ES2232632T3 - Tratamiento de la insuficiencia cardiaca congestiva con sangre autologa pre-tratada. - Google Patents

Abstract

Utilización de una porción de sangre modificada de un paciente, que ha sido preparada tratando la porción de sangre ex vivo con factores estresantes como la luz ultravioleta y un entorno oxidativo, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la insuficiencia cardiaca congestiva (CHF) en un paciente humano que la padece.

Description

Tratamiento de la insuficiencia cardiaca congestiva con sangre autóloga pre-tratada.

Antecedentes de la invención 1. Ambito de la invención

La invención se refiere a utilizaciones de sangre modificada según las reivindicaciones adjuntas.

2. Descripción del estado de la técnica

La insuficiencia cardiaca congestiva (CHF) es un trastorno relativamente común que afecta aproximadamente a 5 millones de americanos, con una tasa de mortalidad de más de 80.000 personas por año. Se cree que la CHF no es un proceso patológico claro de por sí, sino que representa más bien el efecto de múltiples anomalías anatómicas, funcionales y biológicas, que interactúan entre sí para producir, en última instancia, la pérdida progresiva de la aptitud del corazón para cumplir su función como bomba circulatoria.

La CHF puede ser causada por la manifestación de un suceso inicial, como un infarto de miocardio (ataque al corazón) o puede ser secundaria a otras causas, tales como la hipertensión o malformaciones cardiacas como la valvulopatía. El suceso inicial u otras causas tienen como resultado un declive inicial de la capacidad de bombeo del corazón, al dañar por ejemplo el músculo cardiaco. Este declive en la capacidad de bombeo puede no ser observado de inmediato debido a la activación de uno o más mecanismos compensatorios. No obstante, se ha comprobado que la progresión de la CHF es independiente del estado hemodinámico del paciente. Por consiguiente, los cambios nocivos causados por la enfermedad están presentes y siguen su curso aunque el paciente no presente síntomas. De hecho, los mecanismos compensatorios que mantienen una función cardiovascular normal durante las fases iniciales de la CHF pueden contribuir realmente a la progresión de la enfermedad, al ejercer, por ejemplo, efectos nocivos en el corazón y la circulación.

Algunos de los cambios pato-fisiológicos más importantes que aparecen en la CHF son la activación del eje hipotálamo-hipófiso-suprarrenal, la disfunción endotelial sistémica y la reestructuración miocárdica.

Entre las terapias específicamente dirigidas a contrarrestar la activación del eje hipotálamo-hipófiso-suprarrenal, se encuentran los agentes anti-adrenérgicos beta (bloqueantes \beta), los inhibidores de la enzima de conversión de la angiotensina (ACE), ciertos bloqueantes del canal del calcio, nitratos y bloqueantes de endotelina-1. Los bloqueantes de conducto del calcio y los nitratos, si bien producen mejora clínica, todavía no se ha visto claramente que prolonguen la supervivencia, mientras que los bloqueantes \beta y los inhibidores ACE, según se ha comprobado, prologan de forma notable la vida, al igual que los antihistamínicos. Los estudios experimentales en los que se ha utilizado bloqueantes de endotelina-1 presentan un efecto beneficioso.

La disfunción endotelial sistémica es una característica bien reconocida de la CHF y se encuentra claramente presente en el momento en que aparecen signos de disfunción ventricular izquierda. La disfunción endotelial es importante, teniendo en cuenta la estrecha relación de la microcirculación miocardial con los miocitos cardiacos. La evidencia sugiere que la disfunción microvascular contribuye notablemente a la disfunción miocítica y los cambios morfológicos que conducen a la insuficiencia miocárdica progresiva.

En términos de pato-fisiología subyacente, la evidencia sugiere que la disfunción endotelial puede ser causada por una carencia relativa de NO, que se puede atribuir a un aumento de la formación de O_{2} vascular por una oxidasa NADH-dependiente y la subsiguiente depuración excesiva de NO. Entre los factores potenciales que contribuyen a un aumento de la producción de O_{2}, se encuentran los siguientes: incremento del tono del nervio simpático, norepinefrina, angiotensina II, endotelina-1 y TNF-\alpha. Además los niveles de IL-10, una citoquina anti-inflamatoria clave, son inadecuadamente bajos en relación con los niveles de TNF-\alpha. Se tiene ahora el convencimiento de que unos niveles elevados de TNF-\alpha, con citoquinas pro-inflamatorias asociadas, que incluyen IL-6 y receptores solubles de TNF-\alpha, desempeñan un papel importante en la evolución de la CHF, al ser el causante de una menor contractilidad miocárdica, una dilatación biventricular, e hipotensión y están probablemente involucrados en la activación y en la disfunción endotelial. También se cree que la TNF-\alpha puede desempeñar un papel en la atrofia muscular, no explicada hasta la fecha, que se produce en los pacientes graves de CHF. Los estudios preliminares en pequeños números de pacientes con terapia de TNF-\alpha receptor soluble indican mejoras en la clasificación funcional de NYHA y en el bienestar del paciente, medido por los índices de la calidad de vida.

La reestructuración miocárdica es un proceso complejo que acompaña la transición de la insuficiencia cardiaca asintomática a la sintomática y puede describirse como una serie de cambios adaptativos dentro del miocardio. Los componentes principales de la reestructuración miocárdica son alteraciones en la biología miocítica, la pérdida de miocitos por necrosis o apoptosis, alteraciones en la matriz extracelular y alteraciones en la geometría de la cámara ventricular izquierda. No está claro si la reestructuración miocárdica es simplemente la respuesta del órgano terminal que se produce tras años de exposición a los efectos tóxicos de la estimulación neuro-hormonal a largo plazo o si la reestructuración miocárdica contribuye de forma independiente a la progresión de la insuficiencia cardiaca. Los hechos sugieren, hasta la fecha, que una terapia adecuada puede ralentizar o detener la progresión de la reestructuración miocárdica.

Aunque los tratamientos utilizados en la actualidad pueden aliviar los síntomas de la CHF y corregir ciertas anomalías patofiológicas causadas por el proceso patológico, la CHF sigue siendo una enfermedad progresiva implacable, con una tasa de mortalidad relativamente elevada. De hecho, las disminuciones relativas de morbidez y mortalidad obtenidas gracias a los fármacos existentes son del orden de 10 a 25% aproximadamente. Por consiguiente, existe la necesidad de tratamientos aditivos o superiores para la CHF, especialmente aquellos que puedan modificar notablemente la enfermedad subyacente.

Resumen de la invención

La presente invención supera por lo menos algunas de las desventajas antes citadas y algunas otras de las terapias actualmente conocidas de la CHF al ofrecer la utilización de una porción de sangre de mamífero tratada ex vivo para la preparación de un medicamento para el tratamiento de la CHF.

La porción de sangre se trata sometiéndola a uno o varios factores estresantes que, según se ha comprobado, modifican la sangre. Según la presente invención, la porción de sangre se puede modificar sometiendo la sangre o fracciones celulares o no celulares separadas de la sangre, o mezclas de fracciones no-celulares y/o células separadas de la sangre, a factores estresantes elegidos entre: factores estresantes de temperatura, emisiones electromagnéticas y entornos oxidativos, o cualquier combinación de dichos factores estresantes, de forma simultánea o secuencial.

