JPH09135640A - シクラメンの倍数体の作製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 シクラメンの新品種を得るために有用なシク
ラメンの同質倍数体を、しかも効率よく作製する方法を
提供する。 【解決手段】 シクラメンの倍数体を下記工程に従って
作製する。 （Ａ）シクラメンの種子又は組織を培養して培養細胞を
得る工程、（Ｂ）前記（Ａ）工程で得られる培養細胞を
コルヒチンを含有する培地に浸漬する工程、（Ｃ）前記
（Ｂ）工程で得られるコルヒチン処理培養細胞を培地で
培養してエンブリオジェニックカルスを形成させる工
程、（Ｄ）前記（Ｃ）の工程で得られるエンブリオジェ
ニックカルスを培養して不定胚を形成させ、これを培養
する工程。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、シクラメンの倍数
体の作製方法に関し、詳しくは、シクラメンの同質倍数
体を効率よく作製するシクラメン倍数体の作製方法に関
する。

【０００２】

【従来の技術】植物の種子や組織をコルヒチンなどで処
理して得られる同質倍数体は、倍数化前のものに比べる
と、植物の細胞や器官の大きさが増したり、生育が旺盛
になったり、病害虫への抵抗性が高まったり、種々の体
内成分の含量が増えたりする等の効果が得られるため、
倍数化による植物の育種が各種の植物について試みられ
ている。

【０００３】例えば、薬用ニンジンの種子胚から摘出し
た子葉をＭＳ固体培地で静置培養して直接不定胚を誘導
し、次いでこの不定胚をＢ５液体培地で振盪培養して２
次胚を形成しつつ増殖中の不定胚集塊を５ｍｍ角程度の
極小角に調整し、更にこの不定胚集塊を所要濃度のコル
ヒチン溶液に浸漬して所要時間振盪した後、再分化固体
培地で静置培養することを特徴とする薬用ニンジンの４
倍体誘導法が知られている（特開平６−１５３７３１号
公報）。

【０００４】一方、シクラメンでは、胚珠をコルヒチン
処理してこれを組織培養すると複二倍体が得られる（ブ
リーディング サイエンス Breeding Science、第４４
巻、第１６１頁（１９９４））ことが知られているが、
この方法は、種間交配によるもので胚珠形成数や倍数体
形成数が少なく、しかも得られる植物体は、異質倍数体
のため園芸品種との交配育種には使用しがたいという問
題があった。また、シクラメン園芸品種を用いた育種の
ための同質４倍体、同質８倍体のような倍体数及びその
作製方法については知られていない。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明は上記観点から
なされたものであり、シクラメンの新品種を得るために
有用なシクラメンの同質倍数体を、しかも効率よく作製
する方法を提供することを課題とする。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するためにシクラメンの同質倍数体を得ようと種
々検討した結果、シクラメンの種子又は組織を培養して
培養細胞を得、これをコルヒチン含有培地に浸漬後、再
度カルス化し不定胚を形成させることによってシクラメ
ンの同質倍数体が効率よく作製できることを見出し、本
発明を完成させた。

【０００７】すなわち本発明は、下記工程からなるシク
ラメンの倍数体の作製方法である。 （Ａ）シクラメンの種子又は組織を培養して培養細胞を
得る工程、（Ｂ）前記（Ａ）工程で得られる培養細胞を
コルヒチンを含有する培地に浸漬する工程、（Ｃ）前記
（Ｂ）工程で得られるコルヒチン処理培養細胞を培地で
培養してエンブリオジェニックカルスを形成させる工
程、（Ｄ）前記（Ｃ）の工程で得られるエンブリオジェ
ニックカルスを培養して不定胚を形成させ、これを培養
する工程。

【０００８】ここで、上記本発明の（Ａ）工程で得られ
る培養細胞は、具体的にはエンブリオジェニックカルス
及び／又は不定胚を含有する培養細胞であり、前記
（Ａ）工程に、さらに培養細胞中のエンブリオジェニッ
クカルス及び／又は不定胚を５μ〜３ｍｍ、好ましくは
１０μｍ〜２ｍｍに微細化する操作を加え、この微細化
されたエンブリオジェニックカルス及び／又は不定胚
を、次の（Ｂ）工程でコルヒチン処理することが本発明
のシクラメン倍数体の作製方法として好ましい。

