JP2003520244A

JP2003520244A - 前処理した自己血液によるうっ血性心不全の処置

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Publication number: JP2003520244A
Application number: JP2001552917A
Authority: JP
Inventors: エルドンアール．スミス，; ギジェルモトレ−アミオーネ，
Original assignee: バソジェンアイルランドリミテッド
Priority date: 2000-01-18
Filing date: 2001-01-18
Publication date: 2003-07-02
Also published as: EP1267897B1; ATE281839T1; AU773118B2; US6572895B2; MXPA02007032A; NO20023267L; DE60107065T2; AU2820801A; PT1267897E; IL150725A0; EP1267897A1; CA2296997A1; CN1400906A; US20020051766A1; WO2001052870A1; DK1267897T3; CA2400801A1; HK1050847A1; CA2400801C; PL357261A1

Abstract

(57)【要約】患者の血液アリコートを、体温より高いかまたは低い温度、電磁気的照射および酸化的環境からなる群より選択される少なくとも１つのストレッサーでエキソビボで処理、それに続いてその処理された血液アリコートを患者に投与する工程を含む、ヒト患者におけるうっ血性心不全（ＣＨＦ）を処置する方法。この処理は、それ自体で使用され得るかまたは慣用的なＣＨＦ処置と組み合わせた補助的治療法として使用され得る。１つの局面において、本発明は、うっ血性心不全（ＣＨＦ）に罹患しているヒト患者においてＣＨＦを処置するための医薬品の調製における、該患者の改変された血液アリコートの使用であって、該改変されたアリコートは、紫外光および酸化的環境を含むストレッサーで該患者の血液のアリコートをエキソビボで処理する工程によって調製される、使用を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（発明の背景）（１．発明の分野）本発明は、特に、ヒト被験体に対する改変血液アリコートの投与による、必要
に応じて、うっ血性心不全の症状の緩和のための１以上の他の処置と組み合わせ
た、うっ血性心不全を処置するための方法に関する。

【０００２】（２．先行技術の記載）うっ血性心不全（ＣＨＦ）は、年間８０，０００人を超える死亡率を伴う、約
５百万のアメリカ人に冒す比較的一般的な障害である。ＣＨＦは、それ自体では
明確な疾患プロセスではないが、むしろ、互いに作用して、循環ポンプとしての
機能を満たす心臓の能力の進行性の喪失を最終的に生成する、複数の解剖学的、
機能的および生物学的異常の効果を表すと考えられる。

【０００３】ＣＨＦは、心筋梗塞（心臓発作）のような指標的事象の発生によって引き起こ
され得るか、あるいは高血圧または心臓の奇形（例えば、弁の疾患）のような他
の原因に対して二次的であり得る。この指標的事象または他の原因は、例えば、
心筋に損傷を与えることによって、心臓のポンプ能力における最初の伯下を生じ
る。このポンプ能力における伯下は、１以上の補償的な機構の活性化に起因して
、すぐには認められないかもしれない。しかし、ＣＨＦの進行は、患者の血行動
態の状態に非依存的であると見出されてきた。従って、この疾患によって引き起
こされる損傷的改変は、患者が無症候のままの間でさえ、存在しそして進行する
。実際、ＣＨＦの早期の間に正常な心血管機能を維持する補償的機構は、例えば
、心臓および循環に対して有害な効果を及ぼすことによって、実際にこの疾患の
進行に寄与し得る。

【０００４】ＣＨＦにおいて発生するより重要な病態生理学的な変化のいくらかは、視床下
部−下垂体−副腎軸の活性化、全身性の内皮の機能不全および心筋の再構築（ｒ
ｅｍｏｄｅｌｉｎｇ）である。

【０００５】視床下部−下垂体−副腎軸の活性化に対する反作用に特に関する治療法として
は、β−アドレナリン作動性遮断剤（β−ブロッカー）、アンギオテンシン変換
酵素（ＡＣＥ）阻害剤、特定のカルシウムチャネルブロッカー、硝酸塩およびエ
ンドセリン−１遮断剤が挙げられる。カルシウムチャネルブロッカーおよび硝酸
塩は、臨床的改善を生じるが、明らかに生存を延長するとは示されておらず、一
方、β−ブロッカーおよびＡＣＥ阻害剤は、アルドステロンアンタゴニストと同
様に、有意に寿命を延長することが示された。エンドセリン−１遮断剤を使用し
た実験的研究は、有利な効果を示した。

【０００６】全身性の内皮の機能不全は、ＣＨＦの十分認識された特徴であり、そして、左
心室の機能不全のタイムサインが存在することによって、明らかに存在する。内
皮の機能不全は、心筋の微少循環と心筋細胞との親密な関係について、重要であ
る。この証拠は、微小血管機能不全が、筋細胞の機能不全および進行性の心筋不
全を生じる形態学的変化に有意に寄与することを示唆する。

【０００７】根底にある病態生理学の点では、証拠は、内皮の機能不全が、ＮＡＤＨ依存性
オキシダーゼによる血管のＯ_２ ⁻形成における増大およびそれに続くＮＯの過剰
な除去に起因し得る、ＮＯの相対的な喪失によって引き起こされ得ることを示唆
する。Ｏ_２ ⁻の生成の増大に対する潜在的な寄与因子としては、増大した交感神
経の緊張、ノルエピネフリン、アンギオテンシンＩＩ、エンドセリンー１および
ＴＮＦ−αが挙げられる。さらに、鍵となる抗炎症性サイトカインであるＩＬ−
１０のレベルは、ＴＮＦ−αレベルに対して不適切に低い。ＴＮＦ−α（ＩＬ−
６を含むプロ炎症性のサイトカインに関連する）および可溶性ＴＮＦ−αレセプ
ターのレベルの上昇は、心筋の収縮性の減少、両心室の拡張および低血圧を引き
起こすことによってＣＨＦの進行において重要な役割を果たし、そしておそらく
内皮の活性化および機能不全に関与すると現在考えられる。また、ＴＮＦ−αは
、重篤なＣＨＦ患者において発生する、今まで説明されなかった筋肉の消耗にお
いて役割を果たし得ると考えられる。可溶性ＴＮＦ−レセプター治療による少数
の患者における予備的な研究は、ＮＹＨＡ機能分類において、および生活の質の
指標によって計測されるような患者の健康において改善を示した。

【０００８】心筋の再構築は、無症候性の心不全から症候性の心不全への移行を伴う複雑な
プロセスであり、そして心筋層内の一連の順応性の変化として説明され得る。心
筋再構築の主要な構成要素は、筋細胞の生物学における変更、壊死またはアポト
ーシスによる筋細胞の喪失、細胞外マトリックスにおける変更および左心室のチ
ャンバの形状における変更である。心筋の再構築が長期間の神経ホルモン刺激の
毒性効果への数年間の曝露後発生する単なる器官内（ｅｎｄ−ｏｒｇａｎ）応答
であるか否か、あるいは心筋の再構築が心不全の進行に非依存的に寄与するか否
かは、不明である。データに対する証拠は、適切な治療が心筋の再構築の進行を
遅延させ得るかまたは停止させ得ることを示唆する。

【０００９】現在使用される処置は、ＣＨＦの症状を緩和し得、そしてその疾患プロセスに
よって引き起こされた特定の病態生理学的異常を補正し得るが、ＣＨＦは、依然
として容赦なく進行し、比較的高い死亡率を伴う。実際、既存の薬物によっても
たらされる罹患率および死亡率における相対的な減少は、約１０％から２５％程
度である。従って、ＣＨＦに対するさらなるまたは優れた処置、特にその根底に
ある疾患を有意に改変し得る処置に対する必要性が存在する。

【００１０】（発明の要旨）本発明は、現在公知のＣＨＦ治療法の上記の少なくともいくつかおよび他の弱
点を克服し、これは、哺乳動物の血液のアリコートをエキソビボで処理しそして
続いて哺乳動物の被験体の体内に導入する、ＣＨＦを処置するための方法を提供
することによる。

【００１１】この血液のアリコートは、血液を改変することが見出された１以上のストレッ
サーに供されることによって処理される。本発明に従って、この血液のアリコー
トは、血液、または分離された細胞性もしくは非細胞性の血液画分、または分離
された細胞性および／もしくは非細胞性の血液画分の混合物を、温度ストレッサ
ー、電磁気的照射および酸化的環境から選択されるストレッサー、またはこれら
のストレッサーの任意の組み合わせに、同時にまたは連続して供することによっ
て、改変され得る。

