JP4141636B2

JP4141636B2 - ストレスの治療およびストレスに対する予備調整

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Publication number: JP4141636B2
Application number: JP2000511510A
Authority: JP
Inventors: アメ，パヴェル; トラムブレ，ジョアン
Original assignee: ヴァソゲンアイルランドリミテッド; サントル・オスピタリエ・ドゥ・リュニヴェルシテ・ドゥ・モントリオール
Priority date: 1997-09-12
Filing date: 1998-09-11
Publication date: 2008-08-27
Anticipated expiration: 2018-09-11
Also published as: HK1031322A1; EP1011696A1; EA200000312A1; IL135018A; ATE253922T1; DE69819749D1; ES2210814T3; IL135018A0; JP2001516723A; AU9148098A; DE69819749T2; AU741181B2; EP1011696B1; PT1011696E; DK1011696T3; EA003232B1; WO1999013890A1; NZ503770A; IL135014A0

Description

【０００１】
【発明の技術分野】
この発明は、医薬及び内科療法の分野に関する。特に、ストレスの治療及び、より特別には、哺乳類（人を含む）にストレスに対する向上した反応及び抵抗を与えるために哺乳類を治療する方法及び組成物に関する。
【０００２】
【背景と先行技術】
哺乳類についてのストレスの影響は通常、血流力学のパラメーターの変化（心拍数の増加及び血圧の上昇を含む）に伴って体温の上昇に現れる。したがって、上昇した血圧（高血圧）に既にかかっている患者については、高血圧は心臓血管疾患の主な危険因子であるので、ストレスの影響は特に危険である。
【０００３】
哺乳類が受け得るストレスは、これらの影響を与え、そして広い種々な身体的な形を取りうる。抑制、制限、危険との突然の遭遇、ショック等によって誘発された心理学的ストレスは体の臓器の一つ以上に影響する身体的ストレスに変わる。同様に、暑さまたは寒さへの暴露、外科的な損傷を含む傷害、精の出し過ぎ等のような身体的ストレスは体の臓器の機能異常を生じる。ストレスは今、心臓血管疾患、癌、及び免疫学的機能障害のような多くの疾患の主な有害因子として認識されている。すべてのストレス応答の基になると見られる普通の心理学的事象には、熱ストレス蛋白または熱ショック蛋白（ＨＳＰ’ｓ）として知られる分化した一群の細胞内蛋白のすべての体細胞中における合成の誘発及び上昇調節（upregulation）がある。これらのＨＳＰｓは、どんな形のストレスが与えられていることによって生じた潜在的な損傷からも細胞を保護するように機能する。
【０００４】
身体的ストレスの一つの特別な種は虚血であり、それは減少した血の流れから生じる酸素の欠乏である。身体臓器の虚血は、非常に深刻な場合には、臓器の細胞の終局的な死を生じる。血流の再開による虚血臓器の再潅流は、炎症による臓器への更なる損傷を生じることがよくあり、そして既に損傷した細胞を活気づけることはない。臓器へ弱い虚血ストレスを繰り返し与えると、ストレス虚血に抵抗する能力を増すことがよくあるが、この効果は、ＨＳＰｓの上昇調節された合成に特に関連すると考えられる。虚血は、病理学上の症状として、例えば、痙攣、血栓症、または他の血管の障害の結果として現れることがある。虚血は、手術の間の血管の締めによってゆっくりと誘発され得る。
【０００５】
哺乳類の患者に制御されたストレスを与えることによって、その後に遭遇する制御されない同種のストレスに体をよりよく備えさせるために、その患者を予め調整することが知られている。身体の運動及び訓練が、例えば、物理的運動ストレスのよりよい処理に体を備えさせる。制御された条件下で繰り返し体を温めることが、身体または身体の臓器にその後の熱ストレスのよりよい処理のためのプレコンディショニング（予備調整）を与えることが示された。虚血に関してさえても、以前に軽い虚血にかかったことのある心臓のような身体臓器は、後で起こる心筋梗塞を生じる型虚血の影響によりよく抵抗することが出来る。Ｇｅｒｓｈ等によって述べられているように、“患者の繰り返しのアンギナ症状の発現は本格的な梗塞に発展する可能性があるので、予備調整はおそらく臨床の意味では重要である。以前に梗塞アンギナのある患者は、予備調整の機会なしに突然の冠動脈閉塞を受けたと考えられる患者よりも軽い梗塞を受けることができる。対照的に、動物データによれば、多数回の一時的な虚血を受けた患者は、保護的な予備調整ができた結果耐性になる。”¹ しかしながら、熱または虚血にかけることによる予備調整は、ほとんどの哺乳類の身体及び身体の臓器に関して明らかに非実用的である。
【０００６】
米国特許第４９６８４８３号（Ｍｕｅｌｌｅｒ等）は、患者の分取血液を制御された温度で体外的に酸素／オゾンの混合物及び紫外線で処理することによって酸化するための装置を記載している。この装置は、血液学的酸化療法用に提案されている。
【０００７】
米国特許第５５９１４５７号（Ｂｏｌｔｏｎ）は、患者から分取血液を抽出し、それを３７〜４３℃の範囲の温度で酸素／オゾンの混合物及び紫外線放射にかけた後、処理した血液をヒト患者に再注入することによって、ヒトの血小板の凝集を阻害する方法、免疫系を刺激する方法及び白ろう病のような末梢血管疾患を治療する方法を開示している。
【０００８】
国際特許出願ＰＣＴ／ＧＢ９３／００２５９（Ｂｏｌｔｏｎ）は、哺乳類の患者の血液中の酸化窒素の含有量を増すための、哺乳類の患者の高血圧のような症状を治療するのに潜在的に有用な、同様な方法を記載している。
【０００９】
【発明の要点】
哺乳類の患者のストレスを治療する新規な方法を提供することが本発明の一つの目的である。
【００１０】
