KR20040101381A

KR20040101381A - 신규한 용도

Info

Publication number: KR20040101381A
Application number: KR10-2004-7015621A
Authority: KR
Inventors: 고바야시마사카주; 지앙홍시; 판판; 에릭손라우리에; 엡스아아론; 윈카르멘
Original assignee: 후지사와 야꾸힝 고교 가부시키가이샤
Priority date: 2002-04-16
Filing date: 2003-04-14
Publication date: 2004-12-02
Also published as: AR039416A1; US20030232867A1; CN1646122A; TW200306825A; CA2481184A1; JP2005526107A; BR0309427A; EP1494669A1; NO20044272L; RU2004133347A; US20060211725A1; NZ535692A; IL164185A0; MXPA04010170A; WO2003086391A1; AU2003223119A1; ZA200407813B; PL372902A1

Abstract

본 발명은 이식된 장기 또는 조직에서의 만성 거부를 예방 및/또는 치료하기 위한 약제를 제조하기 위한 하기 화학식(I) 또는 (II)의 화합물의 신규한 용도에 관한 것이다:

Description

신규한 용도{New use}

현재 말기 장기 질환의 치료법으로서 통상 간, 신장, 폐 및 심장의 장기 이식이 수행되고 있다. 정교한 이식 조직 적합 검사(tissue typing), 수술 기술, 및 더욱 효과적인 면역억제 치료법의 개발로 이식 결과는 계속적으로 개선되어 왔다. 그러나, 만성 거부와 관련된 문제 때문에, 장기 이식이 비가역적 장기 질환에 대해서는 임상적으로 실행가능한 해결책은 아니다.

진행성 및 비가역성 이식 기능장애로서 명시된 만성 거부가 임상 이식에 있어 후기 장기 이식 손실의 주요 원인중 하나이다.

징후를 갖는 전형적인 만성 거부는 동맥경화증-유사 변형으로, 예를 들면 이식 혈관병증, 이식 혈관 질환, 이식 동맥경화증, 이식 관(상)질환, 혈관협착증, 사이질 섬유증 등이다. 이 혈관 병변은 평활근 세포의 유주 및 증식, 즉, 이로써 내막 증식 및 비후, 평활근 세포의 비후 손상을 일으키고, 최종적으로는 순차 관강 폐색(혈관 리모델링)을 일으키는 것을 특징으로 한다. 특히, 신장의 경우, 만성 거부는 만성 동종이식 신장병증으로 명명될 수 있다.

만성 거부는 효능이 있는 치료법 또는 예방법이 공지되어 있지 않기 때문에 확고부동하고 조절할 수 없는 것으로 보인다. 따라서, 임상 장기 이식에서 만성 동종이식 거부를 예방 및/또는 치료함에 유효한 치료법에 대하여 계속적으로 요구되고 있다.

본 발명에서 사용되는 화학식(I) 또는 (II)의 화합물와 관련하여, 화학식(I) 또는 (II)의 화합물은 USP 5,308, 865에 기술된 암, 류마티스 관절염, 면역성 또는 비면역성 근원의 만성 염증 질환 치료에 유용하다고 공지되어 있다. 만성 염증 질환이 이 특허에 기술되어 있지만, 혈관 병변을 특징으로 하는 이식된 장기에서의 만성 거부과는 상이하고, 따라서 이식된 장기의 만성 거부는 기술되어 있지 않다.

레프루노미드 및 관련 화합물은 혈관 손상 후의 근육 세포의 과잉증식을 저하시키고, 따라서 이들 화합물은 혈관 손상 후의 혈관협착증 및 동맥경화증 예방 및 치료에 유용하다고 EP 0665013에 공지되어 있다. 그러나, 본 발명의 화학식(I) 또는 (II)의 화합물은 상기 특허 출원에 기술되어 있지 않다. 또한, 본 발명의 만성 거부는 숙주 면역 및 비-면역 반응의 결과로서 이식된 장기의 전체 혈관에서 발견되는 반면, 상기 특허 출원에 기술된 질환은 손상 복원을 위해 환부에서 나타난다. 따라서, 이들 질환은 서로 발생학상 완전히 상이하다.

USP 5,624, 946 및 USP 5,688, 824에는 일반 레프루노미드 화합물이 이식된 장기에서의 만성 거부를 조절하거나 가역시키는 활성을 갖는 것으로 공지되어 있다. 그러나, 본 발명의 화학식(I) 또는 (II)의 화합물은 상기 특허 출원에 기술되어 있지 않다.

따라서, 화학식(I) 또는 (II)의 화합물이 이식된 장기 또는 조직에서의 만성 거부를 예방 및/또는 치료하기 위한 활성을 갖는 것에 대해서는 전혀 알려진 바 없다.

