JPH09227594A

JPH09227594A - 化合物ｒｐ−１７７６

Info

Publication number: JPH09227594A
Application number: JP8032394A
Authority: JP
Inventors: Shinichiro Toki; 眞一郎土岐; Tsutomu Azuma; 勉我妻; Yutaka Saito; 裕斎藤; Keiko Ochiai; 恵子落合; Katsuhiko Ando; 勝彦安藤; Yuzuru Matsuda; 譲松田
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1996-02-20
Filing date: 1996-02-20
Publication date: 1997-09-02

Abstract

(57)【要約】【課題】優れた抗菌作用を有する化合物を提供する。【解決手段】一般式（Ｉ）で表され、抗菌作用を有する新規化合物ＲＰ−１７７
６。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ストレプトマイセ
ス属に属する微生物により生産され、抗菌活性を有する
新規環状ペプチド系化合物ＲＰ−１７７６に関する。

【０００２】

【従来の技術】式(II)

【０００３】

【化２】

【０００４】で示されるＷＳ９３２６Ａがジャーナル・
オブ・アンチバイオチックス（Journal of Antibiotic
s）４５巻１０５５頁（１９９２年）および同誌４５巻
１０６４頁に、タキキニン・アンタゴニストとして報告
されている。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、抗菌
活性を有する新規生理活性物質を提供することにある。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明によれば、式
（Ｉ）

【０００７】

【化３】

【０００８】で表される化合物ＲＰ−１７７６が提供さ
れる。該化合物はストレプトマイセス属に属する微生物
を培養することによって得られる。

【０００９】

【発明を解決するための手段】以下に本発明を詳細に説
明する。ＲＰ−１７７６の理化学的性質は以下のとおり
である。なお、理化学的性質は以下の機器により測定し
た。融点：柳本製作所微量融点測定器比旋光度：日本分光工業 DIP370型デジタル旋光計マススペクトル：日本電子 HX110A型質量分析装置赤外吸収スペクトル：日本電子 JIR-RFX3001 型赤外
吸収分光計紫外吸収スペクトル：島津製作所 UV-2200 型紫外吸
収分光計核磁気共鳴スペクトル：日本電子 α400型核磁気共
鳴装置

