JPH08231589A - 新規なペプチドおよび免疫賦活剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 大豆のタンパク質分解酵素の分解液から新
規な免疫賦活作用を有する新規なペプチドを提供する。 【構成】 大豆をタンパク買分解酵素等で処理し、新規
な免疫賦活作用を有する２種のペプチドは（１）Ｉｌｅ
−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−
Ａｌａ、（２）Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓ
ｎであり、免疫賦活作用を有し、毒性も極めて低い。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、医薬として有用性を有
する下記のアミノ酸の配列のペプチド構造を有するペプ
チドならびにそのペプチドを有効成分とする免疫賦活剤
に関する。 （１）Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｇｌ
ｙ−Ｖａｌ−Ａｌａ （２）Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ （式中、アミノ酸残基を表わす各記号は、アミノ酸化学
において慣用の表示法によるものである。）

【０００２】

【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】摂取さ
れた食品は消化管の中で分解、吸収される過程で宿主免
疫系へ種々の影響を与えることが知られている（Ｊ．
Ｌ．Ｄｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．：Ａｎｎ．Ｉｎｔｅｒ
ｎ．Ｍｅｄ．，１０１，８１０−８２４（１９８
４））。宿主の免疫反応は免疫担当細胞であるリンパ球
及びマクロファージから分泌される生理活性物質によっ
て調節、制御されていることが知られているが、一方、
食品成分中にも宿主免疫系を調節する物質の存在が知ら
れている。その中には、食品蛋白買を酵素的に分解した
ペプチドとして、ヒトカゼイン由来Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｐ
ｈｅ，ウシカゼイン由来Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ，ヒト
βカゼイン由来Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｐｒ
ｏ−Ｔｙｒのものが知られておりいずれもマクロファー
ジの活性を上昇させることが見いだされている（Ｆ．Ｐ
ａｒｋｅｒ ｅｔ ａｌ．：Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．１４５，６７７−６８２（１９８４），Ｊ．Ｂｅｒ
ｔｈ ｏｕ ｅｔ ａｌ．：ＦＡＢＳ Ｌｅｔｔ．，２
１８，５５−５８（１９８７））。生体内に摂取された
食品蛋白質は、そのままの形かあるいは分解されてペプ
チドの形で免疫応答系細胞と接する。このような食品成
分と免疫応答系細胞との相互作用は、これまで知られて
いるところでは、たとえば免疫系の異常状態である食品
アレルギーを引き起こす場合があり、さらに、免疫系の
賦活あるいは抑制という形となって観察されている。免
疫応答系を調節する本来の生体内物質としてインターロ
イキンをはじめとするサイトカイニンと呼ばれる一群の
ポリペプチドであり、その機能及び構造について多くの
情報が集積しつつある。これに対し、食品たん白質由来
のペプチドで免疫調節機能をもつものは多くはなく、未
だ医薬品としての開発が進んでいるとの報告はない。

【０００３】

【課題を解決するための手段】本発明者は、大豆のタン
パク質分解酵素の分解液から薬理作用を有する物質を検
索し、新規な２種のペプチドが強い免疫賦活作用を有す
ることを見出した。そして、これら２種のペプチドを医
薬として実用化するための研究を鋭意行った。その結
果、この２種のペプチドが免疫賦活作用を有し、天然物
由来の免疫賦活剤としての有用性を見い出した。本発明
は係る知見に基づくものである。以下に、本発明を詳細
に説明する。本発明に係る新規なペプチドは、次式
（１）及び（２） （１）Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｇｌ
ｙ−Ｖａｌ−Ａｌａ （２）Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ （式中の各記号はペプチド化学におけるアミノ酸配列の
各アミノ酸単位を示す。）の式で示されるＬ体のアミノ
酸の配列を有する新規なペプチドであり、常温における
性状は白色の粉末である。

