JPH09215498A - ヌクレオシド化合物の製造方法 - Google Patents
ヌクレオシド化合物の製造方法Info
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- JPH09215498A JPH09215498A JP4961996A JP4961996A JPH09215498A JP H09215498 A JPH09215498 A JP H09215498A JP 4961996 A JP4961996 A JP 4961996A JP 4961996 A JP4961996 A JP 4961996A JP H09215498 A JPH09215498 A JP H09215498A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 酵素による核酸塩基の交換反応を利用してヌ
クレオシド化合物を得る方法において、交換反応を高濃
度でかつ反応速度を向上させてヌクレオシド化合物を得
る方法を提供する。 【解決手段】 イノシン及びデオキシイノシンからなる
群より選択されるヌクレオシドとピリミジン塩基とを、
リン酸又はリン酸塩存在下の水溶液中において、耐熱性
プリンヌクレオシドホスホリラーゼ及び耐熱性ピリミジ
ンヌクレオシドホスホリラーゼにより塩基交換させ、こ
の塩基交換反応により生成したヒポキサンチンを電子受
容体の共存下に耐熱性キサンチンデヒドロゲナーゼによ
り尿酸に変化させることにより、ヌクレオシド化合物を
得る。
クレオシド化合物を得る方法において、交換反応を高濃
度でかつ反応速度を向上させてヌクレオシド化合物を得
る方法を提供する。 【解決手段】 イノシン及びデオキシイノシンからなる
群より選択されるヌクレオシドとピリミジン塩基とを、
リン酸又はリン酸塩存在下の水溶液中において、耐熱性
プリンヌクレオシドホスホリラーゼ及び耐熱性ピリミジ
ンヌクレオシドホスホリラーゼにより塩基交換させ、こ
の塩基交換反応により生成したヒポキサンチンを電子受
容体の共存下に耐熱性キサンチンデヒドロゲナーゼによ
り尿酸に変化させることにより、ヌクレオシド化合物を
得る。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、耐熱性酵素による
核酸塩基の交換反応を利用してヌクレオシド化合物を製
造する方法に関する。
核酸塩基の交換反応を利用してヌクレオシド化合物を製
造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】従来、酵素による核酸塩基の交換反応を
利用してヌクレオシド化合物を製造する方法が提案され
ているが、原料系と生成系の間に反応の平衡状態が生
じ、収率が向上しない原因となっていた。これに対し
て、特開平４−１９７１９３号公報に、イノシン又はデ
オキシイノシンであるヌクレオシドと核酸塩基とをリン
酸塩の水溶液中、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ及
びピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼにより塩基交
換反応させ、この交換反応により生成したヒポキサンチ
ンをキサンチンオキシダーゼにより尿酸に変化させて、
ヌクレオシド化合物を得る方法が開示されている。
利用してヌクレオシド化合物を製造する方法が提案され
ているが、原料系と生成系の間に反応の平衡状態が生
じ、収率が向上しない原因となっていた。これに対し
て、特開平４−１９７１９３号公報に、イノシン又はデ
オキシイノシンであるヌクレオシドと核酸塩基とをリン
酸塩の水溶液中、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ及
びピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼにより塩基交
換反応させ、この交換反応により生成したヒポキサンチ
ンをキサンチンオキシダーゼにより尿酸に変化させて、
ヌクレオシド化合物を得る方法が開示されている。
【０００３】しかし、該公報に開示された方法では、プ
リンヌクレオシドホスホリラーゼ及びピリミジンヌクレ
オシドホスホリラーゼについては耐熱性酵素を用いてい
るが、キサンチンオキシダーゼは５０℃以上に至適生育
温度を有する耐熱性キサンチンオキシダーゼは見いださ
れていなかったので、常温に至適生育温度を有するキサ
ンチンオキシダーゼが用いられ、したがって反応温度は
４０℃に設定されており、反応全体として耐熱性のプリ
ンヌクレオシドホスホリラーゼ及びピリミジンヌクレオ
シドホスホリラーゼを用いる利点が生かされていなかっ
た。
リンヌクレオシドホスホリラーゼ及びピリミジンヌクレ
オシドホスホリラーゼについては耐熱性酵素を用いてい
るが、キサンチンオキシダーゼは５０℃以上に至適生育
温度を有する耐熱性キサンチンオキシダーゼは見いださ
れていなかったので、常温に至適生育温度を有するキサ
ンチンオキシダーゼが用いられ、したがって反応温度は
４０℃に設定されており、反応全体として耐熱性のプリ
ンヌクレオシドホスホリラーゼ及びピリミジンヌクレオ
シドホスホリラーゼを用いる利点が生かされていなかっ
た。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明は酵素による核
酸塩基の交換反応を利用してヌクレオシド化合物を得る
方法において、耐熱性酵素を使用することにより、交換
