KR100543413B1

KR100543413B1 - 전처리된 자가혈에 의한 울혈성 심부전증의 치료

Info

Publication number: KR100543413B1
Application number: KR1020027009206A
Authority: KR
Inventors: 스미쓰엘던알.; 토레-아미온길러모
Original assignee: 바소겐 아일랜드 리미티드
Priority date: 2000-01-18
Filing date: 2001-01-18
Publication date: 2006-01-20
Also published as: HK1050847A1; PT1267897E; CA2400801C; ATE281839T1; ES2232632T3; CA2400801A1; DE60107065D1; CN1400906A; AU773118B2; DK1267897T3; BR0107705A; HK1050847B; NO20023267L; CA2296997A1; US6572895B2; EP1267897A1; ZA200205401B; CZ20022402A3; EA200200767A1; IL150725A0

Abstract

환자 혈액의 분획을 생체 외에서(ex vivo) 체온 이상 또는 이하의 온도, 전자기 방출 및 산화적 환경으로 이루어진 군으로부터 선택된 최소한 하나의 스트레스 인자로 처리하고, 상기 처리된 혈액의 분획을 환자에게 투여함으로써 인간 환자에서 울혈성 심부전증(CHF)을 치료하는 방법. 상기 치료법은 그 자체로 또는 통상적인 CHF 치료법과 조합하여 부속 치료법으로서 사용될 수 있다.

울혈성 심부전증(Congestive Heart Failure, CHF), 사전처리된 자가혈(pretreated autologous blood)

Description

전처리된 자가혈에 의한 울혈성 심부전증의 치료{Treatment of congestive heart failure by pretreated autologous blood}

본 발명은 울혈성 심부전증(congestive heart failure)의 치료를 위한 방법에 관한 것으로서, 특히 인간 피험자에 변형된 혈액의 분획(aliquot)을, 선택적으로 하나 또는 그 이상의 울혈성 심부전증의 증상을 완화하기 위한 다른 치료제와 조합하여, 투여함으로써 치료하는 방법에 관한 것이다.

울혈성 심부전증(congestive heart failure, CHF)은 대략 5백만의 미국인들에게 영향을 미치고, 치사율이 연간 80,000명에 달하는, 상대적으로 일반적인 질병이다. CHF는 그 자체로 분별 가능한 질병 과정이라기보다는, 함께 상호 작용하여 궁극적으로 순환 펌프로서의 기능을 수행하기 위한 심장의 점진적인 능력 손실을 야기하는, 다중의 해부학적, 기능적 및 생물학적 비정상의 효과를 나타내는 것으로 믿어지고 있다.

CHF는 심근 경색(심장 마비)과 같은 지표성 사건의 발생에 의하여 야기될 수 있으며, 고혈압 또는 판막 질환과 같은 심장 기형 등의 다른 원인들에 2차적일 수 있다. 지표성 사건 또는 다른 원인들은, 예를 들어 심장 근육에 손상을 가함으로써, 심장의 펌핑 능력에 있어서 초기 감소를 야기한다. 이러한 펌핑 능력의 감소 는, 하나 또는 그 이상의 보상 기전으로 인하여, 즉각적으로 인지되지 않을 수도 있다. 그러나, CHF의 진행은 환자의 혈역학(hemodynamic) 상태에 대하여 독립적인 것으로 발견되었다. 그러므로, 질병에 의하여 야기된 손상 변화는, 환자가 무증상인 상태로 남아 있는 동안에도, 존재하고 있으며, 진행되고 있다. 사실, CHF의 초기 상태 동안 정상적인 심혈관 기능을 유지하는 보상 기전은, 예를 들어 심장 및 순환에 해로운 효과를 가함으로써, 실제로는 질병의 진전에 기여할 수도 있다.

CHF에서 발생하는 몇몇 더욱 중요한 병생리학적(pathophysiologic) 변화는 시상하부-뇌하수체-부신계(hypothalamic-pituitary-adrenal axis)의 활성화, 전신성 내피 기능장애(systematic endothelial dysfunction) 및 심근 리모델링(myocardial remodeling)이다.

시상하부-뇌하수체-부신계의 활성화를 중화시키는 데에 특히 사용되는 치료제는 베타-아드레날린성 차단제(β-blockers), 안지오텐신 전환 효소(ACE) 저해제, 특정 칼슘 채널 차단제, 질산염 및 엔도쎄린-1(endothelin-1) 차단제가 포함된다.

칼슘 채널 차단제 및 질산염이 생존을 지속시키는 임상적 개선을 나타내는지에 대하여 명백히 증명된 바가 없으나, 반면에 베타-차단제와 ACE 저해제는, 알도스테론 길항제와 마찬가지로, 유의성 있게 생명을 지속시키는 것으로 입증된 바 있다. 엔도쎄린-1 차단제를 사용한 실험적 연구들이 유익한 효과를 나타낸 바 있다.

전신성 내피 기능장애는 잘 인식되어진 CHF의 특징이고, 좌심실 기능장애의 시간적 징후들이 나타나는 것에 의하여 명백히 나타난다. 내피 기능장애는 심근 미세순환(myocardial microcirculation)과 심근세포(cardiac myocytes)와의 밀접한 관계와 관련하여 중요하다. 미세혈관(microvascular) 기능장애는 근세포 기능장애 및 점진적인 심근 장애로 이어지는 형태적(morphological) 변화에 현저하게 기여하는 것임을 암시하는 증거들이 있다.

기초가 되는 병생리학의 관점에서, 내피 기능장애는 일산화질소의 상대적인 결핍에 의하여 야기될 수 있으며, 이는 NADH-의존 산화제에 의한 혈관 산소 생성의 증가 및 이에 수반되는 일산화질소(NO)의 과도한 스캐빈징에 기인한다는 것을 암시하는 증거가 있다. 증가된 산소 생성에 기여하는 잠재적인 요소들은 증가된 교감신경긴장(sympathetic tone), 노르에피네프린(norepinephrine), 안지오텐신 Ⅱ, 엔도쎄린-1 및 TNF-α를 포함한다. 부가하여, 핵심적인 항염증 시토카인(anti-inflammatory)인 인터루킨-10(IL-10)의 수준이 TNF-α의 그것에 비하여 부적절하게 낮은 것을 들 수 있다. 현재는 TNF-α의 증가된 수준이, 인터루킨-6를 포함하는 전구염증(proinflammatory) 시토카인 및 용해성 TNF-α수용체와 연계하여, 감소된 심근 수축, 양심실 확장(biventricular dilatation), 및 고혈압을 야기함으로써 CHF의 발전에 중요한 역할을 담당하며, 아마도 내피 활성화 및 기능장애에 관여하는 것으로 알려져 있다. 또한, TNF-α는 심한 CHF 환자들에게서 나타나는 지금까지는 설명되어지지 않은 근육 폐기(muscle wasting)에 역할을 하는 것으로 믿어지고 있다. 적은 수의 환자에게서 용해성 TNF-수용체 요법을 사용한 예비 연구는 NYHA 기능 분류 및 삶의 질 지수들(quality of life indices)에 의하여 측정된, 환자 복지에 있어서 향상을 나타낸 바 있다.

심근 리모델링은 무증상에서 증상성 심장병으로의 전이를 동반하는 복잡한 과정이며, 심근층(myocardium) 내에서의 일련의 적응성 변화로 서술될 수 있다. 심근 리모델링의 주요 요소는 근세포 생물학에서의 변이, 괴사(necrosis) 또는 세포사멸(apoptosis)에 의한 근세포의 감소, 세포외 기질에서의 변이 및 좌심실 기하학(left ventricular chamber geometry)에서의 변이이다. 심근 리모델링이 단순히 장기적인 신경호르몬성 자극의 독성 효과에 수년간 노출됨으로써 발생하는 말단-기관(end-organ) 반응인지, 아니면 심근 리모델링이 심장병의 진전에 독립적으로 기여하는 것인지는 명확하지 않다. 현재까지의 증거는 적당한 치료법이 심근 리모델링의 진전을 늦추거나 멈추게 할 수 있다는 것을 암시한다.