【０００４】前記の２種のペプチドは、化学的に合成す
る方法または大豆のタンパク質分解酵素の分解液から分
離精製する方法を挙げることができる。本発明に係る新
規なペプチドを化学的に合成する場合には、液相法また
は固相法等の通常のペプチド合成方法によって行うこと
ができるが、好ましくは、固相法によってポリマー性の
固相支持体へ前記ペプチドのＣ末端（カルボキシル末端
側）からそのアミノ酸残基に対応したＬ体のアミノ酸を
順次ペプチド結合によって結合して行くのがよい。そし
て、そのようにして得られた合成ペプチドは、トリフル
オロメタンスルホン酸、フッ化水素等を用いてポリマー
性の固相支持体から切断した後、アミノ酸側鎖の保護基
を除去し、逆相系のカラムを用いた高速液体クロマトグ
ラフィー（以下、ＨＰＬＣと略記する。）等を用いた通
常の方法で精製することができる。

【０００５】上記したように、本発明に係る新規なペプ
チドは大豆のタンパク質分解酵素の分解液から分離精製
することができるが、その場合には、発明者等の文献
［Ｊ．Ｎｕｔｒ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．４，ｐｐ
４５０−４５７，（１９９３，Ａｕｇｕｓｔ）］の方法
に準拠し、例えば、以下のようにして行うことができ
る。上記の新規なペプチドを含有している生大豆を用い
て、適当な溶媒（例えば、水−トリス塩酸緩衝液、リン
酸緩衝液の中性の緩衝液等）中で十分にホモジネイトし
た後、加水分解する。加水分解は常法に従って行う。例
えば、ペプシン等のタンパク質分解酵素で加水分解する
場合は、生大豆ホモジネイトを必要とあれば更に加水分
解した後、酵素の至適温度まで加温しｐＨを至適値に調
整し、酵素を加えてインキュベートする。次いで必要に
応じ中和した後、酵素を失活させて加水分解液を得る。
その加水分解液を濾紙および／またはセライト等を用い
て濾過することによって不溶性成分を除去し、得られた
濾液をセロファン等の半透膜を用いて適当な溶媒（例え
ば、トリス−塩酸緩衝液、リン酸緩衝液の中性の緩衝液
等）中で十分に透析し、その濾液中の成分で半透膜を通
過した成分を含む溶液を強酸性陽イオン交換樹脂（例え
ば、ダウケミカル社製のＤｏｗｅｘ５０Ｗ等）にかけ、
その吸着溶出分画から 免疫賦活作用を有する成分を含
有する分画を得、得られた免疫賦活作用を有する分画を
ゲル濾過（例えば，ファルマシア社製のＳｅｐｈａｄｅ
ｘ Ｇ−２５等）によって分画し、得られた免疫賦活作
用を有する分画を陽イオン交換ゲル濾過（例えば、ファ
ルマシア社製の ＳＰ−ＳｅｐｈａｄｅＸ Ｃ−２５
等）によって分画し、得られた免疫賦活作用を有する分
画を更に逆相ＨＰＬＣによって分画する。

【０００６】この新規な２種のペプチドは、静脈内への
繰返し投与を行った場合、抗体産生を惹起せず、アナフ
イラキシーショックを起こさない。また、このペプチド
はＬ−アミノ酸のみの配列構造からなり、投与後、生体
内のプロテアーゼにより徐々に分解される為，毒性は極
めて低く安全性は極めて高い（ＬＤ_５０＞５０００ｍｇ
／Ｋｇ：ラット経口投与）。本発明に係る新規なペプチ
ドは、通常用いられる賦形剤等の添加物を用いて注射
剤、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤等に調整すること
ができる。投与法としては、通常は免疫不全症を有して
いる哺乳類（例えば、ヒト、イヌ、ラット等）に注射す
ること、あるいは経口投与することがあげられる。投与
量は、例えば、動物体重１ｋｇ当りこのペプチドを０．
０１〜１０ｍｇの量である。投与回数は、通常、１日１
〜４回程度であるが、投与経路によって、適宜、調整す
ることができる。上記の各種製剤において用いられる賦
形剤、結合剤、滑沢剤の種類は、特に限定されず、通常
の注射剤、散剤、顆粒剤、錠剤あるいはカプセル剤に用
いられるものを使用することができる。