反応を高濃度でかつ反応速度を向上させたヌクレオシド
化合物の製造方法を提供する。
酸塩基の交換反応を利用してヌクレオシド化合物を得る
方法において、耐熱性酵素を使用することにより、交換
反応を高濃度でかつ反応速度を向上させたヌクレオシド
化合物の製造方法を提供する。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは上述の問題
点を解決すべく、耐熱性キサンチンデヒドロゲナーゼを
産生する微生物を鋭意探索した結果、土壌中から、４８
〜５３℃に至適生育温度を有し、５５〜６０℃に至適反
応温度を持つ耐熱性キサンチンデヒドロゲナーゼを産生
する微生物を発見したものであり、該耐熱性キサンチン
デヒドロゲナーゼを見出したことにより、交換反応を高
濃度でかつ反応速度を向上させるという本発明を完成す
るに至った。
点を解決すべく、耐熱性キサンチンデヒドロゲナーゼを
産生する微生物を鋭意探索した結果、土壌中から、４８
〜５３℃に至適生育温度を有し、５５〜６０℃に至適反
応温度を持つ耐熱性キサンチンデヒドロゲナーゼを産生
する微生物を発見したものであり、該耐熱性キサンチン
デヒドロゲナーゼを見出したことにより、交換反応を高
濃度でかつ反応速度を向上させるという本発明を完成す
るに至った。
【０００６】本発明に用いられる耐熱性プリンヌクレオ
シドホスホリラーゼ、耐熱性ピリミジンヌクレオシドホ
スホリラーゼ、及び耐熱性キサンチンデヒドロゲナーゼ
は、いかなる起源のものでも構わないが、５０℃以上に
至適反応温度を有する耐熱性酵素である。
シドホスホリラーゼ、耐熱性ピリミジンヌクレオシドホ
スホリラーゼ、及び耐熱性キサンチンデヒドロゲナーゼ
は、いかなる起源のものでも構わないが、５０℃以上に
至適反応温度を有する耐熱性酵素である。
【０００７】核酸塩基は、一般に常温で水に対する溶解
度が低く、高温になるにつれて急激に溶解度が上昇す
る。したがって、耐熱性酵素を用いることにより、初め
て高濃度反応が可能となる。また、一般に化学反応は温
度が１０℃上昇すると、反応速度が２倍になるので、触
媒としての酵素の能力が同一であれば、耐熱性酵素を用
いることにより、反応速度の向上が図られる。更に、耐
熱性酵素を用いると、低温殺菌の温度に近い温度で反応
を行うことになるので、微生物汚染が少なく、酵素の寿
命が長くなる。
度が低く、高温になるにつれて急激に溶解度が上昇す
る。したがって、耐熱性酵素を用いることにより、初め
て高濃度反応が可能となる。また、一般に化学反応は温
度が１０℃上昇すると、反応速度が２倍になるので、触
媒としての酵素の能力が同一であれば、耐熱性酵素を用
いることにより、反応速度の向上が図られる。更に、耐
熱性酵素を用いると、低温殺菌の温度に近い温度で反応
を行うことになるので、微生物汚染が少なく、酵素の寿
命が長くなる。
【０００８】本発明で用いた耐熱性プリンヌクレオシド
ホスホリラーゼ及び耐熱性ピリミジンヌクレオシドホス
ホリラーゼは、この２種の酵素を同時に産生するバチル
ス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｓｔ
ｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ） ＪＴＳ８５９
（ＰＥＲＭ Ｐ−９６６６）より調製した。
ホスホリラーゼ及び耐熱性ピリミジンヌクレオシドホス
ホリラーゼは、この２種の酵素を同時に産生するバチル
ス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｓｔ
ｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ） ＪＴＳ８５９
（ＰＥＲＭ Ｐ−９６６６）より調製した。
【０００９】耐熱性キサンチンデヒドロゲナーゼは、本
発明者が土壌中から５５〜６０℃に至適反応温度を有す
るキサンチンデヒドロゲナーゼを産生する微生物より調
製した。本菌株は、シュードモナス・エスピー（Ｐｓｅ
ｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）Ｙ−５１０であり、通商産
業省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されてお
り、寄託番号はＦＥＲＭ Ｐ−１５１０４である（本菌
株の寄託の際の表示はシュードモナス・サーモカルボキ
シドボランス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｔｈｅｒｍｏ
ｃａｒｂｏｘｙｄｏｖｏｒａｎｓ）ＹＧＫ−０５１０で
あり、寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１５１０４であったが、
その後記載事項変更届を提出し、表示をシュードモナス
・エスピー Ｙ−５１０と変更した）。
発明者が土壌中から５５〜６０℃に至適反応温度を有す
るキサンチンデヒドロゲナーゼを産生する微生物より調
製した。本菌株は、シュードモナス・エスピー（Ｐｓｅ
ｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）Ｙ−５１０であり、通商産
業省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されてお
り、寄託番号はＦＥＲＭ Ｐ−１５１０４である（本菌
株の寄託の際の表示はシュードモナス・サーモカルボキ
シドボランス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｔｈｅｒｍｏ
