JP2002534473A

JP2002534473A - 細胞死に対する予備条件付け

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Publication number: JP2002534473A
Application number: JP2000593315A
Authority: JP
Inventors: パヴェルハメット，; ヨハネトレンブレイ，; クリスティーヌデスロジエール，; フイファンチェン，
Original assignee: パヴェルハメット，; ヨハネトレンブレイ，; クリスティーヌデスロジエール，; フイファンチェン，
Priority date: 1999-01-12
Filing date: 2000-01-11
Publication date: 2002-10-15
Also published as: AU771162B2; NZ512849A; HK1043726B; CA2360268A1; DK1146885T3; EP1146885B1; DE60002979D1; DE60002979T2; HK1043726A1; PT1146885E; EP1146885A1; IL144242A; AU3028000A; ES2202034T3; MXPA01007111A; ATE241370T1; IL144242A0; WO2000041705A1

Abstract

(57)【要約】哺乳動物の身体から血液のアリコートを採取すること、この採取したアリコートをエキソビボで酸化的ストレッサー（例えば、オゾンガスへの曝露）、温度ストレッサー（すなわち、体温より高いかまたは体温より低い温度）、および紫外光に供すること、ならびにこの処理した血液のアリコートをこの哺乳動物の身体内に再注射することによって、哺乳動物の身体におけるアポトーシスおよび／または壊死に関連した障害（すなわち、放射線曝露障害、化学薬品曝露障害および化学薬品摂取障害、神経学的障害、ならびに物理的外傷障害）を処置し、そして予備条件付けすることによりそれらの発症を相殺する。この処置は、身体におけるアポトーシス／壊死を減少させる効果、および引き続き遭遇するアポトーシス誘導事象に、より良好に抵抗するために身体を予備条件付けする効果を有する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（発明の分野）本発明は、医学の分野に関する。より詳細には、本発明は、哺乳動物の身体（
ヒトの身体を含む）を予備条件付け（ｐｒｅ−ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ）して
、それらの細胞性器官が、アポトーシス誘導事象または壊死誘導事象（アポトー
シスおよび壊死の両方を誘導する事象を含む）によって誘導されるような引き続
き遭遇する細胞死に、より良好に抵抗することを可能にするための手段に関する
。

【０００２】（発明の背景）細胞死の２つの公知な型が、壊死およびアポトーシスである。アポトーシスは
、制御されたプログラム細胞死の生物学的プロセスであり、これによって細胞は
、周囲環境に細胞内容物を放出することを伴わない凝縮プロセスによって死滅す
る。大半の器官および組織の細胞は、長い間に分裂および増殖し、通常はアポト
ーシスによる細胞死で平衡状態にあるプロセスが、健全な身体における最適な細
胞数を生じさせる。従って、アポトーシスは、器官および組織における細胞の総
数に対する制御として作用すると考えられ得る。アポトーシスを受けた細胞（ａ
ｐｏｐｔｏｓｅｄｃｅｌｌ）の残渣は、食作用プロセスによって、大部分が他
の細胞により消費される。アポトーシスのプロセス（これにより、身体は所望さ
れない細胞の除去を行う、天然の十分に調節されたプロセス）は、膜の破裂の結
果として大部分が制御されていない様式で細胞が死滅する壊死のプロセスと対比
される。しかし、重要なことに、多くの場合において、アポトーシスと壊死は連
続体として挙動する。壊死した細胞（ｎｅｃｒｏｓｅｄｃｅｌｌ）の細胞内成
分は、制御されていない様式で生物体内に放出され、通常は、身体が、これらの
急に遭遇した成分を処理しようと試みるので、炎症反応を生じる。アポトーシス
を受けた細胞は、実質的に、有害な炎症反応をなんら引き起こさない。

【０００３】生体、または生体の個々の器官におけるいくつかの医学的障害は、アポトーシ
ス速度の過度な加速に少なくとも一部起因すると考えられ得る。これは、例えば
、身体が、化学毒物を摂取するか、または過剰な量の有害な放射線（放射能、Ｕ
Ｖ曝露など）に遭遇する場合に生じ得る。他の障害は、アポトーシスおよび壊死
の両方に関係する。なお他の障害は、主に壊死に起因する細胞死の加速した速度
に関係する。

【０００４】細胞のアポトーシスは、細胞のミトコンドリアの機能における変化によって開
始されると理解されている。周知のように、ミトコンドリアは、細胞内に位置付
けられる膜結合オルガネラであり、そして総細胞容積の大部分の画分を占める。
これらは、多量の内部膜を含む。ミトコンドリアの主な機能は、栄養素から、細
胞性反応を駆動するために使用され得る形態にエネルギーを変換することである
。これは、化学浸透共役プロセスによって達成され、これにより膜結合イオンポ
ンプは、ミトコンドリア膜の一方から他方にイオンを転移させる。プロトンポン
プは、膜を横切る電気化学的なプロトン勾配を生成し、これは、膜に包埋された
タンパク質（例えば、酵素ＡＴＰシンターゼ）を介してプロトンが流動する場合
に、種々のエネルギーを必要とする反応を駆動するために使用される。イオン性
プロセスとして、ミトコンドリア膜を横切る電位は、このエネルギーを提供する
機構の効率的操作に重要である。ミトコンドリアは、前アポトーシス性（ｐｒｏ
−ａｐｏｐｔｏｔｉｃ）タンパク質を放出することによって、アポトーシスの誘
導に直接関与する。ミトコンドリア膜電位の低下は、アポトーシスの開始の指標
であることが公知である。