Según se indica más arriba, los cambios pato-fisiológicos asociados con la CHF influyen en la activación inmunitaria, la disfunción endotelial y la pérdida de miocitos por necrosis y/o apoptosis. La utilización de la presente invención produce beneficios terapéuticos en cada una de estas tres áreas, según se ha podido comprobar.

Con respecto la activación inmunitaria, la utilización de la presente invención, según se ha comprobado, modula los niveles de citoquinas inflamatorias en diversos modelos inflamatorios experimentales dependientes de Th1/TNF-\alpha en diferentes especies. Por ejemplo, se ha visto que reduce la hipersensibilidad al contacto alérgico en ratones Balb/c, una reacción inmunitaria por Th1 mediada por TNF-\alpha (Shivji et al., Journal of Cutaneous Medicine and Surgery 4:132-137, 2000); reduce la expresión de IL-6 mARN en la artritis inducida por adyuvante en el modelo de rata Lewis de patología inflamatoria; y reduce la proporción de células Th1 a Th2 en pacientes con escleroderma, una enfermedad autoinmunitaria por Th1 (Rabinovich et al., Poster presentado en el XII Congreso Panamericano de Reumatología, Montreal, Canadá, 21-25 de junio de 1998). Se cree que la utilización reduce la respuesta inmunitaria pro-inflamatoria de tipo Th1, por ejemplo aumentando las citoquinas de tipo TH2 anti-inflamatorias, inclusive IL-10.

Se ha visto que la utilización de la invención mejora la función endotelial, en un número de estudios realizados en seres humanos y en animales. Por ejemplo, se ha comprobado que la utilización mejora la función vasodilatadora endotelial - dependiente en un estudio abierto sobre pacientes con enfermedad grave de Raynaud primaria (Cooke et al., International Journal of Angiology 16: 250-254, 1997), mejora la tasa de recuperación del flujo sanguíneo cutáneo tras la oclusión temporal, en unos estudios a doble ciego, controlados con placebo en pacientes con patología vascular periférica avanzada secundaria a la aterosclerosis (Courtman et al., Circulation Vol 102, nº. 18, suppl II, 2000), reduce la progresión de la aterosclerosis en el ratón alimentado con colesterol deficiente en receptor LDL (Babaei et al., Journal of the American College of Cardiology 35 (Suppl. A): 243. 1999), y mejora notablemente la función vasodilatadora dependiente del endotelio para la acetilcolina en conejos Wanatabe con hiper-colesterolemia y grave aterosclerosis según muestra un aumento de la respuesta vasodilatoria al agonista de óxido nítrico (acetilcolina) ( Courtman et al., más arriba). Se cree que la mejora de la función endotelial se debe a un efecto anti-inflamatorio y a una mayor disponibilidad de NO, que puede resultar de una mejora en la capacidad vasodilatora que, según se sabe, está gravemente deteriorada en pacientes de CHF.

Con respecto a la pérdida de miocitos, se cree que la utilización de la invención reduce los niveles de apoptosis y necrosis. Se ha visto que el tratamiento puede proteger el riñón de daños de isquemia/reperfusión (I/R), asociados según se sabe con un aumento de la muerte celular por apoptosis (Tremblay et al., Pathophysiology 5: 26;Chen et al., Médecine Sciences 15 (Suppl.1): 16), y puede reducir la apoptosis en el riñón tras I/R según se determina por laddering del ADN y la densidad de núcleos apoptóticos teñidos por Tdt.

Como la utilización de la invención produce beneficios terapéuticos en tres áreas en las que se producen cambios pato-fisiológicos en la CHF, es decir la disfunción endotelial, la producción de citoquinas inflamatorias y la pérdida de miocitos por apoptosis, se proporciona una fuerte base teórica desde la que se puede predecir que la utilización de la invención será beneficiosa para pacientes con CHF. La utilización de la invención se puede utilizar como terapia de CHF, por sí sola o en combinación con otras terapias, tales como terapia de nitrato, bloqueantes \beta, inhibidores ACE, bloqueantes receptor AT, antagonistas de aldosterona, bloqueantes de conducto de calcio, bloqueantes de TNF, supresores de producción de TNF-\alpha y/u otras medidas de tratamiento rutinario, como la restricción de sodio y fluido, diuréticos, digitales, etc. como fármacos específicos conocidos, que suprimen la producción de TNF-\alpha. Se conocen la pentoxifilina, la amrinona, la adenosina, la talidomida, los inhibidores de la enzima de conversión TNF (TACE) y la dexametasona. Como bloqueantes específicos de TNF, se conocen los anticuerpos monoclonales y etanercept.

Por consiguiente, la presente invención presenta utilizaciones según las reivindicaciones adjuntas.

Breve descripción de las figuras

Se describe ahora la invención, a modo de ejemplo solamente, con referencia a las figuras adjuntas, en las cuales:

Las figuras 1 y 2 adjuntas son presentaciones gráficas de los resultados obtenidos en el ejemplo 2, descrito a continuación;

La figura 3 adjunta es una presentación gráfica de los resultados obtenidos en el ejemplo 3 descrito a continuación;

La figura 4 adjunta es una presentación gráfica de los resultados obtenidos en el ejemplo 4 descrito a continuación;

Las figuras 5 a 8 adjuntas son presentaciones gráficas de los resultados obtenidos en el ejemplo 5 descrito a continuación; y

La figura 9 adjunta es una presentación gráfica de los efectos del tratamiento de la invención en la inflamación mediada por Th1 de la hipersensibilidad de contacto.

Descripción detallada de realizaciones preferidas

Según un proceso preferido de la presente invención, se extrae una porción de sangre de un mamífero, de preferencia un humano, y se trata ex vivo la porción de sangre con ciertos factores estresantes, según se describe con más detalle a continuación. Los términos "porción", "porción de sangre" o términos similares, utilizados aquí, se refieren a sangre completa, fracciones celulares separadas de la sangre, inclusive plaquetas, fracciones no celulares separadas de la sangre, inclusive plasma y combinaciones de lo anterior. El efecto de los factores estresantes consiste en modificar la sangre y/o las fracciones celulares o no celulares de la misma, contenidas en la porción. La porción modificada se vuelve a introducir entonces en el cuerpo del sujeto por cualquier vía adecuada para la vacunación, de preferencia inyección intra-arterial, inyección intramuscular, inyección intravenosa, inyección subcutánea, inyección intra-peritoneal y administración oral, nasal o rectal.

Los factores estresantes, a los que se somete ex vivo la porción de sangre según el método de la presente invención, se eligen entre el factor estresante de temperatura (temperatura de la sangre por encima y por debajo de la temperatura del cuerpo), un entorno oxidativo y una emisión electromagnética, individualmente o en cualquier conexión, de forma simultánea o secuencial. En los seres humanos, convenientemente la porción tiene un volumen suficiente para que, al ser reintroducido en el cuerpo del sujeto, se logre en el mismo un alivio, por lo menos parcial, de la CHF. De preferencia, el volumen de la porción es de hasta 400 ml aproximadamente, de preferencia de 0,1 a 100 ml, todavía mejor de 5 a 15 ml aproximadamente, y todavía mucho mejor de 8 a 12 ml aproximadamente y de forma óptima de 10 ml aproximadamente, junto con un anticoagulante, por ejemplo 2 ml de citrato sódico.