【０００９】また、上記本発明のシクラメン倍数体の作
製方法での（Ｂ）工程における培養細胞のコルヒチン処
理の具体的な方法であるが、（Ａ）工程で得られる培養
細胞を、コルヒチン含有濃度が０．０１〜１０％程度の
コルヒチン含有培地に、概ね１０〜１２０時間、浸漬す
る処理方法を挙げることができる。

【００１０】本発明のシクラメンの倍数体作製方法、す
なわち、（Ａ）工程でシクラメンの種子又は組織を培養
し得られた培養細胞を、（Ｂ）工程でコルヒチン処理
し、これを（Ｃ）工程でカルス化し、次の（Ｄ）工程で
カルスから不定胚を形成させ、さらに植物体を再生させ
るシクラメンの倍数体の作製方法によれば、シクラメン
の同質倍数体を作製することが可能である。また、本発
明のシクラメンの倍数体作製方法によれば、（Ｂ）工程
におけるコルヒチン処理を概ね９９％の不定胚が枯死す
る程度、言い換えれば、（Ｃ）工程においてエンブリオ
ジェニックカルスの形成率が０．１〜５％となる程度の
処理条件にすること、及び（Ａ）〜（Ｄ）の工程中で、
培養細胞、好ましくはエンブリオジェニックカルス及び
／又は不定胚を個別にコルヒチン処理し、再度カルス化
させて選抜を行うことにより、倍数化していない細胞の
ほとんどを除去することができるので、最終的に効率よ
く倍数体を作製することが可能である。

【００１１】

【発明の実施の形態】以下、本発明に係わるシクラメン
の倍数体の作製方法を（Ａ）シクラメンの種子又は組織
からの培養細胞の誘導工程、（Ｂ）コルヒチン処理工
程、（Ｃ）エンブリオジェニックカルス形成工程、
（Ｄ）エンブリオジェニックカルスからの不定胚形成・
植物体再生工程に分けて具体的に説明する。

【００１２】（Ａ）シクラメンの種子又は組織からの培
養細胞の誘導工程（以下「Ａ工程」という） 本発明のシクラメン倍数体作製方法では、まずＡ工程で
シクラメンの種子又は組織から培養細胞を誘導する。

【００１３】本発明が適用されるシクラメンとしては、
シクラメン属に属する植物であれば品種は特に制限され
るものではなく、例えば、４倍体品種のビクトリア、バ
ーバーグや、２倍体品種のピュアホワイト、パステル、
ミニシクラメンなどを挙げることができる。

【００１４】Ａ工程では、上記の様なシクラメンの種子
又は組織を培養するが、本発明のシクラメンの倍数体作
製方法において、後の工程で培養細胞として好ましく用
いられるのは、エンブリオジェニックカルスのような不
定胚形成能を持つカルスやこの様なカルスから発達した
細胞分裂の活性の高い不定胚等を微細化したものである
ので、培養方法としても、得られる培養細胞がエンブリ
オジェニックカルスや不定胚を多く含有する様な培養方
法をとることが好ましい。

【００１５】この様な培養方法としては、通常の培養方
法に従えばよく、例えば、「バイオホルティ」（農耕と
園芸、別冊、３０〜３１頁、１９９０年）、特公平６−
４８９４９号公報及び特開平５−２１１８２４号公報な
どに記載されている方法に準拠した方法が挙げられる。

【００１６】具体的には、シクラメンの種子又は組織を
適当な方法で殺菌処理し、これを無菌条件下で切断して
小切片とする。これを、植物の育成に必要な窒素、リ
ン、カリウム、マグネシウム、カルシウム、マンガン、
銅、亜鉛、ホウ素、モリブデンおよび鉄などの元素を含
む無機塩を含有する水溶液であり、従来より植物組織培
養用培地として用いられている液体培地、例えば、ムラ
シゲ・スクーグ培地（以下「ＭＳ」培地という）、ガン
ボルグのＢ培地、ホワイト培地、ニッチーニッチ培地、
Ｎ６培地などに、適当な濃度で炭素源、植物ホルモン等
を配合し、さらにゲル化剤等を加えて固形培地としたも
のに置床し、好ましくは１０〜３０℃の、より好ましく
は２０℃程度の暗所で、好ましくは５０〜１５０日間、
より好ましくは１２０日間程度培養する。