【０００５】アポトーシスを受けている器官は、ゲル電気泳動後にラダー（ｌａｄｄｅｒ）
として現れる特異的パターンの１８０〜２００塩基対へのオリゴヌクレオソーム
性ＤＮＡ断片化を示す。ＤＮＡ断片化の程度は、その器官におけるアポトーシス
の進行と相関する。そしてこれは、ＤＮＡを抽出し、それを放射標識し、それを
電気泳動に供し、そして種々のＤＮＡフラグメントと関連付けられる放射能を定
量することによって測定され得る。このような技術は、身体の器官または組織に
おけるアポトーシスの範囲または程度を決定するため、アポトーシスを受けてい
る細胞またはアポトーシスの状態または素因を示す細胞の数を決定するために使
用され得る。

【０００６】壊死の過程では、通常細胞質中に含まれる酵素または他の細胞内容物が、壊死
の特徴である細胞膜の崩壊の結果として放出される。これらの１つが、酵素乳酸
脱水素酵素（ＬＤＨ）であり、このレベルは、通常、壊死の程度を決定するため
に使用される。

【０００７】（先行技術の簡潔な参照）米国特許第４，９６８，４８３号（Ｍｕｅｌｌｅｒら）は、制御された温度で
、体外で患者の血液のアリコートを酸素／オゾン混合物および紫外光で処理する
ことによって、血液に酸素添加する装置を記載する。この装置は、血液学的な酸
化療法における用途のために提案されている。

【０００８】米国特許第５，５９１，４５７号（Ｂｏｌｔｏｎ）は、患者由来の血液のアリ
コートを採取すること、それを約３７〜４３℃の範囲の温度でオゾン／酸素ガス
混合物および紫外線照射に供すること、次いで、この処理された血液をヒト患者
に再注射することによって、ヒトにおける血小板の凝集を阻害する方法、免疫系
を刺激する方法、および末梢血管疾患（例えば、レイノー病）を処置する方法を
開示する。

【０００９】米国特許第５，８３４，０３０号（Ｂｏｌｔｏｎ）は、哺乳動物患者における
高血圧のような状態を処置する際に潜在的に有用な、哺乳動物患者の血液中の一
酸化窒素含量を増加させる類似のプロセスを記載する。

【００１０】国際特許出願ＰＣＴ／ＣＡ９７／００５６４（ＶａｓｏｇｅｎＩｎｃ．）（
ＷＯ９８／０７４３６）は、慢性関節リウマチのような自己免疫疾患の症状を軽
減するためにヒト患者に投与するための自己免疫ワクチンを記載する。このワク
チンは、体外で酸化的環境、ＵＶ照射および上昇温度に供された患者の血液のア
リコートを含む。

【００１１】哺乳動物患者の組織または器官におけるアポトーシスの加速をもたらし、そし
てその程度を増加させるように思われる外部の細胞傷害に、より良好に抵抗する
ために哺乳動物患者を予備条件付けするための手段を提供することが、本発明の
目的である。

【００１２】患者の組織または器官における壊死の加速をもたらし、そしてその程度を増加
させるように思われる外部の細胞傷害に、より良好に抵抗するために哺乳動物患
者を予備条件付けするための手段を提供することが、本発明のさらなる目的であ
る。

【００１３】化学中毒および放射線障害の有害な影響に対して哺乳動物患者を予備条件付け
するプロセスを提供することが、本発明のさらなる目的である。

【００１４】アポトーシスに関連した医学的障害または壊死に関連した医学的障害の症状の
進行を軽減または減速させるプロセスを提供することが、本発明のさらなる目的
である。

【００１５】（発明の要旨）本発明は、器官および組織の細胞が、引き続いて遭遇するアポトーシスおよび
／または壊死誘導事象により良好に抵抗し得るように、哺乳動物の身体が予備条
件付けされ得るプロセスを提供する。そのプロセスは、血液のアリコートの改変
をもたらす特定のストレッサー（ｓｔｒｅｓｓｏｒ）で、その哺乳動物の身体か
らの血液のアリコートをインビトロで処理することを包含する。次いで、その処
理された血液のアリコートは、哺乳動物の身体中に再び導入される。この結果と
して、細胞が、引き続いてストレス剤または毒性剤に曝露された場合に、ミトコ
ンドリア膜電位における変化、ＤＮＡラダー発生の減少、およびＬＤＨの放出の
減少によって示される、その身体の細胞のアポトーシスおよびアポトーシス／壊
死に対する抵抗性における有意な増加が得られる。

【００１６】血液のアリコートは、その血液を改変することが見出されている１つ以上のス
トレッサーに供されることによって処理される。本発明によれば、その血液のア
リコートは、その血液、またはその血液の分離された細胞性または非細胞性画分
、あるいはその血液のその分離された細胞性および／または非細胞性画分の混合
物を、熱、紫外光、および酸化的環境から選択されるストレッサーに供すること
によって、改変され得る。そのストレッサーは、個々に、または２つ以上のこの
ようなストレッサーの任意の組み合わせに、同時または連続して、適用され得る
。

【００１７】従って、本発明のプロセスは、哺乳動物の身体を、種々の身体器官の細胞の過
剰の程度のアポトーシスまたは壊死と関連する病原性状態を引き起こすことが知
られている広範な引き続いて遭遇する因子の影響に対して、予備条件付けをする
ために使用され得る。

【００１８】種々の器官または組織における過剰の程度のアポトーシスおよび／または壊死
と関連する医学的障害、そして従って、それについて本発明のプロセスが、使用
のために、その処置として、またはその効果に対する予備条件付けのいずれかと
して示される、医学的障害は、４つの一般的なカテゴリーに分類され得る。それ
らは、以下のものである。