後に遭遇するストレスに対する抵抗及び反応を改良するために哺乳類の患者を予備調整する方法を提供することがもう一つの目的である。
【００１１】
虚血／再潅流損傷に対して標的臓器を保護する方法を提供することがさらにもう一つの重要な目的である。
【００１２】
本発明は、一つ以上のストレッサーに体外的にかけられた後、患者に再注入された患者の分取血液が、後に遭遇するストレスの悪影響に耐えるための患者の後の能力に有利な効果及びストレスの症状に有利な効果を有するという発見に基づいている。本願によって提供される情報によれば、分取血液への選択されたストレッサーの適用は体外的に、その分取血液の血液細胞にある変化を生じさせるように見える。以下でさらに詳細に報告されるように、後に遭遇するストレスに対して増加した抵抗を有することが患者の血液に有利な効果を生み出す。
【００１３】
したがって、一つの側面からは、本発明は、ストレスの悪影響を打ち消すために及び／または患者を予備調整して後に遭遇するストレスに対して向上した抵抗及び反応を与えるために患者を治療する方法であって、患者から分取血液を抽出し、該分取血液に１以上のストレッサーの体外的な適用を与え、該処理された分取血液を患者に再注入すること含む方法を提供する。
【００１４】
したがって、本発明において使用することが出来るストレッサーには、酸化力のあるストレッサー、熱ストレッサー及び紫外線放射があり、これらは、単独または２または３個の組合せにおいて使用され、そして分取血液に同時にまたは連続的に適用される。したがって、本発明のより特定な側面によれば、ストレスの悪影響を打ち消すために及び／または患者を予備調整して後に遭遇するストレスに対して向上した抵抗及び反応を与えるために患者を治療する方法であって、患者から分取血液を抽出し、該抽出された分取血液を酸化力のある環境、ＵＶ放射及び上昇温度から選択された少なくとも１つのストレッサーに体外的にかけ、該処理された分取血液の少なくとも一部分を患者に再注入すること含む方法が提供される。
【００１５】
【好ましい態様】
発明の方法は、患者から血液の一部（以下分取血液）を取り出し、その分取血液を体外で１つ又はそれ以上のストレッサーにさらし、処置した分取血液を患者に再注入することを含む。この処置は、患者がその処置を受けた時点又はそのしばらく後に患者が被るストレスの影響を打ち消す。さらに意義深く重要なのは、処置、好ましくは一連の処置の結果、患者がその後に遭遇するストレスの悪影響に耐える力が備わることである。本発明の処置方法によれば、哺乳類の患者が、その後ストレスが加わった場合にしめすストレス応答が、体温上昇が小さい、心拍数の増加が小さい、及び／または最少血圧の上昇が小さくなることでしめされるように小さくなる。
【００１６】
従って本発明の別の態様は、前もって体外で酸化的環境、紫外線照射、上昇温度から選ばれる少なくとも１つのストレッサーにさらした分取血液を、患者のストレスを治療するための医薬、および、患者がその後に遭遇するストレスに対してよく耐えられるように患者を前もって調整しておくための医薬を製造する目的で、使用する方法を提供する。
【００１７】
処置する分取血液のサイズは、人間の患者の場合、一般的に約０．１ｍｌから約４００ｍｌ、このましくは約０．１−１００ｍｌ、もっともこのましくは５−１５ｍｌで、人間以外の患者に関しての相対体重に適当に比例配分して決める。血液中の白血球の細胞膜が破壊されたり、血液中の細胞が大量に不可逆的なダメージを受けたりすることがないように、ストレッサーのレベルを高くしすぎないように注意する必要がある。
【００１８】
本発明の好ましい方法において、分取血液は体外で、熱ストレッサー、ＵＶストレッサー、あるいは酸化的ストレッサーのどれか１つだけにさらすことができる。また分取血液は体外で、熱ストレッサーとＵＶストレッサー、熱ストレッサーと酸化的ストレッサー、ＵＶストレッサーと酸化的ストレッサーの２つのストレッサーにさらすこともできる。また熱ストレッサーとＵＶストレッサーと酸化的ストレッサーの３つ全部にさらすこともできる。２つ以上のストレッサーの組合せを用いる場合、どんな順番で加えてもよいし、同時に加えてもよい。後の実施例で示すように、３つのストレッサーの内２つ、特に酸化的ストレッサーとＵＶストレッサーを順番に加えるか、ストレッサー３つ全部を同時に用いる場合に特に有益な結果が得られる。
【００１９】
温度ストレッサーは標品を液相に保たなければならず、４５℃を越えて加熱してはならない。
【００２０】
上昇温度(elevated temperature)という用語はここでは本発明の操作において血液をストレッサーにさらし始める時点での血液の温度よりも高いということを意味する。分取血液を取り扱う方法によって違うが、操作開始時の温度は１５℃と低いことがある。分取血液は初めに患者から採取したときは体温（３７℃）であるが、採取、抗凝固剤の添加、処置装置への導入及び分取血液の保存の行動全てが血液を冷却するようにはたらき、操作の開始時には血液の温度は１５℃にまで低くなる。したがって本発明の操作に用いられる「上昇温度ストレッサー」とはこの初期温度以上に熱することである。当業界で知られている適切な熱源ならどれを用いても血液を加熱することができるが、好ましくは１つ又はそれ以上の赤外線ランプである。従って本発明の好ましい操作においては分取血液を、ストレッサーとして赤外線照射単独、又は他のストレッサー即ちＵＶ照射、酸化的環境と組み合わせたものにさらす。赤外線照射すると通常は分取血液が熱せられるがいつもとは限らない。
【００２１】
温度ストレッサーは好ましくは処理する分取血液を正常体温以上、すなわち約３８−４４℃にまで、最も好ましくは約４２．５℃にまで、約３０秒から約１０分間、好ましくは約１−５分間、最も好ましくは約３分間のあいだ温めるものである。
【００２２】
