JPH07506195A - 特異的結合性アッセイ試薬の固定化 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 特異的結合性アッセイ試薬の固定化 発明の分野 本発明は、一般的には、固相支持体上への特異的結合性アッセイ試薬の固定化の ための方法の分野に関する。特に、本発明は、水溶性ポリマーを用いて試薬を固 相支持体上へ固定化する方法に関する。本発明はまた、診断試験において有用な 試薬を固定化しである固相支持体にも関する。

発明の背景 ｉｎ　ＶｉｔｒＯ診断アッセイは、体液サンプル又は組織サンプル中に見出され る被分析物の量を測定するために使用できる。被分析物は、該サンプル中に見出 される他の成分から識別されなければならない。被分析物は、その被分析物に対 する特異的レセプターと該被分析物とを反応させることによって、他のサンプル 成分から識別することができる。被分析物を識別しそして定量するための特異的 レセプターを利用するアッセイは、しばしば特異的結合アッセイと呼ばれる。

最も普通のレセプターは、抗体及び、内因子又は葉酸結合性タンパク質のような 特異的結合性タンパク質である。レセプターは、被分析物又は該被分析物の類縁 体に対して可逆的な特異的結合親和性を有することによって特徴づけられる。該 類縁体は、一般的に被分析物の、酵素、蛍光性分子その他の既知の標識を担持し た誘導体であって、しかも該被分析物とほぼ同一の特異性及び親和性を以てレセ プターと結合するものである。

技術的及び特許文献に記述されている不均質の特異的結合アッセイにおいては、 特異的結合反応のレセプター又は他のアッセイ試薬は、しばしば固相上に固定化 される。これらの試薬の固定化は、結合した成分（例えばレセプターを介して該 固相に結合した被分析物）を未結合の成分から分離するために必要とされる。

レセプター又は他の試薬を固相上に固定化することのできる種々の方法には、吸 着、吸収又は共存結合による結合が含まれる。しかしながら、そのようなアッセ イにおいて使用される固相支持体の多くは、不活性ではなく、タンパク質及び他 の物質を非特異的結合によってサンプルから隠藪し得る。ガラスは比較的不活性 な基質ではあるが、一般に、固相結合アッセイにおいて使用するためには不満足 であることが見出されている。ガラス基質の不十分性についての議論に関しては 、例えば米国特許第３，７９０，６５３号を参照。

しかしなから最近、試薬の、本質的に水溶性の免疫複合体と該試薬に対する抗血 清とを、不活性のガラス繊維固相支持体上に固定化するための手順が記述されて いる。これらの手順は、参照によりここに導入される米国特許第４，５１７，２ ８８号に開示されている。

これらの免疫学的固定化手順においては、少なくと２種の免疫化学的に反応性の 物質を互いに溶液中において組み合わせることによって、可溶性の免疫複合体が 調製される。そのような免疫化学的に反応性の材料の少なくとも１つは、関係被 分析物に対するその免疫化学的特異性のために選択される。例えば、もし該可溶 性の免疫複合体を、ＴＳＨの検出のためにイムノアッセイにおいて使用しようと するならば、該免疫複合体の−の構成要素は、ＴＳＨに対するその免疫化学的特 異性のために選択される。典壓的な一例は、ＴＳＨに対し特異性を有する抗体、 すなわち、抗ＴＳＨ抗体であろう。該免疫複合体の第２の構成要素は、該抗ＴＳ Ｈ抗体に対して向けられた抗体調製物を含んでなることができよう。抗被分析物 抗体（例えばマウス抗ＴＳＨ抗体）に対する抗血清は、精製されたマウスＩｇＧ をホスト動物（すなわち、ヤギ）に注射し、その後肢マウスＩｇＧに対する抗血 清を収穫することにより調製することができる。該マウス抗ＴＳＨ抗体及びマウ スＩｇＧに対するヤギ抗血清は、その後標準原液として構成される。

これらの原液を一旦調製すると、緩衝された媒質に添加することによって、各々 の一部が他と組み合わされる。得られた免疫複合体は、緩衝剤の適当な液量中に 入れて、ガラス繊維フィルターの境界の定まった領域上にスポットされる。代わ りとしては、この免疫複合体の２つの構成要素が、別々の緩衝溶液として該フィ ルターに適用され、その場所で反応することが許容されてもよい。両方の例にお いて、該免疫複合体を適用する点は、該固相内の反応区域を規定する。適用され た免疫複合体は、該ガラス繊維フィルター内の繊維床の間隙中に吸着されそして 捕捉される。適用の方法には、手動の若しくは自動化されたピペットによる、又 は他の、アッセイ分析装置を含む自動化された装置による該免疫複合体溶液の分 配が含まれ得る。該固相への該免疫複合体の適用及び適当なインキュベーション 時間の経過に続き、該固相は、制御された条件下において乾燥され、多くの固相 特異的結合アッセイプロトコールの何れにおいても使用できる、安定な反応性試 薬を与える。

免疫学的固定化は、種々のアッセイ方式において有用ではあるが、多くの固有の 欠点を含むことが認識されている。フィルター上の追加の免疫グロブリン（例え ば、抗被分析物抗体に対する抗血清）の存在は、タンパク質性の及び他の生物学 的材料の、非特異的結合をもたらし得る。これは、アッセイの感度を有意に低下 させ得る。

更に、同一の又は異なったホスト動物の別々の免疫から得られるＩｇＧ調製物に 固有の変動性があることから、製造手順において、ＩｇＧ調製物の力価、純度、 特異性及び親和性におけるロフト間変動に対処しなければならない。同様に、原 液中において免疫複合体が不均質に分布する傾向によって、固相試薬の生産にお ける変動に遭遇し得る。すなわち、そのような免疫複合体は、実質的に可溶性で ある一方、完全には可溶性を維持しないこともあり得、経時的に溶液からいくら かの沈降を起こし得る。原液の定期的な混合を以てしても、重力の影響、温度勾 配及び他の物理的影響が、該固相試薬に適用される溶液内に微妙な不均質性を引 き起こし得る。

スターバーストーデンドリ７−　（ｓｔａｒｂｕｒｓｔ　ｄｅｎｄｒｉｍａｒｓ ）　（ＴｈｅＤＯ讐Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙによって製造されている ）は、正確に規定された組成を存し且つ正確に規定された分子量を有する、球状 の又は他の３次元形状のポリマーである。そのようなデンドリマーは、内部の及 び外部の部分を適当に選択することによって、水溶性高分子として合成すること が可能である。参照によりここに導入される米国特許第Ｊ５０７．１＋６６号及 び第１４　、５６８．７３７号を参照のこと。デンドリマーは、種々の薬剤的材 料に並びに、診断又は治療適用のために選ばれた身体部位へ接合体を導（よう機 能し得る、種々の標的分子に接合されることができる。参照によりここに導入す るＷｏ　８８０１１７８を参照のこと。スターバースト・デンドリマーは、腫瘍 の治療及び診断のための放射性標識した抗体の比活性を高めるための手段として 、合成ポルフィリン（例えば、ヘム、クロロフィル）を抗体分子に共有結合によ り連結するために使用されてきた。Ｒｏｂｅｒｔｓ、　Ｊ、Ｃ，ｅｔ、　ａｌ、 　、　Ｕｓｉｎｇ　５ｔａｒｂｕｒｓｔ　ｄａｎｄｒｉｍｅｒｓ　ａｓ　Ｌｉｎ ｋｅｒ　Ｍｏ１ｅｃｕｌｅｓ　ｔｏ　Ｒａｄｉｏｌａｂａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉ ｅｓ、　Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ、　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１：　３０５−３０８　 （＋９９０）。

発明の要約 本発明は、デンドリマーに特異的結合性アッセイ試薬を共有結合によって連結し そして該デンドリマーー試薬複合体を固相支持体の境界の定まった領域内に固定 化することによる、固相支持体の調製方法に関する。レセプターのような試薬が 、炭素−窒素（Ｃ−Ｎ）結合の形成を含む（が限定はされない）結合方法によっ て、デンドリマーに共有結合によって結合される。そのようなＣ−Ｎ結合は、例 えば、レセプターの炭水化物部分を酸化させてアルデヒドし、該レセプターを該 デンドリマーと組み合わせ、次いで、得られたシッフ塩基を還元することによっ て形成することができる。該デンドリマーに該レセプターを結合させるための他 の方法には、炭素−イ才つ（Ｃ−３）及び炭素−酸素（Ｃ−０）の結合の形成が 含まれる（限定はされない）。該Ｃ−８結合は、例えば、スルホスクシンイミジ ル−（４−イオドアセチル）　アミノベゾエート（Ｓ　ＩＡＢ）標識デンドリマ ーをスルフヒドリル含有レセプターと組み合わせることにより、形成することが できる。Ｃ−Ｏ結合は、例えば、臭化シアン活性化デンドリマーとレセプターの アミノ基との反応によって形成することができる。