발명의 개시

본 발명의 발명자는 포유동물 수혜자에서 화학식(I) 또는 (II)의 화합물이 이식된 장기 또는 조직에서의 만성 거부를 예방 및/또는 치료함에 유효하다는 것을 발견하였다.

따라서, 본 발명은 치료학적 유효량의 화학식(I) 또는 (II)의 화합물을 그를 필요로 하는 포유동물 수혜자에 투여하는 것을 포함하는, 이식된 장기 또는 조직에서의 만성 거부를 예방 및/또는 치료하는 신규한 방법을 제공한다.

추가로, 본 발명은 이식된 장기 또는 조직에서의 만성 거부를 예방 및/또는 치료하기 위한 약제 제조를 위한 화학식(I) 또는 (II)의 화합물의 신규한 용도를 제공한다.

또한, 추가로, 본 발명은 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제와 함께 치료학적 유효량의 화학식(I) 또는 (II)의 화합물을 포함하는 이식된 장기 또는조직에서의 만성 거부를 예방 및/또는 치료하기 위한 신규한 약제학적 조성물을 제공한다.

만성 거부를 예방할 수 있는 치료제는 만성 거부가 시작되기 전 장기 또는 단기간 투여에 의해 개시되었을 때 만성 거부의 작용 또는 조직학적 징후의 발생을 예방하는 치료제이다. 그러므로, 본 발명에서 사용되는 만성 거부의 예방은 장기간 동안 이식된 장기 또는 조직을 보호 또는 유지시키는 것을 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "치료"는 질환을 "조절"하고 "가역"시키는 것을 포함하는 치료법을 의미한다. 만성 거부를 조절할 수 있는 치료법은 각각 만성 거부의 작용 또는 조직학적 징후가 관찰된 후 개시되었을 때 질환의 진행을 지연시키는 치료법이다. 추가로, 만성 거부를 가역시킬 수 있는 치료법은 각각 만성 거부의 작용 또는 조직학적 징후가 발현된 후 개시되었을 때 질환 진행을 가역시키고 작용 또는 조직학적 소견을 정상 상태로 보다 가깝게 되돌리는 치료법을 의미한다.

본 발명의 화합물(I), 즉, (2Z)-2-시아노-3-하이드록시-N-[4-(트리플루오로메틸) 페닐] -2-헵텐-6-인아미드, 또는 화합물(II), 즉 5-(3-부티닐)-N-[4-(트리플루오로메틸) 페닐]-4-이속사졸카복스아미드와 관련하여, 이는 USP 5,308,865의 실시예 14 또는 그와 유사한 방법으로 제조할 수 있고, 이형태체(conformer) 및 입체이성체가 존재할 수 있고, 그러한 이형태체 및 이성체는 또한 본 발명의 범주내 포함되며, 화합물(I)은 또다른 타우토머 형태일 수 있음을 이해할 것이다. 예를 들면, 화합물(I)은 그의 에놀(I) 또는 케토 형태(III), 즉, 하기 도식에 나타낸 2-시아노-3-옥소-N-[4-(트리플루오로메틸)페닐]-6-헵틴아미드로 존재할 수 있고, 그러한 타우토머 형태 또한 본 발명의 범주내 포함된다.

화학식(I) 또는 (II)의 화합물은 용매화물일 수 있고, 이는 본 발명의 범주내 포함된다. 용매화물은 바람직하게 수화물 및 에놀레이트를 포함한다.

본 발명의 화학식(I) 또는 (II)의 화합물은 경구, 비경구 예를 들면, 정맥, 근육내, 피하 또는 관절내, 외부 예로서, 국소, 소화관내, 직장내, 질경유, 흡입식, 눈, 코 또는 설하 투여에 적절한 유기 또는 무기 담체 또는 부형제와 혼합된 활성 성분으로서 화학식(I) 또는 (II)의 화합물을 포함하는 고형, 반고형, 또는 액상 형태와 같은 약제학적 제제 형태로 사용될 수 있다. 활성 성분은 예를 들면, 정제, 펠릿, 캡슐제, 점안제, 좌제, 액제(예: 식염수), 유제, 현탁제(예: 올리브 오일), 연고, 에어로졸 스프레이, 크림제, 스킨 반창고, 패취제 및 사용하기 적절한 다른 제형용의 통상의 비톡성, 약제학적으로 허용가능한 담체와 배합될 수 있다. 사용할 수 있는 담체는 고형, 반고형, 또는 액상 형태로 물, 글루코스, 락토스, 아카시아 검, 젤라틴, 만닛톨, 전분 페이스트, 마그네슘 트리실리케이트, 옥수수 전분, 케라틴, 콜로이드성 실리카, 감자 전분, 우레아 및 약제 제조에 사용하기에 적절한 담체이고, 추가로 보조제, 안정화제, 농후제 및 착색제 및 향료를 사용할 수 있다. 활성 목적 화합물은 이식된 장기 또는 조직에서의 만성 거부를 예방 및/또는치료하기에 충분한 유효량으로 약제학적 조성물내 포함된다.