酸化的ストレッサーを与えるには、分取血液を医薬等級の酸素とオゾンガスの混合物にさらすが、最も好ましいのは前記の温度範囲で分取血液中に医薬等級の酸素ガス（オゾンガスを微量成分として含む）の気流を泡として通すことである。オゾンガスは業界で知られているいかなる供給源から供給してもよい。気流はオゾン含量は約１．０−１００μｇ／ｍｌ、このましくは３−７０μｇ／ｍｌ、最も好ましくは約５−５０μｇ／ｍｌであるのがよい。流速は約０．０１−２リットル／分、好ましくは約０．０５−１．０リットル／分、最も好ましいのは約０．０６−０．３０リットル／分（ＳＴＰ）で気流を分取血液に供給する。酸化的ストレッサーの別のかけ方には、血液に過酸化水素のような過酸化物を加えることや、分取血液に過マンガン酸塩や過ヨウ素酸塩のような生化学的に許される化学酸化剤を加えることがある。
【００２３】
紫外線照射ストレッサーは、処置中の分取血液をＵＶ照射に適した光源を用いて照射することによりうまく与えることができる。紫外線照射は業界で知られている従来の光源を用いて行うことができる。たとえば低圧紫外線ランプを複数個用いて行うことができる。本発明の方法は好ましくは標準型ＵＶランプ、即ちＣ帯波長（２８０ｎｍより短い波長）を出すＵＶランプ、を使用する。標準ＵＶ−ＡとＵＶ−Ｂ線源に対応する紫外線も使うことができる。好ましく使用するのは低圧紫外線ランプで少なくとも９０％の紫外線が約２５３．７ｎｍの波長を有するラインスペクトルを生じるものである。上述の温度と酸化的環境のストレッサーと同時にかけるに適当なそのような紫外線の用量を得るには、選んだ波長における出力が約５−２５ワット、好ましくは５−１０ワットのランプを複数、分取血液を入れたサンプル容器を囲むように配置する。各ランプが１メートルの距離で約４０−８０μＷ／ｃｍ² の強度を与える。２５３．７ｎｍでの合わせた出力が１５−４０ワット、好ましくは２０−４０ワットであるこのようなランプ数個でサンプル瓶を囲み、最大強度で用いるのがいいだろう。血液の入射面で供給されるＵＶエネルギーは３分間の曝露で平方センチメートル当たり０．２５−４．５ジュール、好ましくは０．９−１．８Ｊ／ｃｍ² である。このように処理することにより、本発明にしたがい適当に改変され、患者に再注射できる状態になった分取血液が供給される。
【００２４】
分取血液をストレッサーにさらす時間は数秒から約６０分までである。通常は０．５分から６０分の間である。これはＵＶ照射の強度、温度、酸化剤の濃度と酸化剤が分取血液に供給されると速度によってある程度変わる。分取血液に加えられるストレッサーが強烈であるほど適用時間は一般に短くなる。実施者は他のストレッサーのレベルを設定してから、最適時間を決めるための実験を行う必要があるだろう。おおかたのストレッサー条件下では、好ましい時間は約０．５−１０分の範囲にあり、最も好ましくは２−５分、通常は３分前後である。開始時の血液の温度、および予定の温度まで温めたり冷やしたりする速度は患者ごとに異なる傾向がある。
【００２５】
本発明の好ましいプロセスを行うにあたって、分取血液（あるいは分離された血液細胞画分、又は血小板も含め分離された細胞の混合物、これらの種々の白血球を含有する組み合わせも全血とともに集合的に“分取血液”と呼ぶ）は、米国特許第４，９６８，４８３号（Mueller）に記載されたタイプの装置を使用してストレッサーで処理することができる。分取血液は適当な、無菌の、紫外線透過性の容器に入れ、次いでこの容器を機械に装着する。分取血液の温度を、ＩＲランプのような適当な熱源を使用して予定の値、例えば４２．５±１℃、に調節し、分取血液に酸化ストレスを与えるためのガスを流す前にＵＶランプを決められた時間点灯してＵＶランプの出力を安定させる。次いで組成のわかった酸素／オゾンガス混合物を流量を調節しながら分取血液に加えるがその時間は予め決められた０．５から６０分、好ましくは２から５分、最も好ましくは上述したように約３分間である。その結果分取血液は３種のすべてのストレッサーを同時に受ける。このようにして本発明にしたがい分取血液は所望の効果を十分に達成できる様に適当に改変される。
【００２６】
処理した分取血液の患者への再注入は静脈注射、筋肉内注射、皮下注射あるいは他の通常の注射投与により達成できる。筋肉内再注入が好ましい。
【００２７】
本発明のプロセスは、処置する時点で明らかな患者のストレス症状の治療、および処置後に遭遇するストレスの悪影響に対して哺乳類の患者を予備調整しておくことの両方に有用性を示す。これは特定なストレスあるいはストレスのタイプに対し耐久性を与えることが目的ではなく一般的に適用できることは明らかである。本発明のプロセスにしたがう処置あるいは一連の処置を受けた患者は、未処置の患者と比較して、その後に遭遇するストレスに対する有害な反応を顕著に減少させる、例えば、ストレスに応答する体温の増加を顕著に減少させ、および／または心拍数の増加を減少させ、および／または拡張期血圧の増加を減少させるであろう。したがって、本プロセスは、手術のようなストレスを受ける日取りが決まっている患者に特に有用である。その患者等は、手術前に本発明にしたがい処置あるいは一連の処置を受けることにより彼らの体を手術のために前もって調整できる。その結果彼らは手術に良好に耐え、そしてより早く回復し、したがって入院期間を短縮することができるであろう。
【００２８】
本発明の他の好ましい使用は、虚血を予め調節することと類似の方法で、ストレス誘導ダメージから組織および臓器を保護することである。上述したように、反復性の軽い虚血（アンギナ）症状の発現は、組織および臓器を虚血予備調整によりストレス誘導ダメージに対する感受性を減らせるが、現行の方法では虚血予備調整は実際には行えない。本発明のプロセスは、虚血が身体ストレスの１種である虚血予備調節に代わるものである。したがって、本発明のプロセスは、不安定アンギナの処置し梗塞部分の大きさを小さくする可能性を提供するが、これらは今利用できる治療法では効果的には行えないものである。
【００２９】
同様に、本発明のプロセスは移植手術を受ける体の臓器の保護に適用される。本発明のプロセスによるドナーの体の処置は、臓器をドナーの体から取り出す際、さらに臓器を受け取る体への移植および引き続く外科的処置の間に臓器が被るであろう避けられない虚血の結果として生ずるダメージから体の臓器を保護するに役立つ。本発明にしたがう処置はドナーの体からの臓器の取り出しと臓器を受け取る体への外科的処置との間の移植臓器の有効な寿命を延長し、それにより移植手術の遅延による生存移植臓器の損失が減少される。