該試薬は、抗体又は抗体フラグメント、結合性タンパク質、他のポリペプチド又 は種々の生物活性非蛋白性分子であることができる（限定はされない）。本発明 において有用なデンドリマーには、反応性の官能性末端基を有する水溶性デンド リマーが含まれる（限定はされない）。そのような反応性の官能基には、アミノ 、カルボキシル及びスルフヒドリル官能基が含まれる（限定はされない）。該デ ントリマーは、２２オングストローム（入）、５８人、９５人、及びより大きな 、定まった直径を含む（限定はされない）、種々の定まった直径を有することが できる。好ましい定まった直径は、５ＩＪ人及び９５人であり、最も好ましい定 まった直径は５４人である。

本発明はまた、デンドリマーー試薬複合体を吸着した固相を含んでなる特異的結 合アッセイ複合体をも含む。該好ましい固相は、多孔性の不活性な固相である。

該デンドリマーー試薬複合体は、該試薬を該デンドリマーに共有結合によって取 り付けることにより調製される。

本発明はまた、サンプル中の被分析物の濃度又は存在を測定するための、デンド リマーー試薬複合体を用いる固相結合アッセイを実施するための方法を含んでな る。

図面の簡単な説明 図１は、例として抗体（ＩｇＧ）試薬を使用した、デンドリマーー試薬複合体中 のＣ−Ｎ結合の産生のための、シッフ塩基化学の概要的な表現である。

図２は、例として抗体（ＩｇＧ）試薬を使用した、デンドリマーー試薬複合体中 におけるＣ−８結合の産生のための、スルホスクシンイミジル−（４−イオドア セチル）アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）に基つく化学の概要的な表現である。

図３は、モノクローナル抗体ＣＡ２−デンドリマー複合体との直接的特異的結合 アッセイ方式による、ｈＴＳＨの種々の濃度についての較正曲線を描く。

図４は、ＣＡ２−デンドリマー複合体（ｒＣＡ２−ＤＥＮＩ］　）と、免疫学的 に固定化したモノクローナル抗体ＭＡＢ−２−ヤギ抗ＩｇＧ（ｒ現行タブ」）複 合体とによる、ｈＴＳＨの直接的特異的結合アッセイについての較正曲線を描く 。

図５は、ＣＡ−２デンドリマ一複合体（ｒＣＡ２−ＤＥＮＤＪ　’）と、免疫学 的に固定化したモノクローナル抗体ＣＡ−２ヒツジ抗ＩｇＧ　（ｒ超高感度ＴＳ ＨタブＪ）複合体とによる、ｈＴＳＨの直接的特異的結合アッセイのための較正 曲線を描く。

図６は、図５に描かれた下側末端データの拡大図である。

図７は、抗コルチゾルボリクローナル抗体−デンドリマー複合体（［コルチゾル ーデンドリマー」）と、及び免疫学的に固定化た抗コルチゾル抗体（「現行タブ 」）とによる、コルチゾールの競合的イムノアッセイのための較正曲線を描く。

図８は、葉酸−デンドリマー複合体による競合的アッセイ方式を用いて、種々の 濃度の葉酸についての較正曲線を描く。

詳細な記述 本発明の固相支持体を調製するのに最も有用なデンドリマーは、一般に、米国特 許第’１，５０７．ＩＪ６６号に開示されているように「星」形を有する、球状 の分枝したポリマーである。該星形は、個々の技が核又はコア領域から放射して いるものである組織立てられた分枝に由来する。この多価のコアは、少なくとも ２つの段、又は世代を経て延びている少なくとも２つの規則正しい樹木状の（木 のような）技に、共有結合により結合されている。最外部の段又は世代は、種々 の他の分子と化学的反応できる官能基に終わるように誘導されることができる。

こうして、スター・デンドリマーは、３つの顧著な建築的特徴、すなわち（ａ） 開始剤コア、（ｂ’）該開始剤コアに放射状に取り付けられた反復単位より構成 された開始剤層（各世代）、及び（Ｃ）該最外世代に取り付けられた末端官能性 の外部表面を有する、単一分子構築物である。

デンドリマーのサイズ、形状及び反応性は、開始剤コアの選択、該デンドリマー を創り出す際に用いられる世代数、そして各世代において用いられる反復単位の 選択によって、制御できる。用いる世代の数に応じて、個々のサイズのデンドリ マーが容易に得られる。

加えて、表面部分の全部又は一部の化学的修飾が、特定の診断的又は治療的操作 に適した新しい表面官能性を創り出し得る。本発明において使用するのに適した 全体として球状のデンドリマーが、米国特許第Ｊｌ　、　５０７．４６６号及び 米国特許第４　、５６８．７３７号に開示されている。代わりとしては、米国特 許第４．６９１１．０６４に開示されているような非球形のデンドリマーが、本 発明において使用するために採用できる。好ましくは、該デンドリマーは、アミ ノ末端官能基を有する官能性の付与された外部表面を有する。

信頼性のあるそして再現性のある種々の化学が、デンドリマーの官能性の付与さ れた外部表面への特異的結合性アッセイ試薬の取付けのために利用できる。例え ば、過ヨウ素酸酸化抗体は、デンドリマーと結合させることができ、次いて得ら れたシップ塩基の水素化ホウ素還元を行うことができる。Ｃ−Ｎ結合を形成する ためのこの方法は、図１に概要的に描かれている。好ましくは、５４人のデンド リマーが、適当なアッセイ剤と結合させるために使用される。このチントリマー は、９６個のアミンに終わる末端（表面）基を有し分子量２１５９０を有する第 ５世代粒子である。該アミンに終わる末端基は、通常のアッセイ条件下において そのようなデンドリマーの表面に正味の正電荷を付与する。

代わりとしては、特異的結合性アッセイ試薬は、５ＩＡＢで誘導体としたデンド リマーをスルフヒドリル含有アッセイ試薬と合わせることによるＣ−８結合の形 勢によってデンドリマーに取り付けることができる。Ｓ　ＩＡＢ化学の使用によ るデンドリマーー試薬複合体の調製は、図２に概要的に描かれている。

チントリマー表面官能基には、アミノ末端基の他に、ヒドロキシ、メルカプト、 カルボキシル、アルケニル、アリル、ビニル、アミド、ハロ、尿素、オキシラニ ル、アジリジニル、オキサゾリニル、イミダゾリニル、スルホナート、ホスホナ ート、イソシアナート、及びイソチオシアナートが含まれる。種々の既知の化学 が、この広範な表面官能基と共に使用でき、そのような官能基にアッセイ試薬を 取り付けるのに有用である。

出願人は、デンドリマーー試薬複合体が、特異的結合アッセイ固相上への試薬の 固定化９ために使用できることを発見した。そのような複合体が、イムノアッセ イその他のアッセイにおいて種々の固相試薬の調製に有用である一方、出願人は 、ガラス繊維フィルター基質及び放射状分配アッセイと共に使用するのに際した 、そのような複合体の特に有用な適用を見出した。Ｇｉｅｇｅｌ　ａｔ　ａｌ、 、　Ｃ１１ｎ、　Ｃｈｅ叱２８：　１８９４−９８　（１９８２）及び米国特許 第’１，５１７，２８８号に開示されている放射状分配アッセイは、全段階が直 接に固相上で行われるアッセイ手順である。抗体又は他の試薬は、ガラス繊維濾 紙の小さな領域上に固定化される。検出すべき既知量の被分析物を含有する種々 の較正標準又はそのような被分析物を含有し得る種々の未知のサンプルが、次い でこの固定化されたレセプターと反応させられる。標識された類縁体その他の標 識試薬の適当な添加に続いて、洗浄液の適用により濾紙の中心領域から過剰の試 薬が除去される。エンザイムイムノアッセイの場合においては、該洗浄液は該酵 素のための基質を含んでよく、こうして該洗浄段階と同時に酵素反応を開始する 。好ましくは、該基質に対する該酵素の作用は、蛍光信号を発生させる。該中心 領域の一部における該酵素活性が、次いて全面蛍光光度法によって定量される。

アッセイ方式、すなわち直接的結合アッセイ又は競合アッセイに依存して、蛍光 率は、該サンプル中の被分析物の濃度に正比例又は反比例する。

上述のように、該固相は比較的「不活性」な表面を提供することか好ましい。す なわち、該表面は、特にタンパク性の材料の無差別な吸着に関して、生物学的材 料と比較的無反応性でなければならない。本発明の好ましい具体例においては、 該固相の物理的形態は、該固相の間隙又は孔が、反応液が保持されそして毛細管 作用により輸送されるよう十分に小さいようなものである。他方、該固相孔又は 間隙は、偽の陽性信号を生じるかも知れないような望ましくない成分を保持する 程に小さくてはならない。