Se prefiere aplicar, según la invención, los tres factores estresantes antes citados, de forma simultánea, a la porción bajo tratamiento, con el objeto de conseguir la modificación adecuada de la sangre. También puede ser preferible, en algunas realizaciones de la invención, aplicar dos cualesquiera de los factores estresantes anteriores, por ejemplo aplicar el factor estresante de temperatura y el oxidativo, el factor estresante de temperatura y una emisión electromagnética, o una emisión electromagnética y el factor estresante oxidativo. Hay que procurar utilizar un nivel adecuado de los factores estresantes, con el objeto de modificar de forma eficaz la sangre para aliviar la CHF en el sujeto.

El factor estresante de temperatura calienta la porción que se está tratando hasta una temperatura por encima de la normal del cuerpo o enfría la porción por debajo de la temperatura normal del cuerpo. La temperatura se elige de forma que el factor estresante de temperatura no cause una hemólisis excesiva en la sangre contenida en la porción y de modo que, una vez tratada la porción, se inyecte en el sujeto, consiguiéndose aliviar la CHF. De preferencia, el factor estresante de temperatura se aplica de modo que la temperatura de la totalidad o de parte de la porción sea de hasta 55ºC aproximadamente, y todavía mejor esté comprendida entre -5ºC y 55ºC aproximadamente.

En algunas realizaciones preferidas de la invención, la temperatura de la porción se hace subir por encima de la temperatura normal del cuerpo, de modo que la temperatura media de la porción no exceda de una temperatura de aproximadamente 55ºC, de preferencia de 40ºC a 50ºC aproximadamente, todavía mejor de 40ºC a 44ºC aproximadamente, y de forma óptima en torno a 42,5 \pm 1ºC.

En otras realizaciones preferidas, la porción se enfría por debajo de la temperatura normal del cuerpo, de tal modo que la temperatura media de la porción esté comprendida entre -5ºC y 36,5ºC aproximadamente, de preferencia entre 10ºC y 30ºC aproximadamente y todavía mejor entre 15ºC y 25ºC aproximadamente.

El factor estresante de entorno oxidativo puede ser la aplicación a la porción de agentes oxidantes sólidos, líquidos o gaseosos. De preferencia, supone exponer la porción a una mezcla de gas ozono y oxígeno de calidad médica, de preferencia, introduciendo por borboteo a través de la porción, dentro de las temperaturas antes citadas, una corriente de gas oxígeno de calidad médica con ozono como componente menor. El contenido de ozono de la corriente de gas y el caudal de dicha corriente se eligen de preferencia de forma que la cantidad de ozono introducida en la porción de sangre, ya sea por sí solo o en combinación con otros factores estresantes, no produzca unos niveles excesivos de daños celulares, que harían ineficaz la terapia. La corriente de gas tiene convenientemente un contenido de ozono de hasta aproximadamente 300 \mug/ml, de preferencia hasta aproximadamente 100 \mug/ml, todavía mejor en torno a 30 \mug/ml, todavía mejor hasta 20 \mug/ml aproximadamente, particularmente de preferencia en torno a 10 \mug/ml hasta 20 \mug/ml aproximadamente, y de forma óptima en torno a 14,5 \pm 1,0 \mug/ml. La corriente de gas se suministra convenientemente a la porción a una velocidad de hasta 2,0 litros/minutos aproximadamente de preferencia hasta 0,5 litros/minuto aproximadamente, todavía mejor hasta 0,4 litros/minutos aproximadamente, de preferencia hasta 0,33 litros/minuto aproximadamente y de forma óptima en torno a 0,24 \pm 0,024 litros/minuto, a STP. El límite inferior del caudal de la corriente de gas es de preferencia no inferior a 0,01 litros/minuto, de preferencia no inferior a 0,1 litros/minuto y todavía mejor no inferior a 0,2 litros/minuto.

El factor estresante de emisión electromagnética se aplica convenientemente radiando la porción bajo tratamiento desde una fuente de emisión electromagnética, mientras se mantiene la porción a la temperatura antes citada y se hace pasar por burbujeo, a través de la porción, la mezcla gaseosa de oxígeno/ozono. Las emisiones electromagnéticas preferidas se eligen entre: radiación fotónica, de preferencia luz UV, visible e infrarroja y todavía mejor luz UV. Las fuentes de UV preferidas son las lámparas UV, que emiten principalmente en longitudes de onda de banda UV-C, es decir longitudes de onda inferiores a 280 nm aproximadamente. Estas lámparas pueden emitir también cantidades de luz visible e infrarroja. También se puede utilizar luz ultravioleta correspondiente a fuentes standard UV-A (longitudes de onda de 315 a 400 nm aproximadamente) y UV-B (longitudes de onda de 280 a 315 aproximadamente). Por ejemplo, una dosificación adecuada de dicha luz UV, aplicada simultáneamente con los factores estresantes de entorno oxidativo y temperatura antes citados, se puede obtener con hasta 8 lámparas dispuestas para rodear el contenedor en el que está la porción, con una intensidad tal que proporcione una energía lumínica total UV en la superficie de la sangre de aproximadamente 0,025 a 10 julios/cm^{2}, de preferencia 0,1 a 3,0 julios/cm^{2}, aproximadamente. De preferencia, se utilizan cuatro de estas lámparas.

El tiempo durante el cual se somete la porción a los factores estresantes es, por lo general, de hasta 60 minutos aproximadamente. El tiempo depende, en cierta medida, de la intensidad de la emisión electromagnética elegida, la temperatura, la concentración del agente oxidante y la velocidad a la que se suministra a la porción. Puede ser necesario por parte del operador realizar algún experimento para establecer los tiempos óptimos, una vez que se han establecido los demás niveles de los factores estresantes. Los tiempos preferidos, en condiciones de factores más estresantes serán de aproximadamente 2 a 5 minutos, todavía mejor de 3 a 3 1/2 minutos aproximadamente. La temperatura inicial de la sangre y la velocidad a la que se puede calentar o enfriar hasta alcanzar una temperatura predeterminada tiende a variar de un sujeto a otro. Un tratamiento de este tipo proporciona una porción de sangre modificada lista para inyectar al sujeto.

En la práctica del proceso preferido de la presente invención, la porción de sangre se puede tratar con los factores estresantes, utilizando un aparato del tipo descrito en la patente US nº. 4.968.483 de Mueller. La porción se coloca en un contenedor adecuado, esteril, que transmite luz UV, que se instala dentro de la máquina. Las lámparas UV se conectan durante un período fijo antes de aplicar el flujo de gas a la porción que aporta el factor estresante oxidativo para permitir que la salida de las lámparas UV se estabilice. Las lámparas UV suelen estar encendidas mientras se ajusta la temperatura de la porción hasta el valor predeterminado, por ejemplo 42,5 \pm 1ºC. Luego se aplica a la porción la mezcla de gas oxígeno/ozono, de composición conocida y caudal controlado, durante el período predeterminado de aproximadamente 60 minutos, de preferencia 2 a 5 minutos y todavía mejor, en torno a 3 minutos, según lo indicado anteriormente, de forma que la porción se exponga a los tres factores estresantes simultáneamente. De este modo, la sangre se modifica adecuadamente según la presente invención para alcanzar los efectos deseados.