【００１９】（１）放射線曝露障害。これらは、過剰量の電離放射線（例えば、核放射線、
治療放射線、またはＸ線）または紫外光（例えば、日焼けのような皮膚障害を生
じる）への曝露を含む。このような放射線曝露障害が、アポトーシスの増加と関
連するという事実は、例えば、Ｂｌａｎｋｅｎｂｅｒｇら、「Ｄｙｉｎｇａ
ｔｈｏｕｓａｎｄｄｅａｔｈｓ．Ｒａｄｉｏｎｕｃｌｉｄｅｉｍａｇｉｎｇ
ｏｆａｐｏｐｔｏｓｉｓ」，Ｏ．Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．，１９９９Ｊｕ
ｎｅ；４３（２）：１７０−６およびそこで引用されている種々の参考文献から
；Ｗｏｎｇ，Ｇ．Ｈ．「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅｒｏｌｅｓｏｆｃｙｔｏｋ
ｉｎｅｓａｇａｉｎｓｔｒａｄｉａｔｉｏｎ：ｉｎｄｕｃｔｉｏｎｏｆ
ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌＭｎＳＯＤ」，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ
．Ａｃｔａ１９９５Ｍａｙ２４；１２７１（１）：２０５−２０９および
そこで引用されている種々の参考文献から、Ｚｈａｏら、「Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄ
ｒｉａｌａｎｄｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｆｒｅｅ−ｃａｌｃｉｕｍ
ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｒａｄｉａｔｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄａｐｏｐ
ｔｏｓｉｓｉｎｈｕｍａｎｌｅｕｋｅｍｉｃｃｅｌｌｓ」，ＩｎｔＪ
ＲａｄｉａｔＢｉｏｌ１９９９Ａｐｒ；７５（４）：４９３−５０４か
ら；およびＲｅａｐＥ．Ａ．ら、「Ｒａｄｉａｔｉｏｎａｎｄｓｔｒｅｓ
ｓ−ｉｎｄｕｃｅｄａｐｏｐｔｏｓｉｓ：ａｒｏｌｅｆｏｒＦａｓ／Ｆ
ａｓｌｉｇａｎｄｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ」，ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃ
ａｄＳｃｉＵＳＡ，１９９７Ｍａｙ２７；９４（１１）：５７５０−
５から、公知である。

【００２０】（２）化学薬品曝露障害および科学薬品摂取障害。これらは、化学中毒；細菌
毒素からの食中毒；毒性薬物摂取過量および副作用；神経ガスおよびマスタード
ガスのような化学兵器への曝露からの障害；化学薬品および毒素（アルコールを
含む）からの肝障害；腎臓障害（例えば、アミノグリコシド抗生物質の摂取、Ｘ
線撮影用造影色素から生じる）またはシクロスポリン腎毒性；薬物または毒素誘
導型骨髄抑制に由来する造血障害および免疫不全障害；細菌毒素からの感染；オ
ゾン曝露；溶媒曝露；およびシクロスポリン、シクロホスファミド、またはアザ
チオプリンのような免疫抑制剤の影響を含む。このような化学薬品摂取および曝
露障害がアポトーシスの増大と関連するという事実は、例えば、Ｌｏｓｓｅｒ
ＭＲおよびＰａｙｅｎＤ，「Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｏｆｌｉｖｅｒｄａ
ｍａｇｅ」、ＳｅｍｉｎＬｉｖｅｒＤｉｓ，１９９６Ｎｏｖ；１６（４）
：３５７−６７から；ＳｍｉｔｈＫ．Ｊ．ら、「Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈ
ｅｍｉｃａｌｓｔｕｄｉｅｓｏｆｂａｓｅｍｅｎｔｍｅｍｂｒａｎｅ
ｐｒｏｔｅｉｎｓａｎｄｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎａｎｄａｐｏｔｏ
ｓｉｓｍａｒｋｅｒｓｉｎｓｕｌｆｕｒｍｕｓｔａｒｄｉｎｄｕｃｅ
ｄｃｕｔａｎｅｏｕｓｌｅｓｉｏｎｓｉｎｗｅａｎｌｉｎｇｐｉｇｓ
」、Ｊ．Ｄｅｒｍａｏｌ．Ｓｃｉ．，１９９７Ｓｅｐｔ；１５（３）：１７３
−８２から；ＤａｂｒｏｗｓｋａＭ．Ｉ．ら、「Ｓｕｌｆｕｒｍｕｓｔａｒ
ｄｉｎｄｕｃｅｓａｐｏｐｔｏｓｉｓａｎｄｎｅｃｒｏｓｉｓｉｎ
ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓ」、ＴｏｘｉｃｏｌＡｐｐｌＰｈａｒ
ｍａｃｏｌ１９９６Ｄｅｃ；１４１（２）：５９６−８３から；Ｍｕｌｌｅ
ｒら、「Ａｎｔｈｒａｃｙｃｌｉｎｅ−ｄｅｒｉｖｅｄｃｈｅｍｏｔｈｅｒａ
ｐｅｕｔｉｃｓｉｎａｐｏｐｔｏｓｉｓａｎｄｆｒｅｅｒａｄｉｃａ
ｌｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ（Ｒｅｖｉｅｗ）」、ＩｎｔＪＭｏｌＭｅ
ｄ１９９８Ｆｅｂ：１（２）：４９１−４およびそこで引用される種々の参
考文献から；Ｈｅａｌｅｙら、「Ａｐｏｐｔｏｓｉｓａｎｄｎｅｃｒｏｓｉ
ｓ：ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｏｆｃｅｌｌｄｅａｔｈｉｎｄｕｃｅｄｂ
ｙｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎｅＡｉｎａｒｅｎａｌｐｒｏｘｉｍａｌ
ｔｕｂｕｌａｒｃｅｌｌｌｉｎｅ」、ＫｉｄｎｅｙＩｎｔ，１９９８
Ｄｅｃ；５４（６）：１９５５−６６から；ＨａｔａｋｅＫら、「Ａｐｏｐｔ
ｏｓｉｓ−ｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉ
ｃｓｙｓｔｅｍ：ｎｏｒｍａｌａｎｄｐａｔｈｏｌｏｇｉｃＡ１ｃｏ
ｎｄｉｔｉｏｎｓ（Ｒｅｖｉｅｗ）」、ＩｎｔＪＭｏｌＭｅｄ１９９
８Ｊａｎ；１（１）：１２１−９およびそこで引用される種々の参考文献から
；ＢａｎｋｅｒＤ．Ｅ．ら「Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｏｆｓｐｏｎｔａｎ
ｅｏｕｓａｎｄｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｇｅｎｔ−ｉｎｄｕｃｅｄａ
ｐｏｐｔｏｓｉｓｗｉｔｈＢＣＬ−２ｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉ
ｏｎｉｎａｃｕｔｅｍｙｅｌｏｉｄｌｅｕｋｅｍｉａ」、Ｂｌｏｏｄ，
１９９７Ｊａｎ１；（１）：２４３−５５から；ＶｏｅｔｂｅｒｇＢ．
Ｊ．ら、「Ａｐｏｐｔｏｓｉｓａｃｃｏｍｐａｎｉｅｓａｃｈａｎｇｅ
ｉｎｔｈｅｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ．．．．」，ＣｌｉｎＩｍｍｕｎｏｌ
ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ１９９４Ｍａｙ；７１（２）：１９０−８から；
およびＭｏｕｎｔｚＪ．Ｄ．ら、「Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅｄｉｓｅａｓｅ．
Ａｐｒｏｂｌｅｍｏｆｄｅｆｅｃｔｉｖｅａｐｏｐｔｏｓｉｓ」、Ａｒ
ｔｈｒｉｔｉｓＲｈｅｕｍ１９９４Ｏｃｔ；３７（１０）：１４１５−２
０から、公知である。