該固相は、圧縮された、例えばガラス又は合成繊維又は比較的不活性のセルロー ス性材料のような圧縮された繊維のマットよりなるのが有利である。該固相は、 焼結ガラス、セラミックス及び合成ポリマー性材料のような他の多孔性構造より なっていてもよい。ガラス繊維濾紙は、その不活性であるという特性の故に及び 本発明の水溶性複合体を、アッセイ試薬の保持の定量的評価に十分な量吸着する 能力の故に、本発明の好ましい固相支持体である。ガラス繊維の表面は、正味の 負の電荷を担持てき、それはアッセイ条件下において実質的に正に荷電した表面 を有するデンドリマー、すなわちアミン末端表面基を有するデンドリマーの吸着 を容易にする。

本発明のデンドリマーー試薬複合体は、適当な固相上に一旦吸着されると、種々 の生物学的材料の分析のための種々の分析プロトコールにおいて、使用すること ができる。例えば、デンドリマーーレセブター複合体は、治療薬、天然の又は合 成のステロイド、ホルモン、酵素、抗体その他の関係被分析物の存在についての 、血液又は尿のイムノアッセイのために有用であろう。

そのようなプロトコールにおいて分析されることのできる治療剤には、ジゴキシ ン、シランチン（ｄｉｌａｎｔｉｎ）　、フエノバルビタール、テオフィリン、 ゲンタマイシン、キニジンその他が含まれる（限定はされない）。前記の仕方で 調製された固相はまた、コルチゾル、アルドステロン、テトステロン、プロゲス テロン、及びエストリオールのようなステロイド又はフェリチンのような血清タ ンパク質の検出のためのイムノアッセイにおいて使用することもできる。本発明 の固相複合体の使用によって、ホルモンのレベルもまた測定可能である。これら のホルモンには、テトラヨードサイロニン及びトリヨードサイロニンのような甲 状腺ホルモン、及び甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、インスリン、コルチコトロ ピン、ガストリン、アンジオテンシン、及びプロアンジオテンシンのようなペプ チドホルモン、及びサイロトロピン、レブテオトロピン、ソマトトロピン及びヒ ト絨毛性性腺刺激ホルモン（ＨＣＧ）のようなポリペプチドホルモンが含まれる （限定はされない）。本発明の複合体の他の適用には、代謝に関連する比較的小 さい分子、すなわち葉酸のアッセイ、感染性疾患に関連したポリペプチド抗原及 び抗体すなわちＨＩＶ、肝炎、ＣＭＶ、梅毒、ライム病因子その他多くの感染性 因子に関連した抗原及び抗体のアッセイが含まれる。

出願人は、固相上へのアッセイ試薬の固定化を促進するために、抗血清に代えて チンドリマーが使用できることを発見した。すなわち、チンドリマーは、抗体の ようなアッセイ試薬に又は比較的小さい分子にさえ結合させて、ついでガラス繊 維フィルター上に固定化することができる。免疫学的固定化との比較において、 チンドリマー複合体を利用した固定化は、多くの明確な利点を提供する。第１に 、チンドリマーは、精密なポリマー化学によって生産され、精密な分子サイズ、 分子量及び表面組成を与える精密な数の世代を有するように設計することができ る。均一な且つ特徴付けられた化学のために、そのようなパラメーターは異なっ た製造ロットにわたって均一性を維持する。第２に、チンドリマーは、内部及び 表面組成に依存して、該チンドリマーー試薬接合体が溶液中に留まり溶液の均質 性を経時的に維持するよう、水溶性であるように製造することができる。これは 、溶液中における免疫学的接合体の不均質な分布によるロフト間不拘−性をＨＦ 除する。第３に、チンドリマーに試薬を取り付けるだめの化学は、十分に特徴付 けられており、抗血清及び抗体結合性物質の関連に固有の変動の影響を受けない 。抗血清は、親和性、特異性、及びイムノグロブリン純度の変動の影響を受ける が、チンドリマーー試薬接合体の生産に際してはそれらの何れも問題とならない 。

これらの理由により、チンドリマーに基づく固相試薬は、実質的なロフト間均一 性をもって容易に調製できる。更には、チンドリマーの原液又は市販の溶液が実 質的な期間にわたり均質性を維持することから、市販のアッセイ機器の使用者が これらの固相試薬を現場で調製することが可能である。新たに調製された固相試 薬の使用は、更に、長期貯蔵、貯蔵温度その他の貯蔵変数による変化のような、 調製済固相試薬の出荷及び商業的使用に入り込んでくるかも知れない追加の変数 を排除する。

レセプターのようなアッセイ試薬は、シッフ塩基結合、Ｓ　ＩＡＢ結合その他の 方法を介してチンドリマーに結合させ、次いでガラス繊維フィルターのような固 相材料に提供することができる。好ましい一具体例においては、Ｂａｘｔｅｒ　 Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ　Ｉｎｃ、によって販売されているものとしての「タブ 」が、Ｗｈａｔｍａｎ　Ｉｎｃ、によって販売されているＧＦ／Ｆガラス濾紙か ら組み上げられ、以下に述べるようにプラスチックのタブ部品にはめ込まれる。

一般に、チンドリマーー試薬複合体は、適当な緩衝溶液に入れてそのようなタブ の中心領域に適用される。一般に、そのような緩衝剤は、界面活性剤、被分析物 不含血清アルブミン及びアジ化ナトリウムのような保存剤を含有する。チンドリ マー複合体の溶液の部分量が、ブランクタブの中心上にスポットされ、ついでオ ーブンで加熱乾燥される。冷却後、該タブは冷蔵下に保存することができる。

代わりの具体例においては、チンドリマーそれ自体が、固相へと形成される。チ ンドリマーは、適当な溶媒に溶解して適当な固体表面に噴霧又は他の方法で適用 することができる。溶媒の蒸発により、該チンドリマーは、薄いフィルム又はフ ィラメントへと凝結され、そしてそのように単離することができる。代わりとし ては、凝結されたチンドリマーのそのような薄いフィルムは、特異的結合アッセ イにおいて使用されるチューブ又は他の容器の内表面を被覆するのに使用するこ とができる。抗体のようなアッセイ試薬は、そのようなチンドリマー凝結物に、 該噴霧された材料の適用及び続く乾燥期間の前又は後の何れかに、共有結合によ り連結することができる本発明のチンドリマーー試薬複合体／固相調製物は、種 々の特異的結合アッセイ方式に適用できる。例えば、種々の直接結合アッセイか これらの試薬と共に採用てきる。そのようなアッセイにおいては、抗体又は結合 性タンパク質のようなレセプターは、チンドリマーに共有結合により連結されて 、該固相上に固定化される。該固定化されたチンドリマーー試薬複合体は、関係 被分析物を含有するサンプルと接触させられる。該固定化されたレセプターによ る該被分析物の結合に続き、該固相は洗浄され次いで指示薬と接触させられる。

本発明の文脈において術語「指示薬Ｊは、標識された接合体を意味する。該接合 体は、アッセイ方式に依存して、抗体、抗体フラグメント、結合性タンパク質又 は被分析物を含んでなり、該標識は、直接的に又は間接的に該接合体と関連する 、蛍光的、酵素的、比色法的、放射線測定的、又はその他の標識分子である。該 標識は、基質と接触したとき蛍光を発する酵素的物質よりなることができる。例 えばＴｉｊｓｓｅｎ、　Ｐ、、　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ 　ｉｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇ ｙ、　Ｐｒａｃｔｉｃｅ　ａｎｄ　Ｔｈｅｏｒｙ　ｏｆ　Ｅｎｚｙｍｅ　Ｉｍｍ ｕｎｏａｓｓａｙ、　ｐｐ、　１７３−２１９（第１０章）及びｐｐ、３２９− ３８１１　（第１４章）、　ＥｌｓｅｖｉｅｒＳｃｉｅｎｃｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈ ｅｒｓ、　Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、　Ｔｈｅ　Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ、　１９８ ５＋：：開示されているように、指示薬が固相支持体上に存在する程度は、未知 の被分析物の量と相関させることができる。

本発明の組成物はまた、競合的アッセイ方式においても使用できる。そのような 方式においては、選ばれた被分析物に対する特異性を有する固定化レセプター又 は他の分子が、そのような被分析物を含有していそうなサンプル及び特異的な競 合試薬と接触させられる。該特異的競合試薬は、該被分析物の、標識された類縁 体であることかできる。この具体例においては、該標識された類縁体は、該固相 に固定化されたレセプターへの結合をめて該被分析物と競合する。代わりの一具 体例においては、被分析物が、固相に結合され、そしてサンプル及び特異的競合 試薬、例えば該被分析物に対する標識されたレセプターと接触させられる。この 方式においては、サンプルの被分析物は、可溶性の標識されたレセプターとの結 合をめて固相の被分析物と競合する。両具体例において、洗浄後に該固相に結合 している標識量が、該サンプル中の被分析物のレベルの指標を提供する。すなわ ち、該相に結合した標識量は、該サンプル中の被分析物の量に反比例する。

