【００１７】７週齢のＤＢＡ／２マウス（日本クレア）
を１週間予備飼育した後、１群３匹として、１％ＷＰ
Ｃ、１％ＢＳＡ、 0.1％ＢＳＡ、１％ＢＳＡ分解物、
0.1％ＢＳＡ分解物、 0.1％β−ラクトグロブリン分解
物又は 0.1％β−カゼイン分解物をそれぞれ市販ＣＥ−
２粉末飼料（日本クレア製）に添加して調製した飼料を
摂取させ、７日間飼育した。そして、24時間絶食、絶飲
させた後、10mM過酸化水素水 200μl を経口ゾンデで２
時間毎に５回投与した。さらに、 0.5％卵白アルブミン
(ＯＶＡ、シグマ製）を含むＣＥ−２粉末飼料を自由摂
取させてＯＶＡを経口投与した後、眼底静脈叢より 0.5
週 (３日又は４日) 毎に 100μl 採血して血清中ＯＶＡ
特異的抗体価の変動を測定した。また、ＣＥ−２粉末飼
料のみで飼育した群を対照とした。その結果を図５に示
す。

【００１８】なお、血清中ＯＶＡ特異的抗体価の測定
は、以下のように行った。（１）ＯＶＡを生理的リン酸緩衝液（ＰＢＳ）10μg/ml
に溶解した溶液 100μlをＥＬＩＳＡプレートの各ウエ
ルに添加した後、室温で２時間放置してＯＶＡを固定し
た。（２）0.05％Tween 20を含む生理的リン酸緩衝液（ＰＢ
ＳＴ）でＯＶＡを固定した各ウエルを３回洗浄した後、
10mg/ml 濃度としたＢＳＡを含む0.1Mクエン酸緩衝液(p
H 6.4) 200μl を各ウエルに添加し、室温で２時間放置
してブロッキングした。（３）ＰＢＳＴでブロッキングした各ウエルを３回洗浄
した後、１％ＢＳＡ及び0.05％Tween 20を含む生理的リ
ン酸緩衝液（ＰＢＳＴＢ）で血清を 100倍に希釈した試
料 100μl を各ウエルに添加した。（４）４℃で17時間放置し、ＰＢＳＴで各ウエルを３回
洗浄した後、ビオチン標識抗マウスＩｇＧ（シグマ製）
を10,000倍にＰＢＳＴＢで希釈した溶液 100μlを各ウ
エルに添加した。（５）室温で１時間放置し、ＰＢＳＴで各ウエルを３回
洗浄した後、アビジン標識アルカリフォスファターゼ溶
液を 5,000倍にＰＢＳＴＢで希釈した溶液 100μl を各
ウエルに添加した。（６）室温で 0.5時間放置し、ＰＢＳＴで各ウエルを３
回洗浄し、1Mジエタノールアミン−塩酸緩衝液(pH 9.8)
に0.02％塩化マグネシウム及びp-nitrophenyl phosphat
e 1mg/mlを溶解させた基質溶液 100μl を各ウエルに添
加し、室温で発色させて吸光度(415 nm)を２連で測定し
た。

【００１９】なお、試料の非特異的吸着の影響を見るた
めに、ＯＶＡ溶液に代えて10mg/ml濃度となるようＢＳ
ＡをＰＢＳに溶解した溶液 100μl を各ウエルに添加し
てＢＳＡを固定したウエルも作成した。また、抗体価
は、１群３匹の吸光値の相乗平均とした。

【００２０】このように、対照群では、ＯＶＡ投与開始
後１週でＯＶＡ特異的抗体価が上昇し始めたのに対し
て、１％ＷＰＣ、１％ＢＳＡ、 0.1％ＢＳＡ、１％ＢＳ
Ａ分解物、 0.1％ＢＳＡ分解物、 0.1％β−ラクトグロ
ブリン分解物又は 0.1％β−カゼイン分解物を添加した
飼料を投与した各実験群では、ＯＶＡ特異的抗体価が上
昇し始める時期が 0.5〜１週間遅れ、また、抗体価も低
い値であった。したがって、これらの物質は、マウス腸
管の透過性を減少させて腸管からのＯＶＡの生体内への
進入を防止し、食物アレルギーを予防したことが判っ
た。

