JPH07503722A - 血中の酸化窒素濃度を増加させる方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 の　−　“　ニー　せ　−゛ 本発明は血中の酸化窒素濃度を増加させる方法に関するものである。

血小板は血液中に形成される成分の内の最小のものである。血液ｍｍ３当たりに は約２５０　ｘ　１０６個の血小板が含まれており、白血球ではわずか数千であ ることとは対照的である。平均的な成人の血液には約１兆個の血小板が存在する 。血小板は細胞ではなく、巨核球と呼ばれる巨大骨髄細胞の破片である。巨核球 が成熟したとき、その細胞質が破壊され、数千の血小板が形成される。血小板は ＤＮＡを欠き、タンパク質合成能力をほとんど持たない。血小板は、血液中に放 出されたとき、循環して約１０日で死滅する。

しかし、血小板は活性代謝能を有し、そのエネルギー需要を補う。

血小板は、収縮性タンパク質（アクトミオシン）を豊富に含有するので、筋肉と 同じように、著しく収縮する傾向を有する。新しい血液の凝塊がわずか数分放置 後収縮することが、この現象によって説明できる。この収縮は、血管が切断され たときに、凝血性の栓塞を形成させる役目をする。血小板の主たる機能は凝血の 形成にある。負傷したときに、血小板はその個所に引き寄せられ、そこである物 質（トロンビン）を活性化させ、その物質が凝血過程を開始する。トロンビンは 、線維素源（フィブリノーゲン）を線維素（フィブリン）に転換することのほか 、また、血小板を粘着性にする。すなわち、血小板は、コラーゲンやトロンビン と接触したときに凝集して、損傷血管の穴の中で栓塞を形成する。

血小板は、互いに固着する傾向を有するばかりでなく、血管壁にも同様に固着す る傾向を有する。血小板は、凝血を促進するので、血栓の形成に主要な役目を果 たす。血栓の持つ危険な結末は、多（の心臓血管障害や脳血管障害において明か である。

生化学における進歩によって疾病の病因学における理解が進むにつれて、ヒトの 種々の病状における血液血小板の正確な機能が最近次第に理解され始めた。

例えば、アテローム発生（ａｔｂｅｒｏｇｅｎｅｓｉｓ）の過程、すなわち、動 脈、特に注目されているのは冠状動脈を狭めるプラーク（ｐｌａｑｕｅ）の発生 過程を説明しようとして多くの試みが施されている。最近では、アテローム性動 脈硬化症における血小板の潜在的役割に次第に関心が集まっている。

この点に関して、血液中の酸化窒素（ＮＯ）が、血液血小板の凝集を防ぐことに よって血液の凝血を阻止することが認識されはじめている。例えば５ｃｉｅｎｔ ｉｆｉｃ　Ａｍｅｒｉｃａｎ、　１９９２年５月、６８−７７頁、５ｎｙｃｔｅ ｒらの「酸化窒素の生物学的役割（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｒｏｌｅｓ　ｏｆ　 Ｎ１ｔｒｉｃＯｘｉｄｅ）　Ｊ　、を参照。なお、この記載を引用して、本記述 の一部として援用する。

酸化窒素の正確な生物学的役割が探求されるにつれて、酸化窒素が脳及びその他 の身体部分において重要なメツセンジャー分子として働き、種々の生物学的機能 を支配することが知られるに至った。血管中では、主要な内皮細胞由来弛緩因子 （ＥＤＲＦ）は酸化窒素であり、これが血管拡張を刺激する。酸化窒素はまた、 血小板の凝集を阻止し、大食細胞の細胞毒的作用の原因の一端を担う。

脳では、酸化窒素は、環状ＧＭＰ濃縮の刺激において、興奮性神経伝達物質であ るグルタミン酸塩の作用を仲介する。免疫組織化学的研究によれば、酸化窒素合 成酵素（Ｎ　Ｑ　３　）　（ｎ１ｔｒｉｃ　ｏｘｉｄｅｓｙｎｔｈａｓｅ）は、 脳及び末梢における特定の神経集団に局在している。

酸化窒素合成酵素の阻害剤は、神経刺激によって誘導される腸管の生理学的弛緩 を阻害するが、これは、酸化窒素が一種の神経伝達物質的な性質を有することを 示す。このことから、酸化窒素は、通常の神経伝達物質とは違って、シナプシス 小胞中に蓄えられず、シナプシス膜の典型的な受容タンパク質に作用しない、と いう点で、新しいタイプの神経メツセンジャーであるように思える。酸化窒素の 一つの機能は、神経単位（ノイロン）を虚血性発作や神経毒的発作から保護する ことにあるといえよう。Ｎａｔｕｒｅ第３５１巻、１９９１年６月、７１４−７ １８頁、Ｂｒｅｄｔらの［クローン化発現酸化窒素合成酵素は構造的にシトクロ ム　Ｐ−４５０還元酵素に類似する（Ｃｌｏｎｅｄ　ａｎｄ　Ｅｘｐｒｅｓｓｅ ｄ　Ｎ１ｔｒｉｃ　０ｘｉｄｅ　５ｙｎｔｈａｓｅ　５ｔｒｕｃｔｕｒａｌｌｙ 　Ｒｅｓｅｍｂ撃■■ Ｃｙｔｏ−ｃｈｒｏｍｅ　Ｐ−４５０Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）Ｊを参照。

このようにして、血小板凝集関連の疾病のほか、人間の多数その他の病状が、血 液中の不適切な酸化窒素濃度に関係しているものと現在では考えられている。こ れらの酸化窒素関連の病状には、高血圧、神経学的状態、例えばうつ病、腫瘍、 細菌及び糸状菌の感染症、及びインポテンス、などが含まれる。