【００１２】上で議論したように、ＣＨＦに関連する病態生理学的な変化としては、免疫の
活性化、内皮の機能不全ならびに壊死および／またはアポトーシスを通じた筋細
胞の喪失が挙げられる。本発明のこの処置方法は、これら３つの各領域における
治療上の利点を生成することが示された。

【００１３】免疫の活性化について、本発明の処置は、異なる種におけるいくつかのＴｈ１
／ＴＮＦ−α依存性実験的炎症モデルにおいて、炎症性サイトカインのレベルを
調節することが見出された。例えば、この処置は、Ｂａｌｂ／ｃマウスにおける
アレルギー性接触過敏性、ＴＮＦ−αによって仲介されるＴｈ１駆動免疫反応を
減少させ（Ｓｈｉｖｊｉら、ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｕｔａｎｅｏｕｓＭｅ
ｄｉｃｉｎｅａｎｄＳｕｒｇｅｒｙ４：１３２−１３７、２０００）；炎
症疾患のＬｅｗｉｓラットモデルにおいて、アジュバント誘導された関節炎にお
けるＩＬ−６のｍＲＮＡの発現をダウンレギュレートし；そしてＴｈ１駆動自己
免疫疾患である硬皮症を罹患している患者において、Ｔｈ２細胞に対するＴｈ１
細胞の比率を減少させる（Ｒａｂｉｎｏｖｉｃｈら、１９９８年６月２１〜２５
日の、第１２回Ｐａｎ−ＡｍｅｒｉｃａｎＣｏｎｇｒｅｓｓｏｆＲｈｅｕ
ｍａｔｏｌｏｇｙ、Ｍｏｎｔｒｅａｌ、Ｃａｎａｄａにてポスター発表）ことが
示された。この処置は、例えば、ＩＬ−１０を含む抗炎症性Ｔｈ２型サイトカイ
ンを増大させることによって、炎症活発性のＴｈ１型免疫応答をダウンレギュレ
ートすると考えられる。

【００１４】本発明の処置は、ヒトおよび動物において実施された多くの研究において、内
皮の機能を改善することが見出された。例えば、この処置は、重篤な原発性レー
ノー病を罹患している患者に対するオープンスタディにおいて、内皮依存性の血
管拡張神経の機能を改善し（Ｃｏｏｋｅら、ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＪｏ
ｕｒｎａｌｏｆＡｎｇｉｏｌｏｇｙ１６：２５０−２５４、１９９７）、
アテローム硬化症に二次的である進行した末梢血管の疾患を罹患している患者に
おける、二重盲式のプラシーボコントロールの研究における一時的閉塞後の皮膚
の血流の回復の速度を改善し（Ｃｏｕｒｔｍａｎら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ
Ｖｏｌ．１０２、＃１８、補遺ＩＩ、２０００）、コレステロールを給餌したＬ
ＤＬレセプター欠損マウスにおいてアテローム硬化症の進行を減少させ（Ｂａｂ
ａｅｉら、ＪｏｕｎａｌｏｆＡｍｅｒｉｃａｎＣｏｌｌｅｇｅｏｆＣ
ａｒｄｉｏｌｏｇｙ３５（補遺Ａ）：２４３．１９９９）、そして一酸化窒素
アゴニスト（アセチルコリン）に対する血管拡張応答の増大によって証明された
ように、重篤なアテローム硬化症、高コレステロール血症のＷａｔａｎａｂｅウ
サギにおいてアセチルコリンへの内皮依存性血管拡張神経の機能を顕著に改善す
る（上述のＣｏｕｒｔｍａｎら）ことが見出された。内皮の機能におけるこの改
善は、抗炎症性効果およびＣＨＦ患者において重篤に損なわれることが公知であ
る血管拡張能力における改善を生じ得る、ＮＯの増大した効力によると考えられ
る。

【００１５】筋細胞の喪失に関しては、本発明の方法は、アポトーシスおよびネクローシス
のレベルを減少させると考えられる。この処置は、増大したアポトーシス細胞死
に関連することが公知である虚血／再灌流（Ｉ／Ｒ）障害から腎臓を保護し得る
ことが示され（Ｔｒｅｍｂｌａｙら、Ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ５：２
６；Ｃｈｅｎら、ＭｅｄｉｃｉｎｅＳｃｉｅｎｃｅ１５（補遺１）：１６）
、そしてこの処置は、ＤＮＡのラダー化（ｌａｄｄｅｒｉｎｇ）およびＴｄｔに
よって染色されたアポトーシス核の密度によって決定されるように、Ｉ／Ｒ後の
腎臓におけるアポトーシスを減少させ得ることが示された。

【００１６】本発明の処置は、ＣＨＦにおける病態生理学的改変、すなわち内皮の機能不全
、炎症性サイトカインの生成およびアポトーシスによる筋細胞の喪失が生じる３
つの領域における治療上の利点を生成することから、本発明の処置がＣＨＦを罹
患している患者に対して有益であることが予測される強い理論的な基礎が提供さ
れる。本発明の方法は、それ自体で、または他の治療法（例えば、硝酸塩療法、
β−ブロッカー、ＡＣＥ阻害剤、ＡＴレセプター遮断薬剤、アルドステロンアン
タゴニスト、カルシウムチャネル遮断薬剤、ＴＮＦ遮断薬剤、ＴＮＦ−αの生成
の抑制剤、および／または他のより慣用的な処置方法（例えば、ナトリウム制限
および液体制限、利尿、ジギタリス等））と組み合わせてＣＨＦの治療法として
使用され得る。ＴＮＦ−αの生成を抑制することが公知である特定の薬物は、ペ
ントキシフリン、アムリノン、アデノシン、サリドマイド、ＴＮＦ改変酵素（Ｔ
ＡＣＥ）阻害剤およびデキサメタゾンを含む。特定のＴＮＦ遮断薬剤は、モノク
ローナル抗体およびエタネルセプト（ｅｔｅｎｅｒｃｅｐｔ）を含む。

【００１７】従って、１つの局面において、本発明は、ＣＨＦを被っているヒト患者におい
てＣＨＦを処置する以下を含む方法を提供する：（ａ）体温より高い温度または
より低い温度、電磁気的照射および酸化的環境からなる群より選択された少なく
とも１つのストレッサーで、エキソビボで患者の血液のアリコートを処理する工
程、ならびに（ｂ）工程（ａ）において処理された血液のアリコートを患者に投
与する工程、ここで、このアリコートは、患者のＣＨＦを緩和するために十分な
量を有する。

【００１８】別の局面において、本発明は、ＣＨＦを被っているヒト患者におけるＣＨＦの
ための併用療法を提供する。この併用療法は、酸化的環境、熱ストレスおよび電
磁気的照射から選択された１以上のストレッサーによってエキソビボで処理され
た患者自身の血液アリコートの患者に対する投与、ならびに硝酸塩、β−ブロッ
カー、ＡＣＥ阻害剤、ＡＴレセプター遮断薬剤、アルドステロンアンタゴニスト
、カルシウムチャネル遮断薬剤、ＴＮＦ遮断薬剤、ＴＮＦ−αの生成の抑制剤、
ナトリウム制限および液体制限、利尿剤およびジギタリスからなる群から選択さ
れた処置を包含する。（好ましい実施形態の詳細な記載）本発明の好ましいプロセスに従って、哺乳動物の被験体、好ましくはヒトから
血液のアリコートが抽出され、そしてこの血液アリコートは、特定のストレッサ
ーによってエキソビボで処理され、以下により詳細に記載される。本明細書中に
使用される用語「アリコート」、「血液アリコート」または類似の用語は、全血
、血小板を含む血液の分離された細胞性画分、血漿を含む血液の分離された非細
胞性画分、およびこれらの組み合わせを含む。このストレッサーの効果は、この
アリコートに含まれる血液および／または血液の細胞性もしくは非細胞性の画分
を改変することである。この改変されたアリコートは、続いて、ワクチン接種に
適切な任意の経路、好ましくは動脈内注射、筋内注射、静脈内注射、皮下注射、
腹膜内注射および経口投与、経鼻投与または直腸投与から選択された経路によっ
て被験体の体に再導入される。