Se somete de preferencia un sujeto a una tanda de tratamientos, cada uno de los cuales comprende la extracción de una porción de sangre, el tratamiento de la misma en la forma descrita anteriormente y la nueva administración al sujeto de la porción tratada. Una tanda de tratamientos de este tipo puede comprender la administración diaria de porciones de sangre tratada durante cierto número de días consecutivos, o puede comprender una primera tanda de tratamientos diarios durante un período de tiempo determinado, seguido de un intervalo y luego una o más tandas adicionales de tratamientos diarios.

En una realización preferida, se somete al sujeto a una tanda inicial de tratamientos, que comprende la administración de 4 a 6 porciones de sangre tratada. En otra realización preferida, se somete al sujeto a una tanda inicial de terapia, que comprende la administración de 2 a 4 porciones de sangre tratada, realizándose la administración de un par de porciones consecutivas en días consecutivos o separados por un período de descanso de 1 a 21 días, durante los cuales no se administra ninguna porción al paciente, siendo el período de descanso que separa un par de porciones consecutivas determinado de aproximadamente de 3 a 15 días. En una realización preferida más específica, el régimen de dosificación de la tanda inicial de tratamientos comprende un total de tres porciones, administrándose la primera y la segunda porciones en días consecutivos y disponiéndose un período de descanso de 11 días entre la administración de la segunda y tercera porciones. En el método de la invención, se prefiere administrar no más de una porción al sujeto en un día determinado.

Se prefiere administrar ulteriormente tandas adicionales de tratamientos tras la tanda inicial de tratamientos. De preferencia, se administran tandas ulteriores de tratamiento, por lo menos unas tres semanas después del final de la tanda inicial de tratamientos. En una realización particularmente preferida, el paciente recibe una segunda tanda de tratamientos que comprende la administración de una porción de sangre tratada, cada 30 días, una vez finalizada la tanda inicial de tratamientos, durante un período de 6 meses.

Se observará que el tiempo dejado entre tandas sucesivas de tratamientos deberá elegirse de modo que los efectos positivos del tratamiento de la invención se mantengan y puedan determinarse sobre la base de la respuesta observada de los pacientes individuales.

Según lo indicado anteriormente, el método de la presente invención puede utilizarse de preferencia como tratamiento complementario en combinación con otras terapias para la CHF. Como ejemplos preferidos de otras terapias de este tipo, se puede indicar: uno o más inhibidores ACE, bloqueantes \beta, antihistamínicos, bloqueantes TNF, supresores de producción de TNF y otras formas de terapia de rutina.

La invención se ilustra y describe además con referencia a los siguientes ejemplos específicos.

Ejemplo 1

Este ejemplo describe un estudio realizado para determinar el efecto del tratamiento de la invención en la función endotelial de conejos Watanabe, conocidos por desarrollar complejas lesiones ateroscleróticas durante el primer año de vida. Según se han indicado anteriormente, la disfunción endotelial está vinculada a la pato-fisiología de la CHF.

Los conejos se sometieron al estudio a los 7-8 meses de edad y se aleatorizaron en tres grupos, un primer grupo, que se sacrificó inmediatamente para realizar medidas de referencia, un segundo grupo (n = 10), que recibió inyecciones de sangre tratada según la invención, y un tercer grupo (n = 10) que recibió tratamientos simulados que comprendían inyecciones de sangre no tratada.

El tratamiento comprendía un total de 4 inyecciones de sangre tratada durante un período de 10 semanas. La sangre se trató exponiéndola a los tres factores estresantes siguientes en un aparato como el descrito en general en la patente US nº. 4.968.483 de Mueller et al.:

(a)

una temperatura elevada de 42,5ºC \pm 1,0ºC;

(b)

una mezcla de gas oxígeno de calidad médica que contenía 14,5 \pm 1,0 \mug/ml de ozono, borboteada a través de la sangre a una velocidad de 240 \pm 24 ml/minuto durante 3 minutos; y

(c)

luz ultravioleta a una longitud de onda de 253,7 nm, y una densidad de energía total de 2,0 julios/cm^{2} (con alguna fluctuación dentro de los límites mencionados anteriormente).

La sangre tratada se administró a los animales por inyección intramuscular. Se administraron a los animales de control inyecciones intramusculares de sangre no tratada con el mismo programa de inyección que los animales tratados.

Todos los animales se sacrificaron a los 11 meses de edad. Se tomaron preparaciones anulares de las arterias ilíacas de los animales y se evaluó la cantidad de relajación inducida por la acetil colina (un vasodilatador endotelial-dependiente) tras haber sido tratados con fenilefrina (un vaso constrictor).

La evaluación de las preparaciones anulares mostró un aumento notable de vaso relajación endotelial-mediada (52,2 \pm 6%) en los animales tratados, comparado con los animales de control inyectados con sangre no tratada (22,9 \pm 4%, p inferior a 0,001).

No se observó ninguna relajación cuando se quitó el endotelio de las preparaciones anulares, lo cual confirma el efecto, específico del endotelio, del tratamiento de la invención.

Ejemplo 2

Este ejemplo describe un estudio de los efectos del tratamiento de la terapia de la invención en pacientes que padecen de vasculopatía periférica (PVD). El estudio se realizó en el Hospital Universitario de Lund, en Suecia.

El estudio comprendía un estudio a doble ciego, controlado por placebo, en 18 pacientes, (7 varones, 11 hembras) con PVD moderadamente avanzado, cuyo síntoma principal era una cojera intermitente. Los pacientes que participaron en el estudio fueron reclutados entre la población paciente del Departamento de Medicina Interna del Hospital Universitario de Lund, Suecia.

Los pacientes se asignaron de forma aleatoria para recibir placebo (inyección intramuscular de 10 ml de solución salina caliente o tratamiento según la invención, que comprendía inyecciones intramusculares de 10 ml de sangre autóloga tratada. El tratamiento de la sangre suponía recoger una porción de 10 ml de sangre venosa de un paciente en 2 ml de citrato sódico 3-4% como anticoagulante. Se transfirió cada una de las porciones de sangre a un recipiente estéril, de polietileno de baja densidad, de un solo uso y luego se expuso a las siguientes condiciones, en un aparato como el que se describe en general en la patente US nº. 4.968.483 de Mueller et al.:

(d)

temperatura elevada de elevada de 42,5ºC \pm 1,0ºC;

(e)

gas oxígeno médico que contiene 14,5 \pm 1,0 \mug/ml de ozono, que pasa por burbujeo por la porción de sangre a una velocidad de 240 \pm 24 ml/min a STP durante 3 minutos; y

(f)

luz ultravioleta con una longitud de onda de 253,7 nm, y una energía total de aproximadamente 2,0 julios/cm^{2}.

Cada paciente recibió un total de 12 inyecciones de solución salina o sangre tratada durante un período de 9 semanas.

Se evaluó la terapia midiendo la tasa de recuperación del flujo sanguíneo cutáneo y la tensión de oxígeno tras la oclusión temporal total del flujo sanguíneo en las extremidades de cada paciente antes de comenzar la terapia, y a las 3 semanas, 6 semanas, 9 semanas y 2 meses de haber iniciado la terapia.