本発明は、血液を、酸化窒素濃度増強効果のある量のオゾンガス及び紫外線照射 と接触させることを包含する、血中の酸化窒素濃度を増加させる方法を提供する ものである。

このオゾンガスは、血液中、約０．５μｇ／ｍｌないし約１００μｇ／ｍｌの濃 度を有することが好ましい。

この紫外線照射は約２５３．７　ｎｍの波長を有することが有利である。

好ましくは、血液は、オゾンガス及び紫外線照射と接触させられる間、約０℃な いし約５６℃の温度に維持される。好ましい温度範囲は、３７℃ないし４３℃で あり、最も好ましい温度は４２．５℃である。

処理血液量は０．０１　ｍｌないし４００　ｍｌであってよく、好ましくは約１ ０　ｍｌである。また、血液は、好ましくは約３分間、オゾンガス及び紫外線照 射と接触させる。

この血液は、ヒトの血液であることを得る。

本発明は、前述のような方法によって調製した、酸化窒素濃度の向上した血液に 関するものであり、また、前述のような血液の使用、ならびに、薬物の調製にお ける前述のような方法の使用に関するものである。この薬物は、高血圧、神経学 的状態、うつ病、腫瘍、細菌感染症、糸状菌感染症、インポテンス、ウィルス感 染症あるいは原生類感染症などの治療のためのものであってよい。

本発明をここにさらに詳細に説明する。

以下の実施例１及び２では、血液血小板の凝集の阻止は、血液をオゾンガス及び 紫外線照射（ＵＶ）の組み合わせによって処理した場合に限って達成されること が示される。血液をオゾンガスだけで処理した場合は、血液血小板凝固阻止作用 は最低限である。

血液を紫外線照射だけで処理すれば、血小板凝集阻止作用は全く見られない。さ らに実施例３及び４では、血液血小板凝集阻止作用が酸化窒素仲介機構を経て進 み、本発明に従って血液を紫外線及びオゾンで処理すれば、酸化窒素の血中濃度 が増強されることが示される。

従って、意外にも、オゾンガス及び紫外線の併用処理によって、酸化窒素の血中 濃度が著しく増強されることが見い出されたものであり、これは、血中の酸化窒 素濃度を増加させることによって恩恵を受ける種々の疾患の治療に有用であろう 。

オゾンガスは、オゾン発生器など、この技術分野で知られている任意の通常の供 給源を通じて提供することができる。本発明方法に関連して用いられるオゾンガ スは、約０．５ないし約１００μｇ／ｍｌのオゾン濃度を有する。好ましくは、 オゾンガスは約５ないし約５０μｇ／ｍｌの濃度を有する。オゾンガスは、医療 用酸素をキャリアーとして血液に供給することが好ましく、好ましくはオゾン／ 酸素混合物を血液サンプルに吹き込むなど、本技術分野で既知の任意の手段によ って血液と接触させることが好ましい。

紫外線照射は、例えば複数の低圧紫外線ランプを用いるなど、本技術分野で既知 の任意の通常の供給源を用いて提供することができる。本発明では、標準ＵＶ− Ｃ紫外線照射源を利用することが好ましい。照射線の少なくとも約９０％が約２ ５３．７　ｎｍの波長を有するような線スペクトルを発生する低圧紫外線ランプ を用いることが好ましい。標準のＵＶ−ＡやＵＶ−Ｂ供給源に相当する放射波長 を有する紫外線照射も、容認できる結果を与えるものと思われる。

ＵＶ／オゾン処理すべき血液は、オゾンガス及び紫外線照射と接触させる間、約 ０℃ないし約５６℃の温度に加熱することが好ましい。血液を加熱するには、好 ましくは一個又はそれ以上の赤外線ランプなど、本技術分野で既知の任意の適当 な熱源を用いることができる。血液は、オゾンガス及び紫外線照射と接触させる に先だって、約３７−４３℃、最も好ましくは約４２．５℃に加熱してもよい。

次いで、血液の温度を、ＵＶ／オゾンで処理する間、約４２．５℃に維持するこ とが好ましい。

あるいはその代わりに、血液を、ＵＶ照射を受けさせながら、所定の温度（好ま しくは約４２．５℃）に達するまで加熱し、その温度に達した時点でオゾンガス の血液中への吹き込みを開始させる。

次いで、所定の時間、好ましくは約３分間、ＵＶ／オゾン並行処理を続ける。

さらに代わりの方法として、血液を、所定の温度（好ましくは約４２．５℃）ま で加熱しながら、ＵＶ／オゾンで処理し、次いで、所定の温度に達したときに処 理を終わるか、あるいは、さらにある時間、最も好ましくは約３分間、ＵＶ／オ ゾン処理を継続する。

本発明に従って好んで用いられる赤外線ランプによる血液の約４２．５℃までの 加熱には、約１分５０秒ないし約２分１０秒を要することが判明した。

本発明に従って処理される血液源は、血液型の適合する血液提供者など、外部供 給源からの血液であって、これをＵＶ／オゾン処理して患者に投与してもよいこ とは理解されよう。あるいは、また好ましくは、処理すべき血液を患者から部分 標本として抜き出し、これをＵＶ／オゾン処理し、次いでこれを採取した患者に 再投与してもよい。患者から取り出した血液は、その全量を処理して、患者に再 投与してもよく、あるいはその一部分を処理して患者に再投与してもよい。

一般には、約０．０１ないし約４００ｍ１の血液を本発明に従って処理すること が可能である。好ましい血液量は約０．１ないし２００ｍ１の範囲、さらに好ま しくは約１ないし５０　ｍｌである。最も好ましい方法は、約１０　ｍｌの血液 をオゾンガス及び紫外線照射で処理し、次いでこの処理血液を筋肉内注射によっ て患者に投与（再投与）するものである。