【００２１】（３）神経学的障害（例えば、パーキンソン病（特定の脳細胞のアポトーシス
を含む）、老人性痴呆、およびアルツハイマー病、および同様の疾患）。このよ
うな神経学的障害がアポトーシスの増大に関連するという事実は、例えば、Ｄｅ
ｓｊａｒｄｉｎｓＰ，ＬｅｄｏｕｘＳ「Ｔｈｅｒｏｌｅｏｆａｐｏｐ
ｔｏｓｉｓｉｎｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅｄｉｓｅａｓｅｓ，
「Ｍｅｔａｂ．ＢｒａｉｎＤｉｓ．１９９８Ｊｕｎ；１３（２）：７９−９
６から；ＤｒａｇｕｎｏｗＭ，ＭｃＧｉｂｂｏｎＧ．Ａ．ら「Ａｐｏｐｔｏ
ｓｉｓ，ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃｆａｃｔｏｒｓａｎｄｎｅｕｒｏｄｅ
ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ」、Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１９９７Ｊｕｌ−Ｄｅ
ｃ；８（３−４）：２２３−２６５から；ＫｉｔａｍｕｒａＹ，Ｔａｎｉｇｕ
ｃｈｉＴ，ＳｈｉｍｏｈａｍａＳ，「Ａｐｏｐｔｏｔｉｃｃｅｌｌｄｅ
ａｔｈｉｎｎｅｕｒｏｎｓａｎｄｇｌｉａｌｃｅｌｌｓ：ｉｍｐｌｉ
ｃａｔｉｏｎｓｆｏｒＡｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓｄｉｓｅａｓｅ」、Ｊｐｎ
ＪＰｈａｒｍａｃｏｌ．１９９９Ｊａｎ；７９（１）：１−５から；およ
びＢｕｄｄＳ．Ｌ．およびＮｉｃｈｏｌｌｓＤ．Ｇ．「Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄ
ｒｉａｉｎｔｈｅｌｉｆｅａｎｄｄｅａｔｈｏｆｎｅｕｒｏｎｓ
」、ＥｓｓａｙｓＢｉｏｃｈｅｍ１９９８；３３；４３−５２；および上記
の文献以前のおよびその後の両方の他の刊行物から、公知である。

【００２２】（４）物理的外傷障害（例えば、物理的事故傷害、創傷、熱傷（火傷）、およ
び外科手術中に起こるような血液の損失）。このような障害がアポトーシスの増
大と関連するという事実は、例えば、ＷｉｌｓｏｎＳ．Ｅ．「Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒｃｅｌｌｂｉｏｌｏｇｙｆｏｒｔｈｅｒｅｆｒａｃｔｉｖｅｃ
ｏｒｎｅａｌｓｕｒｇｅｏｎ：ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄｃｅｌｌｄｅａｔｈ
ａｎｄｗｏｕｎｄｈｅａｌｉｎｇ」、ＪＲｅｆｒａｃｔＳｕｒｇ，１
９９７Ｍａｒ−Ａｐｒ；１３（２）：１７１−５から、公知である。

【００２３】特定のプロセスまたは手順が、生きている哺乳動物の身体の組織または器官に
おけるアポトーシスに対して効果があるか否かの決定は、細胞レベルで、例えば
、ミトコンドリア膜電位の測定により、またはＤＮＡフラグメント化の程度の決
定により、最も良く決定される。これらの測定は、以下の特定の実施例において
、より詳細に記載される。プロセスまたは手順がアポトーシスの減少に導かれる
このような測定による決定は、このようなプロセスまたは手順が、上記の４つの
カテゴリーに列挙された任意のアポトーシス関連障害に対する処置または予備条
件付けにおいて有効であることの指標である。上記のカテゴリーの１つにおける
障害に対する軽減または予備条件付けにおけるそのプロセスの実証された効力に
関連する細胞レベルでのプロセスまたは手順のアポトーシス阻害効果のこのよう
な決定は、同じカテゴリー中の他の障害に対する軽減または予備条件付けにおけ
る、そのプロセスまたは手順の潜在的な臨床的成功の強力な証拠である。