ｃａｒｂｏｘｙｄｏｖｏｒａｎｓ）ＹＧＫ−０５１０で
あり、寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１５１０４であったが、
その後記載事項変更届を提出し、表示をシュードモナス
・エスピー Ｙ−５１０と変更した）。
【００１０】本菌株の菌学的性質を、バージェイズ・マ
ニュアル・オブ・システマテック・バクテリオロジー第
２巻に準じて検討した結果は次のようである。 １．形態 桿菌：１．６〜３．２μｍ×０．６〜０．７μｍ ２．培養的性質 ＮＢ培地：５０℃、２日間培養 平板上：黄色。光沢あり、透明、盛り上がらない。コロ
ニーの形は円形。 スラント上：黄色。光沢あり、透明、盛り上がらない。
生育は中程度。
ニュアル・オブ・システマテック・バクテリオロジー第
２巻に準じて検討した結果は次のようである。 １．形態 桿菌：１．６〜３．２μｍ×０．６〜０．７μｍ ２．培養的性質 ＮＢ培地：５０℃、２日間培養 平板上：黄色。光沢あり、透明、盛り上がらない。コロ
ニーの形は円形。 スラント上：黄色。光沢あり、透明、盛り上がらない。
生育は中程度。
【００１１】３．生化学的性質 （１）グラム染色 陰性 （２）嫌気的性質 生育せず （３）運動性 あり、単極毛 （４）オキシダーゼ 陽性 （５）カタラーゼ 陰性 （６）ゼラチンの変化 液化能なし （７）ＯＦテスト 陰性
【００１２】 （８）グルコースからの酸の産生 産生せず （９）ラクトースからの酸の産生 産生せず （１０）キシロースからの酸の産生 産生せず （１１）ガラクトースからの酸の産生 産生せず （１２）硝酸塩の還元 陽性 （１３）硝酸カリウムの脱窒能 陰性 （１４）無機窒素源の利用 ＮＯ3 を唯一の窒素源として 生育しない ＮＨ4 を唯一の窒素源として 生育した
【００１３】 （１５）独立栄養の基質 ＣＯを唯一の炭素源として 生育しない （１６）生育温度 ４０〜５５℃で生育 至適 ４８〜５３℃ （１７）尿素の加水分解 分解能なし （１８）クエン酸の利用 陰性 （１９）インドールの産生 陰性 （２０）ＧＣ含量 ６７．７％
【００１４】以上の菌学的性質に基づき、本菌株はシュ
ードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）に属
することが判明した。本菌株に最も近い種としてはシュ
ードモナス・サーモカルボキシドボランス（Ｐｓｅｕｄ
ｏｍｏｎａｓ ｔｈｅｒｍｏｃａｒｂｏｘｙｄｏｖｏｒ
ａｎｓ）を挙げることができる。しかしながら、比較検
討の結果、本菌株は一酸化炭素を資化できない点が該菌
と異なっていた。
ードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）に属
することが判明した。本菌株に最も近い種としてはシュ
ードモナス・サーモカルボキシドボランス（Ｐｓｅｕｄ
ｏｍｏｎａｓ ｔｈｅｒｍｏｃａｒｂｏｘｙｄｏｖｏｒ
ａｎｓ）を挙げることができる。しかしながら、比較検
討の結果、本菌株は一酸化炭素を資化できない点が該菌
と異なっていた。
【００１５】本菌株から調製した耐熱性キサンチンデヒ
ドロゲナーゼは以下の性質を有する。 １．作用：ヒポキサンチンからキサンチンを経て尿酸に
する。 ２．基質特異性：ヒポキサンチン又はキサンチンに対し
て作用する。 ３．至適ｐＨ：８．２〜９．５ ４．至適反応温度：５５〜６０℃ ５．安定性：ｐＨ７．０において４０〜５０℃、６０分
処理で安定 ６．活性化：メチレンブルー、ＮＡＤ（ニコチンアミド
アデニン ジヌクレオチド）、ＮＡＤＰ（ニコチンア
ミド アデニン ジヌクレオチド リン酸）などの電子
受容体を必要とする。
ドロゲナーゼは以下の性質を有する。 １．作用：ヒポキサンチンからキサンチンを経て尿酸に
する。 ２．基質特異性：ヒポキサンチン又はキサンチンに対し
て作用する。 ３．至適ｐＨ：８．２〜９．５ ４．至適反応温度：５５〜６０℃ ５．安定性：ｐＨ７．０において４０〜５０℃、６０分
処理で安定 ６．活性化：メチレンブルー、ＮＡＤ（ニコチンアミド
アデニン ジヌクレオチド）、ＮＡＤＰ（ニコチンア
ミド アデニン ジヌクレオチド リン酸）などの電子
受容体を必要とする。
【００１６】本発明における核酸塩基の交換反応を用い
るヌクレオシド化合物の製造方法について、まず、核酸
塩基としてピリミジン塩基を用いた場合で反応を説明す
る。 （１）耐熱性プリンヌクレオシドホスホリラーゼによ
り、イノシン又はデオキシイノシンとリン酸又はリン酸
塩から、ヒポキサンチンとリボース−１−リン酸又はデ
オキシリボース−１−リン酸が生成する。
るヌクレオシド化合物の製造方法について、まず、核酸
塩基としてピリミジン塩基を用いた場合で反応を説明す
る。 （１）耐熱性プリンヌクレオシドホスホリラーゼによ
り、イノシン又はデオキシイノシンとリン酸又はリン酸
塩から、ヒポキサンチンとリボース−１−リン酸又はデ
オキシリボース−１−リン酸が生成する。
【００１７】（２）次に、生成したリボース−１−リン
酸又はデオキシリボース−１−リン酸が、耐熱性ピリミ
ジンヌクレオシドホスホリラーゼにより、ピリミジン塩
基と置換反応を行う。これにより、リボース−１−リン
酸とピリミジン塩基との反応からピリミジンヌクレオシ
ドが生成し、デオキシリボース−１−リン酸とピリミジ
ン塩基との反応からはピリミジンデオキシヌクレオシド
が生成する。（１）と（２）の反応を整理すると、イノ
シン又はデオキシイノシンとピリミジン塩基を用いて耐
熱性プリンヌクレオシドホスホリラーゼ及び耐熱性ピリ