비록 현재 사용되는 치료는 CHF의 증상을 완화하고, 질병 과정에 의해 야기되는 특정 병생리학적 장애를 고칠 수 있지만, CHF는 상대적으로 높은 비율의 치사율을 가진 잔인하게 발전하는 질병으로 남아있다. 사실, 현존하는 약물들에 의해 야기된 질병율 및 치사율의 상대적인 감소는 약 10 내지 25 퍼센트의 수치이다. 그러므로, CHF에 대한 추가의 또는 더욱 우수한 치료제, 특히 기초가 되는 질병을 현저하게 변형시킬 수 있는 것들에 대한 필요성이 존재한다.

본 발명은 포유류 혈액의 분획(aliquot)을 생체 외(ex vivo)에서 처리하고, 연이어 포유류 피험체의 체내에 도입함으로써 CHF를 치료하는 방법을 제공함으로써, 현재까지 알려진 CHF 치료법에 대한 최소한 몇몇의 상기 언급한 불이익 및 기타 다른 불이익을 극복한다.

혈액의 분획은 혈액을 변형하는 것으로 알려진 하나 또는 그 이상의 스트레 스 인자(stressors)에 투여함으로써 처리된다. 본 발명에 따르면, 혈액의 분획은 혈액, 또는 혈액의 분리된 세포 또는 비세포 부분(fraction), 또는 혈액의 분리된 세포 및/또는 비세포 부분의 혼합물을 온도 스트레스 인자, 전자기 방출 및 산화 환경, 또는 그와 같은 스트레스 인자의 임의의 조합으로부터 선택된 스트레스 인자에 동시에 또는 연속적으로 투여함으로써 변형될 수 있다.

상기 서술된 바와 같이, CHF와 관련된 병생리학적 변화는 면역 활성화, 내피 기능장애 및 괴사 또는 세포사멸을 통한 근세포의 감소를 포함한다. 본 발명의 치료 방법은 이러한 3가지 영역의 각각에서 치료적 효과를 생산하는 것으로 나타났다.

면역 활성화와 관련하여서는, 본 발명의 치료법은 다른 종들에서의 몇몇 Th1/TNF-α-의존성 실험 염증 모델에서 염증 시토카인의 수준을 조절하는 것으로 발견되었다. 예를 들어, 상기 치료법은 Balb/c 생쥐(mice)에서 TNF-α에 의하여 매개되는 Th1-유도 면역 반응인, 알레르기성 접촉 과민반응을 감소시키고(Shivji et al., Journal of Cutaneous Medicine and Surgery 4: 132-137, 2000); 염증성 질환을 갖는 루이스 래트 모델의 아주반트(adjuvant)-유도 관절염에서 인터루킨-6 mRNA의 발현을 억제-조절하고; Th1-유도 자가면역 질환인, 피부 경화증(scleroderma)를 앓고 있는 환자에서의 Th1의 Th2에 대한 비율을 감소시킨다(Rabinovich et al., ⅩⅡ Pan-American Congress of Rhematology, Montreal, Canada, June 21-25, 1998 포스터 제공). 상기 치료법은 전구-염증성 Th1-형 면역 반응을, 예를 들어 인터루킨-10을 포함하는 항염증성 TH2-형 시토카인을 증가시킴으로써, 억제-조절하는 것 으로 믿어진다.

본 발명의 치료법은 인간 및 동물에서 수행된 몇몇 연구들에서 내피 기능을 향상시키는 것으로 발견되었다. 예를 들어, 상기 치료법은 심각한 일차 레이노드 질병(Raynaud's disease)을 앓고 있는 환자에 대한 개방 연구에서, 내피-의존성 혈관확장제(vasodilator)의 기능을 향상시키고(Cooke et al., International Journal of Angiology 16: 250-254, 1997), 죽상경화증(atherosclerosis)에 이차적인 악화된 말초 혈관 질환(peripheral vascular disease)을 앓고 있는 환자에 대한 이중-맹검(double-blind), 플라세보-조절 연구(placebo-controlled study)에서, 순간적인 폐색(occlusion)에 뒤이은 피부 혈류의 회복 속도를 향상시키고(Courtman et al., Circulation Vol 102, #18, suppl Ⅱ, 2000), 콜레스테롤-섭취 LDL 수용체 결핍 마우스에서 죽상경화증의 진행을 감소시키고(Babaei et al., Journal of the American College of Cardiology 35 (Suppl. A): 243. 1999), 니트릭 옥사이드 길항제(아세틸콜린)에 대한 증가된 혈관확장제 반응에 의하여 입증되는 것처럼, 심각하게 죽상경화적이고, 고콜레스테롤성(hypercholesterolemic)인 와타나베 토끼(Watanabe rabbit)에서, 아세틸콜린에 대한 내피-의존성 혈관확장제의 작용을 현저하게 향상시킨다(상기 Courtman et al.). 내피 작용의 향상은 항염증 효과 및 NO의 증가된 이용가능성에 기인하는 것으로 믿어지며, 이는, CHF 환자에서 심각하게 악화된 것으로 알려진 혈관확장 용량의 향상을 야기한다는 것이 발견되었다.

근세포의 손실과 관련하여, 본 발명의 방법은 세포사멸 및 괴사의 수준을 감소시키는 것으로 믿어진다. 본 치료법은 증가된 세포사멸성 세포사와 연관된 것으 로 알려진 허혈/재관류(ischemia/reperfusion(I/R)) 손상으로부터 신장을 보호할 수 있고(Trembly et al., Pathophysiology 5:26; Chen et al., Medecine Sciences 15(Suppl. 1): 16), DNA 래더링(laddering) 및 Tdt로 염색된 세포사멸성 핵의 밀도로 결정되는, I/R에 뒤이은 신장에서의 세포사멸을 감소시킬 수 있는 것으로 밝혀졌다.

본 발명의 치료법이 CHF에서 발생하는 병생리학적 변화, 즉 내피 기능장애, 염증성 시토카인의 생산 및 세포사멸에 기인하는 근세포 손실이라는 세 가지 영역에서 치료적 잇점을 제공하기 때문에, 본 발명의 치료법이 CHF를 앓고 있는 환자에게 이득이 될 것을 예측할 수 있는 강한 이론적 기초가 제공된다. 본 발명의 방법은 그 자체로 CHF 치료법으로 사용될 수 있거나, 또는 니트레이트 치료법, β-차단제, ACE 저해제, AT 수용체 차단제, 알도스테론 길항제, 칼슘 채널 차단제, TNF 차단제, TNF-α생산 억제제와 같은 다른 치료법, 및/또는 나트륨 및 유체 제한, 이뇨제, 디기탈리스 등과 같은 다른 더 일상적인 치료 방법과 조합하여 사용될 수 있다. TNF-α 생산을 억제하는 것으로 알려진 특정 약물들은 펜톡시필린(pentoxifylline), 암리논(amrinone), 아데노신, 탈리도마이드(thalidomide), TNF 전환 효소(TACE) 저해제 및 덱사메타손(dexamethasone)을 포함한다. 특정 TNF 차단제는 모노클로날 항체 및 에타너셉트(etanercept)를 포함한다.

따라서, 한가지 태양에서 본 발명은 CHF를 앓고 있는 인간 환자에서 CHF를 치료하는 방법을 제공하며, 이는 (a) 환자 혈액의 분획을 생체 외에서 체온 이상 또는 이하의 온도, 전자기 발산 및 산화적 환경으로 이루어진 군으로부터 선택된 최소한 하나의 스트레스 인자로 처리하는 단계; 및 (b) (a)단계에서 처리된, 환자 내에서 CHF를 완화하기에 충분한 부피를 갖는 혈액 분획을, 환자에 투여하는 단계를 포함한다.

또 다른 태양에서는, 본 발명은 CHF를 앓고 있는 인간 환자에서 CHF를 치료하기 위한 조합 치료법을 제공하며, 상기 조합 치료법은 생체 외에서 산화적 환경, 열적 스트레스 및 전자기적 발산에서 선택된 하나 또는 그 이상의 스트레스 인자로 처리된 환자 자신의 혈액 분획을 환자에게 투여하는 것 및 니트레이트, β-차단제, ACE 저해제, AT 수용체 차단제, 알도스테론 길항제, 칼슘 채널 차단제, TNF 차단제, TNF-α 생산 억제제, 나트륨 및 유체 제한, 이뇨제 및 디기탈리스로 이루어진 군으로부터 선택된 치료법을 포함한다.