본 발명에서 치료할 수 있는 포유동물은 가축 포유동물, 예로서, 소, 하우스(houses) 등, 애와 동물, 예로서, 개, 고양이, 래트 등 및 인간, 바람직하게 인간을 포함한다.

장기 또는 조직은 동일한 개체(자가이식), 동계 종 (동계이식), 동종(동종이식) 또는 상이한 종(이종이식)의 기증자로부터 수혜자로 이식될 수 있다. 상기 이식되는 장기 또는 조직은 간, 신장, 심장, 폐, 결합 심장-폐, 기도, 지라, 췌장 (완전 또는 부분, 예: 랑게르한스섬), 피부, 소장, 각막, 골수, 사지, 근육, 신경, 척추원반, 근육모세포 또는 연골, 또는 상기 어느 것의 조합물일 수 있다.

만성 거부의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 화학식(I) 또는 (II)의 화합물은 단독으로 또는 사이클로스포린 A, 타크로리무스, 라파마이신, 아자티오프린, 코르티코스페로이드, 항-림프구 글루블린 또는 OKT3; 특히 사이클로스포린 A 또는 타크로리무스와 같은 하나 이상의 다른 면역억제제와 함께 배합하여 동시, 별개 또는 순차적으로 투여될 수 있다. 추가로, 이러한 용도로 사용하기 위한 화학식(I) 또는 (II)의 화합물은 상기 언급한 바와 같은 하나 이상의 다른 면역억제제와 함께 약제학적 조성물중 혼합물 형태로 투여될 수 있다. 상기 배합 또는 혼합 치료법인 본 발명의 범주내 포함된다.

치료학적 유효량의 화학식(I) 또는 (II)의 화합물의 투여량은 치료하고자 하는 각 개 환자의 연령 및 상태에 따라 달라지고 의존하지만, 이 질환을 예방 및/또는 치료하기 위해서는 1일 투여량 약 1mg-1Og/신체, 바람직하게 5mg-5g/신체 및더욱 바람직하게 10mg-2g/신체의 활성 성분을 투여하고, 약 0.5-1mg, 5mg, 10mg, 50mg, 100mg, 250mg, 500mg, 1g, 2g 및 3g의 평균 단일 투여량이 통상 투여된다. 만성 거부를 예방 또는 치료하기 위하여 인간에게 투여하는 1일 투여량은 약 0.1-50mg/kg 범위일 것이다. 배합 또는 혼합 치료법에서, 예를 들면, 타크로리무스는 약 0.01-5mg/kg, 바람직하게 0.05-0.5mg/kg의 1일 투여량으로 인간에게 투여될 수 있다.

만성 거부를 예방하기 위한 화학식(I) 또는 (II)의 화합물을 투여하는 방법은 예방하고자 하는 종, 및 이상의 성질 및 심중도에 따라 달라질 수 있지만, 화학식(I) 또는 (II)의 화합물은 만성 거부가 시작되지 않았다면 단기 또는 장기, 즉 1 주 내지 1년간 인간에게 투여될 수 있다.

만성 거부를 예방 및 치료하는 화학식(I) 또는 (II)의 화합물의 가능한 메카니즘은 항-사구체염 기저막(GBM) 항체가 감소한 후 TFGβ가 지속적으로 억제되는 것과 관련된다.

하기 실시예를 통해 본 발명을 추가로 상세히 설명한다. 이 실시예가 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것이 아님을 이해하여야 한다.

실시예 1. 만성 거부 예방

(1) 방법

중량 250-300g의 근교배된 수컷 Lewis 래트(LEW) (RT1^I)를 신장 이식 수혜자로서 사용하였다. 중량 250-300g의 근교배된 수컷 LEW 및 Fisher (F344) (RT1^IV^I)를 각각 동계이식 및 동종이식 기능자 래트로서 사용하였다. Fisher 및 Lee.[Fisher et al., Surgery, 58: 904-914, 1965]의 기술을 변형하여 사용하므로써 신장 이식을 수행하였다. 신장 이식물의 생존을 수혜자 래트 생존 시간으로서 측정하였다. 혈액 및 24hr 뇨 샘플을 혈장 크레아티닌, 단백뇨, 및 기증자 사구체염 기저막 단백질(GBM)에 대한 항체 역가 측정을 위해 1주일에 한번 수거하였다. 이식후 90일째 신장 이식물을 수거하고 조직학 및 역전사-중합연쇄반응(RT-PCR) 분석을 수행하였다. 투여한 후 0일째부터 9일째까지 매일 투여량 10 mg/kg 및 20 mg/kg의 화합물(I)을 수혜자 래트에 경구 투여하였다. 대조군 동계이식 및 동종이식 수혜자에게는 이식후 어느 약물도 투여하지 않았다.