ミジンヌクレオシドホスホリラーゼにより、塩基交換反
応を行い、ピリミジンヌクレオシド又はピリミジンデオ
キシヌクレオシドとヒポキサンチンが生成する。
酸又はデオキシリボース−１−リン酸が、耐熱性ピリミ
ジンヌクレオシドホスホリラーゼにより、ピリミジン塩
基と置換反応を行う。これにより、リボース−１−リン
酸とピリミジン塩基との反応からピリミジンヌクレオシ
ドが生成し、デオキシリボース−１−リン酸とピリミジ
ン塩基との反応からはピリミジンデオキシヌクレオシド
が生成する。（１）と（２）の反応を整理すると、イノ
シン又はデオキシイノシンとピリミジン塩基を用いて耐
熱性プリンヌクレオシドホスホリラーゼ及び耐熱性ピリ
ミジンヌクレオシドホスホリラーゼにより、塩基交換反
応を行い、ピリミジンヌクレオシド又はピリミジンデオ
キシヌクレオシドとヒポキサンチンが生成する。
【００１８】（３）反応系に耐熱性キサンチンデヒドロ
ゲナーゼと、メチレンブルー、ＮＡＤ、ＮＡＤＰなどの
電子受容体とを共存させることにより、イノシン又はデ
オキシイノシンの分解で生成したヒポキサンチンは不可
逆的にキサンチンを経て尿酸となる。生成した尿酸は、
耐熱性プリンヌクレオシドホスホリラーゼ及び耐熱性ピ
リミジンヌクレオシドホスホリラーゼの基質にはなり得
ないので、基質の交換反応には関与せず反応系から除外
される。これにより、反応の平衡を目的物のヌクレオシ
ド化合物が生成する側へ移動させ、目的物が定量的に得
られる。
ゲナーゼと、メチレンブルー、ＮＡＤ、ＮＡＤＰなどの
電子受容体とを共存させることにより、イノシン又はデ
オキシイノシンの分解で生成したヒポキサンチンは不可
逆的にキサンチンを経て尿酸となる。生成した尿酸は、
耐熱性プリンヌクレオシドホスホリラーゼ及び耐熱性ピ
リミジンヌクレオシドホスホリラーゼの基質にはなり得
ないので、基質の交換反応には関与せず反応系から除外
される。これにより、反応の平衡を目的物のヌクレオシ
ド化合物が生成する側へ移動させ、目的物が定量的に得
られる。
【００１９】例えば、出発原料のヌクレオシドとしてイ
ノシンを、ピリミジン塩基としてチミンを用いて目的物
のヌクレオシド化合物として５−メチルウリジンを得る
場合は、
ノシンを、ピリミジン塩基としてチミンを用いて目的物
のヌクレオシド化合物として５−メチルウリジンを得る
場合は、
【００２０】
【化１】 （式中、は耐熱性プリンヌクレオシドホスホリラー
ゼ、は耐熱性ピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼ
を示す） （１）と（２）から
ゼ、は耐熱性ピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼ
を示す） （１）と（２）から
【００２１】
【化２】 （式中、とは前記と同一）
【００２２】
【化３】 （式中、は耐熱性キサンチンデヒドロゲナーゼを示
す）
す）
【００２３】一方、交換反応を行う核酸塩基としてプリ
ン塩基を用いた場合は次のようである。（１）と（３）
の反応は上述と同じであるが、（２）では、イノシン又
はデオキシイノシンから生じたリボース−１−リン酸又
はデオキシリボース−１−リン酸が、耐熱性プリンヌク
レオシドホスホリラーゼにより、プリン塩基と置換反応
を行う。これにより、リボース−１−リン酸とプリン塩
基との反応からプリンヌクレオシドが生成し、デオキシ
リボース−１−リン酸とプリン塩基との反応からはプリ
ンデオキシヌクレオシドが生成する。すなわち、イノシ
ン又はデオキシイノシンとプリン塩基を用いて耐熱性プ
リンヌクレオシドホスホリラーゼにより、塩基交換反応
を行い、プリンヌクレオシド又はプリンデオキシヌクレ
オシドとヒポキサンチンが生成する。
ン塩基を用いた場合は次のようである。（１）と（３）
の反応は上述と同じであるが、（２）では、イノシン又
はデオキシイノシンから生じたリボース−１−リン酸又
はデオキシリボース−１−リン酸が、耐熱性プリンヌク
レオシドホスホリラーゼにより、プリン塩基と置換反応
を行う。これにより、リボース−１−リン酸とプリン塩
基との反応からプリンヌクレオシドが生成し、デオキシ
リボース−１−リン酸とプリン塩基との反応からはプリ
ンデオキシヌクレオシドが生成する。すなわち、イノシ
ン又はデオキシイノシンとプリン塩基を用いて耐熱性プ
リンヌクレオシドホスホリラーゼにより、塩基交換反応
を行い、プリンヌクレオシド又はプリンデオキシヌクレ
オシドとヒポキサンチンが生成する。
【００２４】例えば、出発原料のヌクレオシドとしてイ
ノシンを、プリン塩基としてアデニンを用いて目的物の
ヌクレオシド化合物としてアデノシンを得る場合は、
ノシンを、プリン塩基としてアデニンを用いて目的物の
ヌクレオシド化合物としてアデノシンを得る場合は、
【００２５】
【化４】 （式中、は前記と同一） （１）と（２）から
【００２６】
【化５】 （式中、は前記と同一）
【００２７】
【化６】 （式中、は前記と同一）
【００２８】本発明で核酸塩基としてピリミジン塩基を
用いる場合は、（２）の反応において、耐熱性プリンヌ
クレオシドホスホリラーゼ及び耐熱性ピリミジンヌクレ
オシドホスホリラーゼが必要である。一方、プリン塩基
の場合は、耐熱性プリンヌクレオシドホスホリラーゼの
みが必要であるが耐熱性ピリミジンヌクレオシドホスホ
リラーゼを含んでいても反応には差し支えない。
用いる場合は、（２）の反応において、耐熱性プリンヌ
クレオシドホスホリラーゼ及び耐熱性ピリミジンヌクレ
オシドホスホリラーゼが必要である。一方、プリン塩基