チンドリマーー試薬接合体及び種々の他の結合性アッセイ試薬を固相に適用し、 洗浄し、該固相に結合した指示薬の量を読み取るのに、種々の機器が利用できる 。好ましい一具体例においては、固相は上述のようなガラス繊維フィルタータブ を含んでなり、そして該機器は、Ｂａｘｔｅｒ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ　Ｉｎ ｃ、より入手できる５ｔｒａｔｕｓ■Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　Ｓｙｓｔｅｍを 含んでなる。この機器は、Ｇｉｅｇｅｌ　ａｔ　ａｌ、、　Ｃ１１ｎ、　Ｃｈｅ ｍ、　２８：１８９１１−９８（１９８２）　ｌ：：記述されているバッチ処理 式卓上機器である。該機器は、放射状分配イムノアッセイ方式における処理タブ に適合させてあり、該方式もまた、Ｇｉｅｇｅｌ　ａｔ　ａｌ、に記述されてい る。該機器は、サンプル、接合体及び基質洗浄液のための液体分配装置を含む。

マイクロプロセッサ−制御のステッパモーターが、試薬の必要部分を吸引し分配 する。該分配装置の全てのタイミング及び操作の面は、該分析装置内のプログラ ムルーチンによって予め定められている。該機器はまた、タブ輸送システム、温 度モニタリングを伴った加熱板、サンプル及び試薬液ポンプ、読み取りステーシ ョン、データ処理、及びタブ廃棄のための手段をも含む。

品質管理のために、該機器のマイクロプロセッサ−の制御プログラムは、参照電 圧、温度、及び分配位置のような重要な操作条件を定期的に検証し、範囲外の値 についてフラッグを立てる。

本発明は、以下の説明的具体例を参照することにより一層理解されようが、該具 体例は純粋に典型例であり、請求の範囲に記述されたものとしての本発明の真の 範囲を限定するものと解してはならない。

実施例１ シッフ塩基結合を介したＩｇＧ−チンドリマーの調製ｐＨＬｓの酢酸緩衝液（０ ，＋　Ｍ　Ｎａ０Ａｃ１０．＋　Ｍ　ＮａＣ１）中の４〜５ｍｇ１ｇＧ／ｍｊｌ ’よりなるＩｇＧ濃縮溶液を調製し、氷上で冷却する。冷却サレタ、ｐＨ’１． ５（７）酢酸緩衝液中の０．１　Ｍ　Ｎａｌ０ｍの２７３体積を、該１ｇＧ溶液 に加え、この合わせられたＩｇＧ／Ｎａ１０ｍ溶液を暗所で２時間２°〜８°Ｃ にてインキュベートする。エチレングリコールを元のＩｇＧ濃縮溶液１ｍ！！当 たり１０μ！加え、インキュベーションを更に１７２時間２°〜８°Ｃにて継続 する。得られたＩｇ含む両分（それは結合したＩｇＧ−チンドリマー調製物（Ｉ ｇＧ−Ｇ　−７ルデヒド誘導体（Ｉ　ｇＧ−ＣＨＯ）（７）溶液を、ｐＨ４，５ の酢酸緩衝液で平衡化した適当なサイズの５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−２５カラムに 通すことにより脱塩した。タンパク質画分を集めてプールし、吸光係数Ｌ’１８ ｍｊ７−ｍｇ−’−ｃｍ−’を用いて２８０ｎｍにて分光光度法によりＩｇＧ− ＣＨＯの濃度を測定した。過ヨウ素酸酸化１ｇＧのアルデヒド含量は、較正標準 としてホルムアルデヒドの適当な濃度を用い、アルデヒド変性試薬Ｐｕｒｐａｌ ｄ　（Ａｌｄｒｉｃｈ、　Ｃａｔ、、　Ｎｏ、　１６−２８９−２）を用いて定 量できる。

水性溶液中のチンドリマ−（粒子サイズ５４人）　（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ 、　Ｃａｔ、　Ｎｏ、　２０５２）が、脱塩したＩ　ｇＧ−ＣＨＯ溶液に、チン ドリマー：　ＩｇＧ−ＣＨＯのモル比３：ｌで加えられる。合わせられたチンド リマー／ＩｇＧ−ＣＨＯは、０．１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ９、Ｉ４中へ 緩衝液交換し、そして、ＩｇＧの最終濃度が約１．０ｍｇＩｇＧ／ｍｌとなるよ うに該溶液の体積が調節される。該溶液は、次いて、２°〜８°Ｃにて１６〜２ ４時間インキュベートされる。次いで、新たに調製したＮａＢＨ−溶液（４ｍｇ ／ｍ１水）の、該チンドリマー／ＩｇＧ−ＣＨＯ反応混合物の体積の１７２０に 等しい量を徐々に加えて２°〜８°Ｃにて更に２時間インキュベートする。得ら れる溶液は、必要ならば、０．２２μｍフィルターを通して濾過することにより 澄明化される。適当なサイズのポリアクリルアミド−アガロースゲルマトリック ス（ＡｃＡ−４１Ｊ　Ｕｌｔｒｏｇｅｌ、　ＩＢＦ、　Ｃａｔ、　Ｎｏ、　２３ ０１６１）が準備され、そしてリン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）１０．１％Ｎ　ａ 　Ｎ　ｙ中に平衡化される。最終のチンドリマー／ＩｇＧ−ＣＨＯ反応混合物は 、ＡｃＡ−１１１１の床体槽の３％未満の体積にまで濃縮され、次いでカラム上 に載せて、適当な流速で溶出させる。第１のタンパク質ピークをｍｇＩｇＧ／ｍ Ｉ２の溶液が調製される。ジチオエリスリトール（ＤＤＥＮＤ）を含んでなる） をプールする。Ｉ　ｇＧ−ＤＥＮＤ調製物中のＩｇＧの濃度は、２８０における 吸光係数１．４８ｍ１−ｍｇ″′−Ｃｍ”を用いて分光光度法により測定される 。

実施例２ ＳＩＡＢ結合を介した１９Ｇ−チンドリマーの調製１１５液量のリン酸ナトリウ ム緩衝液（０，５Ｍ　ＮａＨｚＰＯ＊、ｐＨ７，１）を５８人のプントリア　− （Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃａｓ、　Ｃａｔ、　Ｎｏ、　２１１５２）の業者供給の 水性溶液に加える。得られる水性溶液を、ＩＮ塩酸又はＩＮ水酸化ナトリウムで ｐ）（７，６に調整する。水中の１５ｍｇ／ｍＡ’スルホー３ＴＡＢの適当量が 、スルホ−Ｓ　ＪＡＢ　：チンドリマーのモル比が２０＝１に等しくなるように 、該チンドリマー溶液に加えられ、次いて３０°Ｃにて１時間インキュベートさ れる。得られる５ＩＡＢ−チントリマー誘導体（Ｓ　ＩＡＢ−ＤＥＮＤ）の溶液 を、Ｏ，＋　Ｍ　ＮａＨｚｐｏ＊　（１）　８７．６　）で予め平衡化した５ｅ ｐｈａｄｅｘ　Ｇ−２５の適当なサイズのカラム上に負荷する。約０．５ｒｙｌ ／分の流速での溶出に続いて、該Ｓ　ＴＡＢ−ＤＥＮＤ画分がプールされ、そし てＳ　ＩＡＢ−ＤＥＮＤの濃度が、Ｗｅｉｇｅｌｅ　ａｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ａ ｍ、　Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、　９４：　５９２７　（１９７２）に及びＵｄａｎ ｆｒｉｅｎｄ　ｅｔ　ａｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ　＋７８：　８７１　（１９７ ２）ｆ、１ｍ記述されているようにして、フルオレスカミン（第１級アミンのア ッセイのために用いられる蛍光原試薬）によって測定される。適当な濃度の、誘 導体化されていない５１Ｊ人のチントリマーが、較正標準として使用される。

スルフヒドリル−ＩｇＧ誘導体（ＩｇＧ−３Ｈ）の調製のためには、還元性緩衝 液（０，１ｐＪ、　ＮａＨｚＰＯ＊、　５　ｍＭ　ＥＤＴＡ、　ｐＨ６，０）中 の５ＴＥ）か還元性緩衝液に、ｌ＋、４ｍｇ／ｍｆの濃度に溶解される。このＤ ＴＥ溶液を、該１ｇＧの５ｍｇ／ｍｆ溶液の液量の１／９ニ等しい液量酸ＩｇＧ 溶液に加え、次いて３７°Ｃにて１時間インキュベートする。得られるＩ　ｇＧ −３Ｈ溶液を次いて、適当なサイズの５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−２５カラムを通過 させることにより脱塩し、そして該１ｇＧ−３Ｈ濃度及びＳＨ含量を、標準的な 方法により測定する。

