JPH0822876B2 - ペプチドホルモンカルジオジラチン及びその製造法 - Google Patents

ペプチドホルモンカルジオジラチン及びその製造法

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JPH0822876B2
JPH0822876B2 JP60500395A JP50039585A JPH0822876B2 JP H0822876 B2 JPH0822876 B2 JP H0822876B2 JP 60500395 A JP60500395 A JP 60500395A JP 50039585 A JP50039585 A JP 50039585A JP H0822876 B2 JPH0822876 B2 JP H0822876B2
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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、新規ペプチドホルモンカルジオジラチン及
びその製造法に関する。
電子顕微鏡検査から、豚の右心房が２種類の異なる細
胞型を有し、その中の１つが形態学内分泌細胞（分泌顆
粒）を有することは、知られていた。しかし、右心房の
形態学及び組織化学的検査によつて、心房の筋内分泌細
胞（Aurikel）中に既に公知の型であるようなホルモン
物質は、全く測定することができなかつた。これに対し
て、心臓神経中の多数の公知の神経ペプチドホルモンは
確認された。
ところで、心房抽出液は、既に記載した利尿活性〔ジ
エイ・ピー・マリー（J.P.Marie）、エイツチ・ギレモ
ント（H.Guillemont）、ピー・ワイ・ハツト（P.Y.Hat
t）、“パトル・ビオル（Pathol・Biol.）”、第24巻
（1976年）第549頁〜第554頁、参照〕とともに、意外な
ことに、心筋それ自体のイオン向性に対する効果ないし
は血管平滑筋に対する影響、ならびに発汗に対する影響
を示すことが見い出された。更に、この生物学的作用
は、新規ペプチドホルモンによつて惹起され、この新規
ペプチドホルモンは、その作用に関連して、殊に高血圧
症の診断及び治療の点で大きい臨床的及び治療的な重要
性を生じることが見い出された。
従って、本発明の対象は、アミノ酸残基126個からな
り、その組成が： Asp/Asn 14個、Thy 3個、Ser 15個、Glu/Gln 12個、Pro
10個、Gly 12個、Ala 10個、Val 7個、Met 4個、Ile 1
個、Leu 15個、Tyr 2個、Phe 3個、Lys 4個、His 2個、
Arg 10個、Trp 2個であり、Ｎ−末端側71個のアミノ酸
配列が： Asn-Pro-Val-Tyr-Gly-Ser-Val-Ser-Asn-Ala-Asp-Leu-Me
t-Asp-Phe-Lys-Asn-Leu-Leu-Asp-His-Leu-Glu-Asp-Lys-
Met-Pro-Leu-Glu-Asp-Glu-Ala-Met-Pro-Pro-Gln-Val-Le
u-Ser-Glu-Gln-Asp-Glu-Val-Leu-Ser-Glu-Gln-Asn-Glu-
Glu-Val-Gly-Ala-Pro-Leu-Pro-Leu-Leu-Glu-Glu-Val-Pr
o-Pro-Trp-Thr-Gly-Glu-Val-Asn-Proであり、等電点I.