【００１９】本発明の方法に従ってエキソビボで血液アリコートが供されるストレッサーは
、温度ストレス（体温より高いかまたはより低い血液温度）、酸化的環境および
電磁気的照射から、個々にまたは任意の組み合わせで、同時にかまたは連続して
選択される。適切には、ヒトの被験体において、このアリコートは被験体の体に
再導入された場合、少なくとも被験体におけるＣＨＦの部分的緩和が達成される
のに十分な量を有する。好ましくは、このアリコートの体積は約４００ｍｌまで
であり、好ましくは約０．１ｍｌから約１００ｍｌであり、より好ましくは約５
ｍｌから約１５ｍｌであり、さらにより好ましくは約８ｍｌから約１２ｍｌであ
り、そして最も好ましくは約１０ｍｌである（抗凝固剤、例えば、２ｍｌのクエ
ン酸ナトリウムと共に）。

【００２０】本発明に従って、血液に対する適切な改変を確実にするために、処置下のアリ
コートに上記の３つ全てのストレッサーを同時に適用することが好ましい。本発
明のいくつかの実施形態においては、上記の任意の２つのストレッサーを適用す
ること、例えば、温度ストレスおよび酸化的ストレス、温度ストレスおよび電磁
気的照射、または電磁気的照射および酸化的ストレスを適用することがまた好ま
れ得る。それによって血液を効果的に改変し被験体におけるＣＨＦを緩和する、
ストレッサーの適切なレベルを使用するために注意が払われるべきである。

【００２１】温度ストレッサーは、処置下のアリコートを上記の正常な体温より高くまで暖
め、またはこのアリコートを以下の正常な体温より低く冷却する。この温度は、
温度ストレッサーがこのアリコートに含まれる血液において過剰な溶血を引き起
こさないように、そして処置されたこのアリコートが被験体に注入される場合に
ＣＨＦの緩和が達成されるように選択される。好ましくは、この温度ストレッサ
ーは、このアリコートの全てまたは一部の温度が約５５℃まで、そしてより好ま
しくは、約−５℃から約５５℃の範囲にあるように適用される。

【００２２】本発明のいくつかの好ましい実施形態において、このアリコートの温度は、正
常な体温以上に上昇され、その結果、このアリコートの平均の温度は、約５５℃
の温度を超えず、より好ましくは約４０℃から約５０℃であり、さらにより好ま
しくは約４０℃から約４４℃、そして最も好ましくは約４２．５±１℃である。

【００２３】他の実施形態において、このアリコートは正常な体温より低く冷却され、その
結果、このアリコートの平均の温度は、約−５℃から約３６．５℃の範囲内であ
り、より好ましくは、約１０℃から約３０℃、そしてさらにより好ましくは約１
５℃から約２５℃である。

【００２４】この酸化的環境ストレッサーは、このアリコートへの固体、液体または気体の
酸化剤の適用であり得る。好ましくは、医療用品質の酸素およびオゾンガスの混
合物に対してこのアリコートを、最も好ましくは上記の温度幅で、そのより少な
い成分としてオゾンを有する医療用品質の酸素流をこのアリコートに通気するこ
とによって、曝露する工程を包含する。この気体の流動のオゾン含有量およびこ
の気体の流動の流速は、好ましくは血液アリコートに導入されるオゾンの量が、
それ自体でまたは他のストレッサーと組み合わせて、治療が無効であるといわれ
るような細胞の損傷の過剰なレベルを上昇させないように選択された。適切には
、気体の流動は、約３００μｇ／ｍｌまで、好ましくは約１００μｇ／ｍｌまで
、より好ましくは約３０μｇ／ｍｌまで、さらにより好ましくは約２０μｇ／ｍ
ｌまで、特に好ましくは約１０μｇ／ｍｌから約２０μｇ／ｍｌ，そして最も好
ましくは約１４．５±１．０μｇ／ｍｌのオゾン含有量を有する。このガスの流
動は、ＳＴＰで約２．０リットル／分まで、好ましくは０．５リットル／分まで
、より好ましくは約０．４リットル／分まで、さらにより好ましくは約０．３３
リットル／分まで、そして最も好ましくは約０．２４±０．０２４リットル／分
の速度で、適切にこのアリコートに供給される。気体の流動の流速の下限は、好
ましくは０．０１リットル／分以上であり、より好ましくは０．１リットル／分
以上であり、そしてさらにより好ましくは０．２リットル／分以上である。

【００２５】この電磁気的照射ストレッサーは、このアリコートが上記の温度に維持された
まま、そして酸素／オゾンガス性混合物がアリコート通気されたままで、電磁気
的照射の供給源から処置下のアリコートに照射することによって適切に適用され
る。好ましい電磁気的照射は、光照射、より好ましくは、紫外光、可視光および
赤外光から、そしてさらにより好ましくは紫外光から選択される。最も好ましい
紫外線供給源は主にＵＶ−Ｃ帯の波長、すなわち、約２８０ｎｍより短い波長を
照射する紫外線ランプである。このようなランプはまた、可視光および赤外光の
量も照射し得る。標準的ＵＶ−Ａ（波長約３１５ｎｍから約４００ｎｍ）および
ＵＶ−Ｂ（波長約２８０ｎｍから約３１５ｎｍ）に相当する紫外光の供給源もま
た使用され得る。例えば、上記温度および酸化的環境ストレスと共に同時に適用
されるこのような紫外光の適切な用量は、アリコートを保持するサンプル容器を
囲むように配列された８つまでのランプから得られ得、血液表面での総紫外光エ
ネルギーが、約０．０２５ジュール／ｃｍ^２から約１０ｊｏｕｌｅ／ｃｍ^２、好
ましくは約０．１ジュール／ｃｍ^２から約３．０ｊｏｕｌｅ／ｃｍ^２で送達する
強度で実行され、有利に使用され得る。好ましくは、４つのこのようなランプが
使用される。

【００２６】このアリコートがストレッサーに供される時間は、通常、約６０分までの時間
幅内である。この時間は、選択された電磁気的照射の強度、温度、酸化剤の濃度
、およびアリコートに供される速度にある程度依存する。最適な時間を確立する
いくつかの実験は、一旦他のストレッサーレベルが定められたら、作動の部分に
必要であり得る。ほとんどのストレッサー条件下では、好ましい時間は、ほぼ約
２分から約５分の範囲内であり、より好ましくは約３分または約３分半である。
開始血液温度、および予め決定された温度に温められ得るかまたは冷却され得る
速度は、被験体によって異なる傾向がある。このような処理は、被験体への注入
のために用意される、改変された血液アリコートを提供する。

【００２７】本発明の好ましいプロセスの実行において、この血液アリコートは、Ｍｕｅｌ
ｌｅｒの米国特許第４，９６８，４８３号に記載された型の装置を使用して、ス
トレッサーで処理され得る。このアリコートは、この機械に適合する適切な無菌
的紫外光送波容器（ＵＶｌｉｇｈｔ−ｔｒａｎｓｅｍｉｓｓｉｖｅｃｏｎｔａ
ｉｎｅｒ）に設置される。紫外線ランプは、気体フローがアリコートに適用され
酸化的ストレスを提供する前に、紫外線ランプの出力を安定化させるために定め
られた時間の間スイッチが入れられる。この紫外線ランプは典型的に、アリコー
トの温度が予め決定された値、すなわち４２．５±１℃に順応される間、オンに
される。続いて、既知の組成および制御された流速の酸素／オゾンガス混合物は
、このアリコートが３つ全てのストレッサーを同時に経るように、上記で考察し
たように約６０分までの、好ましくは２分から５分の、そして最も好ましくは約
３分の予め決定された持続時間の間、適用される。この方法によって、血液は、
本発明に従って適切に改変され、所望の効果を達成する。

【００２８】被験体は、好ましくは処置過程を受け、各個々の処置は、血液アリコートの除
去、上記のその処理、および被験体への処理されたアリコートの再投与を包含す
る。このような処置の過程は、多くの連続する日の間の処置された血液アリコー
トの毎日の投与を包含し得るか、または指定された時間の期間の毎日の処置の第
一の過程その後のある間隔および次の１以上のさらなる毎日の処置の過程を包含
し得る。