本技術分野で知られているその他通常の血液投与技術を用いてもよい。例えば動 脈内注射、静脈内注射、皮下注射、腹腔内注射などである。このようなやり方で 少量の宿主血液を投与することをマイクロ自家血液療法と呼んでいる。

本発明はまた、患者の身体から連続的に血液を取り出し、前述のように血液をオ ゾンガス及び紫外線で処理する装置にこれを循環させ、しかる後に患者にこの血 液を返還するというような実施態様をも意図している。この操作は、例えば冠状 バイパス外科手術など、手術操作の実施中に特に有用であろう。

血液は、患者の血中酸化窒素濃度を効果的に上昇させるに十分な時間、オゾンガ ス及び紫外線照射に接触させる。約数秒ないし約６０秒、好ましくは約０．５分 ないし約１０分、最も好ましくは約３分、という処理時間が満足すべき血中酸化 窒素濃度の増強をもたらすことが知られている。血液は、この３分の処理時間の 間、約４２．５℃の温度に保つことが好ましい。

本方法は、本技術分野における普通の熟練者に知られているような滅菌状態のも とで実施されるべきであろう。本発明方法は、医療技術の熟練者によく知られて いるような、血液のオゾン処理や血液の紫外線照射に通常用いられる装置を使用 して実施することができる。本発明方法を実施するには、合衆国特許第４，９６ ８，４８３号に記載のものと類似した装置を使用することが好ましい。合衆国特 許第４，９６８，４８３号の記述を引用し、その全体を本記述の一部として援用 する。

本発明によって提供される血中酸化窒素濃度の増加方法が、血中酸化窒素濃度増 強によって恩恵を受けるであろうような広範囲の病状を処理するための治療的有 用性を有するであろうことは、当業熟練者にとって明かであろう。

本明細書で用いる「処理する」又は「治療する」という言葉（ｔｒｅａｔｉｎｇ ）は、特定の疾患を軽減し又は予防することをいう。卒中などの損傷状態につい て言えば、予防的処理が好ましいことは明かである。また、好ましい宿主を記述 するために「ヒト」という言葉を用いているが、本発明の方法が他のは乳類につ いても同じく有用であろうことは、当業熟練者に明かであろう。

以下の疾病は、本発明方法によって治療し得る可能性のある既知の病状を例示す るものである。高血圧；うつ病などの神経学的病状；腫瘍：細菌、ウィルス、原 虫、糸状菌の感染症；及びインポテンス。このリストは単に例示的なものであり 、血中の酸化窒素濃度の増強によって恩恵を受けるその他の疾患も本発明の技術 によって処理できることは、当業熟練者にとって明かであろう。

末梢血管の疾患は、内皮細胞由来弛緩因子（ＥＤＲＦ）の減少（こ関係するもの と思われ、この因子の濃度が低下すれば、血管の平滑筋の収縮が起こり、従って 血管の管腔直径の減少、及び血流の減少が起こる。自然に存在する主要なＥＤＲ Ｆは酸化窒素である。その上、酸化窒素は血液血小板を安定化させ、その凝集を 減少させる。

従って、ＥＤＲＦ　（酸化窒素）濃度の増加は、循環器系（二二重の、慝恵的効 果を及ぼす。すなわち、それは血小板の凝集を阻止して血液をいっそう流動性に し、また、血管の直径を拡張して血流を改善する。その逆、すなわち酸化窒素濃 度の減少は、末梢血管の疾患、及びその他、血中の酸化窒素濃度の増加によって 恩恵を受けるだろうような前述の病状を引き起こす。

以下の実施例に例示するように、本発明方法は、血液中の酸イヒ窒素濃度を増加 させるものと考えられ、それは、末梢血管の疾、但、及びその他、血液血小板の 凝集や酸化窒素欠乏に関係する病状の本発明による処理における作用様式を説明 するものとなろう。

以下の実施例は本発明を例示するために示すものであって、本発明を限定するた めのものと考えてはならない。

実施皿上 血液中の血小板の凝固の阻止 血液中の血小板の活性に対するオゾン／紫外線処理の効果を検討するために、以 下の実験を行った。

去験燥作 １３の個別実験単位のために１０人の個体から末梢血液サンプル（２０ｍｌ）を 採取した。各サンプルを二つの部分標本に分けた。第１の標本は本発明の技術に 従って次のように処理した。

標本１０　ｍｌを、４２．５℃の温度で、オゾンガス（５−５０μｇ／ｍｌの可 変オゾン濃度）及び紫外線（２５３，７ｎｍ）で３分間、生体外で処理した。こ の血液サンプル処理を実施するために、合衆国特許第４．９６８，４８３号に記 載の装置を用いた。

各サンプルからの第２の標本１０而は非処理対照品とした。

対照品あるいは処理サンプルから遠心分離によって血小板を単離し、異なる濃度 のＡＤＰ　（天然の血小板刺激剤）に応じたその凝集能力を血小板刺激剤で測定 した。オゾン処理血液及び非処理血液の両者からのサンプルを用いて、コールタ −計数器（Ｃｏｕｌｔｅｒｃｏｕｎｔｅｒ）を使用して血小板の数を調べた。以 下に述べる実験の一部では、血液の部分標本を異なる濃度のオゾンで処理した。