【００１０】ＲＰ−１７７６の理化学的データ性状：白色粉末融点：228-230℃ 比旋光度：[α]_D ²⁵＝+27.9°（c＝0.5, CH₃OH）元素分析：実測値(%) C 58.59; H 6.62; N 10.50 理論値(%) C 58.58; H 6.55; N 10.93(C₇₅H₉₄N₁₂O₂₀・
3H₂O) 高分解能FAB-MS：実測値 m/z 1505.6598 [M+Na]⁺ 理論値 m/z 1505.6605 [M+Na]⁺ (C₇₅H₉₄N₁₂O₂₀Na) 分子式：C₇₅H₉₄N₁₂O₂₀ 赤外部吸収スペクトル：νmax (KBr) 3317, 1734, 1
657, 1516, 1456, 1250, 1063 cm^-1 紫外吸収スペクトル：λmax (CH₃OH) ( ε) 222 (81,
600), 282 (21,500), 290 (18,800) nm¹ H-NMR： (DMSO-d₆, 30℃）δ(ppm) (積分値, 多重度,
結合定数) 12.20 (1H, br s), 10.79 (1H, d, 2.0Hz ), 9.28 (1H,
d, 8.8Hz), 8.99 (2H, m), 8.84 (1H, d, 8.1Hz), 7.9
2 (1H, d, 2.9Hz), 7.89 (1H, d, 7.8Hz), 7.84 (1H,
d, 8.1Hz), 7.73 (1H, d, 15.9Hz), 7.67 (1H, d, 7.8H
z), 7.54 (1H, d, 10.0Hz), 7.44 (1H, m), 7.40 (1H,
t, 7.6Hz), 7.35〜7.16 (11H, m), 7.05(1H, t, 7.8H
z), 7.02 (1H, br s), 6.97 (1H, t, 7.8Hz), 6.83 (1
H, d, 10.3Hz), 6.45 (1H, dd, 1.7, 11.5Hz), 6.22 (2
H, d, 8.3Hz), 6.11 (2H, d, 8.3Hz), 5.99 (1H, dq, 1
1.5, 7.1Hz), 5.81 (1H, d, 8.8Hz), 5.65 (1H, br s),
5.44(1H, d, 5.4Hz), 5.30 (1H, q, 6.8Hz), 5.26 (1
H, d, 4.2Hz), 4.95 (1H, dd,5.1, 10.3Hz), 4.86 (1H,
dd, 8.1, 10.0Hz), 4.60 (1H, m), 4.41 (1H, d, 5.1H
z), 4.37 (1H, m), 4.32 (1H, m), 4.26 (1H, d, 8.8H
z), 4.19 (1H, m), 4.15 (1H, m). 4.00 (1H, dd, 8.6,
17.8Hz), 3.85 (1H, m), 3.77 (1H, m), 3.74(1H, m),
3.66 (1H, m), 3.57 (3H, s), 3.40 (1H, m), 3.10 (1
H, m), 3.09 (1H, m), 2.98 (1H, m), 1.99 〜1.65 (7
H, m), 1.61 (3H, dd, 1.7, 7.1Hz), 1.53 (1H, m), 1.
28 (3H, d, 7.3Hz), 1.08 (3H, d, 7.1Hz), 1.05 (3H,
d, 6.8Hz), 0.97 (3H, d, 6.1Hz), 0.96 (3H, d, 6.3H
z), 0.93 (3H, d, 6.6Hz), 0.74 (3H, d, 6.8Hz).

【００１１】¹³C-NMR ： (DMSO-d₆, 30℃) δ(ppm) (多
重度) 175.33 (s), 174.92 (s), 173.21 (s), 172.12 (s), 17
2.04 (s), 172.01 (s), 170.26 (s), 170.10(s), 169.8
8 (s), 169.41 (s), 169.34 (s), 169.27 (s),168.68
(s), 158.23 (s), 142.24 (s), 137.62 (d), 137.17
(s), 136.19 (s),132.14 (s), 131.48 (s), 130.05
(d), 129.74 (d), 129.11 (d), 127.51 (d),127.28
(d), 127.09 (d), 127.02 (s), 126.95 (d), 125.64
(d), 125.52 (d),124.83 (d), 121.36 (d), 120.80
(d), 119.37 (d), 118.09 (d), 112.38 (d),111.19
(d), 109.71 (s), 74.42 (d), 72.39 (d), 71.32 (d),
70.57 (d), 68.67 (d), 60.12 (d), 59.71 (d), 57.86
(d), 56.69 (d), 55.25 (d), 54.90 (d), 54.60 (q), 5
3.04 (d), 53.01 (d), 51.02 (d), 46.64 (t), 42.23
(t). 40.20 (d), 38.55 (t), 30.55 (d), 29.04 (t), 2
8.10 (t), 24.29 (d), 23.54 (t),22.62 (q), 20.96
(q), 19.28 (q), 18.21 (q), 16.37 (q), 15.61 (q), 1
4.00(q), 13.16 (q). 各種展開溶媒による化合物ＲＰ−１７７６の薄層クロマ
トグラフィーのＲｆ値を以下に示す。検出はヨウ素反応
もしくは２５３．７nmの紫外線照射法により行った。