【００２９】１つの好ましい実施形態において、この被験体は、処理された血液の４から６
アリコートの投与を包含する処置の最初の過程を与えられる。別の好ましい実施
形態において、連続した日々の、または患者にアリコートが投与されない１日か
ら２１日までの期間の免除期間（約３日から約１５日の連続するアリコートの選
択された１つの組を分離する免除期間）によって分離された、連続するアリコー
トの任意の組の投与によって、被験体は、処理された血液の２から４アリコート
の投与を包含する治療法の、最初の過程を与えられる。より詳細な好ましい実施
形態において、この処置の最初の過程の投与量の療法は、第一のアリコートおよ
び第二のアリコートが連続する日々投与され、ならびに第二のアリコートの投与
と第三のアリコートの投与との間に１１日の免除期間が提供される、全部で３つ
のアリコートを包含する。本発明の方法において、任意の所定の日に被験体に投
与されるアリコートは、１つしかないことが好ましい。

【００３０】この最初の処置過程に続くさらなる処置過程を、続けて投与することが好まれ
得る。好ましくは、次の処置過程は、最初の処置過程の終了の、少なくとも約３
週間後に投与される。１つの特に好ましい実施形態において、この被験体は、最
初の処置過程の終了に続く、６ヶ月の期間にわたる、処理された血液アリコート
の３０日ごとの投与を包含する、第二の処置過程を受ける。

【００３１】継続する処置過程の間の間隔が、本発明の処置の正の効果が維持されるようで
あるべきであり、そして個々の被験体の観察される応答に基づいて決定され得る
ることが、理解される。

【００３２】上で議論したように、本発明の方法は、ＣＨＦのための他の治療法と組み合わ
せて付属的処置として好ましくは使用され得る。このような他の治療法の好まし
い実施例としては、１つ以上のＡＣＥ阻害剤、β−ブロッカー、アルドステロン
アンタゴニスト、ＴＮＦブロッカー、ＴＮＦ生成の抑制剤および他の形態の慣用
的治療法が挙げられる。

【００３３】本発明は、以下の特定の実施例を参照して、さらに例示されそして説明される
。

【００３４】（実施例１）本実施例は、生涯の最初の年の間に複雑なアテローム硬化症の病変を発症させ
ることが公知であるＷａｔａｎａｂｅウサギにおいて、内皮の機能に対する本発
明の処置の効果を決定するために実施される研究を説明する。以前に言及したよ
うに、内皮の機能不全はＣＨＦの病態生理に関連する。

【００３５】これらのウサギを７〜８月齢で研究に入れ、そして３つの群にランダム化した
。第一群は基準値の測定のために直後に屠殺し、第二群（ｎ＝１０）には本発明
に従って処理した血液の注入を行い、そして第三群（ｎ＝１０）には未処理の血
液を注入することを含む偽処置を行った。

【００３６】この処置は、１０週の期間にわたる処理された血液の合計４回の注入を包含し
た。この血液は、Ｍｕｅｌｌｅｒらへの米国特許第４，９６８，４８３号に一般
的に記載されたような装置において、以下の３つのストレッサーに対する曝露に
よって処理した。：（ａ）４２．５℃±１．０℃の上昇した温度；（ｂ）３分間２４０±２４ｍｌ／分の流量で血液に通気した、１４．５±１．
０μｇ／ｍｌのオゾンを含む医療用品質の酸素の気体混合物；および（ｃ）波長２５３．７ｎｍおよび２．０Ｊ／ｃｍ^２（以前に言及した範囲内で
のいくぶんかの変動を伴う）の総エネルギー密度の紫外線。

【００３７】この処理された血液を、筋内注射によって動物に投与した。コントロール動物
に、処理された動物と同じ注入スケジュールで、未処理の血液を筋内注射で投与
した。

【００３８】全ての動物を、１１月齢で屠殺した。輪調製物を、動物の腸骨動脈から採取し
、そしてフェニルエフリン（ｐｈｅｎｙｌｅｐｈｒｉｎｅ）（血管収縮剤）で処
理した後、アセチルコリン（内皮依存性血管拡張剤）によって誘導される弛緩の
量を、評価した。

【００３９】輪調製物の評価は、内皮媒介血管弛緩における有意な増大（５２．２±６％）
が、未処理の血液を注入したコントロール動物（２２．９±４％、ｐ値０．００
１未満）と比較して、処理された動物において観察されたことを示した。

【００４０】この輪調製物から内皮が除去された場合、弛緩は観察されず、このことは、本
発明の処理の内皮特異的効果をさらに確認した。

【００４１】（実施例２）本実施例は、末梢血管疾患（ＰＶＤ）を罹患している患者に対する、本発明の
治療法の処置の効果についての研究を説明する。この研究は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉ
ｔｙＨｏｓｐｉｔａｌ、Ｌｕｎｄ、Ｓｗｅｄｅｎで実施された。

【００４２】この研究は、中程度に進行したＰＶＤ（その主な症状は間欠性跛行）を罹患し
ている１８の患者（男７、女１１）におけるプラシーボコントロール二重盲検法
を含んだ。この研究に参加した患者は、ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＩｎｔｅ
ｒｎａｌＭｅｄｉｃｉｎｅｏｆｔｈｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＨｏｓｐ
ｉｔａｌ、Ｌｕｎｄ、Ｓｗｅｄｅｎの参加集団から募集した。

【００４３】これらの患者を、プラシーボ（１０ｍｌの温生理食塩水の筋内注射）または１
０ｍｌの処理された自己血の筋内注射を含む、本発明に従った処置のいずれかを
受けるように無作為に割り当てられた。この血液の処理は、抗凝固剤としての３
〜４％のクエン酸ナトリウム２ｍｌ中へ、患者の静脈血の１０ｍｌアリコートを
収集することを含んだ。各血液アリコートを、滅菌済みの使い捨ての低密度ポリ
エチレン容器に移し、そして次にＭｕｅｌｌｅｒらへの米国特許第４，９６８，
４８３号に一般的に記載されたような装置において以下の条件に曝露した。：（ｄ）４２．５℃±１．０℃の上昇した温度（ｅ）ＳＴＰで３分間、２４０±２４ｍｌ／分の流量で血液アリコートに通気
した、１４．５±１．０μｇ／ｍｌのオゾンを含む医療用酸素；および（ｆ）波長２５３．７ｎｍおよび約２．０Ｊ／ｃｍ^２の総エネルギー密度の紫
外線。

【００４４】各患者に、９週間の期間にわたって、生理食塩水または処理された血液の合計
１２回の注射を与えた。

【００４５】この治療を、治療の開始の前、ならびに治療の開始後３週目、６週目、９週目
および２ヶ月目に、各患者の末端における血流の全体的一時的閉塞後の、皮膚の
血流および酸素圧の回復速度を計測することによって評価した。

【００４６】足における皮膚血流を、レーザードップラー磁束計（ＬａｓｅｒＤｏｐｐｌ
ｅｒＦｌｕｘｍｅｔｒｙ）（ＬＤＦ）によって計測し、そして酸素圧を、足に
おける経皮的な皮膚の酸素圧（ＴｃｐＯ_２）の計測によって決定した。本発明の
処置を受ける患者において、最大の灌流に達する総時間（ＴＰ_Ｈ）および最大の
灌流に達する半分の時間（Ｔ_１／２Ｐ_Ｈ）の両方において、皮膚の血流の回復速
度における改善を示す、処置に関連性のある減少に向かう、強い傾向が観察され
た。コントロールの群においては、変化は観察されなかった。

【００４７】本発明に従って処置された患者における改善した血流回復速度は、この処置の
過程の間明らかであり、そしてその間中持続したが、治療の開始後２ヶ月まで、
有意に達しなかった。ＬＤＦによって計測した場合のプラシーボ群および処置さ
れた群についてのＴ_１／２Ｐ_Ｈの比較を、図１に示す。

【００４８】処置された群においては、より迅速な皮膚酸素含有量の回復に向かう傾向もま
た観察された。この差異は、治療の開始後２ヶ月目で統計的に有意になった。プ
ラシーボ群と比較した処置された群についての、虚血後の最大ＴｃｐＯ_２までの
半分の時間（Ｏ_２Ｔ_１／２）の比較を、図２に示す。