【００１７】この様にして得られる培養細胞は、エンブ
リオジェニックカルスや不定胚を含む培養細胞である。
また、次の工程すなわちコルヒチン処理工程に好ましく
用いられるのはエンブリオジェニックカルスや不定胚等
を微細化したもの、より好ましくは不定胚を微細化した
ものであるので、Ａ工程において、さらに培養細胞中の
エンブリオジェニックカルス及び／又は不定胚を、５μ
〜３ｍｍ、好ましくは１０μｍ〜２ｍｍに微細化する操
作を加えることが好ましい。微細化の方法としては、シ
クラメンの培養細胞中のエンブリオカルスも不定胚も軽
く押圧すると細かくなるので、例えば、前記培養細胞か
ら、好ましくは直径５μｍ〜３ｍｍの、より好ましくは
直径１０μｍ〜２ｍｍの大きさのステンレスメッシュ等
を組み合わせて用いて、エンブリオジェニックカルス及
び／又は不定胚を、好ましくは不定胚のみを微細化する
方法等を挙げることができる。また、不定胚としては、
カルス上に直接形成した１次胚を用いることが好まし
い。

【００１８】（Ｂ）コルヒチン処理工程（以下「Ｂ工
程」という） 上記Ａ工程に次いで行われるＢ工程は、上記Ａ工程で得
られた培養細胞、好ましくは、前記培養細胞中の微細化
されたエンブリオジェニックカルス及び／又は不定胚、
より好ましくは、微細化された不定胚を、コルヒチン含
有培地に浸漬し、静置又は振盪して染色体の倍数化を行
う工程である。

【００１９】コルヒチン含有培地としては、適当量の炭
素源等を配合した上記従来より植物組織培養用培地とし
て用いられている液体培地、好ましくはＭＳ培地に、コ
ルヒチンを０．０１〜１０％濃度、好ましくは、０．０
１〜０．２％濃度、さらに好ましくは０．０５％程度の
濃度となるように添加したものが用いられる。

【００２０】また、上記コルヒチン含有培地に用いる、
従来より植物組織培養用培地として用いられている液体
培地は、そのまま用いてもよいし、あるいは水を加えて
１／３〜１／２程度に希釈して用いてもよい。炭素源と
して添加される成分としては、ショ糖、グルコースなど
が挙げられ、添加量は、例えば、ショ糖であれば好まし
くは１０ｇ／リットル〜５０ｇ／リットル、より好まし
くは３０ｇ／リットル程度である。

【００２１】上記コルヒチン含有培地にＡ工程で得られ
る培養細胞を、添加浸漬するが、好ましい添加密度は１
０〜１００個／ｍｌ、より好ましくは５０個／ｍｌ程度
である。浸漬時間は、好ましくは１０〜１２０時間、よ
り好ましくは２０〜２６時間程度である。培養細胞を上
記コルヒチン含有培地に浸漬する際に、静置しておいて
もよいが振盪等を加えてもよい。振盪は、好ましくは５
〜１００ｒｐｍ、より好ましくは３０〜５０ｒｐｍで行
われる。

【００２２】ここで、上記コルヒチン処理における、コ
ルヒチン含有培地のコルヒチン濃度を０．０１〜１０％
とし、またコルヒチン含有培地での培養細胞の浸漬時間
を１０〜１２０時間とすることにより培養細胞は効率よ
く倍数化され、コルヒチン処理後の培養細胞中における
倍数化していない培養細胞の含有量を少なくすることが
できる。この様なコルヒチン処理を行うことにより、結
果として、次の工程において、カルス形成培地でのエン
ブリオジェニックカルスの形成率は、０．１〜５％の範
囲となり、さらに、より好ましい条件でコルヒチン処理
された場合には、エンブリオジェニックカルスの形成率
は、０．５％〜２％の範囲となる。