Se midió el flujo sanguíneo cutáneo en el pie por Flujometria Láser Doppler (LDF) y se determinó la tensión de oxígeno, midiendo la presión de oxígeno transcutanea de la piel (TcpO_{2}) en el pie. En los pacientes que recibieron el tratamiento de la invención, se observó una fuerte tendencia a la reducción, relacionada con el tratamiento, tanto en el tiempo total para alcanzar la perfusión máxima (TP_{H}) como en la mitad del tiempo necesario para alcanzar la perfusión máxima (T_{^{1}/_{2}}P_{H}), lo cual es indicativo de una mejora en la velocidad de recuperación del flujo sanguíneo cutáneo. No se observó ningún cambio en el grupo de control.

La mejora en la tasa de recuperación del flujo sanguíneo en pacientes tratados según la invención fue perceptible durante la tanda de tratamientos y persistió a lo largo de los mismos, si bien no adquirió importancia hasta 2 meses después de haberse iniciado la terapia. En la figura 1 se muestra una comparación del T_{^{1}/_{2}}P_{H} para el placebo y los grupos tratados, medido por LDF.

También se observó una tendencia a una recuperación más rápida del contenido de oxígeno de la piel en el grupo tratado. Esta diferencia adquirió importancia estadística a los 2 meses después de haberse iniciado la terapia. En la figura 2, se muestra una comparación del semi-tiempo para el máximo TcpO_{2} tras la isquemia (O_{2}T_{^{1}/_{2}}) para el grupo tratado, respecto del grupo placebo.

El estudio demostró por consiguiente que, en este grupo de pacientes de PVD moderadamente avanzados, el tratamiento de la invención tuvo un claro efecto biológico sobre la velocidad a la que se recuperaba el flujo sanguíneo en la piel del pie tras un período de isquemia con oclusión total. Un efecto similar, aunque de menor magnitud, se observó para la velocidad de recuperación de TcpO_{2}, mientras que los pacientes que recibían un tratamiento placebo no mostraron ningún cambio. Estos resultados sugieren que el tratamiento de la invención tiene un efecto beneficioso sobre la función endotelial, y parece mejorar la función microcirculatoria de la piel en pacientes con PVD.

Ejemplo 3

Este ejemplo se refiere a la utilización del tratamiento de la invención para evitar el ataque de artritis y describe los resultados de un estudio realizado en un modelo animal establecido de artritis. El modelo animal específico utilizado en este estudio era de artritis inducida por adyuvante en ratas (véase por ejemplo Pearson, C., 1956, "Development of Arthritis, periarthritis and periostitis in rats given adjuvant"; (Desarrollo de la artritis, periartritis y periostitis en ratas a los que se administró adyuvante), Proc. Soc. Exp. Biol.. Med., 91:95). Según este modelo, la artritis se induce en ratas inyectándolas con adyuvante que contiene Mycobacterium butvricum.

Se obtuvieron de los laboratorios Charles River ratas Lewis machos de 4 a 5 semanas de edad, de 100 a 120 g, que se pusieron en cuarentena durante una semana y se incorporaron al estudio. Se preparó una mezcla de adyuvante para inducir la artritis suspendiendo 50 mg de M. butyricum (Difco Laboratories, Inc, Detroit, MI) en 5 ml de esencia de parafina blanca ligera-m3516 (Sigma Chemical Co., St, Louis, MO) y bien mezclada utilizando un homogenizador. Se inyectaron porciones de la mezcla, suficientes para suministrar 0,15 mg de M. butyricum a cada uno de los animales, por vía subcutánea, en la base de la cola. Aparecieron síntomas de artritis unos 12 días después de la inducción, en cada animal, lo cual se apreció por hinchazón de las extremidades.

Se utilizaron corno donantes de sangre 2 ratas a las que no se había inyectado la mezcla de adyuvante. Se recogió la sangre de los donantes por punción cardiaca y se transfirieron 10 ml de sangre citratada a un recipiente estéril, de polietileno de baja densidad para el tratamiento ex vivo con factores estresantes según la invención. Utilizando un aparato como el que se describe en general en la patente antes citada de Mueller, se sometió la sangre a factores estresantes en un tratamiento según la invención.

Se sometieron 6 animales a una tanda de 2 inyecciones de porciones de 0,2 ml de sangre tratada, administrándose las inyecciones en días consecutivos a partir de la aparición de la artritis. Un grupo de control de 8 ratas recibió inyecciones de sangre no tratada utilizando el mismo programa de inyección que para los animales tratados. Las inyecciones comenzaron un día después de la inducción de la artritis. Se midieron los volúmenes de la garra posterior de los animales, en días alternos, tras el inicio de la artritis, por desplazamiento de agua en un vaso de precipitados utilizando una balance Mettler a plena carga. Se tomó la media de los resultados para cada grupo de animales y se presentan gráficamente en la figura 3 adjunta un gráfico del volumen medio de la pata respecto de días posteriores a la inducción de la artritis. La curva superior procede del grupo de control de animales, la curva inferior de los animales que recibieron la tanda de inyecciones de sangre tratada. Si se comparan los animales tratados con los animales del grupo de control, se puede observar una disminución notable en la gravedad de la artritis, que se traduce en volúmenes inferiores de la pata.

Los resultados anteriores muestran que el tratamiento de sujetos con sangre de mamífero modificada puede evitar de forma eficaz la aparición de la artritis en mamíferos.

La expresión de IL-6 mARN en los ganglios linfáticos de animales tratados y no tratados se midió 10 días después de la inducción de la artritis y los resultados se presentan a continuación en el Cuadro I.

CUADRO I

Tratamiento	IL-6 copia nº. (por 4500 unidades de actina)
Activo	< 35 (n = 8)
Control	254 \pm 203 (n =8)

Los resultados mostrados en el Cuadro I indican que el tratamiento según la invención puede modular niveles de citoquinas inflamatorias en un modelo de artritis dependiente de Th1/TNF-\alpha. Se demuestra que la producción de citoquinas inflamatorias, como IL-6 y TNF-\alpha, está relacionada con la pato-fisiología de la CHF.

Ejemplo 4

El experimento recogido en este ejemplo demuestra, mediante la utilización de un sistema de modelo animal con isquemia y reperfusión subsiguiente de diversos órganos corporales, que el tratamiento de la presente invención tiene el efecto de reducir la apoptosis y la necrosis. Se sabe que las heridas de reperfusión-isquemia suponen el incremento de la apoptosis y la necrosis en los órganos y tejidos afectados-véase por ejemplo Saikumar p, et.al. "Mechanisms of cell death in hypoxia/reoxygenation Injury" (Mecanismos de muerte celular en herida con hipoxia/reoxigenación), Oncogene 1998 Dec 24; 17(25):3341-9; y Burns A.T. et.al., "Apoptosis in Ischemia/reperfusion Injury of human renal allografts" (Apoptosis en herida de isquemia/reperfusión de aloinjertos renales humanos); Transplantation, 1998 oct 15; 66(7): 872-6 y otras publicaciones anteriores y ulteriores a la presente. En este ejemplo, se utilizan técnicas conocidas de determinación de la apoptosis a nivel celular.