最後に、ＩｇＧ−ＤＥＮＤの調製のために、Ｓ　ＩＡＢ−ＤＥＮＤ溶液がＩ　ｇ Ｇ−３Ｈ溶液と、Ｓ　ＴＡＢ−ＤＥＮＤ　：　ＩｇＧ−ＳＨ比３．１にて合わせ られ、次いでリン酸ナトリウム緩衝液（０，Ｉ　Ｍ　ＮａＨ２ＰＯ，、ｐＨ７， ６）へと緩衝液交換される。該溶液は、最終ＩｇＧ濃度が約５ｍｇ／ｍｆとなる よう液量調整され、次いで２°〜８°Ｃにて１６〜２４時間インキュベートされ る。該反応は、Ｎ、　Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中のｌｏｍｇ／ｍｊ ’のＮ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）の１７５０体積の停止溶液の添加によって 停止され、室温（２３°〜２５°Ｃ）にて２時間、更にインキュベートされる。

停止された反応混合物は、必要ならば、０．２２μｍフィルターを通すことによ り澄明化させ、次いで上の実施例１に記述したようにＡｃＡ−４４Ｕｌｔｒｏｇ ｅ１カラムを通過させることにより精製される。

実施例３ 固相支持体（タブ）の調製 この実験において使用される固相支持体は、双方ともにＢａＸｔｅｒ　Ｄｉａｇ ｎｏｓｔｉｃｓ　Ｉｎｃ、によって販売されているものである５ｔｒａｔｕｓ■ 分析装置又は５ｔｒａｔｕＳ■■分析装置と共に使用されるものとしての「タブ 」を含んでなる。これらのタブは、Ｇｉａｇａｌ　ａｔ　ａｌ、、　Ｒａｄｉａ ｌ　Ｐａｒｔｉｔｉｏｎ　ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、　Ｃ１１ｎ、　Ｃｈｅｍ、 　２８：　１８９１Ｊ−９８（＋９８２）　ｉ：記述されているように、ＧＦ／ Ｆガラス濾紙（Ｗｈａｔｍａｎ　Ｉｎｃ、）　（Ｄ　１インチ（２，５ｃｍ）幅 のロール及び、スナップ嵌合式プラスチックタブ部品から組み立てられる。適当 な濃度の、チンドリマー溶液、抗体若しくは他のタンパク質溶液又は対照溶液が 、スポット用緩衝液中に形成される。該スポット用緩衝組成物は、特定の実験的 又は製造のパラメーターに適するよう変えることができる。一般には、該スポッ ト用緩衝液は、例えば、２０ｍＭ〜２００ｍＭのトリス（１）Ｈ７，Ｏ〜９．０ 　）　、０．１　％〜１．０９６（７）範囲の濃度ノＺｏｎｙｌ　０ＦＳＮ　（ Ｅ、１．　ＤｕＰｏｎｔ　ＤｅＮｅｍｏｕｒｓ　＆　Ｃｏ、、　Ｃａｔ、　Ｎｏ 、　ＣＨ７＋５２Ｓ）のような非イオン性界面活性剤、０．５％〜４．０％の牛 血清アルブミン（ＢＳＡ）及び０．１％のアジ化ナトリウムを含むが、これに限 定されない。好ましくは、該スポット用緩衝液は、３０〜１００ｍＭのトリス（ ｐ　Ｈ７，０〜８．５　）、０．１　％〜０．５％ノＺｏｎｙｌ■ＦＳＮ　、　 １．０％〜３．０％（７）ＢＳＡ及び０゜１％のアジ化ナトリウムを含んでなる 。最も好ましくは、該スポット用緩衝液は、５０ｍＭのトリス（ｐ　Ｈｓ、ｏ　 ）　、ｏ、＋　％のＺｏｎｙｌ　０ＦＳＮ　、２．０％のＢＳＡ及び０．１％の アジ化ナトリウムを含んでなる。

フッ素化された界面活性剤（例えば３　Ｍ　Ｃａｔ、Ｎｏ、　ＦＣ１７１及びＦ Ｃ＋７００）及び当業者に既知の他の適当な界面活性剤を、Ｚｏｎｙｌ■ＦＳＮ に冒き換えてもよい。

選ばれた溶液の７６μｌの部分を、ブランクタブの中心上にスポットし、次いて ８０°〜９０°Ｃにてオーブン乾燥する。冷却後、使用時まで該タブを２°Ｃ〜 ８°Ｃにて貯蔵することができる。タブ上への溶液のスポットは、ピペッティン グ器具を用いて手動て行ってもよく又は自動化された製造手順によって行っても よい。代わりとしては、該タブは、原液の選ばれた部分量をタブの中心に適用す るための機器パラメーターの適当なプログラミングの後に、Ｓｔ、ｒａｔｕｍ　 Ｏ■装置自身によってスポットされて処理されることができる。

実施例４ 予備的実験において、３つの異なったサイズ（２２人、５ｎ人及び９５人）のチ ンドリマーが、以下に記述するようにして試験された。５４人又は９５人の粒子 が固定化に用いられた場合には、性能にほんの僅かな差しかなかったが、２２人 粒子では、性能が比較的劣っていた。

出願人は、特定の理論又は機構に捕られれるつもりはないが、固定化された抗体 ／チンドリマー複合体のある最小のサイズが、濾紙の表面への最適な吸着のため には必要であるという可能性がある。固定化のために二次的な抗体（チンドリマ ーでなく）を用いた現行のタブ処方に関して、同様な、サイズに関連した現象が 観察されている。ある条件下においては許容できる結果を提供するが、比較的大 きい（９５人）チンドリマー粒子の使用は、通常、高分子量凝集体の形成を伴っ た。こうして、５４人のチンドリマーが、ここに報告した他の全ての実験におい て使用された。２２人のものを含む他の粒子サイズのチンドリマーは、緩衝液、 試薬濃度及び他のパラメーターがここに報告されている値から変動する実験条件 については、適当がも知れない。

更なる実験においては、モノクローナル抗体ＣＡ２−２ｆ　（ＣＡ２）が、５４ 人のチンドリマー粒子に、実施例１において上記したように結合された。ＣＡ２ は、Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　（ ＡＴＣＣ）に受託番号第１８３７号として寄託しである。この抗体及びＢａｘｔ ｅｒ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ　Ｉｎｃ、によって現在販売されている、ｈＴＳ Ｈアッセイにおいて用いられる第２のモノクローナル抗体（ＭＡＢ−２）は、ヒ ト甲状腺刺激ホルモン（ｈＴＳＨ）のβ鎖に対して向けられている。これらの抗 体は、類似のく同してはないにしても）エピトープに向けられていると信しられ ており、１０８乃至１ＱＩＩＩＭ−１の範囲に近似の親和性係数を有する。この ＣＡ２−チンドリマー複合体（ＣＡ２−ＤＥＮＤ）は、実施例３において上記し たようにしてタブ上ヘスボットされ（スポット用緩衝液：５０ｍＭ）リス、ｐＨ ｓ、ｏ。

０．１　％Ｚｏｎｙｌ■ＦＳＮ、　２．０％ＢＳＡ及び０．１％アジ化ナトリウ ム）、そしてｈＴＳＨについての特異的結合アッセイ方式において使用さねた。

タブ上にスポットされたＣＡ２−ＤＥＮＤの量は、選ばれた実験条件に依存して 、３．７５μｇ／タブ乃至３７．５μｇ／タブの範囲内にあった。

直接的特異的結合アッセイが行われ、それにおいては、Ｇｉｅｇｅｌ　ｅｔ　ａ ｌ、、　Ｃ１１ｎ、　Ｃｈｅｍ　２８：　１８９４−９８　（１９８２）ｌ：Ｚ 記述されているようにして、較正された量のｈＴＳＨがＣＡ２−ＤＥＮＤタブ上 にスポットされ、チンドリマーと複合体形成され、洗浄され、そして結合したｈ ＴＳＨＯ量が、５ｔｒａ、ｔｕｓ■機器において前面蛍光光度法によって測定さ れた。これらの実験においては、検出装置は、子牛腸アルカリ性ホスファターゼ と接合させた抗ｈＴＳＨモノクローナル二重抗体（カリフォルニア州、Ｆｏｓｔ ｅｒ　Ｃ１ｔｙのＭｅｄｉｘから、及びペンシルバニア州Ａｌｌｅｎｔｏｗｎの ５ｅｒｏｎｏ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓより商業的に入手できる）と、安定化剤 と、赤色色素と、界面活性剤とそして０．１％のアジ化ナトリウムとを含んてな るトリス緩衝溶液として適用された酵素標識抗ｈＴＳＨ抗体接合体を含んでなる 。Ｇｉｅｇｅｌ　ａｔ　ａｌ、に記述された放射状分配アッセイ方式が、以下の 実験の全てにおいて用いられた。較正標準Ａ、Ｂ、　Ｃ，Ｄ、Ｅ及びＦは、ＢＳ Ａ、安定化剤及び保存剤として０．１　％アジ化ナトリウムを含むトリス緩衝液 （ｐＨ７，５）中に調製された。較正標準溶液Ａ、Ｂ、　Ｃ，Ｄ、Ｅ及びＦは、 ｍ１当たりそれぞれ０．０．０２５．０．７５．３．１２及び５０μｌＵのｈＴ ＳＨを含有した。