【００４９】従って、本研究は、この中程度に進行したＰＶＤ患者の群において、本発明の
処置が、全体的閉塞虚血の期間後の足の皮膚における血流の回復速度に対して明
らかな生物学的効果を有することを実証した。同様だがより小さい大きさの効果
が、ＴｃｐＯ_２回復速度について注目されたが、プラシーボ処置を受けた患者は
、変化を示さなかった。これらの結果は、本発明の処置が内皮の機能に対して有
利な効果を有し、そしてＰＶＤを罹患している患者において皮膚の微小循環機能
を改善するようであることを、示唆する。

【００５０】（実施例３）本実施例は、関節炎の発症を予防するための本発明の処置の使用に関し、そし
て関節炎の確立された動物モデルにおいて実施された研究の結果を説明する。こ
の研究に使用されたこの特定の動物モデルは、ラットにおけるアジュバント誘導
性関節炎であった（例えば、Ｐｅａｒｓｏｎ、Ｃ．１９５６、「Ｄｅｖｅｌｏｐ
ｍｅｎｔｏｆＡｒｔｈｒｉｔｉｓ、ｐｅｒｉａｒｔｈｒｉｔｉｓａｎｄ
ｐｅｒｉｏｓｔｉｔｉｓｉｎｒａｔｓｇｉｖｅｎａｄｊｕｖａｎｔ」、
Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．、９１：９５を参照のこと）。
このモデルに従って、関節炎を、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｂｕｔｙｒｉｃ
ｕｍを含むアジュバントをラットに注射することにより、そのラットにおいて誘
導する。

【００５１】１００〜２００ｇの４〜５週齢の雄性Ｌｅｗｉｓラットを、Ｃｈａｒｌｅｓ
ＲｉｖｅｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから取得し、１週間隔離し、そして研究
に入った。関節炎を誘導するためのアジュバント混合物を、５０ｍｇのＭ．ｂｕ
ｔｙｒｉｃｕｍ（ＤｉｆｃｏＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｄｅｔｒ
ｏｉｔ、ＭＩ）を５ｍｌの明るい白色のパラフィン油−ｍ３５１６（Ｓｉｇｍａ
ＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）に懸濁することによっ
て調製し、そしてホモジェナイザーを使用して完全に混合した。０．１５ｍｇの
Ｍ．ｂｕｔｙｒｉｃｕｍを供給するのに十分なこの混合物のアリコートを、尾の
付け根に各動物に皮下注射した。関節炎の症状は、四肢の膨張によって証拠付け
られるように、各動物において誘導後約１２日で現れた。

【００５２】アジュバント混合物を注射されていない２匹のラットを、血液ドナーとして使
用した。血液を、心臓穿刺によってこれらのドナーから収集し、そして１０ｍｌ
のクエン酸化血液を、本発明に従ってストレッサーでエキソビボで処理するため
に、無菌の低密度ポリエチレン容器に移した。上記のＭｕｅｌｌｅｒの特許に一
般的に記載されたような装置を使用して、この血液に、本発明に従った処理によ
ってストレスを与えた。

【００５３】６匹の動物に、処理された血液の０．２ｍｌアリコートの２回の注射過程を与
え、この注射は関節炎の発症後連続する日々、投与した。８匹のラットのコント
ロール群に、処置された動物と同じ注射スケジュールを使用して、未処理の血液
の注射を与えた。注射を関節炎の誘導１日後に開始した。天井荷重（ｔｏｐ−ｌ
ｏａｄｅｄ）Ｍｅｔｔｌｅｒ天秤を使用し、２５０ｍｌのビーカーでの水の排除
量によって、動物の後ろ足の体積を、関節炎発症後一日おきに計測した。動物の
各群についての結果を平均した。これを関節炎誘導後の日に対する平均の足の体
積のプロットで、付随する図３にグラフで表示した。上の曲線は、コントロール
の動物群に由来し、下の曲線は、処理された血液の注射を受けた動物に由来する
。足のより小さい体積によって示されるような、関節炎の重症度における有意な
減少が、コントロールの動物と比較して、処置された動物について明らかである
。

【００５４】上記の結果は、改変された哺乳動物血による被験体の処置が、哺乳動物におけ
る関節炎の発症を効果的に予防し得ることを示す。

【００５５】処置された動物および未処置の動物のリンパ節におけるＩＬ−６ｍＲＮＡの発
現を、関節炎誘導後１０日で計測し、そしてその結果を以下の表１に表示する。

【００５６】（表１）

【００５７】

【表１】上の表１に示された結果は、本発明に従った処置が、関節炎のＴｈ１／ＴＮＦ
−α依存モデルにおける炎症性サイトカインのレベルを調節し得ることを示す。
ＩＬ−６およびＴＮＦ−αのような炎症性サイトカインの生成が、ＣＨＦの病態
生理に関連する証拠が存在する。

【００５８】（実施例４）本実施例において報告される実験は、種々の身体器官の虚血およびその後の再
灌流を含む動物モデル系の使用によって、本発明の処置がアポトーシスおよび壊
死を減少させる効果を有することを実証する。虚血−再灌流損傷は、罹患した器
官および組織における、アポトーシスおよび壊死の増大を含むことが公知である
。例えば、Ｓａｉｋｕｍａｒｐら「Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｏｆｃｅｌｌ
ｄｅａｔｈｉｎｈｙｐｏｘｉａ／ｒｅｏｘｙｇｅｎａｔｉｏｎｉｎｊｕｒ
ｙ」、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ１９９８Ｄｅｃ２４；１７（２５）：３３４１−
９；およびＢｕｒｎｓＡ．Ｔ．ら「Ａｐｏｐｔｏｓｉｓｉｎｉｓｃｈｅｍ
ｉａ／ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎｉｎｊｕｒｙｏｆｈｕｍａｎｒｅｎａｌ
ａｌｌｏｇｒａｆｔｓ」、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、１９９８Ｏｃ
ｔ１５；６６（７）：８７２−６ならびにこれらに先行する他の刊行物、およ
びこれらに続く他の刊行物を参照のこと。細胞レベルでのアポトーシスの決定に
ついての公知の技術を、本実施例において採用する。

【００５９】雄雌同数の１〜２歳齢の純血の正常なビーグル犬を、実験動物として使用した
。これらの動物を、各群雄３および雌３の６匹の動物からなる４つの群、Ａ、Ｂ
、ＣおよびＤに分離した。群ＡおよびＣの動物を、１０日間の８ｍｌの血液アリ
コートの毎日の除去過程２回、酸素／オゾン、紫外線照射および熱でのこのアリ
コートの体外処理、ならびに５ｍｌの処理したこのアリコートをこの同じ動物へ
筋内注射により再投与することに供すことによって、本発明のプロセスに供した
。

【００６０】このような各処理は以下のように実施した。

【００６１】８ｍｌの血液アリコートを動物から抽出し、クエン酸ナトリウム（２ｍｌ）で
処理し、そして無菌の容器中に置いた。これを、上記のＭｕｅｌｌｅｒの米国特
許第４，９６９，４８３号に一般的に記載されたような装置にて、紫外線照射、
酸素／オゾンガス酸化的環境および上昇した温度ストレッサーに、同時に供した
。より詳細には、無菌の紫外線透過性容器中のこの血液サンプルを、赤外線ラン
プを使用して４２．５℃に加熱し、そしてこの温度に維持したまま、上記の好ま
しい条件下で、優勢波長２５３．７ｎｍの紫外線照射に供した。同時に、オゾン
含有量１３．５〜１５．５μｇ／ｍｌの、医療用品質の酸素とオゾンとの混合物
を、６０〜２４０ｍｌ／分（ＳＴＰ）の範囲内の流量で血液サンプルに通気した
。同時の紫外線曝露および気体混合物が供される時間は、３分であった。５ｍｌ
分の処理された血液アリコートを、試験動物各々に筋内に再注射した。

【００６２】本発明に従った処置過程を受ける群ＡおよびＣの各動物は、１０日間の処置過
程の間に３週間の休息期間を経た。群ＢおよびＤは、コントロール群であり、５
ｍｌの生理食塩水の毎日の注射の１０日間の過程を２回与えられ、この１０日間
の過程の間に３週間の休息期間を伴う。

【００６３】第二の注射過程の１日後、これらの動物に、軽いガス麻酔下で麻酔し、そして
各動物の右腎臓を、背部切開によって摘出した。左腎臓を、一時的に虚血に曝露
するために、６０分間、閉塞クリップを残りの腎臓の動脈および静脈に設置した
。次に、このクリップを除去し、正常な血流による腎臓の再灌流を可能にした。