P.6〜6.5及び分子量約13000ダルトンであるペプチドホ
ルモンのカルジオジラチンである。
更に、また断片、殊にＣ−末端断片及びペプチドホル
モンカルジオジラチンのペプチド鎖の２個のMet残基の
間に存在する断片は、部分的に緩和された形であつても
カルジオジラチンの生物活性を示すことが見い出され
た。
従つて、本発明によるカルジオジラチンは、ペプチド
ホルモンカルジオジラチンのペプチド鎖の２個のMet残
基の間に存在する断片、例えばアミノ酸配列Asp-Phe-Ly
s-Asn-Leu-Leu-Asp-His-Leu-Glu-Asp-Lys-Hseを有する
断片（１）又はアミノ酸配列Pro-Leu-Glu-Asp-Glu-Ala-
Hseを有する断片（２）及びＮ−末端断片Asn-Pro-Val-T
yr-Gly-Ser-Val-Ser-Asn-Ala-Asp-Leu-Hseならびに記載
したホモセリン−ペプチドを簡略化したカルジオジラチ
ン−126のそれぞれのＣ−末端残留主体配列を有する。
この断片は、部分的なブロムシアン分解によつて得ら
れ、この場合カルジオジラチンのＮ−末端短縮により、
それぞれＣ−末端でホモセリン（Hse）で終結する分解
した断片が導かれる。また、アルギニン−特異性蛋白質
分解酵素での分解によつて形成された、カルジオジラチ
ンのＮ−末端で短縮された断片は、緩和された形であつ
ても基幹分子と同様の生物学的作用を定量的に有する。
更に、一連のカルジオジラチン断片は、合成によりメ
リフイールド（Merrifield）−合成によつて得られたか
又は特異的に分解する蛋白酵素を用いてのカルジオジラ
チンの分解によつて得られ、かつ検出された。この場
合、メリフイールド（Merrifield）−合成は、Ｃ−末端
から始まりアミノ酸鎖がそれぞれ２個だけのアミノ酸で
延長され、離脱され、検出され、かつ同じ原理により他
の２個だけのアミノ酸で延長されるように実施された。
この方法は、それが得られた、さらに下に詳細に定義さ
れた断片に必要とされるような程度に屡々繰り返され
た。
得られた断片は、重要な生物活性を示し、しかもそれ
は抗体を形成するのに適当であり、この抗体は、全部の
カルジオジラチンを確認する能力を有し、したがつてカ
ルジオジラチンを検出するために免疫検定の範囲内で使
用することもできる。適当なのは、RIA（同位元素標識
免疫定量法）の多数の公知の実施形式ならびにEIA（酵
素免疫検定）の多数の公知の実施形式である。更に、若
干の断片、殊にアミノ酸39〜126個を包含する断片及び
相当する、Ｎ−末端でアミノ酸７個まで延長した断片
は、カルジオジラチンの血管拡張作用を同様に示すこと
が判明した。
本発明によるカルジオジラチンが有している、HPLC−
データによって特徴付けられる断片は、次のとおりであ
る： アミノ酸位置１〜７を包含する断片： Asn-Pro-Val-Tyr-Gly-Ser-Val、ならびにその構造変
種Met（位置３）、Asn（位置５）及びAla（位置６）、
また双方とも配列Lys-LysをＮ−末端で延長する；例え
ばLys-Lys-Asn-Pro-Val-Tyr-Gly-Ser-Val。
断片８〜19: Ser-Asn-Ala-Asp-Leu-Met-Asp-Phe-Lys-Asn-Leu-Le
u。
（第３図参照） 断片23〜28: Glu-Asp-Lys-Met-Pro-Leuならびにその構造変種Glu
（位置24）。
（第４図参照） 断片29〜37: Glu-Asp-Glu-Ala-Met-Pro-Pro-Gln-Val、ならびにそ
のVal（位置32及び33）及びGlu（位置37）を有する変
種。
断片38〜44: Leu-Ser-Glu-Gln-Asp-Glu-Glu、ならびにそのPro（位
置41）、Asn（位置42）を有する変種。
（第５図） 断片63〜70: Asp-Pro-Ser-Gln-Arg-Asp-Gly-Gly、ならびにそのSer
（位置63）、Ala（位置65）を有する変種。
（第６図） 断片73〜79: GLy-Arg-Gly-Pro-Trp-Asp-Pro、ならびにそのPhe（位
置77）、Ser（位置79）を有する変種。
断片78〜84: Asp-Pro-Ser-Asp-Arg-Ser-Ala、ならびにそのSer（位