アッセイは、選ばれた較正標準（又はサンプル）の６０μ！を吸引しタブ上に放 出することによって５ｔｒａｔｕｓ■■機器によって行われる。抗ｈＴＳＨアル カリ性ホスファターゼ接合体（０，７５μｇ　／　ｍβ）の２０μｌが、次いて 各タブに放出される。５ｔｒａｔｕｓ■機器の基質プローブは、次いて７０μｌ の基質洗浄液（１，０ｍＭの４−メチルウンベリフェリルホスフェート、アルカ リ性ホスファターゼ阻害剤、安定化剤、青色色素、界面活性剤及び０．１％のア ジ化ナトリウムを含有するｐＨ９，Ｏトリス緩衝液）を吸引し、２０μ！乃至５ ０μｌを逐次的にタブに放出する。第２の基質洗浄液が放出されるや否や、当初 の蛍光率が読み取られそして機器の記憶装置に記録される。

メチルウンベリフェリルホスフェート基質に対するホスファターゼの作用により 発生した蛍光の量は、５ｔｒａｔｕｓ■機器により検出され、分当たりのボルト 数で表された率へと変換され、それは表及び図ニｍ　Ｖ　／分（ｒｓｔｒａｔｕ ｓ率」）として提示されている。該５ｔｒａｔｕＳ率は、蛍光の強度の一尺度で あり、それは、今度は、該タブの反応部分に結合されたｈＴＳＨの量の一尺度で ある。

５ｔｒａｔｓｕ■機器の作動の間、個々の較正標準の蛍光率が測定され、そして 値がマイクロプロセッサ−の記憶装置の記憶位置に導かれる。全ての較正標準が 測定されてしまった後、測定されたデータ諸点に、次の方程式に示された形に数 学的関係を適合させるマルチパス線形回帰ルーチンを用いて、プログラムが“Ｒ ｏｄｂａｒｄ”パラメーターＡ、Ｂ、Ｃ及びＤを計算する（Ｄａｖｉｓ、　Ｓ、 Ｅ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　１：　１５−２５　（ １９８０））。

Ｒ＝　（（Ａ−Ｄ）／　［Ｉ＋Ｂ　（Ｘ／Ｃ）］　＋Ｄ＋（式中、Ｒは蛍光率で あり、Ｘは対応する濃度である。）該方程式は、種々のイムノアッセイ系におい て卓越した適合を与えることが報告されている一般化されたシグモイド曲線であ る。記憶装置に記憶されている得られたＡ、Ｂ、　Ｃ及びＤパラメーターに基づ いて、該機器は、アッセイされたサンプルについての濃度の読みを与える。

５つの複製についての作動の結果が、表１に提示され、図３にグラフの形で描か れている。

表１ ＩｇＧ−チンドリマーを用いたｈＴＳＨアッセイについての較正データ較正標準 　平均の率　標準偏差　Ｃ，Ｖ、　（％）Ａ　４３．５　＋０．０７　２３．２ Ｂ　１４２．４　５．９７　４．＋９ Ｃ３９２，＋８　９．８２　２．５１ Ｄ　１３６７．９　５２．４９　３．８４Ｅ　１１５８０．６　９９．２６　２ ．　Ｉ７Ｆ　＋１７７３．０　３１１０．５５　２．８９これらの実験のために は、ＣＡ２−ＤＥＮＤタブは、５ｔｒａｓｕｓ■■機器中て調製した。すなわち 、ブランクタブが、該機器内に入れられ、７６μｌのＣＡ２−ＤＥＮＤ溶液が約 ３５μｌ／秒の流速でサンプルプローブから各タブに適用されるように選ばれた 機器パラメーターを用いて、ＣＡ２−ＤＥＮＤ溶液でスポットされた。

別の実験において、ＣＡ２−ＤＥＮＤタブの性能が、Ｂａｘｔｅｒ　Ｄｉａｇｎ ｏｓｔｉｃｓ　Ｉｎｃ、によって現在販売されており、そしてＧｉｅｇｅｌ　ｅ ｔ　ａｌ、への米国特許第’１，５１７，２８８号（ｒ’２８８特許」）に一般 的に記述されている方法を用いて調製されたタブの性能と比較された。すなわち 、ＣＡ２−ＤＥＮＤ又はＭＡＢ−２は、免疫複合体として免疫学的に固定化され た。ＣＡ２及びＭＡＢ−２の双方とも、マウス抗ｈＴＳＨモノクローナル抗体で あり、各々は、マウスＩｇＧに対するヤギ抗血清を含んでなる二次抗体に複合化 された。得られた免疫学的複合体は、＋２８８特許に記述されているように、ブ ランクタブに吸収させた。この仕方で調製されたタブが、上記のように実施され たアッセイにおいて、ＣＡ２−ＤＥＮＤタブと比較された。これらの実験におい て、全てのタブ（ＣＡ２−ＤＥＮＤ含む）は、５ｔｒａｔｕｓ■■機器からオフ −ラインの、自動化された製造システム中において調製された。図４においては 、２．８μｇタンパク質／タブの濃度にＣＡ２−ＤＥＮＤを含有するタブが、１ ．８７μｇタンパク質／タブの濃度にＭＡＢ−２−ヤギ抗ＩｇＧを含有する免疫 学的に固定化されたタブと比較されている。図５においては、１１．３μｇタン パク質／タブの濃度にＣＡ２−ＤＥＮＤを含有するタブが、３．８μｇタンパク 質／タブの濃度にＣＡ２−ヤギ抗ＩｇＧを含有する免疫学的に固定化されたタブ と比較されている。

これらの結果は、免疫学的な固定化によって調製されたタブで得られるのと同等 な較正曲線をＣＡ２−ＤＥＮＤタブが与えることができる、ということを実証し ている。図６は、図５に示されたデータの低い末端の拡大である。ＣＡ２−ＤＥ ＮＤタブについてのＹ切片（較正標準Ａ、ゼロ単位のｈＴＳＨ）である５５ｍＶ ／分は、免疫学的な固定化によって調製されたＣＡ２タブについてのＹ切片であ るｎ６ｍＶ／分に比して、有意に低く、チンドリマーに基づくタブについての非 常に低い非特異的結合を反映している。これは、アッセイ較正範囲の低い端にお ける、一層高い感度による、低い値の較正標準の一層正確な読みを許容する。

実施例５ フルチゾルアッセイ 競合的イムノアッセイ方式、薬物アッセイ及びポリクローナル抗体の使用への、 本発明の適用を実証するために、コルチゾルについてのイムノアッセイが選ばれ た。

フルチゾルに対する家兎抗血清（マサチューセッツ州のＶｅｎｔｒ’ｅＸより入 手。Ｃａｔ、　Ｎｏ、　１１（１１７１００）を、室温にて１００％飽和（ＮＨ ｔ）ｚＳＯ−とｌ・１　（ｖ／ｖ）で混合し、そして２°〜８℃における高速遠 心によって沈殿を回収した。ベレットをＢｉｏ−Ｒａｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａ結 合性緩衝液（１）　Ｈ９，Ｏ）（Ｃａｔ、　Ｎｏ、　１５３０−６１６１）中に 溶解し、そしてＢｉｏ−Ｒａｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａ親和性ゲルカラム（Ｃａｔ 、　Ｎｏ、　１５３−６１５４　）　ｌニー適用した。該カラムを、貫流のＵＶ 吸収がベースラインに落ちるまで、該結合性緩衝液で洗浄した。これに続き、結 合したＩｇＧをＢｉｏ−Ｒａｄ溶出緩衝液（ｐ　Ｈ３，０）（Ｃａｔ、　Ｎｏ、 　１５３−６１６２）で溶出させ、次いて、直ちにＰＢＳｌｏ、１％ＮａＮｚへ と緩衝液交換した。

精製された抗コルチゾルボリクローナル抗体を、実施例１に記載したようにして ５４人デチンリマー（こ結合させた。この５４人デチンリマー／抗コルチゾルポ リクローナル抗体複合体（抗コルチゾルＤＥＮＤ）は、今度は、実施例３に記載 したようにしてスポット用緩衝液に入れてブランクタブ上ヘスボットした。一般 的に、該タブは、スポット用緩衝液（５０ｍＭ）リス、ｐ　Ｉ（８，０、Ｏ，＋ ％Ｚｏｎｙｌ■ＦＳＮ、２．０％ＢＳＡ及び０．１％アジ化ナトリウム）中の７ ６μｌの５０μｇ／ｍ１の抗コルチゾル−ＤＥＮＤを、ブランクタブにスポット する（すなわち、３．７５μｇ／タブ）して乾燥させることによって調製された 。競合的コルチゾルアッセイにおいて使用された較正標準Ａ。

Ｂ、Ｃ，Ｄ、Ｅ及びＦは、保存剤として０．１％のアジ化ナトリウムを含有する 処理したヒト血清中に作り、それぞれ（ｌ当たりｏ１２゜５．５．０　、＋０． ０．２５及び５０μｇのコルチゾルを含有した。