行った別の実験では、ＵＶ光照射の存在下及び不存在下で血液を処理した。

オゾン処理血液における血小板凝集は、同一人物の非処理対照血液に対する凝集 率として表した。

結果 第１表に示すように、実験結果は、本発明による血液のオゾン及び紫外線による 処理が血液中の血小板の凝集を阻止することを示している。さらに、この阻止効 果が、オゾン濃度と量的相関性を持つことが示されている。（第２表参照。）Ａ ＤＰ−ｉｌ　Ｉｔ・　ハ　こ・ 高庄シン濃度の効果 高濃度のオゾン（３５ないし５０　μｇ／ｍＩ　）は、１３の実験中１１　（１ ０個体中８個体）で、ＡＤＰ誘導血小板凝集に対して目立った阻止率を示した。

（便宜上３３．３％阻止率とした。）１０個体全てについて全てのデータをとる と、血小板凝集の平均阻止率は４９．２　＋／−２７，８％（平均＋ｌ−標準偏 差）であった。男性及び女性からの血液で、阻止効果に顕著な差異はなかった。

（平均阻止率はそれぞれ４８．１％及び５０．７％であった。）この阻止率は、 ＡＤＰ　（凝集刺激剤）の０．０１−０．１　ｍＭ濃度範囲に亘って、ＡＤＰ濃 度と関連性を持つようであり、血小板作用物質の濃度が高いほど阻止率が低くな る。しかし、この関係は、高ＡＤＰ濃度では維持されず（第１表）　、０．０１ ｍＭＡＤＰにおける阻止濃度は０．１ｍＭＡＤＰにおけるものよりも有意に大で あるが（７１％対９５％、ｐ　＜　０．０２）　、多分具かけだけのものであろ う。

笈上表 種々の濃度のＡＤＰの存在下における人の血液血小板の凝集に対する高濃度オゾ ンの影響。

オゾン　ＡＤＰ　凝集　血小板数 Ｈ付　濃度　濃度　阻止率　オゾン処理（個体）（μｇ／ｍｌ）　（ｍＭ）　前 　後２１．１１．９１　５０　１０　１００（Ｆｌ） ２７．１１．９１　５０　５　８３．３（Ｍｌ）　１０　７１．４ ３０　７５．０ ２．１２．９１　５０　１０　０ （Ｆ２）　３０　１０．０ １００２７．３ ３．１２．９１　５０　０．５　６７．１（Ｍｌ）　１　５７．１ ６．１２．９１　５０　０．１　０　３４　４９（Ｍ３）　０．１　６．２ １１．１２．９１　５０　０．０５　６７．０　４６　９３（Ｍ４）　０．１　 ６２．４ １２．１２．９１　５０　０．０１　６７．０　５１　１２１（Ｍ５）　０．１ 　７．１ １３、Ｉ２．９１　５０　０．０１　６３．４　３３　８７９．０］、、９２　 ５０　０．０１　３４．２　３４　４０（Ｍ６）　０．０５　３１．０ １０．０１９２　５０　０．００１　７１．４　４９　６４０．５　１０．１ １．０　２１．８ １３．０１．９２　５０　０．００５　１００　４９　５２（Ｆ４）　０．０１ 　１００ ０．０５　９５．２ ０．１　９２．９ ０．５　９５．８ １．０　９１．６ ５．０　９５．８ １０．０　８０．０ １５．０１．９２　４０　０．０１　９０．０　８１　６６（Ｆｌ）　０．０５ 　７１．４ ０．１　４０．７ ０．５　８７．０ １．０　８１．８ ５．０　９５．５ １０．０　８５．２ ５０．０　８４．０ １００．０　７９．１ ２１．０１．９２　３５　０．０１　６７．１６８７９（Ｍｌ） 以下は第１表に示したデータの要約である。

ＡＤＰｍＭ　Ｏ，０１０，０５０，１００，５０１，００５，００１０，０凝集 阻止　７０．８　５３．５　３４．７　３７．６　５０．３　６０．７　６０． ７％　＋／−２０，９＋／−２６．１　＋／−２８，４＋／−３８，４＋／−２ ８，７＋／−３５，２＋／−３０，４Ｎ＝　６　６　８　７　７　４　４ −１■の　ハ　舌゛　こ−宣　１ン″の乏処理中に血液からの血小板の損失によ って、全血のオゾン処理による血小板凝集に見かけ上の減少が生じるので、８個 体からの血液についての９実験における処理、ならびに非処理全血について全血 小板の計数を行った。結局、血小板の計数は、オゾン処理後、非処理の場合の１ １５．５　＋／−５９，８％（８２−２６４％の範囲）であった。