【００３０】
さらに、本発明のプロセスの特定な臨床適用は、脳のある領域への血液の一時的な閉鎖による、一時的な虚血性発作（ＴＩＡ、前脳卒中）にかかった患者の処置である。彼らは共通して近い将来重い脳卒中になるようである。ＴＩＡ発症時に、そのような患者に本発明のプロセス処置を行うと、脳を前もって調整し、来るべき重い脳卒中の作用の辛さを回避あるいは弱めるであろう。
【００３１】
本発明のプロセスにおける分取血液の処置に使用した、および以下に説明する試験において記載したストレッサーは、血液細胞におけるＳＡＰキナーゼ経路を活性化する作用を有することが知られているストレッサーに含まれる。血液への適用時にＳＡＰキナーゼ経路を活性化する他の公知のストレッサーも血液に適用した場合に本発明のプロセスにおける分取血液と同様な効果が得られると考えられる、すなわち分取血液が患者への再注入後に、ここに記載したようなストレスに対し体の臓器を保護する効果を有するような状態にする。そのようなストレッサーは、ガンマ線および他の形態のイオン線、高浸透圧剤、化学療法剤（例えばシスプラチンおよびマイトマイシンＣ）、ＴＮＦおよびＩＬ−１のような抗炎症性サイトカイン、ツニカマイシン、アニソマイシンおよび亜ヒ酸ナトリウムである。ストレス活性化プロテインキナーゼ（ＳＡＰＫ）、さらに公知のｃＪｕｎアミノ末端キナーゼ（ＪＮＫ）は、Ｅｒｋ−１およびＥｒｋ−２ＭＡＰＫ（マイトジェン活性化プロテインキナーゼ）と類似のプロテインキナーゼのファミリーである。それらはシグナル伝達経路（ＳＡＰキナーゼ経路またはＳＡＰ／ＪＮキナーゼ経路）で活性化され、そのリン酸化機構に作用する。ＳＡＰキナーゼファミリーの一員には、ｐ３８ＨＯＧ、ＪＮＫ（ＪｕｎＮ−末端キナーゼ）およびＢＭＫ−１がある。それら同様なストレッサーはヒートショックプロテイン経路を活性化するものとしても知られている。
【００３２】
ＳＡＰキナーゼ経路の活性化状態の測定は、分取血液をストレス調整のために患者にすぐに再注入できるような状態にする本発明により、分取血液が処理されているかいないかについての有用な指標になりうる。ＳＡＰキナーゼ経路の活性化を決定するために利用できる標準方法は公知であり、また文献で発行されている。それらは個々のＳＡＰキナーゼ（例えばｐ３８およびＳＡＰ−Ｋ３）に対し特異的な抗体による免疫沈降反応、引き続くホスホチロシンブロッティングであり、それらにおいてもしポジティブであればＳＡＰキナーゼ経路活性化を示す。
【００３３】
本発明の有益な効果は、幼若および成熟ラット、特に同系の遺伝的に高血圧症のラット（ＳＨＲ）に関するインビトロ臨床試験により証明された。遺伝的な高血圧ラット（ＳＨＲ）は最も広く知られた高血圧研究用動物モデルであり、この分野の研究者において周知かつ容易に入手可能なものである。ＳＨＲはいくつかの遺伝子欠損を有し、最も重要なものはストレスを受けたときに適当量のＨＳＰを産生しないことである。ＳＨＲは急激に高血圧を発症し、ストレスに応答した脈拍数、血圧および体温の劇的な増加を示す。それらはストレスに対する過剰感受性モデルを表す。それらを使用して得られた結果はヒト患者に関し得られる可能性のある結果をかなりの信頼性で提供する。その効果は、以下の実施例８で記載した犬に関するインビボ臨床試験によっても示された。
【００３４】
【実施例】
実施例１
試験動物と同じ血統の、犠牲にしたＳＨＲから血液を収集し、クエン酸ナトリウム抗凝血剤で処理し、貯蔵した。それからその血液の一部を滅菌容器に置き、そして、上述のミュエラー(Mueller)の米国特許第４，９６８，４８３号に一般的に記載されたような装置内にて、ＵＶ照射、オゾン／酸素ガス酸化環境そして上昇した温度ストレッサーに同時にさらした。より具体的には、滅菌ＵＶ透過容器内の血液試料を赤外線ランプで４２．５℃に加熱し、その温度に維持している間、先に述べた好適な条件下で波長２５３．７ｎｍのＵＶ照射にさらした。同時に、１３．５乃至１５．５μｇ／ｍｌのオゾン含有量である、医療用等級の酸素とオゾンとの気体混合物を、６０乃至２４０ｍｌ／ｍｉｎの範囲にわたる流速にて血液試料を通じてバブリングさせた。ＵＶ露光と気体混合物供給を同時に行った時間は、３分間であった。
【００３５】
貯蔵した血液の別の部分は、コントロールとして機能させるべく、同様に滅菌容器内に置き前述の装置内に配置し、加熱はせず、ＵＶ照射もオゾン／酸素気体混合物の供給もしなかった。加えて、さらなるコントロールを提供するべく、滅菌した生理的塩類水溶液を調製した。
【００３６】
７週齢のＳＨＲを総数４４匹選び、１５匹から成るＡ群、１５匹から成るＢ群及び１４匹から成るＣ群の三群に分けた。１０日間（７乃至９週齢時）、Ａ群の各個体はＵＶ、熱及びオゾン処理された血液１５０μｌの臀部内注射を毎日受けた。Ｂ群の各個体は未処理血液の同様な日毎の注射を同じ時期に受けた。Ｃ群の各個体は生理的塩類溶液の同様な注射を同じ時期に受けた。
【００３７】
９週齢時に、該注射の完了後４日間、被験動物は麻酔されテレメトリープローブ（遠隔測定探針）が各個体の大腿動脈に外科的に挿入された。この遠隔測定探針（商標DATAQUEST LABPRO、Data Sciences Internationalから入手可能）は無線送信機を装備した市販されている探針であり、未制御のストレス反応を誘発するかもしれないさらなる操作を動物に施すこと無しに心拍、収縮期血圧、拡張期血圧及び他の信号が感受され記録されることを許容する。追加の探針が各個体の腹膜腔内に外科的に挿入され、体温を測定した。
【００３８】
体温、血圧及び心拍数の連続した日毎の記録が手術後の１０日間各個体から為され、動物の日々のサイクルのうちの不活動な休息時すなわち日中（「点灯」）時、及び活動時間（夜）に読みが為された。本発明のプロセスに従って処理された血液の注射を受けたＡ群の動物は、休息時の間取られた読みによって特に示されるように、未処理血液の注射を受けたＢ群及び生理的塩類溶液の注射を受けたＣ群に比較して、手術後の平常体温のより素早い復帰を有意に示した（１０日間に対して６日間）。この違いは、夜時間、活動状態の読みとりからはさほど明らかではなく、活動の間存在するより高いコルチゾールレベルが結果に影響しているであろうことを示唆している。このことは、手術のストレスに対する哺乳類個体の応答を軽減することにおいて、本発明の処理の有意な効果を示している。