の場合は、耐熱性プリンヌクレオシドホスホリラーゼの
みが必要であるが耐熱性ピリミジンヌクレオシドホスホ
リラーゼを含んでいても反応には差し支えない。
【００２９】本発明は、工業的に生産が可能であり、安
価に容易に入手可能であるイノシンを原料とし、核酸塩
基の反応を行うことにより、医薬用原料やＤＮＡ合成試
薬原料として有用な化合物であるヌクレオシド化合物を
容易にかつ収率よく製造するものである。
価に容易に入手可能であるイノシンを原料とし、核酸塩
基の反応を行うことにより、医薬用原料やＤＮＡ合成試
薬原料として有用な化合物であるヌクレオシド化合物を
容易にかつ収率よく製造するものである。
【００３０】
【発明の実施の形態】本発明で用いられる耐熱性プリン
ヌクレオシドホスホリラーゼ、耐熱性ピリミジンヌクレ
オシドホスホリラーゼ及び耐熱性キサンチンデヒドロゲ
ナーゼは、５０℃以上に至適反応温度を有する耐熱性酵
素であり、その使用形態は、該酵素を産生する菌体、そ
の破砕物又は抽出物として用いられる。
ヌクレオシドホスホリラーゼ、耐熱性ピリミジンヌクレ
オシドホスホリラーゼ及び耐熱性キサンチンデヒドロゲ
ナーゼは、５０℃以上に至適反応温度を有する耐熱性酵
素であり、その使用形態は、該酵素を産生する菌体、そ
の破砕物又は抽出物として用いられる。
【００３１】本発明の原料として用いられるヌクレオシ
ドは、市場に容易に入手可能なイノシン及びイノシンか
ら容易に化学的に変換可能である２’−デオキシイノシ
ン、３’−デオキシイノシンが挙げられる。
ドは、市場に容易に入手可能なイノシン及びイノシンか
ら容易に化学的に変換可能である２’−デオキシイノシ
ン、３’−デオキシイノシンが挙げられる。
【００３２】用いられるピリミジン塩基は特に制限され
ない。例えば、ウラシル、チミンなどの天然型ピリミジ
ン塩基、５−フルオロウラシル、５−クロロウラシル、
５−ブロモウラシル、５−ヨードウラシル、５−エチル
ウラシル、５−トリフルオロメチルウラシル、５−カル
ボキシウラシルなどの非天然型ピリミジン塩基が挙げら
れる。
ない。例えば、ウラシル、チミンなどの天然型ピリミジ
ン塩基、５−フルオロウラシル、５−クロロウラシル、
５−ブロモウラシル、５−ヨードウラシル、５−エチル
ウラシル、５−トリフルオロメチルウラシル、５−カル
ボキシウラシルなどの非天然型ピリミジン塩基が挙げら
れる。
【００３３】また、キサンチンデヒドロゲナーゼはヒポ
キサンチンに作用してキサンチンを経て尿酸とするの
で、用いられるプリン塩基としては、ヒポキサンチン及
びキサンチン以外のプリン塩基であれば特に制限されな
い。例えば、アデニン、グアニンなどの天然型プリン塩
基、２−クロロプリン、６−クロロプリン、２，６−ジ
クロロプリン、２−アミノ−６−クロロプリン、２，６
−ジアミノプリン、６−メルカプトプリン、６−メチル
チオプリン、２−アミノプリンなどの非天然型プリン塩
基が挙げられる。
キサンチンに作用してキサンチンを経て尿酸とするの
で、用いられるプリン塩基としては、ヒポキサンチン及
びキサンチン以外のプリン塩基であれば特に制限されな
い。例えば、アデニン、グアニンなどの天然型プリン塩
基、２−クロロプリン、６−クロロプリン、２，６−ジ
クロロプリン、２−アミノ−６−クロロプリン、２，６
−ジアミノプリン、６−メルカプトプリン、６−メチル
チオプリン、２−アミノプリンなどの非天然型プリン塩
基が挙げられる。
【００３４】本発明において、用いられるヌクレオシド
の初期濃度は５〜１００ｍＭであり、好ましくは１０〜
５０ｍＭである。また、核酸塩基の初期濃度は５〜１０
０ｍＭであり、好ましくは１０〜５０ｍＭである。リン
酸又はリン酸塩の初期濃度は１〜２０ｍＭであれば十分
である。また、ヌクレオシドと核酸塩基は同一の初期濃
度で用いる。ヌクレオシドとリン酸又はリン酸塩との濃
度比は大きい方が目的物のヌクレオシド化合物の収率は
増加する。
の初期濃度は５〜１００ｍＭであり、好ましくは１０〜
５０ｍＭである。また、核酸塩基の初期濃度は５〜１０
０ｍＭであり、好ましくは１０〜５０ｍＭである。リン
酸又はリン酸塩の初期濃度は１〜２０ｍＭであれば十分
である。また、ヌクレオシドと核酸塩基は同一の初期濃
度で用いる。ヌクレオシドとリン酸又はリン酸塩との濃
度比は大きい方が目的物のヌクレオシド化合物の収率は
増加する。
【００３５】反応液のｐＨは、７．０〜９．５であり、
好ましくは８．２〜９．５である。核酸塩基の中には５
−トリフルオロメチルウラシルのようにアルカリ側で不
安定なものもあるので、用いる原料の性質に応じて好ま
しい反応液のｐＨを設定すればよい。反応温度は５０〜
６０℃であり、好ましくは５０〜５５℃である。なお、
反応液からの生成物の採取は、クロマトグラフィーなど
により行うことができる。
好ましくは８．２〜９．５である。核酸塩基の中には５
−トリフルオロメチルウラシルのようにアルカリ側で不
安定なものもあるので、用いる原料の性質に応じて好ま
しい反応液のｐＨを設定すればよい。反応温度は５０〜
６０℃であり、好ましくは５０〜５５℃である。なお、
反応液からの生成物の採取は、クロマトグラフィーなど
により行うことができる。
【００３６】
【実施例】以下、製造例及び実施例にて本発明を更に説
明するが、本発明はこれら製造例及び実施例に限定され
るものではない。
明するが、本発明はこれら製造例及び実施例に限定され
るものではない。
【００３７】製造例１ 耐熱性プリンヌクレオシドホスホリラーゼと耐熱性ピリ
ミジンヌクレオシドホスホリラーゼの酵素液の調製 バチルス・ステアロサーモフィルス ＪＴＳ８５９（Ｐ