Como animales del experimento, se utilizaron perros sabuesos normales de pura sangre, de 1 a 2 años de edad, en números iguales de hembras y machos. Los animales se separaron en cuatro grupos, A, B, C y D, y cada grupo estaba formado por seis animales, tres machos y tres hembras. Los animales de los grupos A y C se sometieron al proceso de la invención, aplicándoles dos tandas de 10 días de extracción diaria de una porción de 8 ml de sangre, tratamiento extracorporal de la porción con oxígeno/ozono, radiación UV y calor, y readministración de 5 ml de la porción tratada al mismo animal, por inyección intramuscular.

Cada uno de estos tratamientos se realizó del siguiente modo.

Se extrajo una porción de sangre de 8 ml del animal, se trató con citrato sódico (2 ml) y se colocó en un contenedor estéril. Se sometió simultáneamente a radiación UV, a los factores estresantes de entorno oxidativo de gas oxígeno/ozono y temperatura elevada, en un aparato como el que se describe en general en la patente antes citada US 4.969.483 de Mueller. Más específicamente, la muestra de sangre en el contenedor estéril, transparente a los UV, se calentó, utilizando lámparas infrarrojas, hasta 42,5ºC y manteniéndose a dicha temperatura, se sometieron a radiación UV, con una longitud de onda predominante de 253,7 nm, en las condiciones preferidas descritas anteriormente. De forma simultánea, se hizo pasar por la muestra de sangre por burbujeo una mezcla de ozono y oxigeno de calidad médica, con un contenido de ozono de 13,5-15,5 \mug/ml a una velocidad comprendida entre 60 y 240 mls/min (STP). El tiempo de exposición simultánea a UV y de alimentación de la mezcla de gas fue de 3 minutos. Se reinyectó intramuscularmente a cada animal de prueba una porción de 5 ml de la sangre trata-
da.

Cada uno de los animales de los grupos A y C, que recibió las tandas de tratamientos según la invención, se sometió a un período de descanso de tres semanas entre las tandas de tratamiento de 10 días. Los grupos B y D fueron los grupos de control, a los que se administraron dos tandas de 10 días de inyecciones diarias de 5 ml de solución salina fisiológica, con un período de descanso de tres semanas entre las tandas de 10 días.

Un día después de la segunda tanda de inyecciones, se anestesiaron los animales bajo anestesia gaseosa ligera y se extirpó por medio de una incisión posterior el riñón derecho de cada animal. Se colocó un clip de oclusión en la arteria y la vena renal restante para exponer el riñón izquierdo a isquemia transitoria durante 60 minutos. Se quitó luego el clip para permitir la reperfusión del riñón mediante flujo sanguíneo normal.

Los animales se observaron durante 6 días después del procedimiento de isquemia y luego se sacrificaron. El riñón isquémico de cada animal se extrajo quirúrgicamente y se dividió en dos partes. Una parte se mantuvo congelada a -80ºC y la otra parte se fijó en formalina al 10% para estudios de histopatología inmunitaria y de rutina.

Se midió el potencial de membrana mitocondrial en las células tubulares proximales aisladas de los riñones isquémicos y de control, en el momento de extraer el riñón de control y tras el sacrificio. A tal efecto, se purificaron tubos proximales de riñón de perro de las cortezas renales normales o isquémicas mediante el procedimiento de tratamiento con colagenasa descrito por Marshansky et.al., "Isolation of heavy endosomes from dog proximal tubes in suspension", (Aislamiento de endomas pesados de tubos proximales de perro en suspensión), J. Membr. Biol. 153(1), 59-73, 1996. Se aislaron mitocondrias renales en suspensión por centrifugación diferencial (véase Marshansky, ``Organic hydroperoxides at high concentration cause energization and activation of AATP synthesis in mitochondria (los hidroperóxidos orgánicos a elevadas concentraciones causan la energización y la activación de la síntesis AATP en mitocondria), J. Biol. Chem. 264/7), 3670-3673, 1989. Tras la homogenización de tejido en un tampón que contiene 250 mM de sacarosa, 10 mM HEPES-Tris (pH 7,5), y 250 \muM EDTA, se quitaron los residuos celulares por centrifugación a 10.000 g durante 30 minutos. Las mitocondrias se lavaron con el tampón de sacarosa/HEPES sin EDTA.

Se midió el potencial de membrana mitocondrial en la forma descrita por Kroemer, G., Zamzam, N. y Susin, S.A., "Mitochondrial control of apoptosis", (Control mitocondrial de la apoptosis) (Review) Immunology Today (1997) v.18, p 44-51; con colorante JC-1-véase Salvioli et.al., pero sin DiOC6(3) o rodamina 123, resulta una sonda fluorescente fiable para evaluar cambios delta psi en células intactas: implicaciones para estudios sobre la funcionalidad mitocondrial durante la apoptosis'', FEBS Letters 411(1), 77-82. 1987. Se controló y siguió de forma continua la fluorescencia JC-1 en la suspensión de mitocondria purificada de riñones normales e isquémicos sobre un espectro fluorímetro Deltascan modelo RFM 2001 (Photon Technology International), South Brunswick, NJ). La longitud de onda de excitación era de 490 nm (anchura de rendija 2 nm) y la longitud de onda de emisión era de 590 nm (anchura de rendija 4 nm). Las señales se registraron utilizando software Felix® (versión 1.1). Todas las medidas se realizaron con agitación continua a 37ºC. El tampón de incubación para la medida del potencial de membrana mitocondrial contenía 200 mM de sacarosa, 5 mM MgCl_{2}, 5 mM KH_{2}PO_{4}, 0,1 \muM de JC-1 y 30 Mm HEPES-tris (pH 7,5). Las concentraciones del sustrato y los inhibidores era de 10 mM de succinato, 0,1 \muM de rotenona con o sin 0,1 \muM FCCP. Se estimó el potencial de membrana mitocondrial del túbulo proximal en el riñón derecho (de control) antes de la isquemia y en el riñón izquierdo (isquémico) después del sacrificio de los perros, el día sexto después de la isquemia y se estimó como la diferencia de fluorescencia JC-1 tras el desacoplamiento de mitocondria con FCCP, tal como se muestra en la figura 4A adjunta. Para cada medida, se utilizaron 50 \mug de proteína de material purificado.

La fluorescencia JC-1 es proporcional al potencial de membrana mitocondrial. El riñón contralateral nefrectomizado sirvió de control. Como se puede apreciar en la figura 4B, el proceso del tratamiento de la invención no modificó el potencial de membrana del riñón derecho de control no isquémico (p=0,445 por tratado respecto de salino). Sin embargo, el riñón isquémico de animales inyectados con salino mostraron una fluorescencia notablemente inferior (p<0,05) comparado con el riñón de control. El tratamiento estresante según la invención evitó el desacoplamiento de mitocondrias durante la reperfusión/isquemia y el potencial de membrana no mostró ninguna diferencia notable (p=0,244) entre riñones isquémicos y de control. Este parámetro siguió siendo notablemente elevado (p=0,0006) respecto de los perros inyectados con salino, en los riñones isquémicos de perros pretratados según el proceso de la invención durante por lo menos 6 días después de la reperfusión.