置79）を有する変種。
（第７図） 断片86〜92: Leu-Lys-Ser-Lys-Leu-Arg-Ala。
断片96〜104: Gly-Pro-Arg-Ser-Leu-Arg-Arg-Ser-Ser、ならびにそ
のAla（位置96）を有する変種。
（第８図） 断片108〜114: 付加的なTyr（位置107）、Tyr-Gly-Arg-Met-Asp-Arg-
Ileを有するもの、ならびにその環式形 （第９図） 断片117〜126: Ser-Gly-Leu-Gly-Cys-Asn-Ser-Phe-Arg-Tyr及びその
二量体ジスルフイド。
断片120〜126: Gly-Cys-Asn-Ser-Phe-Arg-Tyr及びその二量体ジスル
フイド。
断片39〜126: Ser-Glu-Gln-Asn-Glu-Glu-Val-Gly-Ala-Pro-Leu-Pro-
Leu-Leu-Glu-Glu-Val-Pro-Pro-Trp-Thr-Gly-Glu-Val-As
p-Pro-Ser-Gln-Arg-Asp-Gly-Gly-Ala-Leu-Gly-Arg-Gly-
Pro-Trp-Asp-Pro-Ser-Asp-Arg-Ser-Ala-Leu-Leu-Lys-Se
r-Lys-Leu-Arg-Ala-Leu-Leu-Ala-Gly-Pro-Arg-Ser-Leu-
Arg-Arg-Ser-Ser-Cys-Phe-Gly-Gly-Arg-Met-Asp-Arg-Il
e-Gly-Ala-Gln-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys-Asn-Ser-Phe-Arg-
Tyr、ならびにその位置39〜65のSer-Glu-Pro-Asn-Glu-G
lu-Ala-Gly-Ala-Ala-Leu-Ser-Pro-Leu-Pro-Glu-Val-Pro
-Pro-Trp-Thr-Gly-Glu-Val-Ser-Pro-Alaの範囲内の構造
変種。
配列７〜126中に同一的に含有されている１つの断片
が絶えず生成されるように断片39〜126を完全なカルジ
オジラチンの配列７〜38の１種類又はそれ以上のアミノ
酸によつてＮ−末端で延長する場合には、同様に完全な
カルジオジラチンの血管拡張作用を示す断片が得られ
る。
本発明によれば、心房抽出液を出発物質として使用し
かつ水性溶剤で抽出可能な材料を常用の生化学的精製法
により、活性画分を平滑筋に対する弛緩作用によつて測
定するような試験の使用下に分別することによりカルジ
オジラチンが得られる。有利には、例えば豚の心房の心
房抽出液からペプチドホルモンカルジオジラチンの精製
が行なわれる〔フアウ・ムツト（V.Mutt）、“アルキー
フ・ケミ（Arkiv Kemi）”、第15巻、第69頁〜第74頁
（1959年）〕。有利には、カルジオジラチンは、煮沸し
た心房物質を希酸で抽出することにより得られる。希酸
としては、なかんずくカルボン酸が適当であるが、鉱酸
を使用することもできる。好ましくは、酢酸が、殊に有
利に0.1〜0.3モルの濃度で使用される。
他の精製は、本発明によれば、酸抽出液をアルギン酸
で吸着し、ペプチドを希鉱酸で再びアルゲン酸から溶離
し、溶離液を塩沈殿に付し、この場合形成された沈殿物
を溶解し、かつ再びエタノールで沈殿させるよに行なう
ことができる。次に、エタノール沈殿物は溶解されかつ
カルボキシメチルセルロースによりクロマトグラフイー
処理される。こうして得られた物質は、一般に製薬学的
又は分析的目的のために十分に純粋である。上記の、塩
沈殿によつて得られた沈殿物は、選択的に直接に脱塩し
かつゲルクロマトグラフイーによつて、特にセファデッ
クス・ジー・25（Sephadex G 25）で精製することもで
きる。
精製は、逆相シリカゲルでの高圧−液体−クロマトグ
ラフイー（HPLC）（勾配溶離：アセトニトリルに対して
水中の0.1％のトリフルオル酢酸、０〜60％）及び活性
画分の分離により可能である。
好ましくは、逆相シリカゲルでのHPLCにイオン交換カ
ラムでのHPLCは前接され及び／又は逆相シリカゲルでの
HPLCは１回又は数回、特に２回繰り返される。
合成により得られるか又はＮ−末端メチオニン基もし