본 발명의 바람직한 방법에 따르면, 혈액의 분획은 포유류, 바람직하게는 인간으로부터 추출하고, 상기 혈액 분획은 하기에 더욱 상세히 서술되는 특정 스트레스 인자로 생체 외에서 처리한다. 여기에 서술된 "분획", "혈액의 분획" 또는 이와 유사한 용어들은, 전체 혈액, 혈소판을 포함하는 혈액의 분리된 세포 부분, 혈장을 포함하는 혈액의 분리된 비세포 부분, 및 이들의 조합을 포함한다. 스트레스 인자들의 효과는 분획에 포함된 혈액 및/또는 그 세포 또는 비세포 부분을 변형하는 것이다. 변형된 분획은, 바람직하게는 동맥내 주사, 근육내 주사, 정맥내 주사, 피하 주사, 복강내 주사, 및 구강, 비강 또는 직장 투여로부터 선택된, 백신접종(vaccination)에 적당한 경로로 피험자의 체내로 재도입된다.

본 발명의 방법에 따라서 혈액 분획이 생체 외에서 투여되는 스트레스 인자는 온도 스트레스(체온 이상 또는 이하의 혈액 온도), 산화적 환경 및 전자기적 발산으로부터 개개로 또는 조합으로, 동시에 또는 연속적으로 선택된다. 적당하게는, 인간 피험자에서, 분획은, 피험자의 체내로 재투여되는 경우에, 피험자 내에서 최소한 CHF의 부분적인 완화를 달성할 수 있기에 충분한 부피를 갖는다. 바람직하게는, 항응고제, 예를 들어 2ml의 나트륨 시트레이트와 함께, 분획의 부피는 약 400ml까지, 바람직하게는 약 0.1 내지 약 100ml까지, 더욱 바람직하게는 약 5 내지 약 15ml까지, 더더욱 바람직하게는 약 8 내지 약 12ml까지, 가장 바람직하게는 약 10ml이다.

본 발명에 따르면, 혈액에 적절한 변형이 가해지는 것을 보장하기 위하여, 상기 언급한 3가지 스트레스 인자 모두를 분획에 동시에 가하는 것이 바람직하다. 본 발명의 일부 구현예에서는 또한 상기 스트레스 인자 중의 두 가지, 예를 들어 온도 스트레스 및 산화 스트레스, 온도 스트레스 및 전자기적 발산, 또는 전자기적 발산 및 산화 스트레스를 가하는 것이 바람직할 수도 있다. 적절한 수준의 스트레스 인자를 사용함으로써 효과적으로 혈액을 변형시켜 피험자 내에서 CHF를 완화하도록 주의를 기울여야 한다.

온도 스트레스 인자는 보통 체온보다 높은 온도로 데워 분획을 처리하거나 또는 보통 체온 이하로 분획을 냉각시킨다. 온도는 온도 스트레스 인자가 분획에 함유된 혈액 내에서 지나친 용혈(hemolysis)을 야기하지 않도록 선택되고, 따라서 처리된 분획이 피험자로 주사되는 경우에, CHF의 완화가 달성될 수 있도록 한다. 바람직하게는, 온도 스트레스 인자는 분획의 전부 또는 일부분의 온도가 약 55℃ 까지, 더욱 바람직하게는 약 -5℃ 내지 약 55℃의 범위 내에 있도록 가하여진다.

본 발명의 몇몇 바람직한 구현예들에서, 분획의 온도는 보통 체온 이상으로 상승되고, 따라서 분획의 평균 온도는 약 55℃, 더욱 바람직하게는 약 40℃ 내지 약 50℃, 더더욱 바람직하게는 약 40℃ 내지 약 44℃, 가장 바람직하게는 약 42.5±1℃의 온도를 초과하지 않는다.

다른 바람직한 구현예들에서, 분획은 보통 체온 이하로 냉각되고, 따라서 분획의 평균 온도는 약 -5℃ 내지 약 36.5℃, 더욱 바람직하게는 약 10℃ 내지 약 30℃, 더더욱 바람직하게는 약 15℃ 내지 약 25℃의 범위 내에 있다.

산화적 환경 스트레스 인자는 분획에 고체, 액체 또는 기체 산화 시약을 가하는 것일 수 있다. 바람직하게는, 그것은 분획을 의약급(medical grade) 산소 및 오존 기체의 혼합물에 노출시키는 것을 포함하며, 가장 바람직하게는 오존을 소량 성분으로 가지는 의약급 산소 기체의 흐름을, 상기 언급한 온도 범위에서, 분획을 통하여 버블링(bubbling)함으로써 노출시키는 것을 포함한다. 기체의 오존 함량과 기체의 흐름 속도는 바람직하게는, 그 자체로 또는 다른 스트레스 인자와 함께, 혈액 분획으로 도입되는 오존의 양이 치료법이 비효율적이 되도록 하는 과도한 수준의 세포 손상을 야기하지 않도록 선택된다. 적절하게는, 기체 흐름은 오존 함량을 약 300㎍/ml까지, 바람직하게는 약 100㎍/ml까지, 더욱 바람직하게는 약 30㎍/ml까지, 더더욱 바람직하게는 약 20㎍/ml까지, 특히 바람직하게는 약 10㎍/ml 내지 약 20㎍/ml까지, 그리고 가장 바람직하게는 14.5±1.0㎍/ml까지 갖는다. 기체 흐름은 적절하게는 분획에 약 2.0리터/분까지, 바람직하게는 0.5리터/분까지, 더욱 바람직하게는 0.4리터/분까지, 더더욱 바람직하게는 0.33리터/분까지, 그리고 가장 바람직하게는 0.24±0.024리터/분까지의 속도로 표준 온도 및 압력(standard temperature and pressure, STP) 하에서 공급된다. 기체 흐름 속도의 하한선은 바람직하게는 0.01리터/분보다 낮지 않고, 더욱 바람직하게는 0.1리터/분보다 낮지 않고, 더더욱 바람직하게는 0.2리터/분보다 낮지 않다.

전자기 방출 스트레스 인자는 분획을 상기 언급한 온도로 유지하고 산소/오존 기체 혼합물을 그 분획을 통하여 버블링하면서 전자기 방출 소스(source)로부터 처리하며 조사(irradiating)함으로써 적절하게 가해질 수 있다. 바람직한 전자기 방출은 광 조사(photonic radiation), 더욱 바람직하게는 자외선(UV), 가시광선 및 적외선, 및 더더욱 바람직하게는 자외선으로부터 선택된다. 가장 바람직한 자외선 소스는 주로 UV-C 밴드 파장, 예를 들어 약 280nm보다 짧은 파장을 방출하는 자외선 램프이다. 그와 같은 램프는 또한 약간의 가시 및 적외선을 방출할 수 있다. 표준 UV-A(약 315 내지 약 400nm의 파장) 및 UV-B(약 280 내지 약 315nm의 파장)소스에 상응하는 자외선이 또한 사용될 수 있다. 예를 들어, 상기 언급한 온도 및 산화적 환경 스트레스 인자와 동시에 가하여진, 그와 같은 자외선의 적절한 투여량은 분획을 담고 있는 샘플 용기를 둘러싸도록 배열된 8개까지의 램프들로부터 얻을 수 있으며, 상기 램프들은 혈액의 표면에서 총 자외선 에너지를 전달하기 위한 강도인 약 0.025 내지 약 10줄/cm², 바람직하게는 약 0.1 내지 약 3.0줄/cm²로 작동하는 것 들이 유리하게 사용될 수 있다. 바람직하게는, 그와 같은 램프 4개가 사용된다.

분획이 스트레스 인자에 투여되는 시간은 통상적으로 약 60분까지의 범위 이내이다. 시간은 선택된 전자기 방출의 강도, 온도, 산화제의 농도 및 분획에 공급되는 속도에 어느 정도 의존한다. 일단 다른 스트레스 인자의 수준이 정해진 경우에는, 최적의 시간을 설정하기 위한 약간의 실험이 작동기(operator) 부분에서 필요할 수도 있다. 대부분의 스트레스 인자 환경 아래에서, 바람직한 시간은 대략 약 2 내지 약 5분, 더욱 바람직하게는 약 3 내지 약 3.5분의 범위 내에 있다. 시작 혈액 온도 및 그것이 미리 정해진 온도로 가열되거나 또는 냉각될 수 있는 속도는 피험자에 따라 달라질 수 있다. 그와 같은 처리는 피험자에 주사할 수 있도록 준비된 변형된 혈액 분획을 제공한다.