90일동안 1주일에 한번씩 혈장 크레아티닌 및 단백뇨를 측정하여 수혜자의 신장 기능을 측정하였다. 상기 기술한 바와 같이 신장 이식을 갖는 수혜자로부터 혈액 및 뇨 샘플을 수거하였다. 혈장 크레아티닌은 Sigma Creatinine Kit에 의해, 단백뇨는 Bio-Rad 단백질 에세이에 의해 테스트하였다.

조직학적 분석을 위해 이식 후 90일째 수혜자로부터 신장 이식 조직을 회수하였다. 이식물 샘플을 10% NBF에 고정시키고 연속하여 프로세싱한 후 즉시 ParaPlast^TM파라핀 함몰 매질에 함몰시켰다. 샘플을 3㎛으로 절개하고, 사전-가온화시키고, 탈파라틴화시키고, 다시 수화시킨 후, 4개의 프로세스중 하나로 염색시켰다: Hematoxylin and Eosin, Per-IodicAcidSchiff, Verhoeff's Combined ElasticTrichrome, and Per-Iodic Acid Silver Methenamine. 두명의 조직학자에 의해 조직 단면을 맹목적으로 평가하고 이식 병리학에 대한 수정된 Banff' 기준에 반정략적으로 스코어링하였다[Solez et al., Kidney Int. , 44: 411-422, 1993]

TFGβ가 만성 동종이식 거부를 일으키는데 중요한 작용을 하는 것으로 알려져 왔다. 이식 후 90일째 수혜자로부터 수거된 신장 이식 조직을 TFGβ 유전자 발현을 위해 RT-PCR 시켰다. TRIZOL에 의해 이식된 신장 조직으로부터 총 RNA를 추출하였다. PE Biosystems으로부터의 ABI Prism 7700 서열 검출 시스템 및 시약을 사용하여 Overbergh et al, [Overbergh et al., Cytokine, 11: 305,1999]에 기술된 바와 같이 실시간 RT-PCR를 수행하고, 설치류 GAPDH로 표준화하였다. 래트 TFGβ 에 대한 프라이머 및 프로브는 5'-GCTGCTGACCCCCACTGAT-(센스), 5'-GCCACTGCCGGACAACTC- (안티 센스), 및 CGCCTGAGTGGCTGTCTTTTGACGT-TAMRA이었다. 설치류 GAPDH 프라이머 및 프로브를 PE Biosystem에 의해 디자인하였다.

F344 신장을 갖는 LEW 수혜자의 혈장내 F344 래트 사구체염 기저막 단백질에 대한 특적 항체를 ELISA 에세이를 사용하여 이식 후 근 20, 40, 및 90일째 투여량 10 mg/kg 및 20 mg/kg의 화합물(I)로 처리된 동종이식, 처리되지 않은 동종이식 및 동계이식에서 측정하였다.

(2) 결과.

동계이식은 90일 이상동안 생존하였다. 반대로, 대조군 동종이식중 단지 40%만이 이식 후 90일이상동안 생존하였다. 투여후 90일 이상동안 생존한 투여량 10 mg/kg의 화합물(I) 및 투여량 20 mg/kg의 화합물(I)을 투여받은 동종이식은 각각80% 및 100%였다(표 1).

표 1.

그룹	약물	경로	기간	n	생존일수	생존율
동계이식	-	-	-	6	>90	100%
동종이식	-	-	-	10	14,20,21,24,38,72,>90(4)	40%
화합물(I)	10mg/kg	PO	0-9일	5	28,>90	80%
화합물(II)	20mg/kg	PO	0-9일	5	>90(5)	100%

화합물(I) 치료의 부재하에서, 수혜자의 혈장 크레아티닌은 7주째까지 증가하였고, 단백뇨는 5주째까지 양성으로 검출되었다. 투여량 10 mg/kg 및 20 mg/kg의 화합물(I)로 치료받은 수혜자 둘 모두는 치료받지 않은 래트와 같이 정상의 크레아티닌 및 검출할 수 없는 단백뇨를 유지시켰고 상기 기간동안의 동계이식 수혜자는 하기와 같았다.(도 1-4)