【００２３】上記の様にしてコルヒチン含有培地で培養
細胞が浸漬処理されるが、好ましくは、前記浸漬処理
後、処理液から培養細胞を残してコルヒチン含有培地だ
けを除き、次いでこのコルヒチン処理培養細胞を上記コ
ルヒチン含有培地よりコルヒチンを除いた培地等で好ま
しくは１〜５回、より好ましくは３回程度洗浄する操作
がさらに加えられ、得られたコルヒチン処理培養細胞が
次の工程に用いられる。

【００２４】（Ｃ）エンブリオジェニックカルス形成工
程（以下「Ｃ工程」という） 上記Ｂ工程に次いで行われるＣ工程は、上記Ｂ工程で得
られるコルヒチン処理培養細胞をカルス形成用培地（以
下「カルス形成培地」という）に移植してエンブリオジ
ェニックカルス形成を行う工程である。この工程で用い
るカルス形成培地は、上記Ａ工程やＢ工程で用いた従来
の植物組織培養培地に、炭素源や植物ホルモン等を添加
して調製した液体培地や、さらにこれにゲル化剤を加え
て固体培地に調製したもの等が使用できる。培地の好ま
しいｐＨは４〜６程度であり、また滅菌して用いること
が好ましい。

【００２５】上記カルス形成培地に添加される炭素源と
しては、ショ糖、グルコースなどの糖類が挙げられ、こ
のうち、ショ糖が好ましく用いられる。これらの炭素源
の培地への添加濃度は、糖類の種類などによって適宜選
択されるが、概ね１０〜８０ｇ／リットル、好ましくは
５０ｇ／リットル程度の添加濃度である。

【００２６】また、上記カルス形成培地に添加される植
物ホルモンとしては、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸
（以下「２，４−ＰＡ」という）とカイネチンを混合し
たものが好ましく使用される。これらの植物ホルモンの
培地への添加濃度は、２，４−ＰＡが、好ましくは０．
０１〜４０ｍｇ／リットル、より好ましくは０．５〜１
０ｍｇ／リットル、さらに好ましくは４ｍｇ／リットル
程度であり、カイネチンが、好ましくは０．００１〜２
ｍｇ／リットル、より好ましくは０．０５〜０．５ｍｇ
／リットル、さらに好ましくは、０．１ｍｇ／リットル
程度である。

【００２７】また、固体培地を調製する際に用いる培地
を固化させるためのゲル化剤としては、寒天、アガロー
ス、ゲルライト（ゲランガム）などを挙げることができ
るが、これらのうちでも本発明においてはゲルライトが
好ましく用いられる。上記ゲル化剤の培地への添加量
は、ゲル化剤の種類によって適宜選択されるが、概ね
０．１〜１０ｇ／リットル、好ましくは１〜５ｇ／リッ
トル、より好ましくは２ｇ／リットル程度の添加量で用
いられる。

【００２８】この様なカルス形成用培地上に上記Ｂ工程
で得られるコルヒチン処理した培養細胞を、シャーレ当
たり概ね２０〜２００個、好ましくは１００個の割合で
置床し、好ましくは１５〜３０℃、より好ましくは２５
℃程度で暗所の恒温室内で、好ましくは２０〜６０日、
より好ましくは３０日程度培養することで、コルヒチン
処理培養細胞からエンブリオジェニックカルスを形成さ
せることができる。

【００２９】さらに、この様にして得られるエンブリオ
ジェニックカルスはカルス形成培地上で一定日数毎に継
代培養し、例えば、３０日毎に継代培養して、次の工程
に用いることが好ましい。

【００３０】（Ｄ）エンブリオジェニックカルスから不
定胚形成・植物体再生工程（以下「Ｄ工程」という） 上記Ｃ工程で得られるエンブリオジェニックカルスから
不定胚を形成させ、さらに不定胚から植物体を再生させ
る工程がＤ工程である。エンブリオジェニックカルスか
ら不定胚を形成させる方法は、通常の方法に従えばよ
く、例えば、Ｃ工程で得られたエンブリオジェニックカ
ルスを上記Ｃ工程で用いたのと同様なカルス形成培地に
移植し、好ましくは１０〜３０℃、より好ましくは２０
℃程度の暗所で、好ましくは３０〜９０日間、より好ま
しくは６０日間程度培養すればよい。この様な培養によ
りエンブリオジェニックカルス表面に不定胚を形成させ
ることができる。