본 발명의 바람직한 공정의 수행에 있어서, 혈액 분획은 미국특허 제4,968,483호(Mueller)에 서술된 형태의 장치를 사용하여 스트레스 인자로 처리될 수 있다. 분획은 기계에 장착된 적당한, 살균된, 자외선-투과 용기에 놓여진다. 자외선 램프는 자외선 램프의 출력이 안정화될 수 있도록, 산화 스트레스 인자를 공급하는 기체 흐름이 분획에 가해지기 전에 고정된 시간 동안 켜진다. 자외선 램프는 통상적으로 분획의 온도가 미리 정해진 값, 예를 들어 42.5±1℃로 조정될 때까지 켜진다. 그 후, 공지의 조성 및 조절된 흐름 속도를 갖는 산소/오존 기체 혼합물을 약 60분간, 바람직하게는 2 내지 5분간, 가장 바람직하게는 상기 서술한 바와 같이 약 3분간의 미리 정해진 시간 동안, 분획에 가하여 분획이 3가지 스트레스 인자를 동시에 겪도록 한다. 이러한 방식으로, 혈액은 원하는 효과를 얻기 위하여 본 발명에 따라 적당하게 변형된다.

피험자는, 바람직하게는 치료 과정을 겪게되며, 각각의 치료는 혈액 분획의 제거, 상기 서술한 바와 같은 그 처리 및 처리된 분획의 피험자로의 재투여를 포함한다. 그와 같은 치료과정은 처리된 혈액 분획을 연속적인 몇 일간 매일 투여하는 것을 포함할 수 있으며, 또는 정해진 시간 동안 첫 번째 매일 치료과정 후, 간격을 두고 하나 또는 그 이상의 추가의 매일 치료과정을 포함할 수 있다.

하나의 바람직한 구현예에서, 피험자는 처리된 혈액의 4 내지 6개 분획의 투여를 포함하는 초기 치료과정을 겪게 된다. 다른 바람직한 구현예에서는, 피험자는 처리된 혈액의 2 내지 4개 분획을, 연속적인 한쌍의 분획으로 연속적인 몇 일간 투여하거나, 또는 어떠한 분획도 환자에 투여되지 않고, 휴지기가 연속적인 분획의 하나의 선택된 쌍을 3 내지 15일간 분리시키는, 1 내지 21일간의 휴지기로 분리된 몇 일간 투여하는 것을 포함하는 초기 치료과정을 겪게 된다. 더욱 구체적이고, 바람직한 구현예에서 초기 치료과정의 투여 요법(dosage regimen)은 3가지 분획을 포함하고, 첫 번째 및 두 번째 분획은 연속적인 몇 일간 투여되고, 두 번째 및 세 번째 분획의 투여 사이에 11일간의 휴지기가 존재하는 것이다. 본 발명의 방법에서는, 임의의 주어진 날에 하나의 분획만을 피험자에게 투여하는 것이 바람직하다.

초기 치료과정에 뒤이어 부가적인 치료과정을 이어서 투여하는 것이 바람직할 수 있다. 바람직하게는, 연이은 치료과정은 초기 치료과정의 종료 후 최소한 약 3주 후에 투여된다. 특히 바람직한 한가지 구현예에서는, 피험자는 초기 치료과정의 종료에 이어서, 30일마다 하나의 처리된 혈액의 분획을 6개월간 투여받는 것을 포함하는 두 번째 치료과정을 받는다.

연이은 치료과정 사이의 간격은, 본 발명의 치료의 긍정적인 효과가 유지되는 방식이어야 하고, 개인 피험자의 관찰된 반응에 기초하여 결정될 수 있다는 것을 인지하게 될 것이다.

상기 서술한 바와 같이, 본 발명의 방법은 다른 CHF 치료법과 조합하여 보조적인 치료로서 바람직하게 사용될 수 있다. 그와 같은 다른 치료법의 바람직한 예들로는 하나 또는 그 이상의 ACE 저해제, β-차단제, 알도스테론 길항제, TNF 차단제, TNF 생산 억제제 및 다른 형태의 일상적인 치료들이 포함된다.

본 발명을, 단지 예로서, 첨부된 도면을 참조하며 설명하기로 하며, 도면에서:

첨부된 도면의 도 1 및 2는 하기 서술된 실시예 2로부터 얻은 결과를 그래프로 표시한 것이고;

첨부된 도면의 도 3은 하기 서술된 실시예 3으로부터 얻은 결과를 그래프로 표시한 것이고;

첨부된 도면의 도 4는 하기 서술된 실시예 4로부터 얻은 결과를 그래프로 표시한 것이고;

첨부된 도면의 도 5 내지 8은 하기 서술된 실시예 5로부터 얻은 결과를 그래프로 표시한 것이고; 및

첨부된 도면의 도 9는 접촉 고민감성 Th1-매개 염증에서 본 발명의 치료법의 효과를 그래프로 표시한 것이다.

본 발명은 하기 특정 실시예를 참조하여 더욱 상세히 설명 및 서술된다.

실시예 1

본 실시예는 생후 첫해 동안 복합적인 죽상경화성 병변(atherosclerotic lesions)을 겪는 것으로 알려진 와타나베 토끼의 내피 기능에 대한 본 발명의 치료법의 효과를 결정하기 위하여 수행된 연구를 서술한다. 상기 언급한 바와 같이, 내피 기능장애는 CHF의 병생리학과 연관되어 있다.

토끼들은 7 내지 8개월된 것들이 연구에 투입되었으며, 기준선 측정을 위하여 바로 치사시킨 첫 번째 군, 본 발명에 따라서 처리된 혈액 주사를 받은 두 번째 군(n=10), 처리되지 않은 혈액 주사를 포함한 가짜 처리를 받은 세 번째 군(n=10)의 3가지 군으로 무작위화(randomize) 하였다.

치료법은 10주에 걸쳐 처리된 혈액의 총 4번의 주사를 포함한다. 미국특허 제4,968,483호(Mueller 등)에 일반적으로 서술된 장치 내에서 하기 3가지 스트레스 인자에 노출시킴으로써 혈액을 처리하였다.

(a) 42.5±1.0℃의 상승된 온도;

(b) 오존 14.5±1.0㎍/ml을 함유하는 의학급 산소의 기체 혼합물, 3시간 동안 240±24ml/분의 흐름 속도로 혈액을 통과하여 버블링시킴; 및

(c) 파장 253.7nm 및 총 에너지 밀도 2.0줄/cm²(상기 언급한 범위 내에서 약 간의 변이 있음)의 자외선.

처리한 혈액을 동물에 근육내 주사로 투여하였다. 콘트롤 동물에는 처리된 동물과 마찬가지로 동일한 주사 일정으로 처리되지 않은 혈액을 근육내 주사로 투여하였다.

모든 동물들은 11개월 되었을 때 치사시켰다. 동물의 장골 동맥(iliac arteries)으로부터 링 프레퍼레이션(ring preparation)을 취하고 페닐에프린(혈관수축제)으로 처리한 후에 아세틸콜린(내피-의존성 혈관확장제)에 의하여 유도된 이완(relaxation)의 정도를 평가하였다.

링 프레퍼레이션의 평가는 처리되지 않은 혈액으로 주사된 콘트롤 동물(22.9±4%, p 0.001 이하)에 비하여 처리된 동물에서 내피-매개 혈관이완(vasorelaxation)의 유의성 있는 증가(52.5±6%)가 관찰된다는 것을 보여주었다.

내피가 링 프레퍼레이션으로부터 제거되었을 때에는 아무런 이완이 관찰되지 않았으며, 이는 본 발명의 치료법의 내피-특이적 효과를 더욱 확인해주는 것이다.

실시예 2

본 실시예는 말초 혈관 질환(peripheral vascular disease, PVD)을 앓고 있는 환자들에 대한 본 발명의 치료법의 효과에 대한 연구를 서술한다. 본 연구는 스웨덴 룬드 대학 병원에서 수행되었다.