【００２４】従って、本発明のプロセスは、主に、このような因子に曝露される状態に遭遇
する可能性の高い人々（例えば、化学工場施設、核施設など、または物理的に危
険な状況（例えば、緊急応答チーム）における労働者）によって使用されるため
に指示される。広範な種々の危険に対して軍隊が予備条件付けされ得る潜在的な
軍事適用は、明らかである。そのプロセスの使用のためのより詳細な指示は、医
学的処置（所望でない副作用を伴う毒性薬物の投与を含む）を経験する患者に関
連する。臓器移植を補助するため、またはその他の用途のための、例えば、シク
ロスポリン、シクロホスファミド、およびアザチオプリンのような免疫抑制剤の
投与は、一般に、アポトーシスおよび／または壊死促進関連障害を導く。このよ
うな処置に関与する患者に対する本発明のプロセスの使用は、有益であり得る。
なぜなら、特に、このような患者のための、薬物または放射線の両方を使用し、
かつ本発明のプロセスを使用する処置レジメンが、前もって注意深く計画され得
、そして注意深く制御されたスケジュールに従って行われ得るからである。

【００２５】引き続き遭遇する因子に対する身体または身体器官の予備条件付けのための本
発明のプロセスの使用に加えて、そのプロセスはまた、増大したアポトーシスお
よび／または壊死に関連する医学的障害の症状を制御または軽減するために使用
され得る。本明細書中で使用される場合、用語「症状を軽減させるかまたは症状
に対して保護する」は、保護を得るための予備条件付け、および発現した症状の
処置の両方をいう。医学的障害の原因因子が老化と関連する状況（例えば、パー
キンソン病または老人性痴呆症）において、その障害を患っている患者による、
それを制御するか、またはその症状を軽減するための、本発明のプロセスの使用
は、その最も実践的な使用である。実際、臨床試験は、老年の患者の認識および
全般的健康における改善の証拠を提供している。

【００２６】従って、本発明の１つの局面において、哺乳動物の身体におけるアポトーシス
または壊死の加速した速度に関係する医学的障害の症状を軽減するかまたはそれ
に対して保護するプロセスが提供され、該障害は、放射線曝露障害；化学薬品曝
露障害および化学薬品摂取障害；神経学的障害；および物理的外傷障害から選択
され、これらは、（ａ）その哺乳動物の身体由来の血液のアリコートをエキソビ
ボで、身体温度より高いかまたは低い温度、紫外光、および酸化的環境からなる
群から選択される少なくとも１つのストレッサーと反応させること；および（ｂ
）（ａ）において処理された血液のアリコートを、哺乳動物の身体に投与するこ
とによる、哺乳動物の身体の組織および器官のアポトーシスまたは壊死に対する
速度または感受性を減少する工程を包含する。

【００２７】（好ましい実施形態の説明）本発明の好ましいプロセスに従って、血液のアリコートは、哺乳動物被験体（
好ましくは、ヒト）から採取され、そしてこの血液のアリコートは、以下でより
詳細に記載される特定のストレッサーを用いてエキソビボで処理される。本明細
書中で使用される用語「アリコート」、「血液のアリコート」または類似の用語
は、全血、血液の分離された細胞性画分（血小板を含む）、血液の分離された非
細胞性画分（血漿を含む）、およびそれらの組合せを含む。ストレッサーの効果
は、アリコート中に含まれる、血液および／またはその細胞性画分もしくは非細
胞性画分を改変することである。次いで、改変されたアリコートは、任意の適切
な方法（最も好ましくは、筋肉内注射であるが、皮下注射、腹腔内注射、および
経口投与、鼻投与または直腸投与、動脈内注射または静脈内注射もまた含む）に
よって被験体の身体内に再導入される。

【００２８】血液のアリコートが本発明の方法に従ってエキソビボで供されるストレッサー
は、個々にかまたは任意の組合せにおいて、同時にかまたは連続的に、温度スト
レス（体温より高いかまたは低い血液温度）、酸化的環境および紫外光から選択
される。アリコートは、被験体の身体内に再導入される場合、アポトーシスレベ
ルに対する予備条件付けがこの被験体において達成される、十分な容量を有する
。好ましくは、ヒト患者において、アリコートの容量は、約４００ｍｌまで、好
ましくは、約０．１〜約１００ｍｌ、より好ましくは、約５〜約１５ｍｌ、さら
により好ましくは、約８〜約１２ｍｌ、そして最も好ましくは、約１０ｍｌであ
る。

【００２９】本発明に従って、上述のストレッサーの３つすべてを処理の下でアリコートに
同時に適用して、血液に対する適切な改変を確実にすることが、好ましい。本発
明のいくつかの実施形態において、上記のストレッサーのいずれか２つを適用す
ること（例えば、温度ストレスおよび酸化的ストレス、温度ストレスおよび紫外
光、または紫外光および酸化的ストレス、を適用すること）もまた、好ましい。
適切なレベルのストレッサーを利用し、それによって所望の効果を達成するよう
に血液を効果的に改変することに、注意を払わなければならない。

【００３０】温度ストレッサーは、正常の体温より高い温度に、処理されるべきアリコート
を温めるか、または正常の体温よりも低い温度にアリコートを冷却する。温度は
、温度ストレッサーが、アリコートに含まれる血液における過剰な溶血を生じず
、そしてその結果、試験されるアリコートが被験体に注射される場合に、アポト
ーシスおよび／または壊死に対する有効な予備条件付けが達成されるように選択
される。好ましくは、温度ストレッサーは、アリコートの全てまたは一部の温度
が、約５５℃まで、そしてより好ましくは、約−５℃〜約５５℃の範囲にあるよ
うに、適用される。