【００３１】上記不定胚から植物体を再生させる方法で
あるが、これも通常の方法に従えばよく、例えば、上記
で得られた不定胚を培養密度が、好ましくは１０〜１０
０個／培地３０ｍｌ、より好ましくは、３０個／培地３
０ｍｌ程度となるように再分化用固体培地（以下、「再
分化培地」という）に移植し、好ましくは１５〜３０
℃、より好ましくは２５℃程度の暗所の恒温室内で、好
ましくは１５〜６０日間、より好ましくは３０日間程度
培養する方法が挙げられる。この様な培養により不定胚
を発芽させることができる。

【００３２】また、上記で用いられる再分化培地は、従
来より植物組織培養用に用いられている培地であれば何
れの培地でもよいが、上記Ｃ工程で用いた様なカルス形
成培地に準ずる培地を用いることが好ましく、例えば、
ＭＳ培地の無機塩組成の培地に炭素源、植物ホルモン、
ゲル化剤等を添加し、ｐＨを４〜６に調整、オートクレ
ーブなどにより滅菌した培地等が挙げられる。

【００３３】上記再分化培地が含有する炭素源として
は、ショ糖等が挙げられ、その含有量は好ましくは１０
〜５０ｇ／リットル、より好ましくは３０ｇ／リットル
程度である。また、再分化培地で用いられる植物ホルモ
ンとしては、ナフタレン酢酸（以下、「ＮＡＡ」とい
う）とベンジルアデニンおよびジベレリンとの混合物等
が好ましく使用される。これらの植物ホルモンの培地中
での濃度は、ＮＡＡが、好ましくは０．００１〜０．１
ｍｇ／リットル、より好ましくは０．０１ｍｇ／リット
ル程度であり、ベンジルアデニンが、好ましくは０．０
１〜１ｍｇ／リットル、より好ましくは０．１ｍｇ／リ
ットル程度であり、ジベレリンが好ましくは０．０２〜
２ｍｇ／リットル、より好ましくは０．２ｍｇ／リット
ル程度である。さらに、再分化培地に用いられるゲル化
剤としては、ゲルライト等を挙げることができ、培地へ
の添加量が、好ましくは０．１〜１０ｇ／リットル、よ
り好ましくは２〜７ｇ／リットル、さらに好ましくは５
ｇ／リットル程度となるように用いられる。

【００３４】この様にして得られる発芽した不定胚を、
さらに培養を行うと、例えば、上記再分化培地から植物
ホルモンを除いた組成の培地に置床し、好ましくは１０
００〜５０００ルクス、より好ましくは、３０００ルク
スの照射下、好ましくは１０〜３０℃、より好ましくは
２０℃程度の恒温室内で、好ましくは３０〜１２０日
間、より好ましくは６０日間程度の培養を行うと、培地
上に出た根がねじれている約４ｃｍの幼植物体が得られ
る。

【００３５】この様な本発明の作製方法により得られた
植物体が倍数化されていることを確認する方法として
は、上記幼植物体の根端の染色体を観察することにより
行うことができる（「植物バイオテクの基礎知識」、２
０２頁、１９９４年９月発行）。

【００３６】

【実施例】以下、実施例により本発明をさらに具体的に
説明する。

【００３７】

【実施例１】 （Ａ）シクラメンの組織から培養細胞を誘導する工程 シクラメンとして２倍体品種であるミニシクラメン（品
種：ライラックローズ）を用い、その葉片を材料に用い
て、「バイオホルティ」（農耕と園芸、別冊、３０〜３
１頁、１９９０年）に記載の方法に準じて培養し、エン
ブリオジェニックカルスと不定胚を含む培養細胞を得
た。

【００３８】すなわち、葉身を７０％エタノール溶液に
１０秒間、次いで有効塩素濃度が約１％の次亜塩素酸ナ
トリウム溶液に２０分間浸漬することで、葉身の殺菌処
理を行った。次いで、次亜塩素酸ナトリウム溶液から葉
身を取り出し、その表面に付着した次亜塩素酸ナトリウ
ムを滅菌水で３回洗浄後、これを無菌条件下で切断して
１ｃｍ角の小切片とした。これをＭＳ培地にショ糖５０
ｇ／リットル、２，４−ＰＡを４ｍｇ／リットル、カイ
ネチン０．１ｍｇ／リットルをそれぞれ加え、ｐＨ５．
８とし、ゲルライト２ｇ／リットルを加えた固形培地に
置床した。これを２５℃の暗所で培養し、置床９０日後
にエンブリオジェニックカルスと不定胚を含む培養細胞
を得た。