【００３９】
これらの実験の結果は、図１（測定された個体の体温の手術後日数に対するプロット）に図示される。プロットされた各値は休息時の間全群から得られた値の平均である。曲線ＡはＡ群の動物から導かれ、曲線ＢはＢ群の動物からそして曲線ＣはＣ群の動物から導かれる。生理的塩類溶液を注射された群と未処理血液を注射された群の結果（Ｂ対Ｃ）は有意には異なっていない（Ｐ値０．６７６４）。しかしながら、処理された血液の群からの結果は有意に異なっている（Ａ対Ｂ、ｐ＝０．００８。Ａ対Ｃ、ｐ＝０．０００２）。
【００４０】
実施例２
実施例１に記載されたように処置された４４体、すなわち、本発明のプロセスに従って処理された血液の注射を受けた１５体のＡ群、未処理の血液の注射を受けた１５体のＢ群、そして生理的塩類溶液の注射を受けたＣ群を、実施例１に記載された探針植え込み手術後１０日間、小さな拘束篭内に３０分間それら（個体の齢は１１週）を置くことによって、標準の固定ストレス試験を通しての心理的ストレスにさらした。この固定期間の間、体温、血圧及び心拍数の読みが一分間隔で記録された。
【００４１】
図２は、三群の体温測定の結果のグラフを提示したものである。すなわち、固定ストレス試験の３０分間にわたって横座標としての体温に対する縦座標としての時間のプロットである。図２が示すように、実験群Ａから導かれる曲線２Ａは、一貫してそして有意に、コントロール群Ｂから得られる曲線２Ｂとコントロール群Ｃから得られる曲線２Ｃよりも下にある。得られた全てのデータの統計的な分析は、実験群Ａから得られた特徴における違いの高い意義を確かなものにしている。
【００４２】
図３は、三つの群における心拍数測定の結果を、ストレス試験の時間に対して縦座標としてプロットした心拍数（分当たりの拍動、ｂｐｍ）でもって図表的に提示している。（各群における動物にわたって平均された）同結果は、またも、本発明に従って処理された血液の注射を受けた群であるＡ群が実質的に試験の全継続時間にわたって心拍数において他の２つの群に比較してより低い増加を有した、ということを示している。各群間の違いは統計的に有意である−各ケースにおいてｐ＝０．０００１。
【００４３】
図４は、三つの試験群の各々の拡張期血圧の測定結果を、ストレス試験の時間に対して縦座標としてプロットした拡張期血圧（ｍｍＨｇ）でもって図表的に提示している。本発明に従って処理された血液の注射を受けた群であるＡ群からの値（平均されたもの）は、またも、他の２つの群からのそれらよりも一貫してそして有意に低い（各ケースにおいてｐ＝０．０００１）。
【００４４】
実施例３
実施例２からのＣ群、すなわち７乃至９週齢で生理的塩類溶液の注射を受けたコントロール群の動物を、三つの亜群Ｃａ，Ｃｂ及びＣｃに分けた。各群は、処理された血液１５０μｌ、未処理の血液１５０μｌ、及び生理的塩類溶液１５０μｌの各々の注射を１０日間受けた。注射は動物が１２週齢すなわち充分に成熟した成体となったとき開始した。遠隔測定探針を適所に留めた。同じ３０分固定ストレス試験を１６週齢の各個体に行い、心拍数、血圧、及び体温の測定を行った。
【００４５】
体温応答においては、本発明のプロセスに従って処理された血液を注射されたＣａ群はストレス期間、より鈍感な上昇を有意に示した。このことは、図２と類似の、結果についての図表的提示である図５にて明らかにされている。Ｃａ群の動物から導かれた曲線Ｃａは、Ｃｂ群の動物から導かれた曲線Ｃｂよりも一貫して低く、そして、Ｃｃ群の動物から導かれた曲線Ｃｃよりも一貫して低い。処理された血液対未処理血液の結果、そして、処理された血液対生理的塩類溶液の結果は統計的に区別される− 各ケースにおいてｐ＝０．０００１。
【００４６】
実施例４
本発明に従って処理された血液を注射した、実施例２の実験的に処置された７〜９週令の動物のグループＡを、各グループ５匹ずつ、Ａａ、ＡｂおよびＡｃと称する３つのサブグループに分けた。次に、第２のシリーズとして、処理血液、非処理血液および生理食塩水を、それぞれに１５０μｌ、１０日間毎日注射した。動物が１２週令となった時、注射のクールを開始した。テレメトリープローブを実施例１における場所に残しておいたので、手術を再度行う必要はなかった。１６週令で再度、実施例２に記載したのと同じ不動ストレステストを３０分行い、心拍、血圧および体温を１分間隔で測定した。
【００４７】
体温の上昇のグループ間における違いは非常に大きかった。図２と同様、時間に対する平均体温をプロットしたものの結果を図６に示す。テスト開始約１２分後、本発明に従って処理した血液を２クール注射したグループＡａは、一貫して有意に（各ケースでｐ＝０．００１９以下）、最も低い体温の上昇を示した。グループＡａから得られたカーブＡａは、グループＡｂから得られたカーブＡｂおよびグループＡｃから得られたカーブＡｃよりも一貫して低い。また、カーブＡａの値は、図２のカーブＡの値よりも低いことが分かるであろう。これは、本発明による第２の処理が、動物のストレスに対する耐性を調整するという、さらなる効果を示すものである。これに対しカーブＡｃの値は、図２のカーブＡの値より高く、図２のカーブＣの値よりも低い。これは、２回目の本発明の“ブースター”処理を行わなければ、処理の効果が、処理のクール終了約２４日後では失われる傾向にあることを示すものである。
【００４８】
実施例５
７週令と１２週令で、同じ液体を２クール注射した（生理食塩水の後に生理食塩水、未処理血液の後に未処理血液、および処理血液の後に処理血液）実施例１で得られた動物のストレス応答を、１６週令で実施した前述の第２の不動ストレステストの間、測定した。体温測定から得られた結果を図７に示す。これは、図２と同様に、３０分ストレステストの間における、時間に対する体温のグラフである。カーブＡＡは、本発明によって処理した血液を、１０日間毎日注射する２クール後の動物の測定結果（５匹の平均）から得られる。カーブＢＢは、非処理血液を１０日間毎日注射した２クール後の動物の測定結果（５匹の平均）から得られる。カーブＣＣは、生理食塩水を１０日間毎日注射した２クール後の動物の測定結果（５匹の平均）から得られる。図が示すように、本発明の方法によって処理された動物から得られた値は、他の２つのグループから得られた値よりも、一貫して有意に（Ｐ＝０．０００１）低い。