このコルチゾルアッセイにおいては、選ばれた較正標準中のコルチゾルは、タブ 上に固定化された抗コルチゾル−ＤＥＮＤとの結合をめて、標識されたコルチゾ ル類縁体と競合する。このアッセイは、２０μβの較正標準（又はサンプル）を サンプルカップ中において類縁体溶液（ｐ　Ｈ８，０のトリス緩衝液、安定化剤 、赤色色素、界面活性剤及び０．１％のＮａＮ、中の、０．５μｇ／ｍｌコルチ ゾルー子牛腸アルカリ性ホスファターゼ接合体）の４０μ！及びコルチゾルアッ セイ緩衝液（３０ｍＭのリン酸ナトリウム、８−アニリノ−１−ナフタリンスル ホンサン及び０．１％のアジ化ナトリウム、ｐＨ５，５）の２２０μｌと、５ｔ ｒａｔｕｓ　＠　Ａｕｔｏｍａｔｅｄ　Ｓａｍｐｌｅ　Ｈａｎｄｉｅｒ　（３Ａ Ｓ　）Ｉ　）を用いて混合することによって行われる。該カップを含んだトレー が、次いて５ｔｒａｔｕｓ　０機器へ移される。各カップ中の７０μｌの溶液が 吸引され、抗コルチゾル−ＤＥＮＤを含有するタブへ放出される。５ｔｒａｔｕ ｓ■機器基質プローブは、次いで７０μｌの基質洗浄液（１゜ＯｍＭの４−メチ ルウンベリフェリルホスフェート、アルカリ性ホスファターゼ阻害剤、安定化剤 、青色色素、界面活性剤及び０．１％のアジ化ナトリウムを含有する、ｐＨ９， ０のトリス緩衝液）を吸引し、そして２０μｌを及び５０μ！をタブに逐次放出 する。第２の基質洗浄液が放出されるや否や、当初蛍光率が読み取られ、機器の 記憶装置に記録される。較正曲線が作られＲｏｄｂａｒｄのパラメーターが得ら れた後、各サンプルの濃度がプリントアウトされる。

図７においては、抗コルチゾルーＤＥＮＤタブを用いた競合的アッセイの作動の 結果が、免疫学的固定化によって調製された抗コルチゾルについての類似のアッ セイの結果と比較されている。免疫学的固定化によって調製されたタブ（図７に おける「現行タブ」）は、家兎１ｇＧに対するヤギ抗血清と複合体形成させた家 兎抗コルチゾル血清、界面活性剤、安定化剤、青色／緑色色素及び０．１％のア ジ化ナトリウムを含有する溶液でブランクタブをスポットすることによって製造 された。図７においては、抗コルチゾルーＤＥＮＤを３．７５μｇタンパク質／ タブの濃度に含有するタブが、抗コルチゾルボリクローナル抗体を８５８ｎｇタ ンパク質／タブの濃度に含む免疫学的に固定化されたタブと比較されている。較 正曲線の形は、これら２つのタイプのタブにつき類似である。

実施例６ 葉酸アッセイ 次のアッセイは、ポリペプチド以外の分子に結合させたチンドリマー、すなわち 葉酸のような小さな分子に結合させたチンドリマーの有用性を実証している。

葉酸に結合させたチンドリマ−（葉酸−ＤＥＮＤ）の製造のために、業者によっ て供給された状態の１．５ｍＩ！の５４人デチンリマー（粒子数的ＩＪ、Ｏｘｌ Ｏ”個／ｍＡ’）が、０．３ｒｒｌの０．５Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７，１） に添加される。該溶液のｐＨを、ＩＮ塩酸又はＩＮ水酸化ナトリウムを用いて約 ７．６に調節する。次いで、１．２ｍｇのＮ−ヒドロキシスクシンイミド活性化 葉酸を、０．１２ｍ１のジメチルスルホキシドに溶解し、該ｐ）（７，６のチン ドリマー溶液に加える。合わせられた溶液は、活性化葉酸：チンドリマーの２０ ＝１というモル比を示す。該反応混合物は、室温にて２時間インキュベートされ る。該反応は、０．１４ｍ１の１Ｍ塩酸エタノールアミンを加えることにより停 止される。この反応混合物を、室温にて更に１７２時間インキュベートし、次い で、ＰＢＳｌｏ、１％Ｎ　ａ　Ｎ３　（ｐ　Ｎ７．４　）で平衡化した５ｅｐｈ ａｄｅｘ　Ｇ−２５カラムを通すことにより脱塩する。葉酸の分子濃度は、３５ ０ｎｍにおけるモル吸光係数７４００ｃ　ｍ−’Ｍ−’を用いて評価される。

酵素標識された葉酸結合性タンパク質（ＦＢＰ−ＡＬＰ）の製造のためには、子 牛腸アルカリ性ホスファターゼ（ＡＬＰ）が、０．１Ｍリン酸ナトリウム、Ｉｍ ＭのＭｇ”　（ｐＨ７，６）中に調製される。該ＡＬＰ溶液の液量は、最終濃度 ２．６ｍｇＡＬＰ／ｍｌになるよう調節される。該ＡＬＰ溶液はスルホ−３ＴＡ Ｂの２ｍｇ／ｍｊ７溶液と、スルホ−３ＩＡＢ：ＡＬＰのモル比２０：１にて合 わせられる。該反応混合物は３０°Ｃにて１時間インキュベートされ、次いで、 ０゜１Ｍリン酸ナトリウム、１ｍＭのＭｇ”　（ｐＨ７，６）で平衡化した５ｅ ｐｈａｄｅｘ　Ｇ−２５カラムを通過させることによって脱塩される。タンパク 質画分をプールし、Ｓ　ＴＡＢ標識ＡＬＰ　（ＡＬＰ−３ＩＡＢ）の濃度が、Ｂ ＣＡタンパク質アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ、　Ｃａｔ、　Ｎｏ、　２３２２５０） によって測定される。ＡＬＰ分子当たりの５ＩＡＢ基の数は、当業者に知られた 標準的方法で測定できる。

２．１３ｍ＃の０．１２Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７，５）中のＦＢＰの５ｍｇ に、＋７４ｍｇのＳ−アセチルメルカプトコハク酸無水物含有する８５μ！のジ メチルホルムアミドを加える。該溶液を３０°Ｃにて１時間インキュベートし、 続いて０．１　Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７，６）中の１Ｍヒドロキシルアミン ２２μｌを添加し、３０°Ｃにて更に１７２時間インキュベートする。該溶液を 、次いで、０．１Ｍリン酸ナトリウム、５ｍＭのＥＤＴＡ　（ｐＨ６，０）で平 衡化した５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−２５カラムを通過させることにより脱塩する。

タンパク質画分をプールし、ＦＢＰスルフヒドリル誘導体（ＦＢＰ−ＳＨ）濃度 を、２８０ｎｍにおける吸光係数約３．５７ｍ　ｌ・ｍ　ｇ−１・ｃｍ−’を用 いて測定する。

ＦＢＰ分子当たりのスルフヒドリル基の数は、当業者に知られた標準的方法で測 定できる。

このＡＬＰ−３ＩＡＢ　（分子量＋　ＩＪＯＯＯＯダルトン）及びＦＢＰ−３Ｈ （分子ｉ　３００００ダルトン）溶液は、それぞれモル比ｌ：６にて合わされ、 該合わされた溶液の液量が、総タンパク質濃度が４〜５ｍｇ　／　ｍ　ｌになる よう調節される。この合わされた溶液は、０．１Ｍリン酸ナトリウム、１ｍＭの Ｍｇ”　（ｐ　Ｎ７．６　）中へ緩衝液交換され、次いて２°〜８°Ｃにて２１ １時間インキュベートされる。該反応は、該反応液量の１７５０に等しいジメチ ルホルムアミド中のｌｏｍｇ／ｍ１２のＮ−エチルマレイミドの添加によって停 止され、室温にて更に２時間インキュベートされる。得られた接合体は、１０ｍ Ｍのトリス、ＩｍＭのＭｇ”、０．１　ｍＭのＺ　ｎ　”、及び０．１　％のア ジ化ナトリウム（ｐＨ７，０）で平衡化したＡｃＡ−３５Ｌｌｌｔｒｏｇａｌカ ラムを通過させることにより精製される。プールされた画分中におけるＦＢＰ− ＡＬＰ接合体の濃度はＰｉｅｒｃｅ　ＢＣＡタンパク質アッセイで測定できる。

該葉酸アッセイは５ｔｒａｔｕｓ■機器及びコルチゾル競合アッセイについて上 に報告されているものと類似の条件を用いて、競合方式にて実施された。該葉酸 アッセイにおいては、選ばれた較正標準（又はサンプル）中の葉酸は、ＦＢＰ− ＡＬＰ接合体への結合をめて葉酸−ＤＥＮＤ粒子上の葉酸部分と競合する。すな わち、較正標準又はサンプルにおける漸増的に高めた葉酸濃度は、対応して低い レベルのＦＢＰ−ＡＬＰＬか固相（タブ）上の葉酸−ＤＥＮＤに結合させない。