ＥＲＭ Ｐ−９６６６）を以下の手順で培養した。菌の
培養には、バクトトリプトン１０ｇ、イーストエキス５
ｇ、グルコース３ｇ、食塩３ｇ、イノシン１ｇ及び水１
ＬよりなるｐＨ６．２の培地を用いた。この培地１．５
Ｌにバチルス・ステアロサーモフィルスＪＴＳ８５９
（ＰＥＲＭ Ｐ−９６６６）の胞子３×１０7 個を添加
し、撹拌翼（直径７０ｍｍ、上下部各２枚）を有するジ
ャーファーメンターを用い、撹拌翼を７８０ｒｐｍで回
転させつつ、通気量１ｖｖｍ、培養温度６５℃、ｐＨ
６．０〜６．４で５時間培養した。培養終了後、菌体を
遠心分離（１０，０００ｇ、４℃、１５分）により集菌
した。次いで、酵素液を以下のようにして調製した。
ミジンヌクレオシドホスホリラーゼの酵素液の調製 バチルス・ステアロサーモフィルス ＪＴＳ８５９（Ｐ
ＥＲＭ Ｐ−９６６６）を以下の手順で培養した。菌の
培養には、バクトトリプトン１０ｇ、イーストエキス５
ｇ、グルコース３ｇ、食塩３ｇ、イノシン１ｇ及び水１
ＬよりなるｐＨ６．２の培地を用いた。この培地１．５
Ｌにバチルス・ステアロサーモフィルスＪＴＳ８５９
（ＰＥＲＭ Ｐ−９６６６）の胞子３×１０7 個を添加
し、撹拌翼（直径７０ｍｍ、上下部各２枚）を有するジ
ャーファーメンターを用い、撹拌翼を７８０ｒｐｍで回
転させつつ、通気量１ｖｖｍ、培養温度６５℃、ｐＨ
６．０〜６．４で５時間培養した。培養終了後、菌体を
遠心分離（１０，０００ｇ、４℃、１５分）により集菌
した。次いで、酵素液を以下のようにして調製した。
【００３８】得られた湿菌２０ｇを１０ｍＭリン酸カリ
ウム溶液（ｐＨ７．０、［緩衝液（ｐＨ７）と略す］）
に懸濁し、超音波破砕装置で菌体を破砕した。続いて、
緩衝液（ｐＨ７）を添加して全体を５０ｍｌとした後、
超遠心分離（３０，０００ｇ、４℃、２０分）を行い、
上清３０ｍｌを得た。この上清を熱処理した後、−１０
℃に冷却したアセトン２４ｍｌを添加し、１５分間撹拌
後、遠心分離（１０，０００ｇ、４℃、１０分）を行っ
て上清を得た。この上清に更にアセトン１８ｍｌを添加
し、１５分間撹拌の後、遠心分離（１０，０００ｇ、４
℃、１０分）を行い、沈殿物を得た。この沈殿物を３ｍ
ｌの緩衝液（ｐＨ７）に懸濁させ、アセトン処理済み酵
素液（酵素液［１］と略す）として３．５ｍｌを得た。
ウム溶液（ｐＨ７．０、［緩衝液（ｐＨ７）と略す］）
に懸濁し、超音波破砕装置で菌体を破砕した。続いて、
緩衝液（ｐＨ７）を添加して全体を５０ｍｌとした後、
超遠心分離（３０，０００ｇ、４℃、２０分）を行い、
上清３０ｍｌを得た。この上清を熱処理した後、−１０
℃に冷却したアセトン２４ｍｌを添加し、１５分間撹拌
後、遠心分離（１０，０００ｇ、４℃、１０分）を行っ
て上清を得た。この上清に更にアセトン１８ｍｌを添加
し、１５分間撹拌の後、遠心分離（１０，０００ｇ、４
℃、１０分）を行い、沈殿物を得た。この沈殿物を３ｍ
ｌの緩衝液（ｐＨ７）に懸濁させ、アセトン処理済み酵
素液（酵素液［１］と略す）として３．５ｍｌを得た。
【００３９】製造例２ 耐熱性キサンチンデヒドロゲナーゼの酵素液の調製 シュードモナス・エスピー Ｙ−５１０（ＦＥＲＭ Ｐ
−１５１０４）を以下の手順で調製した。菌の培養に
は、ニュートリエントブロス（ディフコ社製）８ｇ、ヒ
ポキサンチン１ｇ及び水１ＬよりなるｐＨ７．０の培地
を用いた。この培地５００ｍｌにシュードモナス・エス
ピー Ｙ−５１０（ＦＥＲＭ Ｐ−１５１０４）の菌体
３×１０7 個を添加し、２Ｌ容の三角フラスコを用い、
２００ｒｐｍで回転させつつ、培養温度５０℃で１５時
間培養した。培養終了後、菌体を遠心分離（１０，００
０ｇ、４℃、１５分）により集菌した。次いで、酵素液
を以下のようにして調製した。
−１５１０４）を以下の手順で調製した。菌の培養に
は、ニュートリエントブロス（ディフコ社製）８ｇ、ヒ
ポキサンチン１ｇ及び水１ＬよりなるｐＨ７．０の培地
を用いた。この培地５００ｍｌにシュードモナス・エス
ピー Ｙ−５１０（ＦＥＲＭ Ｐ−１５１０４）の菌体
３×１０7 個を添加し、２Ｌ容の三角フラスコを用い、
２００ｒｐｍで回転させつつ、培養温度５０℃で１５時
間培養した。培養終了後、菌体を遠心分離（１０，００
０ｇ、４℃、１５分）により集菌した。次いで、酵素液
を以下のようにして調製した。
【００４０】得られた湿菌１３ｇを緩衝液（ｐＨ７）に
懸濁し、超音波破砕装置で菌体を破砕した。続いて、緩
衝液（ｐＨ７）を添加して全体を４０ｍｌとした後、超
遠心分離（３０，０００ｇ、４℃、２０分）を行い、上
清３０ｍを得た。この上清に対して２５重量％になるよ
うに硫酸アンモニウムを添加し、２０分間撹拌した後、
遠心分離（１０，０００ｇ、４℃、１０分）により沈殿
を除去し、上清を得た。この上清に対して更に４５重量
％になるように硫酸アンモニウムを添加し、２０分間撹
拌の後、遠心分離（１０，０００ｇ、４℃、１０分）に
より沈殿物を得た。
懸濁し、超音波破砕装置で菌体を破砕した。続いて、緩
衝液（ｐＨ７）を添加して全体を４０ｍｌとした後、超
遠心分離（３０，０００ｇ、４℃、２０分）を行い、上
清３０ｍを得た。この上清に対して２５重量％になるよ
うに硫酸アンモニウムを添加し、２０分間撹拌した後、
遠心分離（１０，０００ｇ、４℃、１０分）により沈殿
を除去し、上清を得た。この上清に対して更に４５重量
％になるように硫酸アンモニウムを添加し、２０分間撹
拌の後、遠心分離（１０，０００ｇ、４℃、１０分）に
より沈殿物を得た。
【００４１】この沈殿物を１０ｍｌの緩衝液（ｐＨ７）