본 연구는 그 주된 증상이 간헐성 파행(intermittent claudication)인, 온건하게 진전된 PVD를 앓고 있는 18명의 환자(7명 남자, 11명 여자)에 대한 플라세보- 조절, 이중 맹검 연구를 포함한다. 연구에 참여한 환자들은 스웨덴 룬드 대학 병원 내부 의약 부서의 참가 집단으로부터 모집되었다.

환자들을, 무작위로 플라세보(10ml의 따뜻한 식염수 근육내 주사) 또는 처리된 자가혈 10ml의 근육내 주사를 포함하는 본 발명에 따른 치료법을 받도록 할당하였다. 혈액의 처리는 환자의 정맥혈 10ml 분획을 항응고제로서 3 내지 4%의 나트륨 시트르산 2ml에 수집하는 것을 포함한다. 각 혈액 분획을 살균, 일회용 저밀도 폴리에틸렌 용기로 옮기고 미국특허 제4,968,483호(Mueller 등)에 일반적으로 서술된 장치 내에서 하기 환경에 노출시켰다:

(a) 42.5±1.0℃의 상승된 온도;

(b) 오존 14.5±1.0㎍/ml을 함유하는 의학급 산소의 기체 혼합물, 3시간 동안 STP에서 240±24ml/분의 흐름 속도로 혈액을 통과하여 버블링시킴; 및

(c) 파장 253.7nm 및 총 에너지 2.0줄/cm²의 자외선.

각 환자에 식염수 또는 처리된 혈액을 9주에 걸쳐 12번 주사하였다.

치료법은 피부 혈액 흐름의 회복 속도 및 치료법을 개시하기 전 및 치료를 개시한 후 3주, 6주, 9주, 및 2달 후의 각 환자의 극단(extremities)에서 혈액 흐름의 총 일시적 폐색(occlusion)에 이은 산소 긴장도(oxygen tension)를 측정함으로써 평가하였다.

발에서의 피부 혈액 흐름은 레이저 도플러 플럭스메트리(Laser Doppler Fluxmetry, LDF)에 의하여 측정하였으며, 산소 긴장도는 발에서의 경피성(transcutaneous) 피부 산소 압력(TcpO₂)을 측정함으로써 결정하였다. 본 발명의 치료를 받고 있는 환자들에서는, 최대 관류(perfusion)에 도달하는 총 시간(TP_H) 및 최대 관류에 도달하는 절반 시간(T_1/2P_H) 양자 모두에서 치료-관련 감소로 향하는 강한 경향이 관찰되었으며, 이는 피부 혈액 흐름의 회복 속도에 있어서의 향상을 나타내는 지표가 된다. 콘트롤 군에서는 아무런 변화도 관찰되지 않았다.

본 발명에 따라서 치료된 환자들에서 혈액 흐름의 향상된 회복 속도는 치료 과정 중에 명백하고 지속적이지만, 치료 개시 후 2개월이 지날 때까지는 현저한 정도에까지 이르지는 못했다. 플라세보 및 치료 군의 T_1/2P_H의 비교는 LDF에 의하여 측정하였으며, 도 1에 나타나 있다.

치료된 군에서는 또한 피부 산소 함량이 더욱 빠른 회복 속도로 향하는 경향이 관찰되었다. 이러한 차이는 치료 개시 후 2개월이 경과한 후에는 통계적으로 유의성이 있었다. 플라세보 군에 비한 치료 군의 허혈(ischemia) 후 최대 TcpO₂에 대한 절반 시간의 비교(O₂T_1/2)는 도 2에 나타나 있다.

그러므로, 본 연구는 이러한 온건하게 진전된 PVD 환자 군에서 본 발명의 치료가 발의 피부에서 혈액의 흐름이 총 폐색 허혈의 기간에 이어 회복되는 속도에 명백한 생물학적 영향을 미침을 나타내었다. 비슷하지만, 그 강도는 더 작은 효과가 TcpO₂ 회복의 속도에 대하여 관찰되었으나, 반면에 플라세보 치료를 받는 환자들 은 아무런 변화를 나타내지 않았다. 이러한 결과들은 본 발명의 치료가 내피 기능에 이로운 효과를 갖는다는 것을 암시하며, PVD를 앓고 있는 환자에서 피부 미세순환 기능을 향상시키는 것으로 보인다.

실시예 3

본 실시예는 관절염의 발병을 예방하기 위하여 본 발명의 치료법을 사용하는 것에 관한 것이며, 관절염에 대하여 확립된 동물 모델에서 수행된 연구의 결과를 서술하는 것이다. 본 연구에서 사용된 특정 동물 모델은 쥐에서의 아주반트-유도 관절염이었다(예를 들어, Pearson, C., 1956, "Development of Arthritis, periarthritis and periostitis in rats given aduvant", Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 91:95). 본 모델에 따라서, 마이코박테리움 부티리쿰(Mycobacterium butyricum)을 포함한 아주반트를 쥐들에 주사함으로써 쥐들에서 관절염을 유도하였다.

4 내지 5주 된, 100 내지 120g의 수컷 루이스 쥐들을 Charles River Laboratories로부터 구입하였고, 일주일간 검역한 후 연구에 투입하였다. 관절염을 유도하기 위한 아주반트 혼합물은 50mg의 M. 부티리쿰(Difco Laboratories, Inc., Detroit, MI)을 5ml의 엷은 백색 파라핀 오일-m3516(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)에 현탁시킴으로써 제조하였고, 균질화기(homogenizer)를 사용하여 완전히 혼합하였다. 0.15mg M. 부티리쿰을 공급하기에 충분한 혼합물의 분획을 각각 동물의 꼬리 기저(base)에 피하로 주사하였다. 관절염의 징후들이 유도 후 약 12일이 경과하자, 각 동물들에서 나타났으며, 이는 다리 팽창으로 확인되었다.

아주반트 혼합물이 주사되지 않은 두 마리의 쥐들은 혈액 공여자로 사용하였다. 혈액은 공여자로부터 심장 천공(cardiac puncture)에 의하여 채집하였으며, 구연산화 혈액(citrated blood) 10ml를, 본 발명에 따른 스트레스 인자로 생체 외에서 처리하기 위하여 살균, 저밀도 폴리에틸렌 용기로 옮겼다. 상기 언급한 Mueller 특허에 일반적으로 서술된 바와 같은 장치를 사용하여, 혈액에 본 발명에 따른 처리로써 스트레스를 가하였다.

6마리의 동물에 처리된 혈액 0.2ml 분획을 2회 주사하였으며, 주사는 관절염 발병 이후에 연속되는 날 동안 투여하였다. 8마리의 콘트롤 군은 처리된 동물과 같은 동일한 주사 스케줄을 사용하여 처리되지 않은 혈액의 주사를 받았다. 주사는 관절염 유도 이후 하루가 지나서 개시하였다. 관절염 발병 이후에, 하루건너 간격으로 동물들의 뒷발(hind paw) 부피를, 상단 적재 메틀러 천칭(top-loaded Mettler balance)을 이용하여 250ml 비이커에서의 물 치환(water displacement)에 의하여 측정하였다. 각각의 동물 군에 대한 결과를 평균하고, 첨부된 도 3에, 관절염 유도 후 경과한 날에 대한 평균 발 부피에 관한 도면으로서 그래프로 나타내었다. 상단 곡선은 동물들의 콘트롤 군으로부터 유도되었으며, 하단 곡선은 처리된 혈액 주사 과정을 거친 동물들로부터 유도되었다. 작아진 발 부피에서 나타나는 것처럼, 콘트롤 군의 동물들에 비하여 처리된 동물들에 대한 관절염 심각도에 있어서 유의성 있는 감소가 명백하였다.

상기 결과들은 변형된 포유류 혈액에 의한 피험체의 처리는 포유류에서 관절염의 발병을 효과적으로 방지할 수 있다는 것을 보여준다.

처리된 동물들과 미처리된 동물들의 림프절에서 인터루킨-6 mRNA 발현을, 관절염 유도 후 10일이 경과한 후에 측정하였고, 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.

[표 1]

처리	인터루킨-6 카피 수(4500 액틴 유닛 당)
액티브	＜35(n=8)
콘트롤	254±203(n=8)

표 1에 나타낸 결과는 본 발명에 따른 처리가 관절염의 Th1/TNF-α-의존성 모델에서 염증성 시토카인의 수준을 조절할 수 있다는 것을 보여준다. 인터루킨-6 및 TNF-α와 같은 염증성 시토카인의 생산이 CHF의 병생리학과 연관되어 있다는 증거가 있다.