비처리 동종이식 대조군에서는 진행성 조직학적 만성 거부의 발생이 관찰되었다. 투여량 10 mg/kg 및 20 mg/kg의 화합물(I)로 치료받은 수혜자로부터의 신장 이식물의 Banff 스코어는 비처리 동종이식 대조군과 비교하였을 때 하기와 같이 거의 누적적으로 감소하였다: 각각 사이질 염증 50% 및 67%, 세관염 100% 및 100%, 혈관염 33% 및 50%, 사구체혈관간세포분해(mesangiolysis) 83% 및 100%, 사구체염 75% 및 38%, 세뇨관 위축 40% 및 85%, 사구체경화증 83% 및 100%, 섬유 내막 과다형성 63% 및 44%, 및 이식 사구체병증 79% 및 100%. 신장 이식 병리학의 Banff 기준에 기초하여, 만성 거부 진단 평가를 위해 (-): 0 등급, 정상, (+): 1 등급, 경증, (++): 2 등급, 중간 및 (+++) : 3 등급, 중증을 사용하였다. (표 2)

표 2.

1* : 염증, 2*: 세관염, 3*: 혈관염, 4*: 사구체간질분해, 5* : 사구체염, 6*: 세뇨관 위축, 7*: 사구체경화증, 8* : 섬유-내막 과다형성, 9*: 이식 사구체병증

동계이식 대조군과 비교하여, 비처리 동종이식 대조군에서 TFGβ mRNA는 현저히 상향조절되었다. 이식 후 90일째 화합물(I) 치료는 비처리 동종이식 대조군과 비교하여 투여량-의존 방식으로 TFGβ 유전자 발현을 저해하였다. (도 5)

동계이식 대조군 그룹에서, 혈장 항-GBM은 검출할 수 없었다. 이후 비처리 동종이식 대조군에서 이식 후 거의 20일째 검출할 수 있었고 증가하였다. 투여량10 mg/kg 및 20 mg/kg의 화합물(I)로 치료받은 수혜자는 기증자 GBM에 대한 항체 생산이 감소된 성향을 나타내었다. (도 6-9)

실시예 2. 타크로리무스와의 배합물의 만성 거부 예방

(1) 방법

실시예 1에 기술된 래트 및 신장 이식 방법을 사용하였다. 투여량 3 mg/kg의 화합물(I) 및 투여량 1 mg/kg의 타크로리무스를 이식 후 90일동안 매일 수혜 래트에 경구 투여하였다. 동계이식, 비처리 동종이식, 및 90일동안 투여량 1 mg/kg의 타크로리무스으로만 처리된 동종이식을 대조군 그룹으로 사용하였다.

혈액 및 뇨 샘플을 그들의 혈장 크레아티닌 및 단백뇨 측정을 위해 실시예 1에 기술된 바와 같이 신장 이식을 받은 수혜자로부터 90일동안 1주일에 한번 수거하였다. 혈장 크레아티닌은 Sigma Creatinine Kit 및 단백뇨는 Bio-Rad 단백질 에세이에 의해 테스트하였다.

실시예 1에 기술된 방법을 사용하여, 만성 동종이식 거부의 조직학적 변화를 분석하였다. 두명의 조직학자에 의해 조직 단면을 맹목적으로 평가하고 이식 병리학에 대한 수정된 Banff 기준에 기초하여 반정량적으로 스코어링하였다.

F344 신장을 이식받은 LEW 수혜자의 혈장내 F344 래트 사구체염 기저막 단백질에 대한 특이적인 항체를 동계이식, 비처리 동종이식 및 투여량 1 mg/kg의 타크로리무스와 배합된 투여량 3 mg/kg의 화합물(I)로 처리된 동종이식을 실시예 1에 기술된 방법을 사용하여 이식 후 대략 20일, 40일 및 90일째 측정하였다.

(2) 결과

동계이식은 90일 이상동안 생존하였다. 대조적으로, 이식 후 90일째 대조군 동종이식중 단지 40%만이 생존하였다. 투여량 1 mg/kg의 타크로리무스를 받은 것의 동종이식 및 투여량 1 mg/kg의 타크로리무스와 배합된 투여량 3 mg/kg의 화합물(I)을 받은 것의 동종이식은 이식 후 90일째 생존하였고, 둘 모두 100%였다. (표 3)

표 3.