【０００７】錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤に用いる
添加剤としては、下記のものをあげることができる。賦
形剤としては、結晶セルロース等の糖類、マンニトール
等の糖アルコール類、でんぷん類、無水リン酸カルシウ
ム等；結合剤としてはでんぷん類、ヒドロキシプロピル
メチルセルロース等；崩壊剤としてはカルボキシメチル
セルロースおよびそのカルウム塩類；滑沢剤としてはス
テアリン酸およびその塩類、タルク、ワックス類を挙げ
ることができる。また、製剤の調整にあたっては、必要
に応じメントール、クエン酸およびその塩類、香料等の
矯臭剤を用いることができる。注射用の無菌組成物は、
常法により、本発明に係る新規なペプチドを、注射用
水、生理食塩液およびキシリトールやマンニトールなど
の糖アルコール注射液、プロピレングリコールやポリエ
チレングリコール等のグリコールに溶解または懸濁させ
て注射剤とすることができる。この際、緩衝液、防腐
剤、酸化防止剤等を必要に応じて添加することができ
る。本発明の新規なペプチドを含有する製剤は凍結乾燥
品または乾燥粉末の形とし、用時、通常の溶解剤、例え
ば水または生理食塩液にて溶解して用いることもでき
る。

【０００８】本発明に係る新規なペプチドは、優れた免
疫賦活作用を有し、新規なペプチドをウサギに経口投与
すると、末梢血リンパ球のコンカナバリンＡ（以下Ｃｏ
ｎＡと略記する。）刺激に対する幼若化反応が有意に上
昇し、又、新規なペプチドをＣ５７ＢＬ／６マウスに経
口投与すると抗体産生能が上昇した。更に、新規なペプ
チドは、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてＣ３Ｈ／ＨｅＮマウ
スより得た脾細胞に対してマイトージェン活性を示す。

【０００９】

【実施例】以下に実施例として、製造例及び試験例を記
載し、本発明を更に詳細に説明する。 製造例１ 生大豆２００ｇに脱イオン水１ιを加えホモジナイズし
た後、１Ｎ塩酸にてｐＨを２．０に調整し、ペプシン
（メルク社製、酵素番号ＥＣ３．４．２３．１）１０ｇ
を添加し、３７℃で２０時間撹拌しながら加水分解を行
った。分解反応液を直ちに限外濾過膜（アミコン社製、
ＹＭ１０型、φ７６ｍｍ）に通過させ、通過液を強酸性
陽イオン交換樹脂Ｄｏｗｅｘ ５０ｗ Ｘ４［Ｈ^＋］
（φ４．５ｘ１５ｃｍ）カラムに加えた。カラムを脱イ
オン水で十分に洗浄した後、２Ｎ水酸化アンモニウム液
２ιを用いて溶出した。減圧濃縮によりアンモニアを除
去し、濃縮液４０ｍιを得た。濃縮液４ｍιを予め脱イ
オン水で緩衝化したＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラム
（φ２．５ｘ１５０ｃｍ）に負荷し、流速３０ｍι／ｈ
ｒ、各分画量８．３ｍιでゲル濾過した。その結果は図
１に示すとおりである。上記のゲル濾過を繰り返して大
量分取した免疫賦活活性の高い分画（分画番号１７〜３
７）を集め、凍結乾燥してペプチド粉末（大豆由来のペ
プチド粉末）とした。このペプチド粉末を説イオン水に
溶解した後、予め、脱イオン水で緩衝化したＳＰ−Ｓｅ
ｐｈａｄｅｘ Ｃ−２５［Ｈ^＋］（φ１．５ｘ４７．２
ｃｍ）カラムに負荷し、脱イオン水１ιから３％塩化ナ
トリウム液１ιの濃度勾配法により、流速６０ｍι／ｈ
ｒ、各分画量７．８ｍιでクロマトグラフィーを行っ
た。その結果は図２に示すとおりである。