실시예 4

본 실시예에서 보고된 실험은, 다양한 체내 기관의 허혈 및 뒤이은 재관류를 포함하는 동물 모델 시스템을 사용하여, 본 발명의 치료가 세포사멸 및 괴사를 감소시키는 효과가 있다는 것을 설명한다. 허혈-재관류 부상은 감염된(affected) 기관 및 조직에서 세포사멸 및 괴사의 증가를 포함하는 것으로 알려져 있으며, 예를 들어 Saikumar p, et. al. "Mechanisms of cell death in hypoxia/reoxygenation injury", Oncogene 1998 Dec 24; 17(25):3341-9; 및 Burns A.T. et. al., "Apoptosis in ischemia/reperfusion injury of human renal allografts", Transplantation, 1998 Oct 15;66(7):872-6, 및 상기 문헌들에 앞선 또는 뒤이은 다른 문헌들에 나타나 있다. 세포 수준에서 세포사멸의 결정에 관한 공지의 기술이 본 실시예에서 적용된다.

암수 같은 숫자의, 1 내지 2살 된, 순종의 보통 비글 견(beagle dogs)을 실험용 동물로 사용하였다. 동물들은 A, B, C, D 4개의 군으로 나누었으며, 각각의 군은 수컷 3마리, 암컷 3마리로 이루어진, 6마리의 동물로 이루어졌다. A군과 C군의 동물들은 본 발명의 과정을 거치는데, 이는 8ml 혈액 분획의 매일 제거(daily removal)를 10일 코스로 2회 반복하고, 산소/오존, 자외선 조사 및 열로 분획을 체외(extracorporeal) 처리하고, 근육 내 주사에 의하여 처리된 분획 5ml를 동일한 동물에 재투여함으로써 이루어진다.

그와 같은 각각의 처리를 하기와 같이 수행하였다.

동물로부터 8ml 혈액 분획을 추출하고, 시트르산 나트륨(2ml)으로 처리한 후, 살균한 용기에 보관하였다. 분획을, 상기 언급한 Mueller의 미국 특허 4,969,483에 일반적으로 서술된 장치 내에서, 자외선 조사, 산소/오존 기체 산화적 환경 및 상승된 온도 스트레스 인자로 동시에 처리하였다. 더욱 구체적으로는, 살균, 자외선 투과 용기에 담긴 혈액 샘플을, 적외선 램프를 사용하여 42.5℃로 가열하고, 그 온도로 유지하는 동안에, 미리 서술한 바람직한 조건하에서, 주된 파장이 253.7nm인 자외선으로 조사하였다. 동시에, 오존 함량이 13.5 내지 15.5㎍/ml인 의학급 산소 및 오존의 혼합물을 60 내지 240mls/분의 범위 내 흐름 속도로 혈액 샘 플을 통하여 버블링시켜 주었다(STP). 동시의 자외선 노출 및 기체 혼합물 유입의 시간은 3분이었다. 처리된 혈액 분획 5ml 부분을 각각의 시험 동물에 근육 내 주사로 재주사하였다.

본 발명에 따른 치료 코스를 거친 A 및 C군의 각각의 동물은, 10일 간의 치료 코스 사이에 3주의 휴지기를 겪게 하였다. B 및 D군은 콘트롤 군이었으며, 5ml 생리 식염수 매일 주사로 2번의 10일 코스를 겪게 하였으며, 10일 코스 사이에는 3주의 휴지기를 겪게 하였다.

주사의 2번째 코스를 겪고 하루가 지난 후, 동물들을 경 기체 마취(light gas anaesthesia)로 마취하였고, 각 동물들의 우측 신장을 후방 절개법(back incision)을 통하여 제거하였다. 폐색 클립(occlusive clip)을 남아 있는 신동맥 및 정맥(renal artery and vein)에 꽂아서 좌측 신장을 60분 동안 일시적인 허혈 상태로 노출시켰다. 그 후, 클립을 제거하여 정상적인 혈류로써 신장의 재관류를 유도하였다.

동물들을 허혈 과정 이후 6일 동안 관찰하였고, 이어 치사시켰다. 각 동물의 허혈 신장을 외과적으로 제거하고 두 부분으로 나누었다. 하나의 부분은 -80℃에서 동결 보관하였고, 다른 부분은 면역- 및 통상의 조직병리학(immuno- and routine histopathology) 연구를 위하여 10% 포르말린에 고정시켰다.

허혈 및 콘트롤 신장으로부터 분리된 근위 관상 세포(proximal tubular cells)에서, 콘트롤 신장의 제거 및 뒤이은 치사 시에, 미토콘드리아 막 포텐셜을 측정하였다. 이러한 목적을 위하여, 개의 신장 근위 관(kidney proximal tubes)을 콜라게나아제(collagenase) 처리 과정에 의하여 정상 및 허혈 신장 피질(cortex)로부터 정제하였고, 상기 처리 과정은 Marshansky et. al., "Isolation of heavy endosomes from dog proximal tubes in suspension", J.Membr.Bio 153(1), 59-73, 1996에 서술되어 있다. 250mM 수크로오스, 10mM HEPES-Tris(pH7.5), 및 250μM EDTA를 함유한 완충용액에서 조직을 균질화(homogenization)한 이후에, 신(renal) 미토콘드리아를 분별 원심분리(differential centrifugation)에 의하여 현탁액에서 분리하였다(Marshansky, "Organic hydroperoxides at high concentrations cause energization and activation of AATP synthesis in mitochondria", J.Biol.Chem. 264(7), 3670-3673. 1989.). 세포 잔해(debris)를 30분 동안 10,000g에서의 원심분리에 의하여 제거하였다. 미토콘드리아를 EDTA 없는 수크로오스/HEPES 완충용액으로 세척하였다.

미토콘드리아 막 포텐셜은 Kroemer, G., Zamzam, N. and Susin, S.A., "Mitochondrial control of apoptosis", (Review) Immunology Today(1997)v.18, p44-51; with JC-1 dye - Salvioli et.al., "JC-1, but not DiOC6(3) or rhodamine 123, is a reliable fluorescent probe to assess delta psi changes in intact cells: implications for studies on mitochondrial functionality during apoptpsis" FEBS Letters 411(1), 77-82.1987에 서술된 바와 같이 측정하였다. 정상 및 허혈 신장으로부터 정제된 미토콘드리아 현탁액 내의 JC-1 형광은 Deltascan Model RFM-2001 스펙트로플로리미터(Photon Technology International, South Brunswick, NJ) 상에서 계속적으로 모니터링 하였다. 여기 파장(excitation wavelength)은 490nm(슬릿 폭 4nm)이었으며, 방출 파장(emission wavelength)은 590nm(슬릿 폭 4nm)이었다. 신호는 Felix^R(버젼 1.1) 소프트웨어를 사용하여 기록하였다. 모든 측정은 37℃에서 계속적으로 교반하며 수행하였다. 미토콘드리아 막 포텐셜의 측정을 위한 배양 완충용액은 200mM 수크로오스, 5mM MgCl₂, 5mM KH₂PO₄, JC-1 0.1 μM 및 HEPES-Tris(pH7.5) 30Mm을 함유하였다. 기질과 저해제의 농도는 10mM 숙시네이트, 0.1μM FCCP를 갖거나 갖지 않는 0.1μM 로테논(rotenone)이었다. 근위 관상 미토콘드리아 막 포텐셜은 허혈 전에 우측(콘트롤) 신장 및 허혈 후 6일이 경과한 날 개의 치사 후에 좌측(허혈) 신장에서 평가하였고, 첨부 도면 도 4a에 나타낸 바와 같이 FCCP로 미토콘드리아를 언커플링(uncoupling)한 후 JC-1 형광의 차이로써 평가하였다. 각각의 측정을 위하여, 정제 물질 50㎍ 단백질을 사용하였다.