비처리 동종 이식에서, 수혜자의 혈장 크레아티닌은 7주까지 증가하였고 단백뇨는 5주까지 양성으로 검출되었다. 투여량 1 mg/kg의 타크로리무스와 배합된 투여량 3 mg/kg의 화합물(I)로 처리된 수혜자에서는 비처리 동종이식 대조군과 비교하여 혈장 크레아티딘 및 단백뇨 모두가 감소된 것으로 나타났다. (도 10,11)

비처리 동종이식 대조군에서는 진행성 조직학적 만성 거부의 발생이 관찰되었다. 투여량 3mg/kg의 화합물(I) 및 투여량 1mg/kg의 타크로리무스로 치료받은 수혜자로부터의 신장 이식의 Banff 스코어는 비처리 동종이식 대조군과 비교하였을 때 하기와 같이 거의 누적적으로 감소하였다: 각각 사이질 염증 50%, 세관염85%, 혈관염 92%, 사구체간질분해 75%, 사구체염 38%, 세뇨관 위축 55%, 사구체경화증58%, 섬유 내막 과다형성 63%, 및 이식 사구체병증 57%. 신장 이식 병리학의 Banff 기준에 기초하여, (-), (+), (++) 및 (+++)는 표 2에 정의된 바와 같다. (표 4)

표 4.

1* : 염증, 2*: 세관염, 3*: 혈관염, 4*: 사구체간질분해, 5*: 사구체염, 6*: 세뇨관 위축, 7*: 사구체경화증, 8* : 섬유 내막 과다형성, 9*: 이식 사구체병증

동계이식 대조군 그룹에서,혈장 항-GBM은 검출할 수 없었다. 이후 비처리 동종이식 대조군에서 이식 후 거의 20일째 검출할 수 있었고 증가하였다. 투여량 1mg/kg의 타크로리무스와 배합된 투여량 3 mg/kg의 화합물(I)로 처리된 수혜자에서는 동계이식 대조군 그룹에서와 같이 기증자 GBM에 대한 항체가 검출가능한 수준이 아니었다. (도 12)

실시예 3. 만성 거부 치료

(1) 방법

실시예 1에 기술된 래트 및 신장 이식 방법을 사용하였다. 혈장 크레아티닌이 증가하거나 단백뇨를 검출할 수 있을 때로부터 출발하여 3주동안 수혜자 래트에게 투여량 20 mg/kg의 화합물(I)을 경구 투여하였다. 동계이식 및 비처리 동종이식을 대조군 그룹으로서 사용하였다. 혈액 및 뇨 샘플을 그들의 혈장 크레아티닌 및 단백뇨 측정을 위해 실시예 1에 기술된 바와 같이 신장 이식을 받은 수혜자로부터 1주일에 한번 수거하였다. 혈장 크레아티닌은 Sigma Creatinine Kit 및 단백뇨는 Bio-Rad 단백질 에세이에 의해 테스트하였다.

실시예 1에 기술된 방법을 사용하여 화합물(I)의 구급 치료하의 만성 동종이식 거부의 조직학적 변화를 분석하였다. 두명의 조직학자에 의해 조직 단면을 맹목적으로 평가하고 이식 병리학에 대한 수정된 Banff 기준에 기초하여 반정량적으로 스코어링하였다.

(2) 결과

비처리 동종 이식에서, 수혜자의 혈장 크레아티닌은 7주까지 증가하였고 단백뇨는 5주까지 양성으로 검출되었다. 화합물(I) 구급 치료가 수혜자의 신장 기능을 즉각적으로 개선시키지는 못했지만, 약물 치료를 중단한 후 혈장 크레아티닌 및 단백뇨는 정상 수준에 도달하였다. (도 13,14)

비처리 동종이식 대조군에서는 진행성 조직학적 만성 거부의 발생이 관찰되었다. 투여량 20mg/kg의 화합물(I)로 치료받은 수혜자로부터의 신장 이식의 Banff스코어는 진행성 만성 동종이식 거부시 3주동안 비처리 동종이식 대조군과 비교하였을 때 하기와 같이 거의 누적적으로 감소하였다: 각각 사이질 염증 50%, 세관염70%, 혈관염 92%, 사구체간질분해 33%, 사구체염 38%, 세뇨관 위축 42%, 섬유 내막 과다형성 53%, 및 이식 사구체병증 89%. 신장 이식 병리학의 Banff 기준에 기초하여, (-), (+), (++) 및 (+++)는 표 2에 정의된 바와 같다. (표 5)

표 5.