【００６４】これらの動物を、虚血手順後６日間観察し、次いで屠殺した。各動物のこの虚
血腎臓を外科的に摘出し、２つの部分に分離した。１つの部分を、−８０℃で凍
結しておき、そしてもう一方の部分を、免疫組織病理学的研究および慣用的な組
織病理学的研究のために１０％ホルマリン中で固定した。

【００６５】ミトコンドリア膜電位を、虚血の腎臓およびコントロールの腎臓から単離され
た近位尿細管細胞において、コントロールの腎臓の摘出の時点および続く屠殺の
時点の両方で、計測した。この目的のために、Ｍａｒｓｈａｎｓｋｙら、「Ｉｓ
ｏｌａｔｉｏｎｏｆｈｅａｖｙｅｎｄｏｓｏｍｅｓｆｒｏｍｄｏｇ
ｐｒｏｘｉｍａｌｔｕｂｅｓｉｎｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ」、Ｊ．Ｍｅｍｂ
ｒ．Ｂｉｏｌ．１５３（１）、５９−７３、１９９６に記載されたコラゲナーゼ
処理手順によって、イヌの腎臓の近位管を、正常な腎皮質または虚血の腎皮質か
ら精製した。腎臓のミトコンドリアを、２５０ｍＭのショ糖、１０ｍＭのＨＥＰ
ＥＳ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、および２５０μＭのＥＤＴＡを含む緩衝液中
での組織のホモジナイゼーション後、分画遠心分離（Ｍａｒｓｈａｎｓｋｙ、「
Ｏｒｇａｎｉｃｈｙｄｒｏｐｅｒｏｘｉｄｅｓａｔｈｉｇｈｃｏｎｃｅ
ｎｔｒａｔｉｏｎｓｃａｕｓｅｅｎｅｒｇｉｚａｔｉｏｎａｎｄａｃｔ
ｉｖａｔｉｏｎｏｆＡＡＴＰｓｙｎｔｈｅｓｉｓｉｎｍｉｔｏｃｈｏ
ｎｄｒｉａ」、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４（７）、３６７０−３６７３．
１９８９を参照のこと）によって懸濁液中に単離した。細胞の破片を、１０，０
００ｇで３０分間の遠心分離によって除去した。これらのミトコンドリアを、Ｅ
ＤＴＡを含まないショ糖／ＨＥＰＥＳ緩衝液で洗浄した。

【００６６】ミトコンドリア膜電位を、Ｋｒｏｅｍｅｒ、Ｇ．、Ｚａｍｚａｍ、Ｎ．および
Ｓｕｓｉｎ、Ｓ．Ａ．、「Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌｃｏｎｔｒｏｌｏｆ
ａｐｏｐｔｏｓｉｓ」、（総説）ＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙＴｏｄａｙ（１９９
７）第１８巻、４４−５１頁に記載されたように、ＪＣ−１色素によって計測し
た（Ｓａｌｖｉｏｌｉら、「ＪＣ−１，ｂｕｔｎｏｔＤｉＯＣ６（３）ｏ
ｒｒｈｏｄａｍｉｎｅ１２３，ｉｓａｒｅｌｉａｂｌｅｆｌｕｏｒｅ
ｓｃｅｎｔｐｒｏｂｅｔｏａｓｓｅｓｓｄｅｌｔａｐｓｉｃｈａｎ
ｇｅｓｉｎｉｎｔａｃｔｃｅｌｌｓ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｆｏｒ
ｓｔｕｄｉｅｓｏｎｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ
ｉｔｙｄｕｒｉｎｇａｐｏｐｔｏｓｉｓ」、ＦＥＢＳＬｅｔｔｅｒｓ４
１１（１）、７７−８２．１９８７を参照のこと）。正常な腎臓および虚血の腎
臓から精製されたミトコンドリアの懸濁液におけるＪＣ−１蛍光を、Ｄｅｌｔａ
ｓｃａｎＭｏｄｅｌＲＦＭ−２００１分光蛍光計（ＰｈｏｔｏｎＴｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｙＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、ＳｏｕｔｈＢｒｕｎｓｗｉｃｋ
、ＮＪ）で継続的にモニターした。励起波長は４９０ｎｍ（スリット幅２ｎｍ）
であり、そして発光波長は５９０ｎｍ（スリット幅４ｎｍ）であった。このシグ
ナルを、Ｆｅｌｉｘ（登録商標）（Ｖｅｒｓｉｏｎ１．１）ソフトウェアを使用
して記録した。全ての計測を、３７℃で継続して攪拌しながら実施した。ミトコ
ンドリア膜電位の計測のためのこのインキュベーション緩衝液は、２００ｍＭの
ショ糖、５ｍＭのＭｇＣｌ_２、５ｍＭのＫＨ_２ＰＯ_４、０．１μＭのＪＣ−１お
よび３０ｍＭのＨＥＰＥＳ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）を含んだ。基質および阻
害剤の濃度は、０．１μＭのＦＣＣＰを含むかまたは含まない、１０ｍＭのサク
シネート、０．１μＭのロテノンであった。近位管のミトコンドリア膜電位を、
虚血の前に右（コントロール）腎臓において評価し、そして虚血６日目後のイヌ
の屠殺後に左（虚血）腎臓において評価し、そして添付の図４Ａに示されたよう
にＦＣＣＰとミトコンドリアとの脱共役後のＪＣ−１蛍光の差として評価した。
各計測のために、精製した物質の５０μｇのタンパク質を使用した。

【００６７】ＪＣ−１蛍光は、ミトコンドリア膜電位に比例する。反対側の腎摘出された腎
臓は、コントロールとして役立った。図４Ｂから明らかなように、本発明の処置
プロセスは、非虚血コントロール右腎臓の膜電位を改変しなかった（処理された
もの対食塩水についてｐ＝０．４４５）。しかし、食塩水を注射した動物の虚血
腎臓は、コントロール腎臓と比較して有意に低い（ｐ＜０．０５）蛍光を示した
。本発明に従ったこのストレス処置は、虚血／再灌流の間、ミトコンドリアの脱
共役を妨げ、そして膜電位は虚血腎臓とコントロール腎臓との間で有意差を示さ
なかった（ｐ＝０．２４４）。このパラメーターは、再灌流後少なくとも６日間
、本発明のプロセスに従って前処理されたイヌの虚血腎臓において、食塩水を注
射したイヌに対して、有意に高いままであった（ｐ＝０．０００６）。

【００６８】これらの結果は、本発明のプロセスが、アポトーシスに対する腎臓の保護をも
たらすことおよび／またはミトコンドリアレベルで回復を加速することを示す。
従って、本発明のプロセスは、通常はアポトーシスを加速する、その後の遭遇因
子に対して、哺乳動物の体の細胞、組織および器官を予め条件付けするために、
示される。

【００６９】詳細には、ミトコンドリア膜電位の保存は、ミトコンドリアを保護し、そして
それによってアポトーシスに対して細胞を予め条件付けするこの治療法の能力を
証明する。

【００７０】（実施例５）１２匹のオスＳＨＲラットの群を、上記の実施例４に記載されたようにストレ
スを与えられてプールされた血液の注射によってか、またはコントロール動物に
おいては食塩水の注射によってかのいずれかで処置した。この遺伝系統の動物全
てからの血液は同一であることから、この同じ系統の１動物からの血液を、本発
明のプロセスによって、試験動物への投与のために処理した。この血液を、抗凝
固剤としてのクエン酸ナトリウムで処理し、そして無菌の容器中に置いた。これ
らは、１１日間の休息期間および虚血手術前日の第三の注射の前に、−１４日目
および−１３日目に１５０μｌのストレスを与えられた血液の注射、または食塩
水と並行した注射のいずれかを受けた。手術当日に、ラットを、軽いフルラン（
ｆｌｕｒａｎｅ）で麻酔し、そして右腎臓を中腹部の切開によって摘出した。続
いて左腎臓を、マイクロクリップを使用した左腎の動脈および静脈の閉塞による
一時的虚血に供した。続いてこの皮膚を、一時的に閉じた。６０分間の閉塞後、
このクリップを除去し、そして傷を縫合によって閉じた。これらの動物を、再灌
流後１２時間で屠殺した。