Estos resultados indican que el proceso de la invención tiene un efecto de protección para el riñón contra la apoptosis y/o acelera la recuperación a nivel mitocondrial. Por consiguiente, el proceso de la invención resulta indicado para el preacondicionado de las células, tejidos y órganos de un cuerpo de mamífero frente a los factores que se encuentren ulteriormente que acelerarán normalmente la apoptosis.

Específicamente, la preservación del potencial de membrana mitocondrial pone de manifiesto la capacidad de la terapia para proteger las mitocondrias y por lo tanto pre-acondicionar las células contra la apoptosis.

Ejemplo 5

Se trató un grupo de 12 ratas machos SHR con inyecciones de sangre guardada en reserva y sometida a factores estresantes según lo descrito en el ejemplo 4 anterior o, en los animales de control, con inyecciones de solución salina. Debido a que la sangre de todos los animales de toda esta estirpe genética es igual, se trató sangre de un animal de esta misma estirpe con el proceso de la invención, para su administración al animal de prueba. La sangre se trató con citrato sódico como anticoagulante y se colocó en un contenedor estéril. Recibieron inyecciones de 150 \mul de sangre sometida a factores estresantes los días -14 y -13, seguido de un período de descanso de 11 días y una tercera inyección, el día antes de la cirugía isquémica, o inyecciones en paralelo con la solución salina. El día de la cirugía, las ratas fueron anestesiadas con furano ligero y se extirpó el riñón derecho por medio de una incisión a mitad del abdomen. El riñón izquierdo se sometió entonces a isquemia transitoria por oclusión de la arteria y la vena renal izquierda utilizando un micro clip. La piel se cerró entonces temporalmente. Después de 60 minutos de oclusión, se quitó el clip y se cerró la herida con una sutura. Los animales se sacrificaron 12 horas después de la reperfusión.

Los riñones isquémicos y no isquémicos de los animales de prueba se quitaron y se sometieron a pruebas de laddering de ADN. La fragmentación de ADN oligo nucleosomal en 180 a 200 pares de bases es un modelo específico que aparece como ladder tras la electrofóresis de gel agarosa en diversos órganos sometidos a apoptosis. Para estimar el grado de fragmentación de ADN en la corteza renal, se pesó una porción de corteza renal pulverizada y se extrajo ADN del tejido total por el procedimiento de fenol-cloroformo tras la digestión tisular con proteinaza K y RnasaA en presencia de EDTA. Se marcó un \mug de ADN extraído por ensayo enzimático, utilizando deoxi nucleotidil transferasa terminal con P^{32}-dCTP (véase Teiger et.al., "Apoptosis in pressure overload-induced heart hypertrophy in the rat" (apoptosis en hipertrofia cardiaca en la rata inducida por sobrecarga de presión), J. Clin. Invest, 97, 2891-2897, 1996). Se cargaron cantidades crecientes de ADN radio-marcado sobre geles de sacarosa al 1,5%. Después de la electrofóresis, se transfirió el ADN sobre membranas de nylon (Hybond) y se cuantificó la radioactividad asociada con fragmentos de ADN de 150 a 1500 bp en un Phosphorlmager (Molecular Dynamics). Se trazó una línea de regresión para cada muestra, para la radioactividad en función del ADN cargado sobre el gel (véase deBlois et.al., "Smooth muscle cell apoptosis during vascular regression in spontaneously hypertensive rats" (apoptosis celular del músculo liso durante la regresión vascular en ratas espontáneamente hipertensas) Hypertension 20, 340.349, 1997). La pendiente de la línea de regresión lineal sirvió de índice de fragmentación de ADN (cmp/píxel por \mug ADN).

Los resultados de los riñones con reperfusión isquémica (I/R) y de los riñones normales no I/R, todos ellos de animales que no recibieron inyecciones de sangre sometida a factores estresantes, se muestran ahora gráficamente en la figura 5, donde aparece la gráfica de la pendiente de las líneas de regresión para las diversas muestras (eje vertical) con respecto al tiempo después de iniciar la reperfusión. El laddering de ADN, indicativo de la fragmentación de ADN había aumentado claramente en la corteza renal isquémica si se compara con el órgano no isquémico contralateral y el máximo alcanzado a las doce horas volvió a valores casi basales a las 48 horas. Se eligió por lo tanto 12 horas como el tiempo para estudiar el efecto de la sangre sometida a factores estresantes de la invención sobre la apoptosis renal temprana inducida por isquemia.

La figura 6A adjunta representa el gel de electrofóresis del ADN fragmentado, en la gama de 150-1500 bp, radio marcado según lo descrito para fijar marcas de radioactividad en los fragmentos de ADN. La huella S procede del ADN de riñones de animales que recibieron inyecciones salinas antes de la reperfusión-isquemia renal y la huella V procede del ADN de riñones de animales que recibieron inyecciones de sangre sometida a factor estresante antes de la reperfusión-isquemia del riñón. La figura muestra que 60 minutos de isquemia renal indujeron una clara acumulación de ADN fragmentado en ambos grupos de ratas a las 12 horas, aunque el nivel de este parámetro era notablemente inferior (p<0,05) en animales que recibieron la sangre tratada. La figura 6B cuantifica la cantidad de radiación de las muestras, en unidades arbitrarias, y muestra que la fragmentación-laddering del ADN se produce en ambas muestras S y V como resultado de isquemia/reperfusión, aunque la magnitud está considerablemente reducida en las muestras V, comparado con las muestras S. Los resultados presentados en la figura 6B son las medias de los seis animales en cada caso.

Estos resultados confirman que el efecto citoprotector de la administración de sangre estresada según la invención sobre la herida de reperfusión renal supone la inhibición de la apoptosis temprana o tardía.

La aptitud del tratamiento de la invención para reducir la apoptosis en el riñón tras la isquemia/reperfusión durante la fase temprana de apoptosis (después de 12 horas) según lo determinado por laddering de ADN y la densidad de los núcleos apoptóticos teñidos por Tdt se muestra en las figuras 7 y 8 respectivamente. Asimismo, la figura 3B muestra que los números de células en el riñón tras la isquemia/reperfusión fueron también notablemente superiores en los animales tratados según la invención.

Ejemplo 6

Este ejemplo describe el tratamiento de un pequeño número de pacientes humanos con insuficiencia cardiaca congestiva crónica avanzada. Los pacientes tenían insuficiencia cardiaca congestiva crónica de clase III-IV NYHA, con una fracción de expulsión ventricular izquierda (LVEF) de menos de 40% y una distancia de marcha de 6 minutos de menos de 300 m. Algunos de los pacientes habían recibido previamente otros tratamientos para la CHF.

Protocolo

Los pacientes reciben cierto número de inyecciones de sangre tratada. El programa de tratamiento comprende inyecciones los días 1, 2 y 14, seguido de una sola inyección cada 30 días durante 5 meses, cada inyección con un volumen de 10 ml. Cada tratamiento individual comprende las siguientes etapas:

1. Recogido de 10 ml de sangre venosa perteneciente al paciente en 2 ml de citrato sódico o 3-4% para inyección, USP. El citrato sódico se añade a la muestra para evitar que la sangre coagule durante el tratamiento.

2. Transferencia de la muestra de sangre citrada a un recipiente estéril, de un solo uso, de polietileno de baja densidad.