【００１０】上記クロマトグラフ中、分画番号３０〜３
８の免疫賦活活性の高い分画を集めて凍結乾燥して精製
ペプチド粉末（ＳＰ−Ｉ分画部分）、分画番号３９〜４
７の免疫賦活活性の高い分画を集めて凍結乾燥して精製
ペプチド粉末（ＳＰ−ＩＩ分画部分）を得た。これら精
製ペプチド粉末（ＳＰ−Ｉ、ＳＰ−ＩＩ分画部分）を説
イオン水に溶解した後ＨＰＬＣを行った。条件はカラム
として野村化学（株）製Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ ＯＤＳ−
５０（φ４．６ｍｍＩＤｘ２５ｃｍＬ）を使用し、移動
相として０．１％トリフルオロ酢酸（以下、ＴＦＡと略
記する。）から５０％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ
の濃度勾配法により、流速１．０ｍι／ｍｉｎ、検出波
長２２０ｎｍでＨＰＬＣを行い、免疫賦活活性を有する
ペプチドを得た。その結果、精製ペプチド粉末（ＳＰ−
Ｉ分画部分）を供試料としたＨＰＬＣパターンは、図３
に示すとおりである｛溶出時間；（１）のペプチド１１
２分｝。又、精製ペプチド粉末（ＳＰ−ＩＩ分画部分）
を供試料としたＨＰＬＣパターンは、図４に示すとおり
である｛溶出時間；（２）のペプチド１０９分｝。この
ようにして得られた免疫賦活作用を有するペプチドのア
ミノ酸配列は、アプライドバイオシステム社製のプロテ
インシーケンサー４７７Ａ型を用いて決定された。その
結果、２種のペプチドは、それぞれ、、次式、（１）Ｉ
ｌｅ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｖａ
ｌ−Ａｌａ （２）Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ で示されるＬ体のアミノ酸残基からなる配列を有するペ
プチドであることが確認された。

【００１１】製造例２ 本例は、合成法による製造例である。 Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｖ
ａｌ−Ａｌａの合成法。 アプライドバイオシステム社製のペプチド自動合成装置
４３０Ａ型を用いた固相法によって当該ペプチドを合成
した。固相担体としては、スチレン−ジビニルベンゼン
共重合体（ポリスチレン樹脂）をクロロメチル化した樹
脂を使用した。まず、当該ペプチドのアミノ酸配列に従
って、常法どおり、そのＣ末端側のアラニンからクロロ
メチル樹脂に反応させペプチド結合樹脂を得た。このと
きのアミノ酸は、ｔ−ブトキシカルボニル（以下ｔ−Ｂ
ｏｃと略記す。）基で保護されたｔ−Ｂｏｃアミノ酸を
使用した。次にこのペプチド結合樹脂をエタンジチオー
ルとチオアニソールからなる混合液に懸濁し、室温で１
０分間撹拌後、氷冷下でトリフルオロ酢酸を加え、更に
１０分間撹拌した。この混合液にトリフルオロメタンス
ルホン酸を滴下し、室温で３０分間撹拌した後、無水エ
ーテルを加えてその生成物を沈澱させて分離し、その沈
澱物を無水エーテルで数回洗浄した後、減圧下で乾燥し
た。このようにして得られた末精製の合成ペプチドは蒸
留水に溶解した後、逆相系のカラムＣ_１８（５μｍ）を
用いたＨＰＬＣにより精製した。移動相として（Ａ）
０．１％ＴＦＡ含有蒸留水、（Ｂ）０．１％ＴＦＡ含有
アセトニトリル溶液を使用し、（Ａ）液が２０分間で９
０％→６０％の濃度勾配法により流速１．５ｍι／ｍｉ
ｎでクロマトグラフィーを行った。紫外部波長２１５ｎ
ｍで検出し、最大の吸収を示した溶出分画を分取し、こ
れを凍結乾燥することによって目的とする合成ペプチド
を得た。