【００３１】本発明のいくつかの実施形態において、アリコートの温度は、正常の体温より
高く上昇され、その結果、アリコートの平均温度は、温度約５５℃を超えず、よ
り好ましくは、約４０℃〜約５０℃、さらにより好ましくは、約４０℃〜約４４
℃、そして最も好ましくは、約４２．５±１℃である。

【００３２】他の好ましい実施形態において、アリコートは、正常な体温より低く冷却され
、その結果、アリコートの平均温度は、約４℃〜約３６．５℃、さらにより好ま
しくは、約１０℃〜約３０℃、そしてさらにより好ましくは、約１５℃〜約２５
℃の範囲内である。

【００３３】酸化的環境ストレッサーは、固体、液体または気体の酸化剤のアリコートに対
する適用であり得る。好ましくは、これは、医学的等級の酸素ガスおよびオゾン
ガスの混合物、最も好ましくは、アリコートを通した通気（ｂｕｂｂｌｉｎｇ）
によって、上述の温度範囲にて、医学的等級の酸素ガス流（その中に少量の成分
としてオゾンガスを有する）に対してアリコートを曝露することを包含する。こ
のガス流のオゾン含有量およびこのガスの流速は、好ましくは、血液のアリコー
トに対して導入されるオゾンの量が、それ自体または他のストレッサーとの組合
せのいずれかに対して、過剰なレベルの細胞損傷を生じないように、選択される
。適切には、このガス流は、約３００μｇ／ｍｌまで、好ましくは、約１０〜約
１００μｇ／ｍｌ、より好ましくは、約３０μｇ／ｍｌ、さらにより好ましくは
、約２０μｇ／ｍｌまで、特に好ましくは、約１０μｇ／ｍｌ〜約２０μｇ／ｍ
ｌ、そして最も好ましくは、約１４．５±１．０μｇ／ｍｌのオゾン含有量を有
する。このガス流は、約２．０リットル／分まで、好ましくは、約０．５リット
ル／分まで、より好ましくは、約０．４リットル／分まで、さらにより好ましく
は、約０．３３リットル／分まで、そして最も好ましくは、約０．２４±０．０
２４リットル／分の速度で、アリコートに適切に供給される。このガス流の流量
の下限は、好ましくは、０．０１リットル／分以上、より好ましくは、０．１リ
ットル／分以上、そしてさらにより好ましくは、０．２リットル／分以上である
。

【００３４】紫外光ストレッサーは、ＵＶ光源からの処理の下でアリコートを照射すること
によって適切に適用されるが、一方、アリコートは、上述の温度で維持され、そ
して一方、酸素／オゾンガス混合物は、アリコートを通して通気される。好まし
いＵＶ源は、ＵＶ−Ｃ帯波長（ｂａｎｄｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ）を放射するＵ
Ｖランプ（すなわち、約２８０ｎｍより短い波長における）である。標準的なＵ
Ｖ−Ａ（約３１５〜約４００ｎｍの波長）源およびＵＶ−Ｂ（約２８０〜約３１
５ｎｍの波長）源に対応する紫外光もまた、使用され得る。例えば、上述の温度
ストレッサーおよび酸化的環境ストレッサーとともに同時に適用されるこのよう
なＵＶ光の適切な線量は、アリコートを保持するサンプル容器の周囲に配置され
る、約１５〜約３０ワットの消費電力および約５〜１０ワットの有用なＵＶ出力
を有するランプから得られ得る。血液の表面において約０．０２５〜約１０ジュ
ール／ｃｍ²、好ましくは、約０．１〜約３．０ジュール／ｃｍ²で、２５３．７
ｎｍでの総ＵＶ光エネルギーを送達するための強度で作動される、サンプル瓶の
周囲のこのようなランプ８つまでが、有利に使用され得る。このような処理は、
被験体への注射のために準備される、改変された血液のアリコートを提供する。

【００３５】アリコートがストレッサーに供される時間は、通常、約０．５〜約６０分間の
時間範囲内である。この時間は、ＵＶ光の強度、温度、酸化剤の濃度およびそれ
がアリコートに供給される速度の選択にある程度依存する。一旦他のストレッサ
ーレベルが設定されると、最適な時間を確立するためのいくつかの実験が、作業
者の一部に対して必要であり得る。ほとんどのストレッサー条件下で、好ましい
時間は、およそ約２〜約５分間の範囲、より好ましくは、約３分間にある。開始
血液温度、およびこの血液が予め決定された温度まで温められ得るかまたは冷却
され得る速度は、被験体によって変化する傾向にある。好ましくは、このような
ランプの４つが、使用される。

【００３６】本発明の好ましいプロセスの実施において、血液のアリコートは、上述のＭｕ
ｅｌｌｅｒらの米国特許第４，９６８，４８３号において記載される型の装置を
使用して、ストレッサーを用いて処理され得る。アリコートは、機械に適合され
た適切な滅菌ＵＶ光透過性容器に配置される。ガス流が酸化的ストレスを提供す
るアリコートに適用される前に、ＵＶランプは固定された期間の間変換されて、
ＵＶランプの出力を安定化させる。ＵＶランプは、代表的には、アリコートの温
度が予め決定された値（例えば、４２．５±１℃）に調整される。次いで、公知
の組成物および制御された流速の酸素／オゾンガス混合物は、上記で議論される
ように、約６０分間、好ましくは、２〜５分間、そして最も好ましくは、約３分
間の、予め決定された間、アリコートに適用され、その結果、このアリコートは
、同時に３つ全てのストレッサーを受ける。この方法において、血液は、所望の
効果を達成するために本発明に従って適切に改変される。