【００４９】
同様に図８は、ストレステストの間の３つのグループの心拍の測定結果を示す。本発明に従って処理した血液の注射を２クール行った動物から得られたカーブＡＡは、他の２つのカーブより有意に低い（ｐ＝０．０００１）。
【００５０】
実施例６
虚血ストレスと続いて起こる再潅流の悪影響を防ぐための、哺乳動物の体内器官と組織とを前もって調整する本発明の方法の使用をさらに実証するため、本発明の方法によって処理した後の動物の腎臓における虚血を誘発する実験を、前述したタイプの遺伝的に高血圧のラット（ＳＨＲ）に関して行った。その手順は以下の通りである。
【００５１】
６３匹のラット（ＳＨＲ）のグループを、ほぼ同じようにサブグループＡとＢに分けた。サブグループＡには実施例１に記載した貯留からの血液を２クール注射した。注射した血液は、実施例１に記載したように、紫外光、オゾン−酸素ガスおよび上昇温度ストレッサーで同時に処理したものである。注射の最初のクールは７週令でスタートし、臀部の内部に処理血液の１５０μｌ分取血液を１０日間に渡り、１０回注射したものである。２番目の注射のクールは１２週令でスタートし、同じようにして、処理血液を毎日同量で、１０回注射したものである。サブグループＢには、生理食塩水を同じ回数、同量注射してコントロールとした。
【００５２】
注射の第２クール後、ラットを軽い麻酔で麻痺させ、背中を切開して右の腎臓を取り出した。閉塞性クリップを残りの腎臓の動脈と静脈上に配置し、左の腎臓に一過性の虚血を６０分間起こさせた。皮膚をクリップで一時的に閉じた。続いて、虚血および／または続いて起こる再潅流から生じる損傷の程度に関して、血清クレアチニンおよび血中尿素窒素（ＢＵＮ）を測定するための血液サンプルをとり、生存率を測定した。最初の血液サンプルを採取後、皮膚を完全に閉じた。
【００５３】
生存率を毎日の生き残った数で計った。１４日後、処理血液を注射したサブグループＡの５５％が生存していた。これに対し、生理食塩水−生理食塩水で処理した動物のサブグループＢではわずか３２％であった。生存率をより詳細に図９に示す。縦軸に腎臓の虚血後に生き残ったもののパーセントを、横軸に日数をプロットした。図９中で、実線はサブグループＡの動物の結果を、破線はサブグループＢの動物の結果を示す。
【００５４】
その結果は、本発明による処理を受けた動物において有意な改善（ｐ＜０．０５，ログランクテスト）を示している。これは、虚血および／または続いて起こる再潅流から生じる損傷に対して、本発明の方法によるプレコンディショニング（予備調整）がうまくいっていることを表すものである。
【００５５】
１００〜２００μｌの血液サンプルを、虚血後、１、３、６および１２日目に生き残っている再潅流した動物のしっぽの動脈から採取し、クレアチニン量と血中尿素窒素（ＢＵＮ）量を測定した。クレアチニンの高含有量は腎臓の機能の悪化、すなわち、腎臓が血液から適切にクレアチニンを取り除く機能を果たしていないことを示している。同様に、ＢＵＮ量は腎臓の機能の効率を表す尺度であり、血液のＢＵＮとクレアチニンの量が減れば減るほど、腎臓はさらに効率よく機能する。両方のテストは、ほ乳類の患者における腎臓の機能の標準的な測定である。
【００５６】
図１０はＢＵＮ量測定の結果を示すグラフであり、動物の各グループにおける平均で表してある。各カーブは、虚血後の日数に対するＢＵＮ値のプロットで示してある。カーブ１０ＢはサブグループＢの動物のコントロールから、カーブ１０Ａは処理血液を受けたサブグループＡの動物から得られたものである。６日目に、サブグループＡの動物の平均ＢＵＮ値は有意に低くなった（ｐ＝＜０．０２５）。
【００５７】
同様に図１１は、血清クレアチニンの測定結果を示すグラフであり、処理された血液から平均化されたカーブ１１Ａから、サブグループＡの動物は、コントロールのサブグループＢの動物から平均化されたカーブよりも、１、３および６日目で一貫して有意に低い（ｐ＝＜０．０２５）。これらの結果は本発明の処理を受けた動物のサンプル中における、一貫してより低いクレアチニン量と、より低いＢＵＮ量とを示している。これは、虚血ストレスおよび／または再潅流損傷に対するより高い耐性に関して、この処理によって体の個々の器官と組織とが効果的に、予備調整されることを示している。
【００５８】
各サブグループのクレアチニンとＢＵＮの増加は３日目にピークとなり、１２日目に底の方に戻った。サブグループＡの動物の増加のピークは有意に低い。虚血／再潅流後の６日目では、サブグループＡの動物からのサンプル中のクレアチニンとＢＵＮは両方とも、コントロールの動物からのサンプルに対して約半分である。虚血後の最初の２４時間、コントロールであるサブグループＢのラットの８３％は乏尿症であり（２４時間経過後で尿２ｍｌ以下）、一方、サブグループＡのラットの乏尿症はわずか４２％であった（ｐ＜０．０１）。これを図１２に示す。ここで、各グル−プの動物のバーの数字は、腎臓の虚血／再潅流後の２４時間で排尿した量であり、動物を乏尿、やや乏尿そして正常と、適切に分類してある。図１２の塗りつぶしたバーはサブグループＡの動物から、そして白抜きのバーはサブグループＢの動物から得られたものである。
【００５９】
実施例７
合計４８匹の雄のＳＨＲラットを、グループ当たり動物１２匹ずつの５つのグループに分けた。同系統のＳＨＲラットを殺して採取しプールした血液サンプルは、下記の同時に適用されるストレッサーの組み合わせを使用した他は実施例１と同様にして、４つの異なるストレッサー処理を施した。
【００６０】
１．−ＩＲランプによって保持された４２．５℃の上昇温度で、紫外線に曝しながらＯ₂／Ｏ₃混合ガスをバブリングさせる；
２．−紫外線に曝しながらＯ₂／Ｏ₃混合ガスをバブリングさせる；