【００１２】この合成ペプチドをマススペクトルにより
分析した結果、アミノ酸配列構造を有するペプチドであ
ることが確認された。このマススペクトルの結果は図５
に示すとおりである。他のペプチドについても上記合成
方法に準じ固相法によりそれぞれＣ末端側から反応させ
合成した。末精製の合成ペプチドは以下に示すとおり精
製した。 Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｎの精製法 逆相系のカラムＣ_１８（５μｍ）を用いたＨＰＬＣによ
り精製した。移動相として（Ａ）０．１％ＴＦＡ含有蒸
留水、（Ｂ）０．１％ＴＦＡ含有アセトニトリル溶液を
使用し、（Ａ）液が２０分間で９０％→６０％の濃度勾
配法により流速１．５ｍι／ｍｉｎでクロマトグラフィ
ーを行った。紫外部波長２１５ｎｍで検出し、最大の吸
収を示した溶出分画を分取し、これを凍結乾燥すること
によって目的とする合成ペプチドを得た。

【００１３】この合成ペプチドをマススペクトルにより
分析した結果、アミノ酸配列およびアミノ酸組成が前記
式で示したアミノ酸配列構造を有するペプチドであるこ
とが確認された。このマススペクトルの結果は図６に示
すとおりである。含成によって得られた本発明の２種の
ペプチドは、以下に示す試験によって薬理効果が確認さ
れた。

【００１４】試験例１ （ウサギ末梢血リンパ球のコンカナバリンＡ刺激に対す
る幼若化反応の測定）ウサギは成熟雄性日本白色種（Ｋ
ＢＬ：Ｊｗ、ＳＰＦ，体重２．０ｋｇ）を（株）北山ラ
ベスより購入し、１週間予備飼育を行った後、健常な動
物を試験に供した。飼育は温度２３±２℃、湿度５５±
１０％に保った飼育室内の金属製個別ゲージで行った。
飼料はオリエンタル酵母（株）製ＲＣ４を１日１２０ｇ
給餌し、水は自家揚水（水道法、水質基準適合）を自由
に摂取させた。１群３例のウサギを用い、製造例１にお
ける大豆由来のペプチド粉末２００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ
を体重１ｋｇ当り５ｍιの割合で３０日間連続投与し
た。対照群には同容量の溶媒を投与した。体重測定は３
日毎に行った。投与開始日並びに最終投与の翌日、各ウ
サギの耳静脈からヘパリン処理した注射器で１０ｍιの
血液を採取し、３時間以内に、リンパ球分離並びに^３Ｈ
−サイミジン取り込み能測定法による幼若化反応を実施
した。各リンパ球の取り込んだ放射能から次式により刺
激指数（ＳＩ）を算出した。 ＳＩ＝（ＣｏｎＡを加えた培養系）／（ＣｏｎＡを加え
ない培養系） 大豆由来のペプチド粉末（２００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ）
を３０日間経口投与したウサギの体重変化は表１に示し
た。体重変化は大豆ペプチド投与群と対照群との間に有
意差は認められなっかた。又、ウサギ末梢血リンパ球の
ＣｏｎＡ刺激による幼若化反応（ＳＩ値）を表２に示し
た。この結果、大豆ペプチドの投与前５．３±０．６か
ら投与後４４．８±７．０に上昇し、有意差（ｐ＜０．
０１、ｔ検定）が認められた。