くはアルギニン基での分離によつて得られるＮ−末端断
片は、担体蛋白質との接合後にカイウサギ又はマウス
（バルブ（Balb）Ｃ）のような他の動物種への投与の際
に抗体形成を生じさせる、すなわちハプテンの性質をも
示す。この抗体は、特異性配位子としてアフイニテイク
ロマトグラフイーで濃縮（単離）のため及びペプチドホ
ルモンカルジオジラチンの検出のために使用することが
できる。従つて、Ｎ−末端断片−抗体を特異性配位子と
して用いるアフイニテイクロマトグラフイーは、ペプチ
ドホルモンを濃縮（単離）するためのもう１つの適当な
方法であり、この方法によりカルジオジラチンは、多く
の場合既に十分に純粋な形で得ることができる。アフイ
ニテイクロマトグラフイーは、前記のクロマトグラフイ
ー法の１つと一緒にペプチドホルモンを単離するために
使用することもできるが、それは、クロマトグラフイー
法の１つにそれに適した１種類又はそれ以上の方法によ
る他の精製を接続することができ；適当な方法は、例え
ば電気泳動法、沈殿法、吸着−クロマトグラフイー法、
イオン交換−クロマトグラフイー法、アフイニテイーク
ロマトグラフイー法、等電性フオーカシング法、又は１
種類又はそれ以上の同一又は異なる前記方法の組合せで
ある。
ペプチド鎖の２個のMet残基の間に存在する断片は、
カルジオジラチンから自体公知の方法で適当なヒドラー
ゼを用いる分解によつて得ることができるが、しかし例
えばアミノ酸配列（１）及び（２）を有する上記断片又
はＮ−末端断片のような断片は、合成法で、例えば溶液
中に混合した無水物を用いるメリフイールド（Merrifie
ld）の方法又は合成法のような自体公知のペプチド合成
によつて得ることもできる。
臓器浴中での腎動脈（カイウサギ）、腹大動脈（カイ
ウサギ、ラツト）及び腸間膜動脈下位（カイウサギ）に
対する弛緩効果は、ペプチドの作用に対する鑑別生物検
査の場合に利用され、この場合アドレナリン−前処理後
に収縮した血管筋肉条片は、カルジオジラチンの添加後
に明らかな弛緩を示す。腎動脈からの筋肉条片のこの弛
緩は、臓器浴10ml当り約10ng〜100ngの僅かな用量の際
に検出可能である。試験筋肉としての腹大動脈の条片の
場合には、約10倍の高い用量で検出可能な弛緩が判明
し、カイウサギの腸間膜動脈下位では活性は殆んど観察
されなかつた。
この生物学的作用は、ペプチドホルモンカルジオジラ
チン及び、見い出されたように、その断片、殊にMet−
残基の後又はMet−残基の間にありかつ部分的ブロムシ
アン分離後に得ることができるＣ−末端が大いに臨床的
（診断的）及び治療的に重要性を、実際に殊に次の点で
有することを示す： 1.特定の血管床の鑑別血管拡張、 2.高血圧症の診断、 3.高血圧症の治療。
従って、本発明の対象は、新規ペプチドホルモンカル
ジオジラチン及び／又はその有効な断片を含有する、上
記の診断法及び治療法で使用するための医薬でもある。
この医薬は、例えば錠剤、坐薬、施糖衣錠、溶液等のよ
うに経口又は非経口投与に常用の使用形で、場合によつ
ては常用の、薬理学的に認容性の担持剤及び／又は希釈
剤と一緒に存在することができる。カルジオジラチンの
量は、単位用量当り特に10〜1000ngである。
実施例１ 常用の電子顕微鏡法の使用下で、豚の心臓の右心房に
おいて筋内分泌細胞（内分泌顆粒）の最高の密度を有す
るような個所を測定した。この細胞を主に心房の薄壁個
所で見い出した。この豚の内分泌顆粒は、その大きさの
分布（230及び50nm）及び電子密度に関連してヒトの内
分泌顆粒と比較可能であり；この顆粒の数は、断面積１
μm2当り顆粒約0.02〜0.04である。
この右心房の上記組織を20000頭の豚の心臓から取り
出し、公知方法により抽出した〔ブイ・マツト（V.Mut
t）、“アルキーフ・ケミ（Arkiv Kemi）”第15巻、第6
9頁〜第74頁（1959年）、エス・アイ・セツド（S.I.Sai
d）及びブイ・マツト（V.Mutt）、“ヨーロツピアン・
ジヤーナル・オブ・バイオケミストリー（Eur.J.Bioche
m.）”第28巻、第199頁〜第204頁（1972年）、ブイ・マ
ツト（V.Mutt）、“グート・ホルモンズ（Gut Hormone
s）”、第21頁〜第27頁、エス・アール・ブルーム（S.