血清中の葉酸は、特異的結合性アッセイ試薬に基づく葉酸測定を妨害する葉酸結 合性タンパク質と関連して存在している。

他の血清タンパク質もまた、葉酸及び他のアッセイ試薬との特異的又は非特異的 相互作用を通じて妨害し得る。そのようなものとして、測定されるべき葉酸は、 葉酸結合性タンパク質からそして他の血清タンパク質との妨害的関連から自由に されなければならない。この目的のため、２５％エタノール中ＩＮ水酸化ナトリ ウムを含有する葉酸抽出剤、及び、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）　、エチレン ジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）　、塩化ナトリウム及びリン酸ナトリウム（ｐＨ６ ，３）含有する葉酸還元剤が、アッセイに含まれる。該葉酸抽出剤及び還元剤を アッセイの適当な時点で中和するために、ホウ酸塩を含有する葉酸中和剤（ｐＨ ７，２）及び０．５％葉酸不含ＢＳＡが添加される。

各アッセイタブは、上記実施例３に記述したように、５％葉酸不含ＢＳＡを含む スポット緩衝液中の７６μｌの６．５μｇ／ｍ１葉酸−ＤＥＮＤを、タブの中心 領域上にスポットすることによって構成された。競合的葉酸アッセイにおいて用 いられた較正標準Ａ、Ｂ、Ｃ，Ｄ、Ｅ及びＦは、処理済ヒト血清中それぞれ、０ ．０．９０．２．２０．５．４０．９．９０及び１９．６０　ｎ　ｇ葉酸／ｍｌ ！を含有した。アッセイは、サンプルカップ中の７０μｌの選ばれた較正標準を 、２０μ！の葉酸還元剤と混合し、続いて２０μｌの葉酸抽出剤を添加し、続い て葉酸中和剤中の０．６２５　μｇ　／　ｍ　ｌのＦＢＰ−ＡＬＰを＋６０μｆ 添加することによって、実施される。２０分間のインキュベーションの後、該混 合物が葉酸−ＤＥＮＤタブ上にスポットされ、コルチゾルアッセイ（実施例５） に上記した通りに基質洗浄液で洗浄され、そして蛍光率が読まれ記録される。こ れらの実験の結果は、図８に与えられている。

上記の詳細な記述は、本発明のよりよい理解のために提供されたに過ぎない。そ して、添付の請求の範囲の精神及び範囲から逸脱することなしに、何らかの修正 が当業者に明らかであろうから、そこから不必要な限定を読み取ってはならない 。

１９Ｇ　５４　Ａ”チンドリマ− ＋現行タブ　凸ＣＡ２−ＤＥＮＤ ［ｈＴＳＨ］　、μＩＵ／−ＦＩＧ、　４〔葉酸］、ｎｇ／ａＩ ＦＩＧ　８ フロントベージの続き （７２）発明者　シン、ブラタツブ アメリカ合衆国３３１９３フロリダ、マイアミ、サウスウエスト　６９　ストリ ート１５１１１（７２）発明者　ダイアモンド、ステイーブン、イーアメリカ合 衆国４６５３０インデイアナ、グレインジャー、クエイルパレードライブ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．特異的結合アッセイ複合体であって、（ａ）固相と、 （ｂ）十分に規定された幾何形状と官能性の付与された外表面とを有する水溶性 ポリマーと、そして （ｃ）該官能性の付与された外表面に共有結合により連結された特異的結合性ア ッセイ試薬と、 を含んでなる複合体。 ２．該固相が、複数の、網の目状に絡ませたガラス繊維を含んでなるガラス繊維 フィルターである、請求項１の特異的結合アッセイ複合体。 ３．該ガラス繊維の各々が、実質的に負に荷電した表面を有し且つ該デンドリマ ーの各々が実質的に正に荷電した表面を有するものである、請求項２の特異的結 合アッセイ複合体。 ４．該ポリマーが、開始剤コアと、少なくとも１の内層と、そして官能性の付与 された外表面とを含んでなるデンドリマーであって、該デンドリマーが該固相上 に操作可能に固定化されているものである、請求項１の特異的結合アッセイ複合 体。 ５．該デンドリマーが５４Åのデンドリマーでありそして該官能性の付与された 外表面が操作可能な数のアミノ基を含んでなるものである、請求項２の特異的結 合アッセイ複合体。 ６．該特異的結合性アッセイ試薬がポリペプチドである、請求項１の特異的結合 アッセイ複合体。 ７．該ポリペプチドが、抗体、抗体フラグメント、及び特異的結合性タンパク質 よりなる群より選ばれるものである、請求項６の特異的結合アッセイ複合体。 ８．該ポリペプチドが抗ｈＴＳＨ抗体、抗コルチゾル抗体及び葉酸結合性タンパ ク質よりなる群より選ばれるものである、請求項６の特異的結合アッセイ複合体 。 ９．該特異的結合性アッセイ試薬が按分析物である、請求項１の特異的結合アッ セイ複合体。 １０．該分析物が葉酸である、請求項９の特異的結合アッセイ複合体。 １１．特異的結合アッセイ複合体であって、（ａ）複数のデンドリマーより本質 的になる固相であって、該複数のデンドリマーが特異的結合アッセイ条件におい て実質的に不溶性の凝結物を形成しているものである固相と、そして（ｂ）該固 相に共有結合により連結された特異的結合性アッセイ試薬と、 を含んでなる複合体。 １２．特異的結合性アッセイ試薬を固相上に操作可能に固定化するための方法で あって、 （ａ）該試薬を、共有結合によってデンドリマーに連結し、そして （ｂ）該固相上への該デンドリマーの操作可能な固定化を実現する条件下に、該 デンドリマーを該固相と接触させる、ことを含んでなる方法。 １３．該デンドリマーへの該試薬の該共有結合による連結が、該デンドリマーを 該固相に接触させる前に実施されるものである、請求項１２の方法。 １４．該試薬が、抗体、抗体フラグメント、特異的結合性タンパク質及び按分析 物よりなる群より選ばれるものである、請求項１２の方法。 １５．該デンドリマーへの該試薬の該共有結合による連結が、シッフ塩基還元に よって行われるＣ−Ｎ結合によるものである、請求項１２の方法。 １６、該デンドリマーへの該試薬の該共有結合による連結が、ＳＩＡＢ−標識部 分をスルフヒドリル含有部分と合わせることによって、行われるＣ−Ｓ結合によ るものである、請求項１２の方法。 １７．該デンドリマーへの該試薬の該共有結合による連結が、臭化シアン活性化 デンドリマーと該試薬のアミノ基とを反応させることによって行われるＣ−Ｏ結 合によるものである、請求項１２の方法。 １８．サンプル中の按分析物の濃度又は存在を測定するために特異的結合アッセ イを行うための方法であって、（ａ）該按分析物に対する、又は該被分析物のレ セプターに対する特異性を有する特異的結合性アッセイ試薬をデンドリマーに共 有結合により連結してデンドリマー−試薬複合体を形成させ、（ｂ）該固相上へ の該複合体の操作可能な固定化を実行する条件下に、該複合体の有効量を固相に 加え、（ｃ）結合条件下に該サンプルを該固相に適用し、（ｄ）選ばれた量の指 示薬を結合条件下に該固相に適用し、（ｅ）該固相に結合した該指示薬の量を測 定し、そして（ｆ）該指示薬の量を該サンプル中の該按分析物の濃度又は存在と 相関づけること、 を含んでなる方法。 １９．該試薬が抗体、抗体フラグメント、特異的結合性タンパク質及び分析物よ りなる群より選ばれるものである、請求項１８の方法。 ２０．該サンプル及び該指示薬が該固相に同時に適用されるものである、請求項 １８の方法。 ２１．サンプル中の被分析物の濃度又は存在を測定するために特異的結合アッセ イを行うための方法であって、（ａ）該按分析物に対する、又は該被分析物のレ セプターに対する特異性を有する特異的結合性アッセイ試薬を、共有結合により デンドリマーに連結してデンドリマー−試薬複合体を形成し、（ｂ）該固相上へ の該複合体の操作可能な固定化を実行する条件下に該固相に該複合体の有効量を 添加し、（ｃ）結合条件下に該固相に該サンプルを適用し、（ｄ）標識された特 異的競合試薬を、結合条件下に該固相に適用し、 （ｅ）該固相に結合した標識の量を測定し、そして（ｆ）該標識の量を該サンプ ル中の被分析物の濃度又は存在と相関させること、 を含んでなる方法。 ２２．該特異的競合試薬が、該被分析物の標識された類縁体である、請求項２１ の方法。 ２３．該特異的競合試薬が、該被分析物の標識されたレセプターである、請求項 ２１の方法。 ２４．該試薬が、抗体、抗体フラグメント、特異的結合性タンパク質及び被分析 物よりなる群より選ばれるものである、請求項２１の方法。