JC-1 형광은 미토콘드리아 막 포텐셜에 비례한다. 대측 신적출된(contralateral nephrectomized) 신장을 콘트롤로 사용하였다. 도 4b에서 명백한 것처럼, 본 발명의 치료 과정은 비허혈 콘트롤 우측 신장의 막 포텐셜은 변형시키지 않는다(치료 vs 식염수 p=0.445). 그러나, 식염수 주사 동물의 허혈 신장은 콘트롤 신장과 비교하여 유의성 있게 낮은(p＜0.05) 형광을 나타내었다. 본 발명에 따른 스트레스 처리는 허혈/재관류 동안 미토콘드리아의 언커플링을 방지하였고, 막 포텐셜은 허혈과 콘트롤 신장 사이에서 유의성 있는 차이(p=0.244)를 나타내지 않았다. 이러한 척도는 재관류 이후 최소한 6일 동안 본 발명의 과정에 따른 사전처리가 된 개들의 허혈 신장에서 유의성 있게 높게(p=0.0006 vs 식염수-주사 개들) 남아 있었다.

이러한 결과들은 본 발명의 과정이 세포사멸에 대한 신장의 보호에 영향을 미치며, 그리고/또는 미토콘드리아 수준에서의 회복을 촉진시키는 것을 나타낸다. 따라서 본 발명의 과정은 통상적으로 세포사멸을 가속화시키게 되는 뒤이어 직면하게될 인자들에 대한 포유류 몸체의 세포, 조직 및 기관의 사전-조절(pre-conditioning)을 나타낸다.

구체적으로 미토콘드리아 막 포텐셜의 보존은 미토콘드리아를 보호하고, 따라서 세포사멸에 대하여 세포들을 사전조절(precondition)하는 본 치료법의 능력을 입증한다.

실시예 5

12마리의 SHR 래트 군을 상기 실시예 4에 서술된 바와 같이 혈액 스트레스화 풀(pool)의 주사로 처리하거나, 또는 콘트롤 동물들에서 식염수 주사로 처리하였다. 본 유전 가계(strain)의 모든 동물들로부터의 혈액은 동일하므로, 이러한 동일 가계의 한 동물로부터의 혈액을 테스트 동물로의 투여를 위한 본 발명의 과정에 의하여 처리하였다. 혈액을, 항응고제로서 시트르산 나트륨으로 처리하였으며, 살균 용기에 보관하였다. 래트들에 -14일 및 -13일에 150㎕의 스트레스화된 혈액을 주사하고, 11일간의 휴지기간을 갖게 한 다음, 허혈 수술 하루 전에 세 번째 주사를 놓거나, 또는 병행하여 식염수를 주사하였다. 수술 당일에, 쥐들을 약한 후루란(light flurane)으로 마취시키고, 우측 신장을 중앙-복부 절개법(mid- abdominal incision)을 통하여 제거하였다. 그 후 좌측 신동맥 및 정맥을 미세 클립을 사용하여 폐색시킴으로써 일시적인 허혈 상태에 놓이게 하였다. 그 후 피부를 일시적으로 폐쇄시켰다. 폐색 후 60분이 경과하고, 클립을 제거한 후, 상처를 봉합으로 밀봉하였다. 동물들을 재관류 후 12시간이 경과한 다음 치사시켰다.

테스트 동물들의 허혈 및 비허혈 신장을 제거하고, DNA 래더링 테스트를 수행하였다. 180 내지 200 염기 쌍으로의 올리고뉴클레오소말(oligonucleosomal) DNA 단편화는 세포사멸을 겪는 다양한 기관들에서 아가로오스 겔 전기영동 이후에 래더로서 나타나는 특이적인 패턴이다. 신장 피질에서의 DNA 단편화 정도를 평가하기 위하여, 분쇄된 신장 피질의 분획 무게를 측정하고, EDTA 존재 하에서 단백질가수분해효소 K 및 RNA분해효소 A로 조직을 소화한 후, 총 조직 DNA를 페놀-클로로포름 과정에 의하여 추출하였다. 추출된 DNA 1㎍을 말단 데옥시뉴클레오티딜 전이효소(terminal deoxynucleotidyl transferase)를 사용한 효소 분석법에 의하여 P³²-dCTP로 표지시켰다(Teiger et.al., 'Apoptosis in pressure overload-induced heart hypertrophy in the rat', J. Clin. Invest. 97, 2891-2897, 1996). 증가하는 양의 방사-표지된 DNA를 1.5% 아가로오스 겔에 로딩하였다. 전기영동 이후에, DNA를 나이론 막(Hybond) 위로 옮기고, 150 내지 1500 bp DNA 단편과 연관된 방사능을 Phosphorlmager(Molecular Dynamics)에서 정량하였다. 각각의 샘플에 대한 후퇴선(regression line)을 겔에 로딩된 DNA의 기능으로서 방사능에 대하여 그렸다(deBlois et.al., 'Smooth muscle cell apoptisis during vascular regression in spontaneously hypertensive rats.' Hypertension 29, 340-349, 1997). 선형 후퇴의 기울기는 DNA 단편화 지수로 기능하였다(cpm/pixel per ㎍ DNA).

허혈-재관류 신장 및 스트레스 혈액 주사를 맞지 않은 동물들로부터의 모든 정상, 비-I/R 신장으로부터의 결과들을 재관류 개시 후 시간에 대한 다양한 샘플들의 후퇴선 기울기(세로축) 플롯으로서 도 5에 그래프로 나타내었다. DNA 단편화의 지표인, DNA 래더링은 대측 비허혈 기관에 비하여 허혈 신장 피질에서 명백히 증가하였고, 12시간에서 얻어진 최대값은 48시간 경에는 기저값 근처로 회복되었다. 따라서, 12시간이, 본 발명의 스트레스 혈액의 조기 허혈-유도 신 세포사멸(early ischemia-induced renal apoptosis)에 대한 효과 연구에 있어서, 시간 지점(time point)으로 선택되었다.

첨부된 도 6a는 150 내지 1500 염기쌍 범위 내에서, 서술된 바와 같이 방사능 표지시켜 DNA 단편에 방사능 표지를 부착시킨 단편화된 DNA의 전기영동 사진이다. 궤적(trace) S는 신장 허혈-재관류 이전에 식염수 주사를 맞은 동물들의 신장 DNA로부터 유래하며, 궤적 V는 신장 허혈-재관류 이전에 스트레스 혈액 주사를 맞은 동물들의 신장 DNA로부터 유래한다. 도면은 60분간의 신 허혈은 12시간째에 래트들의 양쪽 군 모두에서 단편화된 DNA의 명백한 축적을 유도하지만, 그 척도의 수준은 처리된 혈액을 받은 동물들에서는 유의성 있게 낮다는(p＜0.05) 것을 보여준다. 도 6b는, 임의 단위(arbitrary unit)로, 샘플로부터의 방사능 양을 정량한 것이며, 허혈/재관류의 결과로서 DNA 단편화-래더링이 S 및 V 샘플 모두에서 발생하 지만, 그 양은 S 샘플과 비교할 때 V 샘플에서 현저히 감소된 것을 보여준다. 도 6b에 나타난 결과는 각 경우에서 6마리 동물들의 평균값이다.

이러한 결과들은 신 재관류 부상에 대한 본 발명에 따른 스트레스 혈액 투여의 세포보호(cytoprotective) 효과가 초기 또는 후기의 세포사멸 저해를 포함한다는 것을 확인시켜 준다.

세포사멸 초기 단계 동안(12시간 후) 허혈/재관류에 이은 신장 내 세포사멸 감소에 있어서의 본 발명의 치료법의 능력을 DNA 래더링 및 Tdt에 의해 염색된 세포사멸성 핵의 밀도에 의해 결정하고, 도 7 및 도 8에 각각 나타내었다. 또한, 도 3B는 허혈/재관류에 이은 신장 내 세포 숫자가 또한 본 발명에 따라 치료받은 동물들에서 유의성 있게 높다는 것을 나타낸다.

실시예 6

본 실시예는 진전된 만성 울혈성 심부전증을 앓고 있는 소수의 인간 환자들에 대한 치료를 서술한다. 환자들은 40% 이하의 좌심실 구혈 부분(left ventricular ejection fraction, LVEF)을 갖고, 300m 이하의 6분 도보 거리를 갖는, NYHA 클래스 Ⅲ-Ⅳ 만성 울혈성 심부전증을 지니고 있었다. 환자 중 일부는 사전에 다른 CHF 치료를 받았었다.