【００３７】本発明のプロセスを作動することにおいて、１〜２週間の期間にわたって、毎
日または１日おきの処置を含む、処置の経路を患者に与えることが、好ましい。
各処置は、実質的に同一であり、同じ容量のアリコートが採取され、ストレスを
受け、そして再注射される。処置の経路は、その効果に対して最も有効な予備条
件付けについて、患者が上記のようなアポトーシス加速因子に曝露されるすぐ前
に完了するように計画される。

【００３８】本発明を、さらに、以下の特定の実施例（すなわち、認可された様式において
実施された動物の研究）を参照して、例示および記載する。

【００３９】本実施例において報告される実験は、種々の身体の器官の虚血および引き続く
再潅流を含む動物モデル系の使用によって、本発明のプロセスがアポトーシスお
よび壊死を減少する効果を有することを示す。虚血−再潅流障害は、罹患した器
官および組織におけるアポトーシスおよび壊死の増加を含むことが公知である−
例えば、Ｓａｉｋｕｍａｒｐ，ら、「Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｏｆｃｅｌｌ
ｄｅａｔｈｉｎｈｙｐｏｘｉａ／ｒｅｏｘｙｇｅｎａｔｉｏｎｉｎｊｕ
ｒｙ」、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ１９９８Ｄｅｃ２４；１７（２５）：３３４１
−９；およびＢｕｒｎｓＡ．Ｔ．ら、「Ａｐｏｐｔｏｓｉｓｉｎｉｓｃｈ
ｅｍｉａ／ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎｉｎｊｕｒｙｏｆｈｕｍａｎｒｅｎ
ａｌａｌｌｏｇｒａｆｔｓ」、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，１９９８
Ｏｃｔ１５；６６（７）：８７２−６、ならびにそれらに先行する他の刊行物
およびそれらに続く他の刊行物の両方を参照のこと。細胞レベルでのアポトーシ
スの実証の公知技術が、本実施例において使用される。本発明のプロセスがこの
モデルにおいてアポトーシスおよび壊死を減少するという知見は、上記に議論さ
れるアポトーシス関連障害の種々のカテゴリーにおけるその有用性の指標である
。

【００４０】（実施例１）純血種の正常なビーグル犬（１〜２年齢）の同数の雄および雌を、実験動物と
して使用した。この動物を、各群６匹の動物（３匹の雄および３匹の雌）からな
る４つの群（Ａ、Ｂ、ＣおよびＤ）に分けた。群ＡおよびＣの動物を、血液の８
ｍｌのアリコートの毎日の取り出し、酸素／オゾン、ＵＶ照射および熱を用いる
このアリコートの体外処理、ならびに処理されたアリコートの５ｍｌの筋肉内注
射による同じ動物への再投与の１０日過程に２回供することによって、本発明の
プロセスに供した。

【００４１】このような各処理を、以下のように実施した。

【００４２】血液の８ｍｌのアリコートを、動物から採取し、クエン酸ナトリウム（２ｍｌ
）を用いて処理し、そして滅菌容器に置いた。これを、一般に上述のＭｕｅｌｌ
ｅｒの米国特許第４，９６９，４８３号に記載されるような装置において、ＵＶ
照射、酸素／オゾンガスの酸化的環境および上昇する温度ストレッサーに同時に
供した。より詳細には、滅菌したＵＶ透過容器中の血液サンプルを、赤外ランプ
を使用して４２．５℃まで過熱し、そしてその温度で維持し、これを、以前に記
載される好ましい条件下で波長２５３．７ｎｍのＵＶ照射に供した。同時に、医
学的等級の酸素およびオゾンの混合物（オゾン含有量１３．５〜１５．５μｇ／
ｍｌ）を、６０〜２４０ｍｌ／分の範囲内の流速で、この血液サンプルを通して
通気した。同時のＵＶ曝露およびガス混合物供給の時間は、３分間であった。処
理した血液のアリコートの５ｍｌ部分を、各試験動物に筋肉内で再注射した。

【００４３】本発明に従う処置の過程を受ける群ＡおよびＣの各動物は、１０日過程の処置
の間に３週間の休止期間を経験した。群ＢおよびＤは、コントロール群であり、
１０日過程の間に３週間の休止期間を伴い、５ｍｌの生理食塩水の注射を２回の
１０日過程の毎日与えられた。

【００４４】第２コースの注射の翌日、この動物を浅いガス麻酔のもとで麻酔し、そして各
動物の右腎臓を、背部切開から取り出した。残りの腎臓動脈および腎臓静脈上に
閉鎖性クリップを配置して、左腎臓を、６０分間、一過性の虚血に曝した。次い
で、このクリップを取り外し、正常な血流で腎臓を灌流させた。

【００４５】この動物を、虚血手順後６日間観察し、次いで屠殺した。各動物の虚血腎臓を
外科的に取り出し、そして２つの部分に分割した。一方の部分を−８０℃で凍結
させたままにし、そしてもう一方の部分を、免疫学的かつ慣用的な組織病理学的
研究のために１０％ホルマリン中で固定した。