【００３９】得られた培養細胞を孔径２ｍｍおよび１ｍ
ｍの２種類のステンレスメッシュを用いて順に濾過し直
径１ｍｍ以上２ｍｍ以下の培養細胞（不定胚）を得た。

【００４０】（Ｂ）コルヒチン処理工程 上記（Ａ）工程で得られた培養細胞（不定胚）２００個
を直径６ｃｍの大きさのシャーレに入れ、これにコルヒ
チン含有培地４ｍｌを加えた。コルヒチン含有培地は、
ＭＳ培地の無機塩濃度を１／３に希釈し、この溶液にシ
ョ糖を３０ｇ／リットル、コルヒチンを表１に記載した
濃度になるように添加し、ｐＨ５．８に調整したもので
あった。このシャーレを、上記コルヒチン含有培地に、
暗黒下、ロータリーシェーカーにより６０ｒｐｍで振盪
しながら、表１に記載した時間（１２、２４、３６、４
８、９６時間）だけ浸漬した。浸漬終了後、シャーレに
コルヒチン処理された培養細胞を残して上記コルヒチン
含有培地のみを除いた。次いで、シャーレに上記のコル
ヒチン含有培地よりコルヒチンを除いた培地４ｍｌを加
えてコルヒチン処理培養細胞を洗浄した。この洗浄操作
を３回行った。試験区はコルヒチンの濃度毎に４反復で
あった。

【００４１】（Ｃ）エンブリオジェニックカルス形成工
程 直径９ｃｍの大きさのシャーレに、ＭＳ培地の無機塩組
成の培地にショ糖を５０ｇ／リットル、２，４−ＰＡを
４ｍｇ／リットル、カイネチンを０．１ｍｇ／リット
ル、ゲルライトを２ｇ／リットルの割合で添加した組成
の培地であってｐＨが５．８に調整されたカルス形成培
地を充填し、これに上記（Ｂ）工程で得られたコルヒチ
ン処理培養細胞（不定胚）を、各処理条件毎に１シャー
レ当たり１００個ずつ８枚のシャーレに（計８００個）
置床した。これを２５℃の暗所の恒温室内で、３０日間
静置培養してエンブリオジェニックカルスを形成させ
た。培地上に形成されたエンブリオジェニックカルス数
を調べ、これとコルヒチン処理培養細胞（不定胚）の個
数８００個から、以下の式を用いてエンブリオジェニッ
クカルスの形成率（％）を算出した。

【００４２】

【数１】エンフ゛リオシ゛ェニックカルス形成率(%) ＝ １００ × エンフ゛
リオシ゛ェニックカルス数 ／ 不定胚数

【００４３】（Ｄ）エンブリオジェニックカルスから不
定胚形成・植物体再生工程 上記（Ｃ）工程で得られたエンブリオジェニックカルス
を上記と同じ組成のカルス形成培地で６０日間培養し
て、不定胚を形成させた。直径９ｃｍの大きさのシャー
レに、ＭＳ培地の無機塩組成の培地にショ糖を３０ｇ／
リットル、ＮＡＡを０．０１ｍｇ／リットル、ベンジル
アデニンを０．１ｍｇ／リットル、ジベレリンを０．２
ｍｇ／リットル、ゲルライトを５ｇ／リットルの割合で
添加した組成の培地であってｐＨが５．８に調整された
再分化培地３０ｍｌを充填し、これに上記で得られた不
定胚３０個／シャーレ（試験条件によっては３０個以
下）を置床した。これを２５℃の暗所にて３０日間培養
して、不定胚を発芽させた。これをさらに、再分化培地
から植物ホルモンを除去した培地（ｐＨ５．８）を充填
したプラントボックス（８×８ｃｍ）に置床して、２０
℃の明所（３０００ルクス）恒温室内で、６０日間静置
培養して幼植物体を得た。