に懸濁させ、緩衝液１Ｌ中で、２０時間透析を行い、硫
酸プロタミンを０．２５重量％になるように添加し、５
分間撹拌した後、遠心分離（１０，０００ｇ、４℃、１
０分）により沈殿を除き、粗酵素液１５ｍｌを得た。得
られた粗酵素液をＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ｆａ
ｓｔ ｆｌｏｗ（ファルマシア社製）８０ｍｌを充填し
たカラム（φ１８ｍｍ×３２ｍｍ）に添加した。次い
で、１０ｍＭから６００ｍＭのリン酸カリウム（ｐＨ
７．０）直線濃度勾配で溶出を行い、キサンチンデヒド
ロゲナーゼ活性の認められた分画４５ｍｌを分取し、酵
素液（酵素液［２］と略す）とした。
に懸濁させ、緩衝液１Ｌ中で、２０時間透析を行い、硫
酸プロタミンを０．２５重量％になるように添加し、５
分間撹拌した後、遠心分離（１０，０００ｇ、４℃、１
０分）により沈殿を除き、粗酵素液１５ｍｌを得た。得
られた粗酵素液をＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ｆａ
ｓｔ ｆｌｏｗ（ファルマシア社製）８０ｍｌを充填し
たカラム（φ１８ｍｍ×３２ｍｍ）に添加した。次い
で、１０ｍＭから６００ｍＭのリン酸カリウム（ｐＨ
７．０）直線濃度勾配で溶出を行い、キサンチンデヒド
ロゲナーゼ活性の認められた分画４５ｍｌを分取し、酵
素液（酵素液［２］と略す）とした。
【００４２】実施例１ １０ｍＭのイノシン（東京化成製・特級）、１０ｍＭの
チミン（淀川製薬製）、１．２５ｍＭのリン酸カリウ
ム、０．０５ｍＭのメチレンブルー（和光純薬製・生体
染色用）、酵素液［１］０．０３ｍｌ及び酵素液［２］
０．０５ｍｌを含む１ｍｌの１００ｍＭトリス塩酸緩衝
液（ｐＨ８．５）中で５０℃、５時間反応させ、反応液
中に含まれる各成分の濃度を測定した。その結果を図１
に示す。原料のチミンは微かに残存が認められたが、イ
ノシンは完全に消失した。目的物の５−メチルウリジン
は８．４ｍＭ（収率８４％）生成した。目的物の５−メ
チルウリジンの生成量が非常に高く、定量的に生成して
いることを示している。
チミン（淀川製薬製）、１．２５ｍＭのリン酸カリウ
ム、０．０５ｍＭのメチレンブルー（和光純薬製・生体
染色用）、酵素液［１］０．０３ｍｌ及び酵素液［２］
０．０５ｍｌを含む１ｍｌの１００ｍＭトリス塩酸緩衝
液（ｐＨ８．５）中で５０℃、５時間反応させ、反応液
中に含まれる各成分の濃度を測定した。その結果を図１
に示す。原料のチミンは微かに残存が認められたが、イ
ノシンは完全に消失した。目的物の５−メチルウリジン
は８．４ｍＭ（収率８４％）生成した。目的物の５−メ
チルウリジンの生成量が非常に高く、定量的に生成して
いることを示している。
【００４３】比較例１ また、耐熱性キサンチンデヒドロゲナーゼを添加しない
こと以外はすべて実施例１と同一の手順と条件で反応を
行い、反応液中に含まれる各成分の濃度を測定した。そ
の結果を図２に示す。目的物である５−メチルウリジン
の生成は２．８ｍＭ（収率２８％）で反応は平衡状態に
達したことを示している。
こと以外はすべて実施例１と同一の手順と条件で反応を
行い、反応液中に含まれる各成分の濃度を測定した。そ
の結果を図２に示す。目的物である５−メチルウリジン
の生成は２．８ｍＭ（収率２８％）で反応は平衡状態に
達したことを示している。
【００４４】実施例２〜３ チミンに代えて表１に示す核酸塩基を用いた以外は、実
施例１と同様の条件で５０℃、５．５時間反応させた。
なお、比較のため耐熱性キサンチンデヒドロゲナーゼを
添加しないこと以外はすべて実施例２〜３と同様の条件
で反応させた。その結果を表１に示す。
施例１と同様の条件で５０℃、５．５時間反応させた。
なお、比較のため耐熱性キサンチンデヒドロゲナーゼを
添加しないこと以外はすべて実施例２〜３と同様の条件
で反応させた。その結果を表１に示す。
【００４５】
【表１】
【００４６】実施例４〜９ イノシンに代えて２’−デオキシイノシン（ヤマサ醤油
製）を用い、また、チミンに代えて表２に示す核酸塩基
を用いた以外は、実施例１と同様の条件で５０℃、５．
５時間反応させた。なお、比較のため耐熱性キサンチン
デヒドロゲナーゼを添加しないこと以外はすべて実施例
４〜９と同様の条件で反応させた。その結果を表２に示
す。
製）を用い、また、チミンに代えて表２に示す核酸塩基
を用いた以外は、実施例１と同様の条件で５０℃、５．
５時間反応させた。なお、比較のため耐熱性キサンチン
デヒドロゲナーゼを添加しないこと以外はすべて実施例
４〜９と同様の条件で反応させた。その結果を表２に示
す。
【００４７】
【表２】
【００４８】実施例１０ イノシン（東京化成製・特級）とチミン（淀川製薬製）
を各１０ｍＭ使用して、表３に示す各種温度で実施例１
と同様の操作を行い、３０分反応後に生成した５−メチ
ルウリジンを測定した。その結果を表３に示す。反応速
度（ｍＭ／分）は５−メチルウリジン生成量（ｍＭ）を
３０分で除した数値である。反応温度４０℃のとき反応
速度が０．０２ｍＭ／分であるが、反応温度が５０℃以
上になると反応速度が約０．１ｍＭ／分と立ち上がって
いる。
を各１０ｍＭ使用して、表３に示す各種温度で実施例１
と同様の操作を行い、３０分反応後に生成した５−メチ
ルウリジンを測定した。その結果を表３に示す。反応速
度（ｍＭ／分）は５−メチルウリジン生成量（ｍＭ）を
３０分で除した数値である。反応温度４０℃のとき反応
速度が０．０２ｍＭ／分であるが、反応温度が５０℃以
上になると反応速度が約０．１ｍＭ／分と立ち上がって