３．−ＩＲランプによって上昇温度（４２．５℃）に保持して、Ｏ₂／Ｏ₃混合ガスをバブリングさせる；
４．−ＩＲランプによって４２．５℃に保持し、紫外線に曝しながらＯ₂ガスをバブリングさせる（これは酸化的環境を構成しない）。
【００６１】
ストレッサーの量、時間、強度等は実施例１に詳述されているとおりであった。
【００６２】
処理を施した血液サンプルを第１、第２、第３及び第４グループのそれぞれの動物に投与した。なお、第５グループは、同じ養生法で同量の生理食塩水を投与された。すなわち、動物が第７週齢の時に開始した第１期の１０日間及び動物が第１２週齢の時に開始した同様な第２期の１０日間に、毎日１５０μｌを筋肉注射した。
【００６３】
第２期の注射を完了した後の日に、実施例６と同様に動物に麻酔をして、一方の腎臓を摘出した。残った左の腎臓は、残った腎動脈を塞いで６０分間、一時的に虚血状態とした。虚血状態とこれに続く再潅流の後８日間、生存率をモニターした。手術の後２４時間、尿の排出量を測定した。
【００６４】
添付の図１３は、手術後８日目におけるそれぞれのグループの動物の生存率を示している。対照グループとして生理食塩水を投与された第５グループの生存率はわずか２５％であったが、他の全てのグループは顕著にこれより良好であった。酸化的ストレッサー及び紫外線を伴う血液処理を受けた第２グループは、生存率が７５％と特に良好であって、続けてうける虚血状態−再潅流のストレスに耐えるために非常に良い予備調整であることを示している。
【００６５】
添付の図１４は、尿排出量測定についての結果を示している。ここで、手術後２４時間に６ｍｌ以下の尿排出量であることは、動物が乏尿（尿量過小）であることを決定づけるものであり、換言すれば、極度に腎臓の機能が損なわれたか、全く腎臓の機能が存在しないということである。乏尿の動物数は縦軸で示されている。乏尿の動物の最高数は対照である第５グループにおいてみられるが、本発明によって処理を施された他の全てのグループでは顕著に改善されている。
【００６６】
実施例８
虚血インビボ腎臓試験での虚血ストレスと再潅流に対する予備調整にこの方法を使用することを示す実施例６の実験的手法を、実験用イヌについて行った。これらのイヌは純血の正常ビーグル犬（１−２歳）で各グループ、サブグループはそれぞれオスメス同数である。
【００６７】
このように、動物は、ＡＢＣＤの４グループに分けられ、各グル−プはオス３頭とメス３頭の合計６頭より構成された。グループＡとＣには、本発明の方法を適用した、すなわち、実施例６で記載したように毎日、分取血液（３ｍｌ）を採血し、この分取血液をオゾン／酸素処理、紫外線照射および熱処理を体外で行い、同じ動物に処理分取血液を筋内注入により戻すという１０日間コースを２回行った。２回の１０日間コースの間に３週間の静養期間を設けた。
【００６８】
第２回目のコースに続く日に動物を負担の軽い麻酔で麻酔を行い、背中を切開し右の腎臓を各動物から取り出した。残りの腎臓の動脈と静脈を閉塞クリップで留め、一過性の虚血状態に６０分間維持した。続いて血液サンプルを動物から採血し、実施例６で記載したように障害腎臓作用の指標としてクレアチニンと血尿窒素を分析した。
【００６９】
ケレアチニンの結果は、添付の第１５図のグラフに示すとおりであり、血液クレアチニンの含有量が虚血に続く６日間のデータが時間軸にプロットしてある。カーブＡＣは、グループＡとグループＣの動物から得られた結果であり、対照グループＢＤよりも一貫して低い値であり、これは本発明の方法で処理された犬において著しく腎臓の機能が改善されたものであることを示すものである。記号ＡＲＦは、急性腎不全を示すものである。グループ内の時間に対する変化は高度に有意である（ｐ＜０．０００１）。
【００７０】
虚血にさらされた場合の器官の損傷は、虚血の結果による理由だけから生じることがあり（たとえば、虚血が後で溶解する血栓によって生じた場合であって、血栓が溶解しても器官の損傷を受けたところに血液が流れないといういわゆる不再流現象が生じたとき）、あるいは、虚血のあと、白血球またはフリーラジカルなどが器官の血管とか細胞を損傷する可能性があるときに器官に血液を再潅流したときにも起こる。ここで使用されている用語「虚血および／または再潅流の結果生ずる損傷」および「虚血／再灌流損傷」は、それぞれ単独であるいはその組み合わせにより生ずる損傷の２つのタイプのものを包含するものである。
【００７１】
本発明の方法の上述の結果は、ＳＨＲにおける生存率、血液中の尿素とクレアチニンレベルおよび尿流によって測定されるように、虚血およびまたは再潅流の結果生ずる損傷から腎臓を保護することができることを示すものである。これは、一般に身体の器官、これには心臓、肝臓、脳、脊髄および腎臓のようなその他の器官とか組織が含まれるが、これらを虚血／再潅流から保護する処置として本方法が応用できることを意味するものであり、また、外科的治療、身体の器官の除去または移植のような、身体の器官の虚血／再潅流を含む外科的処置が予定されている患者の処置に本方法を実際に適用できることを示している。
【００７２】
とくに、虚血による深刻な腎臓の機能不全は、高い罹病率と死亡率を伴う重大な臨床上の問題である。本発明の方法は、これらの病気を克服する新規な治療法を提供するものである。これは、腎臓移植に先立ってドナーあるいはレシピエントのいずれかあるいは両者に適用することができる。これは、腎臓の再血管新生の前に適用することができる。危険性の高い患者の侵襲的評価、たとえば糖尿病患者の血管造影のような場合、の前に適用することができる。大動脈瘤の治療や腎臓のベンチ手術（すなわち、腎臓を一時的に摘出し、エクスビボで手術しそのあと再移植される場合）のような腹部の大動脈手術の前に適用することができる。
【００７３】
心臓に絡む処置に関連するこの利用について、この発明の処置は、冠状動脈、およびバイパス形成に先立って、あるいは腎臓の場合のような移植に先立って行うことができる。これは、冠状の動脈のバイパス移植のための心肺のバイパス形成、弁修復あるいは先天的ないし後天的心臓の形態的異常の外科的治療を伴う心臓切開手術をしようとしている患者への利用を示唆している。脳、あるいは腸、腎臓および手足を含むほかの器官と組織の場合には、この発明の処置は、危険率の高い患者の血管形成あるいは血管内膜切除に先立って適用することができる。