このように、オゾン／ＵＶ処理の前と後の全血小板計数から、オゾン処理の結果 血液からの血小板の大きな損失がないことがわかる。

ＡＤＰ　ｉ゛１　こ−　の　ハ　の　イ′　こ・々のオゾン　Ｆの≦ 各４個体についての４実験において、あるＡＤＰ濃度範囲で３種の異なるオゾン 濃度（５，２５及び５０μｇ／ｍｌ）を用いた。各個体からの異なるオゾン濃度 のデータをまとめて４実験からのデータの平均値を計算すると、用いるオゾン濃 度と血小板凝集阻止率との間に何らかの薬量対応関係が存在することが示された 。（第２表を参照。） 全体としてのこれらの差異は顕著ではないが、４個体中の２個体において、５μ ｇ／ｍｌでよりも５０μｇ／ｍｌで、オゾンの有意に大きな阻止効果が見られた 。（第３表を参照。）第呈表 ＡＤＰの存在下における血小板凝集阻止に対する異なるオゾン濃度の影響 オゾン　ＡＤＰ　凝集　血小板数 日付　濃度　濃度　阻止率　オゾン処理（個体）　（μｇ／ｍｌ）　（ｍＭ）　 前　後３．１２．９　１５　０．１　２７．３（Ｍ２）　２５　０．１　１００ ５０　０．５　６７．１ ５　１．０　０ ２５　１．０　２８．６ ５０　１．０　５７．１ ５　５．０　０ ２５　５．０　２５．０ ５０　５．０　５０．０ ５０　３０．０　８８．１ ５０　０．０５　３１．０ ５００．１９．８ ５　１．０　２２．５ ２５　１．０　１３．７ ５０　１．０　２６．２ ５　５．０　０ ２５　５．０　１７．８ ５０　５．０　３１．５ １０．０１．９２　５　０．００１　５７．１　４９　７３（Ｆ３）　２５　０ ．００１　８５．７　９０５０　０．００１　７１．４　６４ ５　０．００５　３７．５ ２５　０．００５　８０．０ ５０　０．００５　３７．５ ５　０．０１　６６．４ ２５　０．０１　８３．２ ５０　０．０１　６９．８ ５　０．０５　４４．９ ２５　０．０５　６６．９ ５０　０．０５　３３．８ ５　０．１　２９．３ ２５　０．１　６１．０ ５０　０．１　３１．２ ５　０．５　３９．４ ２５　０．５　５４．５ ５０　０．５　１０．１ ５　１．０　２１．８ ２５　１．０　５２．９ ５０　１．０　２１．８ １３．０１．９２　５　０．００５　１００　４９　６０（Ｆ４）　２５　０． ００５　１００　８５５０　０．００５　１００　５２ ５　０．０１　１００ ２５　０．０１　８７．５ ５０　０．０１　１００ ５　０．０５　８４．８ ２５　０．０５　９７．１ ５０　０．０５　９５．２ ５　０．１　８２．９ ２５　０．１　９１．４ ５０　０．１　９２．９ ５　０．５　８３．３ ２５　０．５　９５．８ ５０　０．５　９５．８ ５　１．０　８３．２ ２５　１．０　８９．５ ５０　１．０　９１．６ ５　５．０　７９．２ ２５　５．０　９１．７ ５０　５．０　９５．８ ５　１０．０　８５．３ ２５　１０．０　８０．０ ５０　１０．０　８０．０ 以下は第２表に示したデータの要約である。

オゾン濃度（μｇ／ｍ１）５２５５０ 血小板凝集（％）　３８．５＋／−３０，９５６，５＋／−２９，４５５，９＋ ／−２６，４（平均子／−標準偏差ｎ＝４） 策１表 ２個体における血小板凝集阻止に対する異なるオゾン濃度の影響 ５、ｃｚｇ／ｍｌとの差異　ｎｓ　ｐ＜０．０１血小板凝集Ｍ６　（９６）　８ ．７＋／−９，６１１，２＋／−１０，２２４，７＋／−９，０５μｇ／ｍＩと の差異　ｎｓ　Ｐ（０，０２ｎｓ＝有意差なし ハ　の　シン　の　、ζこ−ＵＶ゛′の／ＵＶ光の存在下及び不存在下、種々の ＡＤＰ濃度でヒトの血液血小板の凝集に対するオゾンの影響を検討した。第４表 に示す結果から、オゾン単独でも何らかの血小板凝集阻止反応が見られたものの 、この反応はほとんど常にＵＶ光の存在下で大きくなり、この−回の実験でＵＶ 光の効果はきわめて顕著であった（　ｐ＜０．００１）。

この結果はまた、ＡＤＰの単一濃度（０，０１ｍＭ）を用いた第２の実験でも繰 り返された。この第２実験の結果を第５表に示す。

策土表 オゾンによる４０μｇ／ｍｌ濃度でのＡＤＰ誘導血小板凝集の阻止率に対するＵ ｖ光光彩影響実験日１５．０１．９２、個体Ｆ１．　）ＡＤＰ濃度　血小板凝集 阻止率（％） （ｍＭ）　＋ＵＶ　−ＵＶ Ｏ，０１９０，０６０，０ ０，０５７１，４０ ０，１４０，７４０，７ ０，５８７，００ １，０８１，８０ ５，０９５，５１９，４ １０，０８５，２１８，５ ５０，０８４，０１６，０ １００，０７９，１４，２ 平均＋／−標準偏差　７９．４＋／−１５，１１７，６＋／−１９，６（ｐ＜０ ．００１）オゾンの存在下及び不存在下でのＡ　Ｄ　Ｐ　（０，０１ｍＭ）誘導 血小板凝集に対するＵＶ光の影響（実験日２１．０１．９２、個体Ｍ２）血小板 凝集阻止率 オゾン３５μｇ／ｍｌ＋ＵＶ　オゾン３５　ｐ　ｇ／ｍｌ　−Ｕ　Ｖ　オゾンな しＵＶのみ８３．４％　１１．２％　０％ 要約すれば、実施例１の結果は、血液の部分標本を生体外でオシン及び紫外線光 で処理すると、血液血小板の凝集が阻止されることを示している。この血小板阻 止作用はオゾン濃度に対して薬量相関的であることがわかった。さらにまた、血 小板阻止作用は、第４表及び第５表から明かなように、紫外線光とオゾンガスと の併用処理に決定的に依存していることがわかった。オゾンガス単独の処理は最 小限の血小板凝集阻止作用を示し、紫外線光単独による処理は血小板凝集阻止作 用を示さなかった。

実施烈２ 酸化窒素の測定 オゾン化／ＵＶ光処理が処理血液中の血小板の凝集に影響する機構を明らかにす るために、ある種の酸化形態の窒素の濃度を測定した。

酸化窒素の直接測定を行うことは困難である。しかし、酸化窒素はアルギニンが シトルリンに変換される代謝経路における中間体である。その他の安定な最終産 物は硝酸塩及び亜硝酸塩である。