【００４４】倍数体の判断は、「植物バイオテクの基礎
知識」に記載の方法に準じて行った。すなわち、上記で
得られた幼植物体の根端を切り出し、根端を組織固定液
（エタノール：酢酸を３容：１容に混合した溶液）に１
時間浸漬し、処理後、根端を蒸留水に２時間浸漬し、次
いで、根端をスライドガラス上に取り出して、セルラー
ゼ（植物細胞壁分解酵素）を含む溶液を滴下し、１５分
間の酵素処理を行った。次に、スライドガラス上に根端
を残して酵素液を蒸留水で洗浄した後、アセトオルセイ
ン染色による押しつぶし法にて染色体を染色した。これ
について顕微鏡下で染色体本数を測定し、４倍体（染色
体本数９６本）の存在を確認した。上記で得られた幼植
物体全てについて染色体数を測定して倍数体数を調べ、
以下の式により倍数体作製率を算出した。結果をエンブ
リオジェニックカルスの形成率と共に表１に示す。

【００４５】

【数２】倍数体作製率（％）＝１００ × 倍数体数 ／
エンフ゛リオシ゛ェニックカルス形成数

【００４６】

【表１】

【００４７】

【実施例２】シクラメンの２倍体品種であるパステル
（品種：シューベルト）、ピュアホワイト及び４倍体品
種であるバーバーグ、ビクトリアの葉片を用いて同質倍
数体を作製する実験を行った。

【００４８】実験は、上記実施例１において、（Ｂ）の
コルヒチン処理工程に用いるコルヒチン含有培地のコル
ヒチン濃度を０．０５％、コルヒチン処理時間を２４時
間とした以外は、実施例１と全く同様の方法で行った。
なお、コルヒチン処理の試験区は、パステルが４反復、
ピュアホワイト及びバーバーグがそれぞれ２反復、ビク
トリアが６反復であった。

【００４９】実験で得られたエンブリオジェニックカル
ス形成数とコルヒチン処理不定胚数からエンブリオジェ
ニックカルス形成率（％）を、また、倍数体数と前記エ
ンブリオジェニックカルス形成数から倍数体作製率
（％）を、実施例１と同様にして算出した。結果を表２
に示す。

【００５０】

【表２】

【００５１】これらの結果から、本発明のシクラメンの
倍数体の作製方法によれば、シクラメンの同質倍数体
を、しかも高作製率で作製できることがわかる。

【００５２】

【発明の効果】本発明の方法によれば、シクラメンの同
質倍数体を作製することができ、しかもこの様な同質倍
数体を効率よく高い作製率で作製することができる。よ
って、本発明の方法は、シクラメンの新品種を得るため
に有用である。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記工程からなるシクラメンの倍数体の
   作製方法： （Ａ）シクラメンの種子又は組織を培養して培養細胞を
   得る工程、（Ｂ）前記（Ａ）工程で得られる培養細胞を
   コルヒチンを含有する培地に浸漬する工程、（Ｃ）前記
   （Ｂ）工程で得られるコルヒチン処理培養細胞を培地で
   培養してエンブリオジェニックカルスを形成させる工
   程、（Ｄ）前記（Ｃ）の工程で得られるエンブリオジェ
   ニックカルスを培養して不定胚を形成させ、これを培養
   する工程。
2. 【請求項２】 （Ａ）工程で得られる培養細胞がエンブ
   リオジェニックカルス及び／又は不定胚を含有すること
   を特徴とする請求項１記載のシクラメンの倍数体の作製
   方法。
3. 【請求項３】 （Ａ）工程に、さらに培養細胞中のエン
   ブリオジェニックカルス及び／又は不定胚を５μｍ〜３
   ｍｍに微細化する操作を加えることを特徴とする請求項
   １記載のシクラメンの倍数体の作製方法。
4. 【請求項４】 （Ｂ）工程において、コルヒチン含有培
   地のコルヒチン濃度を０．０１〜１０％とし、培養細胞
   のコルヒチン含有培地への浸漬時間を１０〜１２０時間
   とすることを特徴とする請求項１記載のシクラメンの倍
   数体の作製方法。