【００７４】
大手術のための全身麻酔に先立って本発明の方法を行うことは、主な器官があとで被る虚血ー再潅流障害に十分耐えるために身体を全般的に予備調整することとみることができる。脳、心臓、肝臓、腸、脊髄、腎臓あるいは四肢に供給している動脈に潜むアテローマ性動脈硬化症は手術時または手術後に血栓症虚血をより引き起こしやすいものであるが、このアテローマ性動脈硬化症が相当程度進行したあるいはしているらしい患者に、全身麻酔を含む大きな手術的処置を行うに先立って本方法を適用できることを示すものである。また、この発明の方法による同様の身体の全般的予備調整は、続いて生じるショック、つまり血液とかそのほかの体液のロス、心臓の機能不全、血管の極端な肥大および極端な低血圧により生体器官や組織の低潅流を引き起こすものであるが、この影響を軽減するのに利用できることを示すものである。実例は、重大な血液損失、外傷、敗血症および心臓性ショックである。手術を待っている患者を含めて、事故にさらされようとしている人々とか自然災害の救援救助隊員は、本発明の方法の受益者となるであろう。
【００７５】
ストレス、たとえば、外科処置と一部としての虚血ストレス、手術あるいは予見できるストレスー状況の一部としての一般的心理的ストレスあるいは生理的ストレス、にかかるに先立って患者の身体および身体の器官の予備調整に関連した本発明の処置の有用性の他の分野は、当業者にとって明らかであろう。
【００７６】
参考文献
１．Ｂ．Ｊ．ゲルシュ（Gersh）、Ｅ．ブラウンワールド（Braunwald）およびＪ．Ｄ．ラザフォールド（Rutherford）：心臓の収縮と弛緩の機構（Mechanism of Cardiac Contraction and Relaxation），（ブラウンワールド編集「心臓病：心臓血管薬のテキストブック」(Heart Disease:Textbook of Cardiovascular Medicine）第５版、３６０−３９３ページ、１９９７年、フィラデルフィア所在、W. B. Saunder社出版）
【図面の簡単な説明】
添付の図面において：
【図１】下記の具体的実施例１で得られた結果を図示したものである。
【図２】下記の実施例２で得られた体温についての結果を図示したものである。
【図３】下記の実施例２で得られた心拍数についての結果を図示したものである。
【図４】下記の実施例２で得られた拡張期の血圧についての結果を図示したものである。
【図５】下記の実施例３で得られた体温についての結果を図示したものである。
【図６】下記の実施例４で得られた体温についての結果を図示したものである。
【図７】下記の実施例５で得られた体温についての結果を図示したものである。
【図８】下記の実施例５で得られた心拍数についての結果を図示したものである。
【図９】下記の実施例６で得られた結果を図示したものである。
【図１０】下記の実施例６で得られた結果を図示したものである。
【図１１】下記の実施例６で得られた結果を図示したものである。
【図１２】下記の実施例６で得られた結果を図示したものである。
【図１３】下記の実施例７で得られた結果を図示したものである。
【図１４】下記の実施例７で得られた結果を図示したものである。
【図１５】下記の実施例８の結果を図示したものである。

Claims

患者から採取した血液の分取血液を酸化性環境、ＵＶ照射および４５℃までの上昇温度から選択される少なくとも２つのストレッサーに曝すことを特徴とする、
患者の細胞、組織および／または内臓の虚血−再灌流を生ずる外科手術後発生する虚血のストレスの副作用をよりよく阻止するよう患者を予備調整するための分取血液の製造方法。
分取血液が０．１ｍｌから４００ｍｌの量である請求項１の方法。
選択したストレッサーまたはストレッサーの組合せを０．５〜６０分の範囲の期間分取血液に適用することを特徴とする請求項２の方法。
分取血液が曝される酸化性環境ストレッサーが医療用酸素とオゾンとの混合物からなり、オゾン含量が０．１〜１００μｇ／ｍｌであることを特徴とする請求項３の方法。
紫外線照射ストレッサーが、主として２８０ｎｍまたはそれより短い波長で発するＵＶランプからの紫外線である請求項３の方法。
上昇温度ストレッサーが３８〜４３℃の範囲にある温度である請求項３の方法。
分取血液が酸化性環境ストレッサーおよびＵＶ照射ストレッサーに同時に曝される請求項３の方法。
分取血液が酸化性環境ストレッサーおよび上昇温度ストレッサーに同時に曝される請求項３の方法。
分取血液がＵＶ照射ストレッサーおよび上昇温度ストレッサーに同時に曝される請求項３の方法。
分取血液が三つの該ストレッサー全てに同時に曝される請求項３の方法。
上昇温度ストレッサーが赤外線により適用される請求項１０の方法。
虚血性ストレスが患者の腎臓、心臓、肝臓、腸、脊髄または脳の虚血−再灌流である請求項１の方法。
虚血性ストレスが腎臓の虚血−再灌流である請求項１の方法。
患者がアテローム性動脈硬化症を患っており、外科的処置の際に生命維持に必要な器官が虚血する前に、患者が全身麻酔を行うよう予定されている請求項１の方法。
患者が心肺バイパスを用いた開胸手術または心臓移植を受けるよう予定されている請求項１の方法。
分取血液が赤外線により曝されることで熱せられることを特徴とする請求項１の方法。
患者が大動脈瘤手術を受けるよう予定されている請求項１の方法。
分取血液が酸化性環境および／またはＵＶ照射と組合せて赤外線に曝されることを特徴とする請求項１６の方法。
患者がアテローム性動脈硬化症を患っており、外科的処置を予定されている請求項１の方法。
複数の分取血液を該ストレッサーに曝すことを特徴とする請求項１９の方法。
分取血液が曝される酸化性環境ストレッサーが、オゾン含量が０．１〜１００μｇ／ｍｌの医療用酸素とオゾンとの混合物であり、紫外線ストレッサーが主として２８０ｎｍまたはそれより短い波長で発するＵＶランプからの紫外線であり、上昇温度ストレッサーが３８〜４３℃の範囲の温度である請求項１０の方法。