R.Bloom）（編者）エジンバラ−ロンドン−ニユーヨー
ク：チヤーチル・リビングストン（Edinburgh-London-N
ew York:Churchill Livingstone）、1978年、参照〕。
実施例２ このために豚の心房40kgを煮沸し、0.2モルの酢酸で
抽出した。この液をアルギン酸で吸着し、アルゲン酸
をエタノールで洗浄し、引続き0.2モルの塩酸で溶離し
た。次に、ペプチドを含有する溶離液にペプチドが沈殿
するまで塩を添加し、沈殿物を遠心分離する。この沈殿
物を再び燐酸塩緩衝液pH7に溶解し、エタノールの添加
によつて再び沈殿物を生じさせる。この沈殿物を再び燐
酸塩緩衝液pH6.4に溶解し、カルボキシメチルセルロー
ス上に塗布した。カラムは、先に、0.03モルのNaOH、0.
025モルのH3PO4、チオジクリコール0.5％を含有する緩
衝液pH6.4で平衡にさせた。同じ緩衝液を用いての溶離
後、0.03モルのNaOH、0.025モルのH3PO4及び0.2モルのN
aClを含有する緩衝液pH6.4でさらに溶離を行なつた。こ
の場合には、最も活性の画分が溶離された。
塩含有緩衝液で溶離した画分をイオン交換カラム〔エ
ム・ケイ・ビー（LKB）社のテイー・エス・ケイ（TSK）
−カルボキシメチルセルロース〕上に与え、0.03モルの
燐酸ナトリウム緩衝液pH6.4及び０〜0.5モルの塩化ナト
リウム勾配で溶離する。活性画分を捕集し、架橋デキス
トラゲルのカラム〔セフアデツクス・ジー・25（Sephad
ex G25 ）〕により脱塩し、かつ逆相を有する分取高圧
液体クロマトグラフイー（HPLC）に、特にオルガノゲン
C18‐５μ（Organogen C18‐５μ ）の使用下で与え
る。
カラム：ウオータースC18−μボンダパツク（Bondapa
k）、４×250nm。
勾配溶離：アセトニトリルに対して水中のトリフルオ
ル酢酸0.1％、45分間で０〜60％。
ペプチドカルジオジラチンは、アセトニトリル45％で
HPLC−カラムから流出し、かつ24.1分間の保持時間を示
す。
第１図は、このHPLCの線図を示す。
得られた活性画分をその後になお２回同じHPLCに与え
た。
等電点I.P.を６〜6.5で測定した。
ペプチドは、アミノ酸分析で次の組成を示す： Asp/Asn 14個、Thr 3個、Ser 15個、Glu/Gln 12個、P
ro 10個、Gly 12個、Ala 10個、Val 7個、Met 4個、Ile
1個、Leu 15個、Tyr 2個、Phe 3個、Lys 4個、His 2
個、Arg 10個、Trp 2個。
アミノ酸配列をＮ−末端から自動化されたエドマン分
解法によつて次のように測定した： Asn-Pro-Val-Tyr-Gly-Ser-Val-Ser-Asn-Ala-Asp-Leu-
Met-Asp-Phe-Lys-Asn-Leu-Leu-Asp-His-Leu-Glu-Asp-Ly
s-Met-Pro-Leu-Glu-Asp-Glu-Ala-Met-Pro-Pro-Gln-Val-
Leu-Ser-Glu-Gln-Asp-Glu-Val-Leu-Ser-Glu-Gln-Asn-Gl
u-Glu-Val-Gly-Ala-Pro-Leu-Pro-Leu-Leu-Glu-Glu-Val-
Pro-Pro-Trp-Thr-Gly-Glu-Val-Asn-Pro:（全部の配列
は、配列分析によりアミノ酸残基126個を包含する）。
分子量は、アミノ酸組成により約13000ダルトンを算
出した。
精製方法の種々の段階には、下記の生物検査による生
物学的試験を実施し、この場合には、精製の程度が進む
につれて特異的活性の上昇を示した。
生物検査の実施： 生物検査を血管平滑筋で実施し、この場合には、臓器
浴中で試験すべき画分の作用下に弛緩を測定した。

Claims (8)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】アミノ酸残基126個からなり、そのアミノ
    酸組成が： Asp/Asn 14個、Thy 3個、Ser 15個、Glu/Gln 12個、Pro
    10個、Gly 12個、Ala 10個、Val 7個、Met 4個、Ile 1
    個、Leu 15個、Tyr 2個、Phe 3個、Lys 4個、His 2個、
    Arg 10個、Trp 2個であり、Ｎ−末端側71個のアミノ酸
    配列が： Asn-Pro-Val-Tyr-Gly-Ser-Val-Ser-Asn-Ala-Asp-Leu-Me
    t-Asp-Phe-Lys-Asn-Leu-Leu-Asp-His-Leu-Glu-Asp-Lys-
    Met-Pro-Leu-Glu-Asp-Glu-Ala-Met-Pro-Pro-Gln-Val-Le
    u-Ser-Glu-Gln-Asp-Glu-Val-Leu-Ser-Glu-Gln-Asn-Glu-
    Glu-Val-Gly-Ala-Pro-Leu-Pro-Leu-Leu-Glu-Glu-Val-Pr
    o-Pro-Trp-Thr-Gly-Glu-Val-Asn-Proであり、等電点I.