【００１５】試験例２ （マウス脾細胞の抗体産生能測定）マウスは雄性、５週
齢（Ｓｌｃ：Ｃ５７ＢＬ／６、ＳＰＦ）を日本エスエル
シー（株）より購入し１週間予備飼育を行った後、健常
な動物を試験に供した。マウスの飼育は温度２３±２
℃、湿度５５±１０％に保った飼育室内のエアコンケー
ジで行った。餌料はオリエンタル酵母（株）製ＭＦ、水
は自家揚水（水道法、水質基準適合）を自由に摂取させ
た。１群３例のマウスを用い、製造例１における大豆由
来のペプチド粉末２００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙを体重１０
ｇ当り０．１ｍιの割合で１０日間連続経口投与した。
体重は、毎日計測した。大豆ペプチドの投与開始から５
日後、それぞれのマウスの尾静脈にヒツジ赤血球（ＳＲ
ＢＣ、デンカ生研（株））５Ｘ１０^８ｃｅｌｌｓ／ｍι
を０．２ｍｌ投与して免疫した。免疫の５日後、各群の
マウスから脾臓を採取し、Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｉｎｉｍ
ａｌ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｍｅｄｉｕｍ（ＥＭＥＭ、
日水製薬（株））を入れたシャーレ内で脾細胞を遊離さ
せた。リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で３回洗浄した後、ＥＭ
ＥＭで２．５Ｘ１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍιに調整した脾細
胞と５０％ＳＲＢＣ浮遊液及びモルモット乾燥補体（デ
ンカ生研（株））を８：１：１の割合で混合した。Ｃｕ
ｎｎｉｎｇｈａｍ，Ａ．Ｊ．らの方法（Ｉｍｍｕｎｏｌ
ｏｇｙ，１４，５９９，（１９６８））に準じて３７℃
で９０分反応後、溶血班（Ｐｌａｑｕｅ ｆｏｒｍｉｎ
ｇ ｃｅｌｌ、ＰＦＣ）を計測した。大豆由来のペプチ
ド粉末（２００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ）を１０日間経口投
与したマウスの体重変化並びに脾細胞調製時に測定した
脾臓重量を表３に示した。体重変化において大豆ペプチ
ド投与群と対照群との間に有意差は認められなかった。
又、大豆ペプチド投与群の脾臓重量は１０４．７±６．
１、対照群のそれは７３．１±１０．９で両者間に有意
差は認められなかった。マウス脾細胞での抗体産生能を
表４に示した。大豆ペブチド投与群の抗体産生細胞数は
１１１２±３０６．６であり、対照群の抗体産生細胞数
４９３．３±１７０．２と比較して有意（ｐ（０．０
１、ｔ検定）に上昇していた。

【００１６】試験例３ （合成ペプチドのマイトージェン活性の測定）藤原らの
方法（栄食誌，Ｖｏｌ４３，Ｎｏ．３，２０３−２０
８，（１９９０））に準じてマイトージェン活性を測定
した。製造例２で合成した新規な２種類のペプチドは、
２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＲＰＭＩ１６４０培地に対して
溶解（最大濃度１ｍｇ／ｍｌ）し，０．２μのフィルタ
ー濾過滅菌後、同培地により２倍ごと段階希釈を行った
ものを供試サンプルとした。Ｃ３Ｈ／ＨｅＮマウス
（６週齢、雄性）の脾臓を無菌的に摘出し、ワイヤーメ
ッシュ上で２５ｍＭＨＥＰＥＳ−ＲＰＭＩ１６４０培地
を滴下しながら穏やかに磨砕し、通過液を更にもう一組
のワイヤーメッシュを通すことにより単一細胞浮遊液を
調製した。脾細胞は同培地にて３回洗浄後、牛胎児血清
１０％を含む２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＲＰＭＩ１６４０
培地に浮遊させ、９６ウェルマイクロプレートに５Ｘ１
０^５個／１００μι／ウェルとなるように分注した。そ
の後、前記の供試サンプル１０μιを加え、５％ＣＯ_２
雰囲気下、３７℃で培養した。尚、陰性対照には、２５
ｍＭ ＭＨＥＰＳ−ＲＰＭＩ１６４０培地１０μιを、
陽性対照にはコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ、終濃度１μ
ｇ／ｍι）並びにリポポリサッカライド（ＬＰＳ、終濃
度１００μｇ／ｎι）を供試サンプルの代わりに加えて
いる。その後、０．５％の３−（４，５−ジメチル−２
−チアゾリル）−２，５ジフェニル−２Ｈテトラゾリウ
ムブロマイド（ＭＴＴ） 溶液を１０μι加え、更に３
時間培養を行い、しかる後、生じたＭＴＴ−フォルマザ
ンを酸−イソプロパノール溶液 （０．０４Ｎ濃度に塩
酸を添加）１００μιを加えて溶解し、ＥＩＡリーダー
にて５９５ｎｍの吸光度を測定した。データは陰性対照
の値を１００とした相対値にて表示している。マイトジ
ェン活性の結果は表５に示すとおりである。以上の試験
の結果、本発明に係わる新規な２種のペプチドより成る
大豆由来のペプチド粉末は、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて有
意に免疫機能に影響を及ぼすことが確認された。更に、
本発明に係わる新規な２種の合成ペプチドは、ｉｎ ｖ
ｉｔｒｏにおいて有意にマイトージェン活性を示すこと
が確認され、免疫賦活剤として有用である。尚、本発明
に係わる新規な２種のペプチドは、構造的にそのアミノ
酸配列を部分構造とするペプチドにおいて、構造中に採
用することもできる。