1* : 염증, 2*: 세관염, 3* : 혈관염, 4*: 사구체간질분해, 5*: 사구체염, 6*: 세뇨관 위축, 7*: 사구체경화증, 8*: 섬유 내막 과다형성, 9*: 이식 사구체병증

실시예 4. 타크로리무스의 단기 치료법과 병용시킨 만성 거부 치료법

(1) 방법

실시예 1에 기술된 래트 및 신장 이식 방법을 사용하였다. 이식 후 0일부터 9일째 투여량 1mg/kg의 타크로리무스, 및 이식 후 10일부터 28일째 투여량 10mg/kg 및 15mg/kg의 화합물(I)을 수혜자 래트에 경구 투여하였다. 이 연구에서 LEW 수혜자는 이식 후 10일동안 단기간동안 1 mg/kg/일로 타크로리무스를 경구 투여받으므로써 급성 거부를 피하고 F344 신장 이식를 점차적으로 파괴시켜 결과적으로는 인간의 만성 거부와 유사한 기능 및 조직학적 변화를 일으키는 만성 거부를 지연시켰다. 동계이식, 비처리 동종이식 및 10일동안 1 mg/kg의 타크로리무스로만 처리된 동종이식을 대조군 그룹으로 사용하였다. 기술된 바와 같이 신장 이식을 받은 수혜자로부터 1주일에 한번 수거하였다. 혈장 크레아티닌은 Sigma Creatinine Kit 및 단백뇨는 Bio-Rad 단백질 에세이에 의해 테스트하였다.

(2) 결과

동계이식은 90일 이상동안 생존하였다. 반대로, 대조군 동종이식중 단지 40%만이 이식 후 90일까지 생존하였다. 이식 후 10일동안 투여량 1 mg/kg의 타크로리무스만을 투여받은 동종이식은 100%의 동종이식 생존율을 나타내었다. 동물 사례수를 증가시킨 후 단기간의 타크로리무스 및 28일 내지 60일간의 10 mg/kg 또는 15 mg/kg의 수혜자에 대한 각각의 동종이식 생존율을 이용가능할 것이다.(표 6)

표 6.

그룹	약물	경로	기간	n	생존일수	생존율
동계이식	-	-	-	6	>90	100%
동종이식	-	-	-	10	14,20,21,24,38,72,>90(4)	40%
타크로리무스	1mg/kg	PO	0-9일	5	>90	100%
타크로리무스화합물(I)	1mg/kg10mg/kg	PO	0-9일28-60일	2	>90(2)	N/A
타크로리무스화합물(I)	1mg/kg15mg/kg	PO	0-9일28-60일	1	>90	N/A

90일동안 1주일에 1번 그들의 혈장 크레아티닌 및 단백뇨를 측정하여 수혜자의 신장 기능을 측정하였다.

동종이식 대조군에서는 이식 7주 후 및 타크로리무스를 단기 투여하여 치료받은 동종이식에서는 8주후 혈장 크레아티닌이 급속도로 증가한 반면, 동계이식 대조군에서는 정상 범위내로 유지되었다. 28일 내지 60일동안 10mg/kg의 화합물(I)은 전체 연구 기간동안 혈장 크레아티닌 수준을 1.5 mg/dL의 정상 값 미만으로 유지시켰다. 15 mg/kg/일의 화합물(I)로 처리된 수혜자는 이식 후 3주로부터 출발하여 9주째까지 혈장 크레아티닌이 증가하였지만, 그후 정상 수준으로 가역되고 유지되었다(도 15,16). 40%의 동종이식 대조군 래트 및 타크로리무스를 단기 투여하여 치료받은 동종이식 100%는 이식 후 90일 이상동안 생존하였고, 동계이식 대조군과 비교하여 단백뇨는 이식 후 각각 2주 및 5주째까지 검출가능하였고, 이후 현저히 증가하였다. 28일부터 60일까지 10 mg/kg 및 15 mg/kg의 화합물(I)의 치료는 신장 수혜자의 단백뇨 진행을 감소시켰다(도 17,18)

화학식(I) 또는 (II)의 화합물은 이식된 장기 또는 조직에서의 만성 거부를 예방 및/또는 치료하는 활성을 갖는 것으로 입증되었다. 따라서, 본 발명은 이식된 장기 또는 조직에서 만성 거부를 예방 및/또는 치료하기 위한 유용한 면역억제제를 제공한다.

도면의 간단한 설명

도 1은 투여량 10mg/kg의 화합물(I)로 치료한 후의 혈장 크레아티닌 농도를 나타내다(실시예 1)

도 2는 투여량 20mg/kg의 화합물(I)로 치료한 후의 혈장 크레아티닌 농도를 나타내다(실시예 1)

도 3은 투여량 10mg/kg의 화합물(I)로 치료한 후의 단백뇨 정량을 나타낸다(실시예 1)

도 4는 투여량 20mg/kg의 화합물(I)로 치료한 후의 단백뇨 정량을 나타낸다(실시예 1).