従って、実施例１に従って紫外線光及びオゾンガスで処理した血液のいくつかの サンプルについての酸化窒素含有量は、オゾン／ＵＶ光で処理する前、及び後の サンプルにつき、硝酸塩を亜硝酸塩に転換した後、硝酸塩プラス亜硝酸塩の合計 濃度を測定することによって間接的に測定した。

その結果から、本発明に従って処理した後の硝酸塩プラス亜硝酸塩濃度にわずか な増加があることが示された。この増加は、オゾンガス／ＵＶ光で処理したサン プルに一貫して見られた。すなわち、オゾンガス／ＵＶ光処理によって酸化窒素 濃度は増強されるようであり、これが本発明によって血液血小板凝固阻止が達成 される作用様式の一部であろう。この治療効果は前述のような末梢血管の疾患の 病因学と矛盾しないようである。

結論 実施例１及び２のデータは、本発明に従って血液をオゾンガス及び紫外線光で処 理すれば、下記の理由によって、現実に血小板凝集の阻止作用が誘導されること を示している。

１、この阻止効果は、少なくとも部分的に、ＡＤＰ濃度に依存しており、ＡＤＰ 濃度が低いほどオゾンの阻止効果が大きい。これは、比較的高い作用物質濃度が 、血小板の「過剰刺激（ｈｙｐｅｒｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ）Ｊによってオゾン の阻止効果に部分的に打ち勝つものと解釈できよう。これは、阻止作用が少なく とも部分的に可逆的であり、おそらく血小板の凝集能力を破滅させることによっ て作用するものではないことを示している。

２、この阻止効果はオゾン濃度に対して量的相関関係にあるように思われ、オゾ ン濃度が高いほど、血小板凝集阻止効果が大きくなる。

３、この阻止効果はＵＶ依存性であり、これがオゾンガスの酸化能力によって引 き起こされる非特異的毒性作用ではないことを示している。

実施血止 年齢層２０ないし５０歳の、女性６人、男性７人からなる１３人の健康な非喫煙 志願者から採取した静脈血（２０ｍｌ）をクエン酸ナトリウム抗凝血物質中に集 めた。いずれの志願者も、本研究の少なくとも１週間前までには薬物を摂取して いなかった。この血液を二つの１０ｍ１部分標本に分けた。標本の一つは以下に 述べるようにオゾン／ＵＶで処理し、他方は非処理対照サンプルとした。

ジル　゛ン几 合衆国特許第４．．９６８，４８３号に記載のものと同様な装置を用いて、異な るオゾン濃度で本発明に従って血液を処理した。血液サンプル中に医療用酸素中 のオゾンを０．３１／ｍｉｎの速度で所定の約３分間吹き込んだ。この血液を４ ２．５℃の温度に加熱し、波長２５３．７　ｎｍの紫外線光を当てた。酸素キャ リアー中のオゾン濃度は約５ないし５０Ｉｇ／ｍｌの間で可変とし、オゾン・モ ニター（Ｈｕｍａｒｅｓ社、力−ルスルーエ、ドイツ国）を用いて測定した。

血小板凝来の倹肚 血小板の凝集は、ホーン（Ｂｏｒｎ）の終点比濁法（ｅｎｄ　ｐａｉｎｔｊｕｒ ｂｉｄｉｍｅｔｒｉｃ　ｍｅｔｈｏｄ　）に主として則って測定した。

血液１０ｍ１（オゾン処理血液あるいは非処理対照血液）を、２００ｘｇで２０ 分間、室温で遠心分離にかけて、血小板凝集度しょう（ＰＰＰ）を調製した。４ 　ｍｌのＰＰＰを、１．０　ｍｌの燐酸塩緩衝食塩水を加えて希釈した。

希釈Ｐ　ＲＰ　（０，２２５ｍｌ）を、小型磁気撹拌棒を含む血小板凝集度（血 小板凝集計、モデル１００２、ＡＩ）Ｇ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ　Ｌｔｄ、　 Ｃｏｄｉｃｏｔｅ。

Ｈｅｒｔｓ、、英国）のキュヴエットに入れ、３７℃で平衡化させた。撹拌を開 始した後、作用物質０．０２５ｍ１　（ＡＤＰ−ＡＤＰ血小板凝集試薬、あるい は、コラーゲン−コラーゲン血小板凝集試薬；いずれもＳｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉ ｃａｌ　Ｃｏ、、　Ｐｏｏｌｅ、　Ｄｏｒｓｅｔ、英国）を加えて、下記の結果 の項に示した最終濃度にした。光透過における最大変化を測定した。オゾン処理 サンプルにおける血小板凝集度は、各個体の実験条件について、対照サンプルに おける凝集度に対するパーセントで示した。

血液血小板の計数は、全血について、英国シェフイールド、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ　 Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｈｏ５ｐｉｔａｌの血液部の提供になるコールタ−計数器を用 いて行った。

結果 全血を、酸素中オゾン３５−５０　μｇ／ｍｌで、０．３１／ｍｉｎの流速で３ 分間（反応オゾンの全量：　３１．５−４５　ｍｇ）　、ＵＶで照射しながら処 理すれば、全体として明かな血小板数の増加が見られ、検討した１２個体におい て対照値の１４６１１５７％（平均＋／−標準偏差、８１−２０２％）となった 。これは、この実験に用いた条件のもとでは、全血のオゾン処理によって血液血 小板は破壊されないことを示している。

さらに、肉眼で評価したところ、対照血液サンプルと比較して、処理血液には目 立った溶血現象は観察されず、これは、この処理法が赤血球の正常機能にほとん ど影響を与えないことを示している。