3. Tratamiento ex vivo de la muestra de sangre por exposición simultánea a:

-

una temperatura elevada de 42,5 \pm 1,0ºC,

-

una mezcla de gas de oxígeno de calidad médica que contiene 14,5 \pm 1,0 \mug/ml de ozono, que se hace pasar por burbujeo a través de la muestra de sangre a una velocidad de 240 \pm 24 ml/min (a STP); y

-

luz ultravioleta a una longitud de onda de 253,7 nm.

4. Transferencia de la muestra de sangre del contenedor estéril de un solo uso a una jeringa estéril.

5. Inyección intramuscular de 2 ml ó 10 ml de la muestra de sangre tratada en el músculo gluteal del mismo paciente, tras anestesia local (1 ml de 2% de Novocaína o equivalente) en la zona de la inyección.

El tratamiento ex vivo de la muestra de sangre descrito en la etapa (3) anterior se realiza con un aparato como el que describe en general la patente US nº. 4.968.483 de Mueller et al. La muestra de sangre se expone simultáneamente a los tres factores estresantes durante un período de 3 minutos.

Evaluación de CHF

Se controlan y se siguen las manifestaciones negativas de los pacientes durante cada visita. Se realiza asimismo un seguimiento después del tratamiento para controlar la supervivencia, las hospitalizaciones y cualquier evento negativo importante.

Los criterios de valoración primarios utilizados para evaluar la eficacia del tratamiento son los cambios en una distancia de paseo de 6 minutos y/o la clasificación funcional NYHA. Como criterios de valoración secundarios, se pueden citar la mejora de la función cardiaca, la reducción de las condiciones diuréticas; la reducción de la estancia de hospitalización y la mejora de los síntomas.

Como queda demostrado con los datos descritos anteriormente, la utilización de la presente invención tiene, según se ha visto, una actividad biológica importante en los seres humanos y en cierto número de sistemas de modelos animales, todo lo cual supone una respuestas inflamatorias dependientes de Th1/TNF-\alpha. Según se ha mencionado anteriormente, se cree que la utilización regula y reduce la respuesta inmunitaria de tipo Th1 pro inflamatoria, aumentando por ejemplo las citoquinas anti inflamatorias de tipo TH2 inclusive IL-10. Esto explicaría por lo menos parcialmente la capacidad de la utilización de la invención de producir beneficios terapéuticos en cada una las tres áreas que caracterizan la CHF.

Además, existen pruebas que sugieren que la invención es IL-10 dependiente (figura 9 y Shahid S. et al., Journal of Investigative Dermatology, 14, nº. 4, 2000), y produce una regulación y un aumento de las citoquinas anti inflamatorias como la IL-10 y una regulación y una reducción de las respuestas inmunitarias debidas a TH-1. Se ha propuesto también que IL-10 puede ser un componente importante de la red de citoquinas en la CHF, ya que parece existir una reducción en el nivel de IL-10 en relación con TNF-\alpha en CHF (Yamaoka et al., Jpn Circ J 63: 951-956).

Claims (24)

1. Utilización de una porción de sangre modificada de un paciente, que ha sido preparada tratando la porción de sangre ex vivo con factores estresantes como la luz ultravioleta y un entorno oxidativo, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la insuficiencia cardiaca congestiva (CHF) en un paciente humano que la padece.

2. Utilización según la reivindicación 1, en la que el entorno oxidativo utilizado en el tratamiento de la porción de sangre comprende la aplicación de un agente oxidante a la porción.

3. Utilización según la reivindicación 2, en la que el agente oxidante contiene gas ozono.

4.Utilización según la reivindicación 2 ó 3, en la que el agente oxidante comprende una mezcla de gas ozono y oxígeno de calidad médica, estando contenido el gas ozono en la mezcla en una concentración de hasta 300 \mug/ml.

5. Utilización según la reivindicación 4, en la que el gas ozono está contenido en la mezcla, en una concentración de hasta 30 \mug/ml.

6. Utilización según la reivindicación 5, en la que el gas ozono está contenido en la mezcla en una concentración de 13 \mug/ml a 15,5 \mug/ml.

7. Utilización según la reivindicación 4, 5 ó 6, en la que la mezcla se aplica a la porción a un caudal de hasta 0,33 litros/minuto.

8. Utilización según la reivindicación 7, en la que la mezcla se aplica a la porción a un caudal de 0,21 litros/minuto a 0,27 litros/minuto.

9. Utilización cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que luz ultravioleta utilizada en el tratamiento de la porción de sangre comprende luz ultravioleta que tiene una o más longitudes de onda de banda UV-C.

10. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la temperatura a la que se enfría o se calienta la porción durante el tratamiento de la porción de sangre es una temperatura tal que por lo menos parte de la porción se encuentra entre -5ºC y 55ºC.

11. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la temperatura media de la sangre en la porción durante la etapa de tratamiento es del orden de 37ºC a 55ºC.

12. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la temperatura media de la sangre en la porción durante la etapa de tratamiento es del orden de 0ºC a 36,5ºC.

13. Utilización según la reivindicación 12, en la que la citada temperatura media de la sangre en la porción es del orden de 10ºC a 30ºC.

14. Utilización según la reivindicación 11, en la que la citada temperatura es de 42,5 \pm 1ºC.

15. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el volumen de la porción es del orden de 0,1 a 400 ml.

16. Utilización según la reivindicación 15, en la que el volumen de la porción es de 0,1, a 100 ml.

17. Utilización según la reivindicación 15, en la que el volumen de la porción es de 5 a 15 ml.

18. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la porción se trata con los factores estresantes durante un período de hasta 60 minutos.

19. Utilización según la reivindicación 18, en la que la porción se trata con factores estresantes durante un período de 2 a 5 minutos.

20. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la porción se trata con luz ultravioleta y entorno oxidativo de forma simultánea.

21. Utilización de una combinación de una porción de la propia sangre del paciente, que ha sido tratada ex vivo con uno más factores estresantes, elegidos entre un entorno oxidativo, estrés térmico y emisión electromagnética,y un agente farmacéutico elegido entre: nitratos, bloqueantes \beta, inhibidores ACE, bloqueantes receptor AT, antihistamínico, bloqueantes de conducto de calcio, bloqueantes TNF, supresores de producción de TNF-\alpha, restricción de sodio y de fluido, diuréticos y digitales para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la insuficiencia cardiaca congestiva (CHF) en un paciente humano que la padece.

22. Utilización según la reivindicación 21, en la que el agente farmacéutico es un supresor de TNF-\alpha elegido entre la pentoxifilina, los inhibidores de ACE, la amrinona, la adenosina, la talidomida y la dexametasona.

23. Utilización según la reivindicación 21 ó 22, en la que los factores estresantes comprenden un entorno oxidativo y luz ultravioleta, aplicados simultáneamente a la porción de sangre ex vivo.

24. Utilización según la reivindicación 23, en la que el entorno oxidativo comprende una mezcla de oxígeno de calidad médica y ozono, introducidos por burbujeo por la porción de sangre, y la luz ultravioleta comprende luz ultravioleta que tiene una o más longitudes de onda de banda UV-C, aplicados simultáneamente a la porción de sangre ex vivo mientras la sangre en la porción tiene una temperatura media del orden de 37ºC a 55ºC.