いる。
【００４９】
【表３】
【００５０】
【発明の効果】核酸塩基の交換反応を利用したヌクレオ
シド化合物の製造方法において耐熱性酵素を用いること
により、交換反応が高濃度で可能となり、また、反応速
度の向上が図られる。更に、低温殺菌の温度に近い温度
で反応を行うことになるので、微生物汚染が少なく、酵
素の寿命が長くなるという効果が期待できる。
シド化合物の製造方法において耐熱性酵素を用いること
により、交換反応が高濃度で可能となり、また、反応速
度の向上が図られる。更に、低温殺菌の温度に近い温度
で反応を行うことになるので、微生物汚染が少なく、酵
素の寿命が長くなるという効果が期待できる。
【図１】実施例１における反応液中の各成分の濃度の経
時変化を示すグラフである。
時変化を示すグラフである。
【図２】比較例１における反応液中の各成分の濃度の経
時変化を示すグラフである。
時変化を示すグラフである。
Claims (4)
- 【請求項１】 イノシン及びデオキシイノシンからなる
群より選択されるヌクレオシドとピリミジン塩基とを、
リン酸又はリン酸塩存在下の水溶液中において、耐熱性
プリンヌクレオシドホスホリラーゼ及び耐熱性ピリミジ
ンヌクレオシドホスホリラーゼにより塩基交換させ、こ
の塩基交換反応により生成したヒポキサンチンを電子受
容体の共存下に耐熱性キサンチンデヒドロゲナーゼによ
り尿酸に変化させることを特徴とするヌクレオシド化合
物の製造方法。 - 【請求項２】 イノシン及びデオキシイノシンからなる
群より選択されるヌクレオシドとプリン塩基とを、リン
酸又はリン酸塩存在下の水溶液中において、耐熱性プリ
ンヌクレオシドホスホリラーゼにより塩基交換させ、こ
の塩基交換反応により生成したヒポキサンチンを電子受
容体の共存下に耐熱性キサンチンデヒドロゲナーゼによ
り尿酸に変化させることを特徴とするヌクレオシド化合
物の製造方法。 - 【請求項３】 耐熱性キサンチンデヒドロゲナーゼがシ
ュードモナス・エスピー Ｙ−５１０（ＦＥＲＭ Ｐ−
１５１０４）の産生物である請求項１又は２記載のヌク
レオシド化合物の製造方法。 - 【請求項４】 電子受容体がメチレンブルー、ニコチン
アミド アデニンジヌクレオチド、ニコチンアミド ア
デニン ジヌクレオチド リン酸から選ばれた１種以上
の電子受容体である請求項１又は２記載のヌクレオシド
化合物の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP04961996A JP3731237B2 (ja) | 1996-02-14 | 1996-02-14 | ヌクレオシド化合物の製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP04961996A JP3731237B2 (ja) | 1996-02-14 | 1996-02-14 | ヌクレオシド化合物の製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09215498A true JPH09215498A (ja) | 1997-08-19 |
| JP3731237B2 JP3731237B2 (ja) | 2006-01-05 |
Family
ID=12836260
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP04961996A Expired - Fee Related JP3731237B2 (ja) | 1996-02-14 | 1996-02-14 | ヌクレオシド化合物の製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3731237B2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002036800A1 (fr) * | 2000-11-06 | 2002-05-10 | Mitsui Chemicals, Inc. | Procede de production de compose nucleoside |
| US11959116B2 (en) | 2021-10-27 | 2024-04-16 | Asahi Kasei Pharma Corporation | Method for producing nicotinamide mononucleotide |
-
1996
- 1996-02-14 JP JP04961996A patent/JP3731237B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002036800A1 (fr) * | 2000-11-06 | 2002-05-10 | Mitsui Chemicals, Inc. | Procede de production de compose nucleoside |
| US11959116B2 (en) | 2021-10-27 | 2024-04-16 | Asahi Kasei Pharma Corporation | Method for producing nicotinamide mononucleotide |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3731237B2 (ja) | 2006-01-05 |
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