上記のように３５−５０Ｉｇ／ｍｌのオゾンで処理した血液からの血小板は、そ れがＡ　Ｄ　Ｐ　（０，００Ｉ−１００ｍｍｏｌ／Ｉ濃度）に反応して凝集する 能力において減少していることを示した。全体の凝集阻止度は５３．１＋／−３ １，，１％（平均＋／−標準偏差、ｎ＝１３）であった。この阻止度は個体間で ばらつきがあり、２．６％ないし１００％に亘った。

このオゾン／ＵＶ処理による阻止効果はＡＤＰ濃度に依存し、ＡＤＰ濃度が低い ところでは血小板凝集阻止の濃度が比較的高かった。（第６表を参照。）　Ａ　 Ｄ　Ｐｏ、０１　ｍｍｏｌ／ｌにおける阻止効果は、この作用物質０．１　ｍｍ ｏｌ／１におけるものよりも著しく大（ｐ＜０．０２）であった。（第６表を参 照。） 血小板凝集の誘発剤としてコラーゲンを用いた場合、３５−５０μｇ／ｍｌの酸 素中オゾンで処理した血小板も、高い凝集阻止レベルを示した。すなわち、ｌ　 ｍｇ／ｍｌのコラーゲンを用いて７４．２　＋／−４３，３％、１０　ｍｇ／ｍ ｌのコラーゲンを用いて７６．４　＋／−２５，２％（ｎ＝５）であった。

血液サンプル中に吹き込む酸素中のオゾン濃度を減少させると、血小板凝集阻止 における処理効果が減少する。検討した４個体の全体の平均値には顕著な差異は ないものの、処理に対する個々の反応においてこの差異は顕著であった。（第７ 表を参照。）笈旦表 酸素中５０μｇ／ｍｌ濃度のオゾン及びＵＶ照射によって生体外で血液を処理す ることによるＡＤＰ誘導血小板凝集阻止に対する血小板作用物質ＡＤ’Ｐの異な る濃度の影響 ５．０　５０．０ 女性１　０．００１　７１．４ ０．０１　６９．８ 女性２　０．０１　６３．４ ０．１　３０．４ １．０　２０．８ ０．０５　５３．５＋／−２６，１，ｎ＝６０．１　３４．７＋／−２８，４， ｎ＝８　＊第ヱ表 酸素中オゾン及びＵＶ照射を用いる生体外での全血の処理によるＡＤＰ誘導血小 板凝集阻止に対するオゾンの異なる濃度の影響血小板凝集阻止率 個体　μｇ／ｍｌオゾン　μｇ／ｍｌオゾン　μｇ／ｍｌオゾン男性１　１５． ５　５３．９　６５．６　＊　＊男性２　８．７　１１．２　２４．７＊平均（ ｎ＝４）　３８．５　５６．５　５５．９標準偏差　３０．９　２９．４　２６ ．４＊　＊　ｐ＜０．０１で有意 ＊　ｐ＜０．０２で有意 実施医主 血しょう酸化窒素濃度に対する 血液の生体外でのＵＶ／オゾン処理の影響実験の組！ １４人の正常な健康個体から採取した、クエン酸ナトリウムで凝固防止した血液 （１０ｍｌ）を、２０−５０μｇ／ｒｎｌ濃度のオゾンを含む酸素を用いて、実 施例３に述べたようにしてＵＶ／オゾンガスで処理した。各個体からの対照血液 は処理しなかった。１５０００　ｘ　ｇで３０秒間遠心分離にかけて血液の細胞 成分を除いた後、血しょうを一２０℃で蓄えた。

Ｌ−アルギニンから代謝的に生産される酸化窒素は不安定で、酸素と反応して硝 酸塩及び亜硝酸塩を形成する。カドミウム触媒を用いて硝酸塩を亜硝酸塩に変換 した後、全硝酸塩プラス亜硝酸塩を測定した。亜硝酸塩は１９８２年にＧｒｅｅ ｎ、　Ｗａｇｎｅｒ、　Ｇｌｏｇｏｗｓｋｉ。

５ｋｉｐｐｅｒ、　Ｗｉｓｈｎｏｋ　＆　Ｔａｎｎｅｎｂａｕｍが発表した（Ａ ｎａｌｙｔｉｃａｌＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　１２６巻、１３１−１３８頁 ）方法に基づいてＧｒｉｅｓｓ試薬を用いて比色法によって測定した。全ての処 理サンプル及び対照サンプルは一回の評価操作によって測定した。

結果 亜硝酸塩濃度の実際の値は、０．６−２７．６μｍｏｌ／１と個体間で大幅にば らついた。個体間の比較を可能にするために、オゾン処理サンプルにおける亜硝 酸塩の濃度を、対応非処理対照における濃度に対するパーセンテージで表した。

結果の要約は次の通りである。

対照品と比較した ５　１１０．０ ８　１６２．９ ９　１７５．８ １０　３５０．０ １１　８４５．５ １２　９８５．７ １３　２０７５．０ １４　３０６７．０ 算術平均　５８９．５％ これらの値は正規分布を形成していない。しかし、データを対数変換すればほぼ 正規分布が得られる。対数変換によって、ＵＶ／オゾン処理血液サンプル中の亜 硝酸塩濃度は非処理サンプルにおけるそれより有意に大である。（ｐ＜００１） 凪止検肚 酸化窒素は血小板の凝集を阻止する。これはその生理学的作用の一つである。血 小板に対する酸化窒素の作用が遊離のオキシヘモグロビンによって阻害されるこ とは知られている。（Ｓａｌｖｅｍｉｎｉ。

Ｒａｄｚｉｓｚｅｗｓｋｉ、　Ｋｏｒｂｕｔ　＆　Ｖａｎｅ、　Ｂｒ、　Ｊ、　 Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、　、　１０１巻、９９１−９９５頁、１９９０年。）従っ て、我々は、全血のＵＶ／オゾンガス処理による血小板凝集阻止作用に対するオ キシヘモグロビンの影響を検討した。