【００２１】

【発明の実施の形態】本発明では、腸管保護剤の有効成
分として、ホエー蛋白質、カゼイン、血清アルブミン又
はこれらの分解物を単独で、あるいは二種以上混合して
使用する。そして、粉末、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、
ドリンク剤等の形で製剤化し、腸管保護効果を有する医
薬として使用しても良いし、各種栄養組成物や飲食品等
に配合し腸管保護効果を賦与して使用しても良い。ま
た、年齢、治療効果、病態等により異なるが、ホエー蛋
白質、カゼイン、血清アルブミン又はこれらの分解物に
腸管保護効果を発揮させるためには、通常、１回に体重
１kg当たり 130mg〜13g の範囲で、１日１回から数回経
口投与すれば良い。

【００２２】

【実施例１】ホエー蛋白質、カゼイン、血清アルブミン
又はこれらの分解物から選択される一種以上の物質100g
とラクトース 65gを混和し、60メッシュの篩を通した
後、アルコール性ポリビニルピロリドン 20gで湿らせ、
12メッシュの篩を通して乾燥した。そして、タルク 25g
と澱粉 10gを加え、常法により打錠して重量 300mgの腸
管保護作用を有する錠剤を製造した。

【００２３】

【実施例２】ホエー蛋白質、カゼイン、血清アルブミン
又はこれらの分解物から選択される一種以上の物質100
g、メチルセルロース 75g、コーンスターチ 40g及び香
料少々を混和し、60メッシュの篩を通した後、アルコー
ル性ポリビニルピロリドン 15gで湿らせ、0.7 mm径ステ
ンレススチールの篩を通し、腸管保護作用を有する顆粒
剤を製造した。

【００２４】

【発明の効果】ホエー蛋白質、カゼイン、血清アルブミ
ン又はこれらの分解物は、タイト・ジャンクションの弛
緩を防止する作用を有し、タイト・ジャンクションの間
を通り抜けて体内に吸収されるアレルゲン等の物質の透
過を防止する効果を有する。したがって、これらの物質
を有効成分として含有する腸管保護剤を使用することに
より、食物アレルギー等の予防及び治療の効果を発揮さ
せることが可能となる。また、これらの物質は、食品素
材として通常使用されている成分であり、安全性の面で
も全く問題はない。

【図面の簡単な説明】

【図１】ＴＥＥＲを測定する実験系のモデルを示す。

【図２】試験例１におけるβ−カゼイン、カゼイン、β
−ラクトグロブリン、ＢＳＡ及びＷＰＣのタイト・ジャ
ンクション弛緩防止効果を示す。

【図３】試験例２におけるβ−ラクトグロブリンの濃度
の違いによるタイト・ジャンクション弛緩防止効果を示
す。

【図４】試験例３におけるＢＳＡ分解物の濃度の違いに
よるタイト・ジャンクション弛緩防止効果を示す。

【図５】試験例４におけるＷＰＣ、ＢＳＡ、ＢＳＡ分解
物、β−ラクトグロブリン分解物及びβ−カゼイン分解
物の腸管保護効果を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ａ２３Ｊ 3/12 Ａ６１Ｋ 37/16 Ａ２３Ｌ 1/305 37/18

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ホエー蛋白質、カゼイン、血清アルブミ
ン又はこれらの分解物から選択される一種以上の物質を
有効成分とする腸管保護剤。
【請求項２】ホエー蛋白質がβ−ラクトグロブリンで
ある請求項１記載の腸管保護剤。
【請求項３】カゼインがβ−カゼインである請求項１
記載の腸管保護剤。