【００１２】展開溶媒１：クロロホルム：メタノール＝
９：１薄層：キーゼルゲル６０Ｆ₂₅₄(メルク社製、Art.5628) 展開方法：室温、上昇法、１５〜３０分Ｒｆ値：０．２２展開溶媒２：クロロホルム：メタノール：エタノール：
水＝１０：４：４：２薄層：キーゼルゲル６０Ｆ₂₅₄(メルク社製、Art.5628) 展開方法：室温、上昇法、１５〜３０分Ｒｆ値：０．７９展開溶媒３：メタノール薄層：ＲＰ−１８Ｆ₂₅₄s (メルク社製、Art.13724) 展開方法：室温、上昇法、１５〜６０分Ｒｆ値：０．７４化合物ＲＰ−１７７６の生物活性について、以下の試験
例で説明する。

【００１３】試験例１：各種細菌に対する抗菌活性各種細菌に対する最小生育阻害濃度（ＭＩＣ）につい
て、バクトトリプトン（Difco社製）３ｇ／Ｌ、肉エキ
ス３ｇ／Ｌ、酵母エキス 1ｇ／Ｌ、グルコース1ｇ／
Ｌ、寒天１６ｇ／Ｌの組成からなる培地（pH7.0)を用い
て寒天希釈法により測定した。その結果を第１表に示
す。

【００１４】

【表１】

【００１５】次にＲＰ−１７７６の製造法について説明
する。ＲＰ−１７７６は、ストレプトマイセス属に属
し、ＲＰ−１７７６の生産能を有する微生物を培地に培
養し、培養物中にＲＰ−１７７６を生成蓄積させ、該培
養物からＲＰ−１７７６を採取することによって製造さ
れる。ＲＰ−１７７６生産能を有する微生物としては、
ストレプトマイセス属に属し、ＲＰ−１７７６生産能を
有する菌株であればいずれの菌株でも用いることができ
る。また、これらの菌株を人工的変異方法、たとえば紫
外線照射、Ｘ線照射、変異誘発剤処理などによって変異
させた変異株あるいは自然的に変異した変異株などでも
ＲＰ−１７７６生産能を有するものであれば本発明に用
いることができる。

【００１６】具体的に好適な例としては、ストレプトマ
イセス・エスピー(Streptomyces sp.)ＲＰ−１７７６株
があげられる。ストレプトマイセス・エスピー(Strepto
myces sp.)ＲＰ−１７７６株の形態、培養性状、生理学
的性質における特徴を記述する。

【００１７】１. 形態的性質 1)菌糸気菌糸形成；有気菌糸の分断および運動性；無基生菌糸の分断および運動性；無 2)胞子胞子の形成の有無および着生位置；気菌糸に形成胞子嚢の形成の有無および着生位置；無胞子柄上で連鎖する胞子の数；10個以上多数の胞子が連鎖する場合の形状；直状又は曲状胞子の特徴表面構造；平滑形状および大きさ；短桿形、約0.6〜0.8μm × 0.7〜0.
9μm 運動性および鞭毛の存在；無 3)その他厚膜胞子；無集束菌糸；無疑似胞子嚢；無菌糸の分裂様式；単純分枝

【００１８】２.培養的性質ＲＰ−１７７６株は、一般に使用されている合成および
天然培地で普通もしくは旺盛な成育を示し、基生菌糸は
薄黄色から茶色系を示す。培地により茶色系の可溶性色
素が産生されることもある。各種培地上での28℃、14日
間培養した時の生育および色の特徴を下記に示す。な
お、色の表示は Color Harmony Manual ［Container Co
rporation of America(1958)］による色の分類に従っ
た。

【００１９】1)シュクロース・硝酸塩寒天培地生育状態；普通基生菌糸の色調；ライトアイボリー(2ca)〜オートミー
ル(2ec) 気菌糸の着生状態とその色調；普通、パーチメント(1c
b) 可溶性色素；無 2)グルコース・アスパラギン寒天培地生育状態；旺盛基生菌糸の色調；ベージュ(3ge) 気菌糸の着生状態とその色調；旺盛、ホワイト(a)〜ア
イボリーチント(2cb) 可溶性色素；無 3)グリセリン・アスパラギン寒天培地生育状態；旺盛基生菌糸の色調；オートミール(2ec)〜バンブー(2gc) 気菌糸の着生状態とその色調；旺盛、ホワイト(a)〜オ
ートミール(2ec) 可溶性色素；無 4)スターチ・無機塩寒天培地生育状態；旺盛基生菌糸の色調；バンブー(2gc)〜コークタン(4ie) 気菌糸の着生状態とその色調；旺盛、オートミール(2e
c)〜ライトオリーブグレー(1 1/2ge) 可溶性色素；わずかに産生（茶色）