実験Ω抵斐 室温で２０分間２００　ｘ　ｇで遠心分離にかけることによって、ＵＶ／オゾン 処理あるいは非処理（対照）の全血から血小板富化血しょうを調製した。刺激剤 としてのＡＤＰ、コラーゲンあるいはトロンビンとの反応による血小板凝集を血 小板凝集計で測定した。オゾン処理に続いて、血小板凝集度測定の前に、血小板 富化血しょうにオキシヘモグロビンを加えた。もし血小板凝集を阻止するための 血液のＵＶ／オゾン処理が酸化窒素仲介機構に従って働いているなら、ＵＶ／オ ゾン処理によって起きる血小板凝集阻止はオキシヘモグロビンの添加によって妨 げられるはずである。結果を以下の第８表に示す。

第旦表 オゾン／ＵＶ処理後の 血小板　血小板凝集阻止率 」体　作里宣質　地なＵ　川」凹曲Ｈ隻女性ａ　トロンビン１００　ｉｕ　２３ 　４女性ｂ　トロンビン１００ｉｕ　５７　０トロンビン　１０　ｉｕ　９７　 ５７ ＡＤＰ１ｍｍｏｌ／ｌ　３６　０ 男性ａ　トロンビン１０　ｉｕ　８０　７９コラーゲン１　ｍｇ／ｍ１　９５　 ８０ＡＤ　Ｐ　１　ｍｍｏｌ／Ｉ　１６　０Ａ　Ｄ　Ｐ　０．１　ｍｍｏｌ／Ｉ 　２６　９ばらつきはあるが、３個体の内の２個体は、ヘモグロビンの存在下で 、ＵＶ／オゾン処理後の血小板凝集阻止率に一貫した減少が見られ、第３の個体 は、用いた凝集条件の４つの内の３つで多少の減少が見られた。血小板凝集の全 体平均は、ヘモグロビンなしで５４％、この酸化窒素作用阻害剤の存在下で２９ ％であった。

結論 以上のデータは、血液のオゾン処理が亜硝酸塩（酸化窒素の安定な代謝物）の濃 度を向上させること、また、血液のオゾン処理によって引き起こされる血小板凝 集阻止が、酸化窒素作用阻害剤であるヘモグロビンによって逆行させ得ること、 を示している。

全体として、これらのデータは、本発明による血液のＵＶ／オゾン処理が、生体 内で、酸化窒素の血中濃度を増加させ、酸化窒素仲介機構による血小板の凝集を 阻止することを強く示唆している。

以上のような本発明の記述から、本発明は種々の方式で変更させることかできる ことは自ずから明かであろう。このような変更は本発明の精神と範囲から逸脱し たものと考えるべきではなく、このような改変は全て以下の請求の範囲に含まれ るものと意図するものである。

閏！！！慣審報告 フロントページの続き （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、　ＰＴ、　Ｓ Ｅ）、　ＡＵ、　ＣＡ、ＪＰ、　ＫＲ，Ｎ

Claims (23)

【特許請求の範囲】
1. １．血液を、酸化窒素濃度増強効果のある量のオゾンガス及び紫外線照射と接触 させることを包含する、血中の酸化窒素濃度の増加方法。
2. ２．オゾンガスが、血液中で約０．５μｇ／ｍｌないし約１００μｇ／ｍｌの濃 度を有する、請求項１の方法。
3. ３．オゾンガスが約５μｇ／ｍｌないし約５０μｇ／ｍｌの濃度を有する、請求 項２の方法。
4. ４．紫外線照射が約２５３．７ｎｍの波長を有する請求項１ないし３のいずれか １項の方法。
5. ５．血液を、オゾンガス及び紫外線照射と接触させる間、約０℃ないし約５６℃ の温度に保つ、前記請求項のいずれか１項の方法。
6. ６．血液を、オゾンガス及び紫外線照射と接触させる間、約３７℃ないし約４３ ℃の温度に保つ、請求項５の方法。
7. ７．血液を、オゾンガス及び紫外線照射と接触させる間、約４２．５℃の温度に 保つ、請求項６の方法。
8. ８．処理血液が約０．０１ｍｌないし約４００ｍｌである、前記請求項のいずれ か１項の方法。
9. ９．処理血液が約１０ｍｌである、請求項８の方法。
10. １０．血液を、約３分間、オゾンガス及び紫外線照射と接触させる、前記請求項 のいずれか１項の方法。
11. １１．血液がヒトの血液である、前記請求項のいずれか１項の方法。
12. １２．前記請求項のいずれか１項による方法によって調製した、酸化窒素の濃度 の増強された血液。
13. １３．請求項１２による血液の医療用製剤における使用。
14. １４．請求項１ないし１１のいずれか１項の方法の医療製剤における使用。
15. １５．請求項１３叉は１４による、高血圧治療用医療製剤における使用。
16. １６．請求項１３叉は１４による、神経学的病状治療用製剤における使用。
17. １７．請求項１３叉は１４による、うつ病治療用製剤における使用。
18. １８．請求項１３叉は１４による、腫瘍治療用製剤における使用。
19. １９．請求項１３叉は１４による、細菌感染症治療用製剤における使用。
20. ２０．請求項１３叉は１４による、糸状菌感染症治療用製剤における使用。
21. ２１．請求項１３叉は１４による、インポテンス治療用製剤における使用。
22. ２２．請求項１３叉は１４による、ウイルス感染症治療用製剤における使用。
23. ２３．請求項１３叉は１４による、原虫類感染症治療用製剤における使用