【００７１】これらの試験動物の虚血腎臓および非虚血腎臓を、摘出しそしてＤＮＡラダー
試験に供した。１８０〜２００塩基対へのオリゴヌクレオソームＤＮＡフラグメ
ント化は、アポトーシスを経た種々の器官においてアガロースゲル電気泳動後に
ラダーとして現れる、特異的なパターンである。腎皮質におけるＤＮＡフラグメ
ント化の程度を評価するために、破砕した腎皮質のアリコートを計量し、そして
総組織ＤＮＡを、ＥＤＴＡ存在下でのプロテイナーゼＫおよびＲｎａｓｅＡによ
る組織消化の後、フェノール−クロロホルム手順によって抽出した。１μｇの抽
出されたＤＮＡを、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを使
用した酵素アッセイによってＰ^３２−ｄＣＴＰで標識した（Ｔｅｉｇｅｒら、「
Ａｐｏｐｔｏｓｉｓｉｎｐｒｅｓｓｕｒｅｏｖｅｒｌｏａｄ−ｉｎｄｕｃ
ｅｄｈｅａｒｔｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｙｉｎｔｈｅｒａｔ」、Ｊ．Ｃ
ｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９７、２８９１−２８９７、１９９６を参照のこと）。
放射性標識されたＤＮＡの漸増量を、１．５％のアガロースゲルにロードした。
電気泳動後、ＤＮＡを、ナイロン膜（Ｈｙｂｏｎｄ）に転写し、そして、１５０
〜１５００塩基対のＤＮＡフラグメントに結合した放射能を、蛍光画像装置（Ｐ
ｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒ）（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｙｎａｍｉｃｓ）によ
って定量した。各サンプルについての回帰直線を、ゲルにロードされたＤＮＡの
関数として放射能について描いた（ｄｅＢｌｏｉｓら、「Ｓｍｏｏｔｈｍｕｓ
ｃｌｅｃｅｌｌａｐｏｐｔｏｓｉｓｄｕｒｉｎｇｖａｓｃｕｌａｒｒ
ｅｇｒｅｓｓｉｏｎｉｎｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓｌｙｈｙｐｅｒｔｅｎｓ
ｉｖｅｒａｔｓ．」Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ２９、３４０−３４９、１９
９７を参照のこと）。この回帰直線の傾きは、ＤＮＡフラグメント化指数（ＤＮ
Ａ１μｇ当たりのｃｐｍ／ピクセル）として役立った。

【００７２】虚血−再灌流（Ｉ／Ｒ）腎臓からの結果および正常な非Ｉ／Ｒ腎臓からの結果
（全てストレスを与えられた血液の注射を受けなかった動物からの結果）を、図
５にグラフで示す種々のサンプルについての再灌流の開始後の時間に対する回帰
直線の傾き（縦軸）のプロット。ＤＮＡフラグメント化を示すこのＤＮＡラダー
化は、反対側の非虚血器官と比較して虚血腎皮質において明らかに増大し、そし
て１２時間で達した最大値は、４８時間までに基底値近くに戻った。従って、１
２時間を、ストレスを与えた本発明の血液の、早期の虚血誘導性腎アポトーシス
に対する効果の研究のための時点として選択した。

【００７３】添付の図面の図６Ａは、１５０〜１５００塩基対の範囲の、記載されたように
放射性標識してＤＮＡフラグメントに放射能標識を付着させた、フラグメント化
ＤＮＡの電気泳動ゲルの写真である。微量のＳは、腎臓の虚血−再灌流の前に食
塩水の注射を受けた動物からの腎臓のＤＮＡに由来し、そして微量のＶは、腎臓
の虚血−再灌流の前にストレスを与えた血液の注射を受けた動物の腎臓のＤＮＡ
に由来する。この図は、６０分の腎虚血が、１２時間でフラグメント化ＤＮＡの
明らかな蓄積をどちらの群のラットにおいても誘導したが、このパラメーターの
レベルは、処理された血液を受けた動物において有意に低い（ｐ＜０．０５）こ
とを示す。図６Ｂは、任意の単位でサンプルからの照射の量を定量し、そしてＤ
ＮＡフラグメント化−ラダー化がＳおよびＶの両方のサンプルにおいて虚血／再
灌流の結果として生じるが、その程度はＳサンプルと比較してＶサンプルにおい
て顕著に減少することを示す。図６Ｂに表示された結果は、各場合において６動
物の平均である。

【００７４】これらの結果は、本発明に従ってストレスを与えた血液の投与の、腎臓再灌流
損傷に対する細胞保護効果が、早期または後期のアポトーシスの阻害に関連する
ことを確認する。

【００７５】ＤＮＡラダー化およびＴｄｔで染色されたアポトーシス核の密度によって決定
したときのアポトーシスの早期（１２時間後）の間の、腎臓での虚血／再灌流後
のアポトーシスの減少における本発明の処置の能力を、図７および図８にそれぞ
れ示す。同様に、図８Ｂは、虚血／再灌流後の腎臓における細胞数がまた、本発
明に従って処置された動物において有意に高かったことを示す。

【００７６】（実施例６）この実施例は、進行した慢性うっ血性心不全を罹患している少数のヒト患者の
処置を記載する。これらの患者は、ＮＹＨＡ分類ＩＩＩ−ＩＶ慢性うっ血性心不
全を罹患し、左心室駆出率（ＬＶＥＦ）が４０％未満であり、そして６分間の歩
行距離は３００ｍ未満である。これらの患者の幾人かは、他のＣＨＦ処置を以前
に受けた。

【００７７】（プロトコール：）患者は、処理された血液の多数の注射を受ける。この処置スケジュールは、１
日目、２日目および１４日目の注射、続く５ヶ月間の３０日毎の１回の注射を含
み、各注射は１０ｍｌの体積を有する。各個体の処置は、以下の工程を包含する
：１．注射用３〜４％のクエン酸ナトリウムＵＳＰ２ｍｌ中への患者自身の静脈
血の１０ｍｌの収集。このクエン酸ナトリウムは、処理の間に血液が凝固するの
を防ぐためにサンプルに添加される。

【００７８】２．クエン酸処理した血液サンプルの、無菌の使い捨て低密度ポリエチレン容
器への移動。

【００７９】３．以下に対する同時曝露による血液サンプルのエキソビボ処理： −４２．５℃±１．０℃の上昇した温度、 −２４０±２４ｍｌ／分の流速で（ＳＴＰで）血液サンプルに通気する、１４
．５±１．０μｇ／ｍＬのオゾンを含む医療グレードの酸素の気体混合物；およ
び −波長２５３．７ｎｍの紫外光。

【００８０】４．無菌使い捨て容器から無菌シリンジへの血液サンプルの移動。

【００８１】５．注射部位での局所麻酔（１ｍｌの２％ノボカイン（Ｎｏｖｏｃａｉｎ）ま
たは同等物）に続く、同じ患者の臀筋への処理された血液サンプルの２ｍｌまた
は１０ｍｌの筋内注射。

【００８２】上記の工程（３）に記載されたこの血液サンプルのエキソビボ処置を、Ｍｕｅ
ｌｌｅｒらに対する米国特許第４，９６８，４８３号に一般的に記載された装置
で実行する。この血液サンプルを、３分間にわたり３つ全てのストレッサーに同
時に曝露する。

【００８３】（ＣＨＦの評価：）患者を、各訪問の間、有害な事象についてモニターする。同様に、処置後の追
跡を、生存、入院、および重大な有害な事象をモニターするために実施する。

【００８４】この処置の有効性を評価するために使用された一次的終点は、６分間の歩行距
離および／またはＮＹＨＡ機能分類における変化である。二次的終点としては、
以下が挙げられる：心機能の改善、利尿要求の減少；入院滞在の減少；および症
状の改善。

【００８５】上記のデータによって実証されるように、本発明の処置が、ヒトにおいて、お
よび動物モデル系（全てがＴｈ１／ＴＮＦ−α依存性炎症応答を含む）の多くに
おいて重大な生物学的活性を有することが示されている。上記のように、この処
置が、例えば、ＩＬ−１０を含む抗炎症性ＴＨ２型サイトカインの増大によって
、炎症促進性のＴｈ１型免疫応答をダウンレギュレートすると考えられる。これ
は、ＣＨＦを特徴付ける３つの領域の各々における治療上の利点を生じる本発明
の処置の能力を、少なくとも部分的に説明する。