【００２０】5)チロシン寒天培地生育状態；旺盛基生菌糸の色調；バンブー(2gc)〜ビーバー(3li) 気菌糸の着生状態とその色調；旺盛、オートミール(2e
c) 可溶性色素；わずかに産生（茶色） 6)栄養寒天培地生育状態；旺盛基生菌糸の色調；ライトウィート(2ea)〜ライトゴール
ド(2ic) 気菌糸の着生状態とその色調；旺盛、ホワイト(a)〜ラ
イトアイボリー(2ca) 可溶性色素；わずかに産生（茶色） 7)イースト・麦芽寒天培地生育状態；旺盛基生菌糸の色調；マスタードブラウン(2pi)〜ビーバー
(3li) 気菌糸の着生状態とその色調；旺盛、ホワイト(a)〜オ
ートミール(2ec) 可溶性色素；産生（茶色） 8)オートミール寒天培地生育状態；旺盛基生菌糸の色調；ライトマスタードタン(2ie) 気菌糸の着生状態とその色調；旺盛、オートミール(2e
c) 可溶性色素；わずかに産生（黄土色）

【００２１】３.生理学的性質ＲＰ−１７７６株の生理学的諸性質を以下に示す。1)に
ついては14日間培養後、2)〜6)については28℃、2〜3週
間培養後の結果を記述する。 1)生育温度範囲；6℃〜 35℃ 2)ゼラチンの液化；有 3)スターチの加水分解；有 4)脱脂粉乳の凝固およびペプトン化；ペプトン化する 5)メラニン様色素の生成 (1) ペプトン・イースト・鉄寒天培地；無 (2) チロシン寒天培地；有 6)炭素源の利用性基礎培地はプリードハム・ゴトリーブ寒天培地を使用し
た。以下、＋は利用することを、−は利用しないことを
示す。 L-アラビノース；＋ D-キシロース；＋ D-グルコース；＋シュクロース；− ラフィノース；− D-フルクトース；＋ラムノース；＋イノシトール；− D-マンニトール；＋

【００２２】４.化学分類的性質 1)菌体中のジアミノピメリン酸の光学異性体；LL型 2)菌体脂質の主要キノン；MK-9(H₆),MK-9(H₈) 以上、形態的には気中菌糸に胞子鎖が形成されること、
化学分類的には細胞壁がI 型（LL−ジアミノピメリン
酸、グリシン）であること、および、主要キノンがメナ
キノン９の3飽和型(MK-9(H₆))、4飽和型(MK-9(H₈))であ
ることから、本菌株は放線菌の中でストレプトマイセス
属に分類される。

【００２３】従って、本菌株をストレプトマイセス・エ
スピーＲＰ−１７７６（Streptomyces sp.ＲＰ−１７７
６）と命名し、工業技術院生命工学工業技術研究所にFE
RM BP-5396として平成８年２月１５日付けで寄託した。
本発明の化合物ＲＰ−１７７６生産菌の培養に際して
は、放線菌の培養に用いられる通常の培養方法が適用さ
れる。培地としては、菌の資化し得る炭素源、窒素源、
無機物などを程よく含有する培地であれば天然培地、合
成培地いずれでも使用可能である。

【００２４】炭素源としては、グルコース、澱粉、デキ
ストリン、マンノース、マルトースなどの炭水化物、ク
エン酸、リンゴ酸、酢酸、フマール酸などの有機酸、メ
タノール、エタノールなどのアルコール、メタン、エタ
ン、プロパン、ｎ−パラフィンなどの炭化水素、グルタ
ミン酸などのアミノ酸あるいはグリセロールなどが用い
られる。