프로토콜:

환자들에게 처리된 혈액을 수회 주사한다. 치료 스케줄은 1, 2 및 14일에 주사하고, 5달 동안 매 30일마다 단회 주사를 하며, 각 주사는 10ml 부피를 갖는 것을 포함한다. 각 개인 치료는 하기 단계를 포함한다:

1. 환자 자신의 정맥혈 10ml를 주사용(USP) 3 내지 4% 시트르산 나트륨 2ml에 채집. 치료 도중에 혈액이 응고되는 것을 방지하기 위하여 시트르산 나트륨을 샘플에 가한다.

2. 시트르산화 혈액 샘플을 살균, 일회용, 저밀도 폴리에틸렌 용기로 옮김.

3. 하기 사항들에 동시에 노출시킴으로써 혈액 샘플의 생체 외 처리:

- 42.5±1.0℃로 상승된 온도.

- 14.5±1.0㎍/ml 오존을 함유한 의학급 산소의 기체 혼합물로서, 이를 혈액 샘플에 240±24ml/min(STP에서)의 흐름 속도로 버블링; 및

-253.7nm의 파장을 갖는 자외선.

4. 혈액 샘플을 살균 일회용 용기로부터 살균 주사기로 옮김.

5. 처리된 혈액 샘플 2ml 또는 10ml를 동일한 환자의 둔부 근육에 근육내 주사하고, 주사 부위에 국부 마취(2% 노보카인(Novocain) 또는 동등물 1ml).

상기 (3) 단계에서 서술된 혈액 샘플의 생체 외 처리는 Mueller 등의 미국특허 제4,968,483호에 일반적으로 서술된 바와 같은 장치로 수행된다. 혈액 샘플은 3분 동안 동시에 3가지 모든 스트레스 인자에 노출된다.

CHF의 평가:

환자들을 매 방문마다 부작용 사례들(adverse events)에 대하여 모니터링 한다. 또한, 생존, 입원 및 유의성 있는 부작용 사례들을 모니터하기 위하여 치료 후 추적(post-treatment follow-up)을 수행하였다.

치료의 효율성을 평가하기 위한 일차적인 종점들(endpoints)은 6분 도보 거 리 및/또는 NYHA 기능 분류에 있어서의 변화들이었다. 이차적인 종점들은: 심장 기능의 향상, 이뇨 요구(diuretic requirement)의 감소; 입원 기간의 감소; 및 증상의 향상을 포함한다.

상기 서술된 데이터에 의하여 설명되는 바와 같이, 본 발명의 치료법은 인간 및 몇몇 동물 모델 시스템에서 유의성 있는 생물학적 활성을 가지며, 그들 모두는 Th1/TNF-α의존성 염증 반응을 포함하는 것으로 나타났다. 상기 언급한 바와 같이, 치료법은 전구염증성(pro-inflammatory) Th1-형 면역 반응, 예를 들어 인터루킨-10을 포함하는 항 염증성 TH2 형 시토카인을 증가시킴으로써, 억제-조절하는 것으로 믿어진다. 이러한 사실은 CHF를 특성화하는 3가지 영역 각각에서 치료적 효과를 나타내는, 본 발명의 치료법의 능력을 최소한 부분적으로나마 설명해주는 것이다.

더욱이, 본 발명의 치료법이 인터루킨-10 의존성이며(도 9 및 Shahid S. et al., Journal of Investigative Dermatology, 14, N.4, 2000), 인터루킨-10과 같은 항염증성 시토카인의 촉진-조절 및 TH1-작동 면역 반응의 억제-조절을 야기한다는 것을 암시하는 증거가 있다. 또한, CHF에서의 TNF-α와 관련된 인터루킨-10의 수준에 있어서 감소가 나타나므로, 인터루킨-10은 CHF에서 시토카인 네트워크의 중요 성분이 될 수 있다는 것이 제안된 바 있다(Yamaoka et al., Jpn Circ J63: 951-956).

비록 본 발명이 특히 바람직한 실시예를 참고하여 서술되었으나, 본 발명의 정신(spirit) 또는 범위(scope)로부터 벗어남이 없이 본 발명에 많은 변이가 가하여질 수 있다는 것을 염두에 두여야 한다. 그와 같은 모든 변형들은 하기 클레임의 범위 내에 포함되도록 의도된 것이다.

Claims

환자 혈액의 분획을 생체 외에서(ex vivo) 자외선 및 오존 기체를 포함하는 스트레스 인자로 처리함으로써 제조된, 환자의 변형된 혈액 분획을 포함하는 울혈성 심부전증(CHF)을 앓고 있는 인간 환자에서 울혈성 심부전증을 치료하기 위한 약학 조성물.
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제1항에 있어서, 상기 오존 기체는 의료용 산소(medical grade oxygen)를 포함하여 혼합물을 제공하며, 상기 오존 기체는 10㎍/ml 내지 300㎍/ml의 농도로 혼합물에 포함되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제4항에 있어서, 상기 오존 기체는 10㎍/ml 내지 30㎍/ml의 농도로 혼합물에 포함되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제5항에 있어서, 상기 오존 기체는 13.5㎍/ml 내지 15.5㎍/ml의 농도로 혼합물에 포함되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 혼합물은 0.1리터/분 내지 0.33리터/분의 흐름 속도로 분획에 가해지는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제7항에 있어서, 상기 혼합물은 0.21리터/분 내지 0.27리터/분의 흐름 속도로 분획에 가해지는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제1항, 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 혈액 분획의 처리에 사용된 상기 자외선은 UV-C 밴드 파장을 갖는 자외선을 포함하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제1항, 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 혈액 분획을 처리하는 동안 혈액 분획이 냉각 또는 가열되는 상기 온도는 분획의 최소한 일부분이 -5℃ 내지 55℃의 범위 내에 있는 온도인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제1항, 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 처리 단계 중 분획 내 혈액의 평균 온도는 37℃ 내지 55℃의 범위 내에 있는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제1항, 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 처리 단계 중 분획 내 혈액의 평균 온도는 0℃ 내지 36.5℃의 범위 내에 있는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제12항에 있어서, 상기 분획 내 혈액의 평균 온도는 10℃ 내지 30℃의 범위 내에 있는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제11항에 있어서, 상기 온도는 42.5±1℃인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제1항, 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분획의 부피는 0.1 내지 400ml인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제15항에 있어서, 상기 분획의 부피는 0.1 내지 100ml인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제15항에 있어서, 상기 분획의 부피는 5 내지 15ml인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제1항, 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분획은 2분 내지 60분의 시간 동안 스트레스 인자로 처리되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제18항에 있어서, 상기 분획은 2 내지 5분의 시간 동안 스트레스 인자로 처리되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제1항, 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분획은 자외선 및 오존 기체로 동시에 처리되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
(a) 오존 기체, 열적 스트레스 및 전자기 방출로부터 선택된 스트레스 인자로 생체 외에서(ex vivo) 처리된 환자 자신의 혈액 분획; 및 (b) 니트레이트, β-차단제, ACE 저해제, AT 수용체 차단제, 알도스테론 길항제, 칼슘 채널 차단제, TNF 차단제, TNF-α 생산 억제제, 나트륨 및 유체 제한, 이뇨제 및 디기탈리스로 이루어진 군으로부터 선택된 의약을 포함하는 울혈성 심부전증(CHF)을 앓고 있는 인간 환자에서 울혈성 심부전증을 치료하기 위한 약학 조성물.
제21항에 있어서, 상기 의약은 펜톡시필린(pentoxifylline), TACE 저해제, 암리논(amrinone), 아데노신, 탈리도미드(thalidomide) 및 덱사메타손(dexamethasone)으로 이루어진 군으로부터 선택된 TNF-α의 저해제인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제21항 또는 제22항에 있어서, 상기 스트레스 인자는 생체 외(ex vivo)에서 혈액 분획에 동시에 가해지는, 오존 기체 및 자외선을 포함하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제23항에 있어서, 상기 오존 기체는 혈액 분획을 통하여 버블링된 의료용 산소를 포함하여 혼합물을 제공하며, 상기 자외선은 UV-C 밴드 파장을 갖는 자외선을 포함하며, 상기 자외선은 분획 내 혈액이 37℃ 내지 55℃의 범위 내의 평균 온도를 갖는 동안 생체 외(ex vivo)에서 혈액 분획에 동시에 가해지는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.