    P.6〜6.5及び分子量約13000ダルトンであるペプチドホ
    ルモンカルジオジラチン。
  2. 【請求項２】アミノ酸組成が： Asp/Asn 14個、Thy 3個、Ser 15個、Glu/Gln 12個、Pro
    10個、Gly 12個、Ala 10個、Val 7個、Met 4個、Ile 1
    個、Leu 15個、Tyr 2個、Phe 3個、Lys 4個、His 2個、
    Arg 10個、Trp 2個であり、Ｎ−末端側71個のアミノ酸
    配列が： Asn-Pro-Val-Tyr-Gly-Ser-Val-Ser-Asn-Ala-Asp-Leu-Me
    t-Asp-Phe-Lys-Asn-Leu-Leu-Asp-His-Leu-Glu-Asp-Lys-
    Met-Pro-Leu-Glu-Asp-Glu-Ala-Met-Pro-Pro-Gln-Val-Le
    u-Ser-Glu-Gln-Asp-Glu-Val-Leu-Ser-Glu-Gln-Asn-Glu-
    Glu-Val-Gly-Ala-Pro-Leu-Pro-Leu-Leu-Glu-Glu-Val-Pr
    o-Pro-Trp-Thr-Gly-Glu-Val-Asn-Proであり、等電点I.
    P.6〜6.5及び分子量約13000ダルトンであるペプチドホ
    ルモンのカルジオジラチンを製造する方法において、豚
    の心房の心房抽出液を出発物質として使用し、水性溶剤
    で抽出可能な物質を常用の生化学的精製法により、活性
    画分を平滑筋に対する弛緩作用ならびに液体比重測定法
    及び皮膚を介しての水放出のヒトの能力測定によって測
    定するような試験の使用下で分別することを特徴とす
    る、ペプチドホルモンのカルジオジラチンの製造法。
  3. 【請求項３】煮沸した心房物質を希酸で抽出する、請求
    の範囲第２項記載の方法。
  4. 【請求項４】酸抽出液をアルギン酸で吸着し、ペプチド
    を希鉱酸で溶離し、溶離液をNa−アセテートで緩衝し、
    中和し、塩沈殿に与え、沈殿物を溶解し、エタノール沈
    殿に与え、エタノール沈殿物を再び溶解し、かつカルボ
    キシメチルセルロースによりクロマトグラフィー処理す
    る、請求の範囲第２項記載の方法。
  5. 【請求項５】塩沈殿で得られた沈殿物を架橋デキストラ
    ンゲルによるカラムクロマトグラフィーで直接に脱塩
    し、かつ精製する、請求の範囲第４項記載の方法。
  6. 【請求項６】心房抽出液を酢酸で得る、請求の範囲第２
    項又は第３項に記載の方法。
  7. 【請求項７】精製のために高圧液体クロマトグラフィー
    （HPLC）を逆相シリカゲル（勾配溶離：アセトニトリル
    に対して水中の0.1％のトリフルオル酢酸、０〜60％）
    で実施し、活性画分を分離する、請求の範囲第３項から
    第５項までのいずれか１項に記載の方法。
  8. 【請求項８】逆相シリカゲルでのHPLCにイオン交換カラ
    ムでのHPLCを前接し及び／又は逆相シリカゲルでのHPLC
    を１回又は数回繰り返す、請求の範囲第７項記載の方
    法。
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