【００２５】窒素源としては、塩化アンモニウム、硫酸
アンモニウム、硝酸アンモニウム、リン酸アンモニウム
などのアンモニウム塩、アスパラギン酸、グルタミン、
シスチン、アラニンなどのアミノ酸、尿素、ペプトン、
肉エキス、酵母エキス、乾燥酵母、コーン・スチープ・
リカー、ソルブル・ベジタブル・プロテイン、ソイ・ビ
ーン・ミール、トリプトン、綿実粕、大豆カゼイン、カ
ザミノ酸、ファーマメディアなどが用いられる。

【００２６】無機物としては、リン酸一水素カリウム、
リン酸二水素カリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン
酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄、硫酸
マンガン、硫酸銅、硫酸コバルト、硫酸亜鉛、パントテ
ン酸カルシウム、モリブデン酸アンモニウム、硫酸アル
ミニウムカリウム、炭酸バリウム、炭酸カルシウム、塩
化コバルト、硫酸ニッケル、食塩などが用いられる。

【００２７】その他必要に応じて、培地にビタミン、た
とえばサイアミンなど菌体の増殖あるいはＲＰ−１７７
６の生産を促進する物質を加える。また、用いる微生物
が特定の物質を要求する場合は、該物質を加える。培養
は振盪培養法、通気撹拌培養法などにより、１５〜３５
℃の温度で、中性付近のpHで行われる。通常３〜１５日
の培養によって、ＲＰ−１７７６の蓄積は最大に達し、
培養は完了する。

【００２８】培養液中に蓄積したＲＰ−１７７６を培養
液から単離採取するに際しては、培養液から微生物代謝
産物を採取する通常の方法が適用される。すなわち、ア
セトン、メタノールなどの有機溶媒による菌体成分の抽
出、ろ過、遠心分離などによる菌体除去、吸着樹脂、シ
リカゲル、シラナイズドシリカゲル、逆相シリカゲル、
アルミニウム、セルロース、ケイ藻土、ケイ酸マグネシ
ウム、ゲルろ過剤、イオン交換樹脂などを用いるカラム
クロマトグラフィーもしくは薄層クロマトグラフィーに
よる活性物質の吸脱着処理、適当な溶媒系による分配な
どによってＲＰ−１７７６は単離される。

【００２９】上記精製工程中のＲＰ−１７７６の検出
は、蛍光剤入りシリカゲル（キーゲルゼルＦ₂₅₄、メル
ク社製）を用いた薄層クロマトグラフィー、ついでヨウ
素反応または２５３．７nmの紫外線照射法により行うこ
とができる。以下に本発明の実施例を示す。

【００３０】

【実施例】

実施例１種菌として、ストレプトマイセス・エスピー
ＲＰ−１７７６(FERM BP-5396)を用い、第一種培地とし
てグルコース１０ｇ／Ｌ、可溶性デンプン１０ｇ／Ｌ、
バクトトリプトン５ｇ／Ｌ、酵母エキス５ｇ／Ｌ、肉エ
キス５ｇ／Ｌ、リン酸マグネシウム・８水和物０．５ｇ
／Ｌ（ｐＨ７．２）の組成からなる培地を用いた。種菌
１白金耳を太型試験管に入れた第一種培地１０mlに植菌
し、２８℃で５日間振盪培養した（第一種培養）。

【００３１】この第一種培養液５mlを３００ml容三角フ
ラスコに入った５０mlの第二種培地に植菌した。第二種
培地の組成は第一種培地の組成と同じである。第二種培
養は２８℃で２日間行った。得られた第二種培養液５０
mlを２Ｌ容三角フラスコに入った５００mlの第三種培地
に植菌した。第三種培地の組成は第一種培地の組成と同
じである。第三種培養は２８℃で３日間行った。