【００８６】さらに、本発明の処置がＩＬ−１０依存的であり（図９およびＳｈａｈｉｄ
Ｓ．ら、ＪｏｕｒｎａｌｏｆＩｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅＤｅｒｍａｔｏ
ｌｏｇｙ、１４、第４号、２０００）、ＩＬ−１０のような抗炎症性サイトカイ
ンのアップレギュレーション、およびＴＨ−１駆動免疫応答のダウンレギュレー
ションをもたらすことを示唆する証拠が存在する。ＣＨＦにおけるＴＮＦ−αに
関して、ＩＬ−１０のレベルにおける減少が存在するようであるため、ＩＬ−１
０が、ＣＨＦにおけるサイトカインネットワークの重要な構成要素であり得るこ
ともまた提案される（Ｙａｍａｏｋａら、ＪｐｎＣｉｒｃＪ６３：９５１
−９５６）。

【００８７】本発明は、特定の好ましい実施形態を参照して記載されているが、本発明の意
図または範囲から逸脱せずに、本発明に対して多くの改変がなされ得ることが認
められる。このような改変の全てが、特許請求の範囲の範囲内に含まれることが
意図される。

【図面の簡単な説明】

本発明は、ここで以下の添付する図面を参照して、例示の目的でのみ、記載さ
れる：

【図１】添付する図面の図１および図２は、以下に記載された実施例２から得られた結
果のグラフ表示である；

【図２】添付する図面の図１および図２は、以下に記載された実施例２から得られた結
果のグラフ表示である；

【図３】添付する図面の図３は、以下に記載された実施例３から得られた結果のグラフ
表示である；

【図４】添付する図面の図４は、以下に記載された実施例４から得られた結果のグラフ
表示である；

【図５】添付する図面の図５から図８は、以下に記載された実施例５から得られた結果
のグラフ表示である；

【図６】添付する図面の図５から図８は、以下に記載された実施例５から得られた結果
のグラフ表示である；

【図７】添付する図面の図５から図８は、以下に記載された実施例５から得られた結果
のグラフ表示である；

【図８】添付する図面の図５から図８は、以下に記載された実施例５から得られた結果
のグラフ表示である；そして

【図９】添付する図面の図９は、接触過敏性Ｔｈ−１媒介炎症における本発明の処置の
効果のグラフ表示である

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 31/7076 Ａ６１Ｋ 31/7076 35/78 35/78 Ｃ 45/00 45/00 Ａ６１Ｐ 9/04 Ａ６１Ｐ 9/04 43/00 １２１ 43/00 １２１ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷＦターム(参考） 4C084 AA19 MA02 NA05 NA06 NA14 ZA361 ZA832 ZC022 ZC032 ZC432 ZC502 ZC752 4C086 AA01 AA02 BC16 BC17 CB07 DA10 EA18 GA07 GA08 MA01 MA02 MA04 MA07 NA05 NA06 NA14 ZA36 ZA83 ZC02 ZC03 ZC43 ZC50 ZC75 4C087 AA01 AA02 BB34 DA05 MA01 MA02 NA05 NA06 NA14 ZA36 ZA83 ZC02 ZC03 ZC43 ZC50 ZC75 4C088 AB37 MA01 NA05 NA06 NA14 ZA36 ZA83 ZC02 ZC03 ZC43 ZC50 ZC75

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】うっ血性心不全（ＣＨＦ）に罹患しているヒト患者において
ＣＨＦを処置するための医薬品の調製における、該患者の改変された血液アリコ
ートの使用であって、該改変されたアリコートは、紫外光および酸化的環境を含
むストレッサーで該患者の血液のアリコートをエキソビボで処理する工程によっ
て調製される、使用。
【請求項２】前記血液アリコートの処理に使用される前記酸化的環境が、
該アリコートに対する酸化剤の適用を包含する、請求項１に記載の使用。
【請求項３】前記酸化剤が、オゾンガスを含み、そして該オゾンガスが、
過剰なレベルの細胞損傷を生じない量で前記血液アリコートに導入される、請求
項２に記載の使用。
【請求項４】前記酸化剤が、オゾンガスおよび医療用グレードの酸素の混
合物を含み、前記オゾンガスが、３００μｇ／ｍｌまでの濃度で該混合物中に含
まれる、請求項２または請求項３に記載の使用。
【請求項５】前記オゾンガスが、３０μｇ／ｍｌまでの濃度で前記混合物
中に含まれる、請求項４に記載の使用。
【請求項６】前記オゾンガスが、１３．５μｇ／ｍｌ〜１５．５μｇ／ｍ
ｌの濃度で前記混合物中に含まれる、請求項５に記載の使用。
【請求項７】前記混合物が、０．３３リットル／分までの流速で、前記ア
リコートに適用される、請求項４、請求項５または請求項６に記載の使用。
【請求項８】前記混合物が、０．２１リットル／分〜０．２７リットル／
分の流速で、前記アリコートに適用される、請求項７に記載の使用。
【請求項９】前記血液アリコートの処理に使用される前記紫外光が、１以
上のＵＶ−Ｃ帯の波長を有する紫外光を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記
載の使用。
【請求項１０】前記血液アリコートの処理の間に該アリコートが冷却され
るかまたは加熱される温度が、該アリコートの少なくとも一部が−５℃〜５５℃
の範囲にあるような温度である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１１】前記処理工程中の前記アリコートにおける前記血液の平均
温度が、３７℃〜５５℃の範囲にある、請求項に記載１〜１０のいずれか１項に
記載の使用。
【請求項１２】前記処理工程中の前記アリコートにおける前記血液の平均
温度が、０℃〜３６．５℃の範囲にある、請求項１〜１１のいずれか１項に記載
の使用。
【請求項１３】前記アリコートにおける前記血液の平均温度が、１０℃〜
３０℃の範囲にある、請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】前記温度が、４２．５±１℃である、請求項１１に記載の
使用。
【請求項１５】前記アリコートの体積が、０．１ｍｌ〜４００ｍｌである
、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１６】前記アリコートの体積が、０．１ｍｌ〜１００ｍｌまでで
ある、請求項１５に記載の使用。
【請求項１７】前記アリコートの体積が、５ｍｌ〜１５ｍｌである、請求
項１５に記載の使用。
【請求項１８】前記アリコートが、６０分までの期間にわたって前記スト
レッサーで処理される、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１９】前記アリコートが、２分〜５分の期間にわたって前記スト
レッサーで処理される、請求項１８に記載の使用。
【請求項２０】前記アリコートが、紫外光および酸化的環境によって同時
に処理される、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２１】うっ血性心不全（ＣＨＦ）に罹患しているヒト患者におい
てうっ血性心不全（ＣＨＦ）を処置するための医薬品の調製における、該患者自
身の血液のアリコートと薬学的薬剤との組み合わせの使用であって、該血液のア
リコートは、酸化的環境、熱ストレスおよび電磁気的照射から選択される１以上
のストレッサーで、エキソビボで処理されており、該薬学的薬剤は、硝酸塩、β
−遮断剤、ＡＣＥ阻害剤、ＡＴレセプター遮断剤、アルドステロンアンタゴニス
ト、カルシウムチャネル遮断剤、ＴＮＦ遮断剤、ＴＮＦ−α生成のサプレッサー
、ナトリウムおよび水分制限、利尿剤ならびにジギタリスからなる群より選択さ
れる、使用。
【請求項２２】前記薬学的薬剤が、ペントキシフィリン、ＴＡＣＥ阻害剤
、アムリノン、アデノシン、サリドマイドおよびデキサメタゾンからなる群より
選択されるＴＮＦ−αのサプレッサーである、請求項２１に記載の使用。
【請求項２３】前記ストレッサーが、酸化的環境および紫外光を含み、前
記血液アリコートにエキソビボで同時に適用される、請求項２１または請求項２
２に記載の使用。
【請求項２４】前記酸化的環境が、前記血液アリコートに通気される医療
用グレードの酸素およびオゾンの混合物を含み、そして前記紫外光が、１以上の
ＵＶ−Ｃ帯の波長を有する紫外光を含み、該アリコートにおける該血液が、３７
℃〜５５℃の範囲の平均温度を有しながら、該血液アリコートにエキソビボで同
時に適用される、請求項２３に記載の使用。