도 5는 화합물(I)을 사용한 치료시 TFGβ 유전자 발현의 저해를 나타낸다. (실시예 1)

도 6은 동계 이식에서 GBM에 대한 항체 생성을 나타낸다(실시예 1)

도 7은 동종이식에서 GBM에 대한 항체의 생산을 나타낸다(실시예 1)

도 8은 투여량 10mg/kg의 화합물(I)로 치료된 동종이식에서 GBM에 대한 항체의 생산을 나타낸다(실시예 1).

도 9는 투여량 20mg/kg의 화합물(I)로 치료된 동종이식에서 GBM에 대한 항체의 생산을 나타낸다(실시예 1).

도 10은 투여량 1 mg/kg의 타크로리무스와 배합된 투여량 3 mg/kg의 화합물(I)로 처리된 이식물에서의 혈장 크레아티닌 농도를 나타낸다(실시예 2)

도 11은 투여량 1 mg/kg의 타크로리무스와 배합된 투여량 3 mg/kg의 화합물(I)로 처리된 이식물에서의 단백뇨 정량을 나타낸다(실시예 2)

도 12는 타크로리무스와 배합된 화합물(I)로 처리된 동종 이식물에서의 GBM에 대한 항체의 생산을 나타낸다(실시예 2).

도 13은 투여량 20mg/kg의 화합물(I)로 구급 처리된 이식물에서의 혈장 크레아티닌 농도를 나타낸다(실시예 3)

도 14는 투여량 20mg/kg의 화합물(I)로 구급 처리된 이식물에서의 단백뇨 정량을 나타낸다(실시예 3)

도 15는 타크로리무스로 단기 처리되고 투여량 10mg/kg의 화합물(I)로 구급 처리된 이식물에서의 혈장 크레아티닌 농도를 나타낸다(실시예 4).

도 16은 타크로리무스로 단기 처리되고 15mg/kg의 화합물(I)로 구급 처리된 이식물에서의 혈장 크레아티닌 농도를 나타낸다(실시예 4).

도 17은 타크로리무스로 단기 처리되고 투여량 10mg/kg의 화합물(I)로 구급 처리된 이식물에서의 단백뇨 정량을 나타낸다(실시예 4).

도 18은 타크로리무스로 단기 처리되고 투여량 15mg/kg의 화합물(I)로 구급 처리된 이식물에서의 단백뇨 정량을 나타낸다(실시예 4).

Claims

치료학적 유효량의 하기 화학식(I) 또는 (II)의 화합물을 그를 필요로 하는 포유동물 수혜자에 투여하는 것을 포함하는, 이식된 장기 또는 조직에서의 만성 거부를 예방 및/또는 치료하는 방법:
제 1항에 있어서, 만성 거부를 예방하기 위한 방법.
제 2항에 있어서, 이식이 동종이식편 이식인 방법.
제 1항에 있어서, 추가로 치료학적 유효량의 타크로리무스를 투여하는 것을 포함하는 방법.
제 3항에 있어서, 추가로 치료학적 유효량의 타크로리무스를 투여하는 것을 포함하는 방법.
제 1항에 있어서, 경구 투여하는 방법.
이식된 장기 또는 조직에서의 만성 거부를 예방 및/또는 치료하기 위한 약제를 제조하기 위한 하기 화학식(I) 또는 (II)의 화합물의 용도:
제 7항에 있어서, 약제가 만성 거부를 예방하기 위한 용도.
제 8항에 있어서, 이식이 동종이식편 이식인 용도.
제 7항에 있어서, 타크로리무스와 함께 약제를 제조하기 위한 용도.
제 9항에 있어서, 타크로리무스와 함께 약제를 제조하기 위한 용도.
제 7항에 있어서, 약제가 경구 투여용인 용도.
약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제와 함께 치료학적 유효량의 하기 화학식(I) 또는 (II)의 화합물을 포함하는, 이식된 장기 또는 조직에서의 만성 거부를 예방 및/또는 치료하기 위한 약제학적 조성물:
제 13항에 있어서, 조성물이 만성 거부를 예방하기 위한 약제학적 조성물.
제 14항에 있어서, 이식이 동종이식편 이식인 약제학적 조성물.
제 13항에 있어서, 치료학적 유효량의 타크로리무스와 함께 공-투여하기 위한 약제학적 조성물.
제 15항에 있어서, 치료학적 유효량의 타크로리무스와 함께 공-투여하기 위한 약제학적 조성물.
제 13항에 있어서, 경구 투여하기 위한 약제학적 조성물.