【００１７】

【表１】 本発明に係る新規な２種のペプチドの、製造例１におけ
る大豆由来のペプチド粉末投与時のウサギ体重変化。

【００１８】

【表２】 本発明に係る新規な２種のペプチドの、製造例１におけ
る大豆由来のペプチド粉末投与時の、ウサギ末梢血リン
パ球のコンカナバリンＡ刺激による幼若化反応。

【００１９】

【表３】 本発明に係る新規な２種のペプチドの、製造例１におけ
る大豆由来のペプチド粉末投与時の、マウス体重変化と
脾臓重量。

【００２０】

【表４】 本発明に係る新規な２種のペプチドの、製造例１におけ
る大豆由来のペプチド粉末投与時の、マウス脾細胞での
抗体産生能。

【００２１】

【表５】 本発明に係る新規な２種の合成ペプチドの、ｉｎ ｖｉ
ｔｒｏにおけるマイトージェン活性。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明に係る新規な２種のペプチドの、製造例
１におけるＳｅｐｈｄｅｘ Ｇ−２５カラムクロマトグ
ラフィーによる免疫賦活ペプチドの分離精製の結果を示
す図である。

【図２】本発明に係る新規な２種のペプチドの、製造例
１におけるＳＰ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｃ−２５
［Ｈ^＋］カラムクロマトグラフィーによる免疫賦活ペプ
チドの分離精製の結果を示す図である。

【図３】本発明に係る新規なペプチドの、製造例１にお
ける精製ペプチド粉末（ＳＰ−Ｉ分画部分）を供試料と
した、逆相高速液体クロマトグラフィーによる免疫賦活
ペプチドの分離精製の結果を示す図である。

【図４】本発明に係る新規なペプチドの、製造例１にお
ける精製ペプチド粉末（ＳＰ−ＩＩ分画部分）を供試料
とした、逆相高速液体クロマトグラフィーによる免疫賦
活ペプチドの分離精製の結果を示す図である。

【図５、図６】同、製造例２で得られた２種の合成ペプ
チドのマススペクトルを示す図である。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 次式； Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｖａｌ−
   Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｌａ で示されるＬ体のアミノ酸の配列によるペプチド構造を
   有する新規なペプチド。
2. 【請求項２】 次式； Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｖａｌ−
   Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｌａ で示されるＬ体のアミノ酸の配列によるペプチド構造を
   有する新規なペプチドを有効成分として含有することを
   特徴とする免疫賦活剤。
3. 【請求項３】 次式； Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−
   Ｇｌｙ−Ａｓｎ で示されるＬ体のアミノ酸の配列によるペプチド構造を
   有する新規なペプチド。
4. 【請求項４】 次式； Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−
   Ｇｌｙ−Ａｓｎ で示されるＬ体のアミノ酸の配列によるペプチド構造を
   有する新規なペプチドを有効成分として含有することを
   特徴とする免疫賦活剤。