【００３２】得られた第三種培養液５００mlを３０Ｌ容
培養タンクに入った１５Ｌの主発酵培地に植菌した。主
発酵培地としては、可溶性デンプン４０ｇ／Ｌ、ソイ・
ビーン・ミール１０ｇ／Ｌ、コーン・スチープ・リカー
５ｇ／Ｌ、乾燥酵母５ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム
０．５ｇ／Ｌ、硫酸亜鉛・７水和物１０ｍｇ／Ｌ、塩化
コバルト・６水和物１ｍｇ／Ｌ、硫酸ニッケル１ｍｇ／
Ｌ、ダイアイオンＨＰ−２０（三菱化成社製）１０％
容、リン酸マグネシウム・８水和物０．５ｇ／Ｌの組成
とする培地（pH７．０）を用いた。この主発酵培養は２
８℃、通気量１ｖｖｍ、撹拌回転数２００ｒｐｍで４日
間通気撹拌培養することにより行った。

【００３３】得られた主発酵培養液１５Ｌに濾過助剤
（ラヂオライト＃６００、昭和化学社製）を添加後、遠
心分離器（回転数：1,800rpm）を用いて分別した。分別
した菌体に１５Ｌのメタノールを加え撹拌後ろ過した。
ろ液に１５Ｌの脱イオン水を添加し、脱イオン水を用い
て充填した２ＬのダイヤイオンＨＰ−２０カラム（三菱
化成社製）に通塔した。カラムを５０％メタノール水溶
液６Ｌで洗浄後、６Ｌのメタノール−アセトン混合溶媒
（７：３）で溶出した。溶出液を減圧下で濃縮して、５
００ｍｌの酢酸エチルを用いて５回洗浄した後、減圧下
で乾固し、７ｇの灰色の粉末を得た。この粉末を２００
ｍｇずつとり、５ｍｌの７８％メタノール溶液に溶解
し、同じ組成の溶媒を用いて充填した１５０ｍｌの逆相
シリカゲルカラム（ＹＭＣ社製、ＯＤＳ−ＡＱＳ５０）
に重層し、同じ組成の溶媒で溶出した。溶出液を２０ｍ
ｌずつ試験管に分取すると、ＲＰ−１７７６は画分番号
３４から４７に溶出された。この操作を粉末全量に対し
て繰り返し行った結果、ＲＰ−１７７６粗精製品を１．
４ｇ得た。得られた粗精製品を２０ｍｇとり、０．１％
トリフルオロ酢酸を含む７８％メタノール溶液に溶解し
た。これを、逆相シリカゲルカラム（ＹＭＣＯＤＳ
ＡＱＳＨ−３２３５−ＡＱ、ＹＭＣ社製）を用いた
分取ＨＰＬＣで分画した。分取ＨＰＬＣは室温、流速１
０ｍｌ／分の条件で行い、２２０ｎｍの吸光度を測定す
ることにより検出した結果、ＲＰ−１７７６はＨＰＬＣ
開始後、３２分から３４分に溶出された。溶出画分を集
めた後、等量の脱イオン水で希釈し、脱イオン水を用い
て充填した２０ｍｌのＨＰ−２０カラム（三菱化成社
製）に通塔した。カラムを６０ｍｌの脱イオン水で洗浄
後、６０ｍｌのメタノール−アセトン混合溶媒（７：
３）を用いて溶出した。溶出液を集め、減圧下で乾固す
ると、ＲＰ−１７７６の無色粉末が得られた。以上の操
作を粗精製品１．４ｇ全量に対して繰り返し行った結
果、３４０ｍｇの化合物ＲＰ−１７７６の粉末を得た。

【００３４】

【発明の効果】本発明によれば、抗菌活性を有するＲＰ
−１７７６を提供することができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者松田譲東京都小金井市貫井南町１−22−７

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】式（Ｉ）【化１】で表される化合物ＲＰ−１７７６。