【００４６】ミトコンドリアの膜電位を、虚血腎臓およびコントロール腎臓から単離した近
位尿細管細胞において、コントロール腎臓の取り出しの時点および屠殺後の時点
の両方で、測定した。この目的のために、Ｍａｒｓｈａｎｓｋｙら「Ｉｓｏｌａ
ｔｉｏｎｏｆｈｅａｖｙｅｎｄｏｓｏｍｅｓｆｒｏｍｄｏｇｐｒｏ
ｘｉｍａｌｔｕｂｅｓｉｎｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ」Ｊ．Ｍｅｍｂｒ．Ｂｉ
ｏｌ１５３（１）、５９〜７３、１９９６に記載のコラゲナーゼ処理手順によ
り、イヌ腎属近位尿細管を、正常腎皮質または虚血腎皮質から浄化した。２５０
ｍＭスクロース、１０ｍＭＨＥＰＥＳ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、および２５
０μＭＥＤＴＡを含有する緩衝液中での組織ホモジナイズ後、示差的遠心分離
により、懸濁液中に腎ミトコンドリアを単離した（Ｍａｒｓｈａｎｓｋｙ「Ｏｒ
ｇａｎｉｃｈｙｄｒｏｐｅｒｏｘｉｄｅｓａｔｈｉｇｈｃｏｎｃｅｎｔ
ｒａｔｉｏｎｓｃａｕｓｅｅｎｅｒｇｉｚａｔｉｏｎａｎｄａｃｔｉｖ
ａｔｉｏｎｏｆＡＡＴＰｓｙｎｔｈｅｓｉｓｉｎｍｉｔｏｃｈｏｎｄ
ｒｉａ」Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４（７）３６７０〜３６７３．１９８９
を参照のこと）。細胞小片を１０，０００ｇ、３０分間の遠心分離により、除去
した。ＥＤＴＡのないスクロース／ＨＥＰＥＳ緩衝液でミトコンドリアを洗浄し
た。

【００４７】ミトコンドリア膜電位をＫｒｏｅｍｅｒ，Ｇ．、Ｚａｍｚａｍ，Ｎ．およびＳ
ｕｓｉｎ，Ｓ．Ａ．「Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌｃｏｎｔｒｏｌｏｆａ
ｐｏｔｏｓｉｓ」（総説）ＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙＴｏｄａｙ（１９９７）第１
８巻、４４〜５１頁により記載されたように、ＪＣ−１色素を用いて、測定した
−Ｓａｌｖｉｏｌｉら「ＪＣ−１，ｂｕｔｎｏｔＤｉＯＣ６（３）ｏｒｒ
ｈｏｄａｍｉｎｅ１２３、ｉｓａｒｅｌｉａｂｌｅｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎ
ｔｐｒｏｂｅｔｏａｓｓｅｓｓｄｅｌｔａｐｓｉｃｈａｎｇｅｓ
ｉｎｉｎｔａｃｔｃｅｌｌｓ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｆｏｒｓｔｕ
ｄｉｅｓｏｎｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ
ｄｕｒｉｎｇａｐｏｔｏｓｉｓ」ＦＥＢＳＬｅｔｔｅｒｓ４１１（１）、
７７〜８２．１９８７を参照のこと。正常腎臓および虚血腎臓からの精製ミトコ
ンドリアの懸濁液中のＪＣ−１蛍光を、ＤｅｌｔａｓｃａｎＭｏｄｅｌＲＦ
Ｍ−２００１分光蛍光計（ＰｈｏｔｏｎＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｔｅｒｎ
ａｔｉｏｎａｌ，ＳｏｕｔｈＢｒｕｎｓｗｉｃｋ，ＮＪ）上で、連続的にモニ
ターした。励起波長は４９０ｎｍ（スリット幅２ｎｍ）であり、そして放射波長
は５９０ｎｍ（スリット幅４ｎｍ）であった。このシグナルをＦｅｌｉｘ（登録
商標）（Ｖｅｒｓｉｏｎ１．１）ソフトウェアを用いて記録した。全ての測定を
３７℃で連続撹拌しながら行った。ミトコンドリア膜電位の測定のためのインキ
ュベーション緩衝液は、２００ｍＭスクロース、５ｍＭＭｇＣｌ₂、５ｍＭ
ＫＨ₂ＰＯ₄、０．１μＭのＪＣ−１および３０ｍＭＨＥＰＥＳ−Ｔｒｉｓ（ｐ
Ｈ７．５）を含んだ。基質およびインヒビターの濃度は、１０ｍＭスクシネート
、０．１μＭロテノン（０．１μＭＦＣＣＰを含むかまたは含まない）であっ
た。近位尿細管ミトコンドリア膜電位を、虚血の前に右（コントロール）の腎臓
で、そして虚血６日後イヌの屠殺後に、左（虚血）腎臓で評価した。これを、添
付の図１Ａに示すように、ミトコンドリアとＦＣＣＰとの非共役後に、ＪＣ−１
蛍光の差異として評価した。各測定について、５０μｇのタンパク質の精製材料
を用いた。

【００４８】ＪＣ−１蛍光は、ミトコンドリア膜電位に比例している。反対側の摘出腎臓は
、コントロールとして働いた。図１Ｂから明白であるとおり、本発明の処理プロ
セスは、非虚血性コントロールの右腎臓の膜電位を改変しなかった（処置対生理
食塩水について、ｐ＝０．４４５）。しかし、生理食塩水を注射した動物の虚血
腎臓は、コントロールの腎臓に比較して有意に低い（ｐ＜０．０５）蛍光を示し
た。本発明に従うストレス処置は、虚血／再灌流の間のミトコンドリアの非共役
を防止した。そして膜電位は、虚血腎臓とコントロール腎層との間で有意な差を
示さなかった（ｐ＝０．２４４）。このパラメーターは、本発明のプロセスに従
って、再灌流後少なくとも６日間、前処置したイヌの虚血腎臓において、有意に
高いままであった（生理食塩水を注射したイヌに対して、ｐ＝０．０００６）。

【００４９】これらの結果は、本発明のプロセスが、ミトコンドリアレベルで、アポトーシ
スに対する腎臓の保護に影響する、および／または回復を加速することを示す。
従って、本発明のプロセスは、通常であればアポトーシスを加速する引き続く遭
遇因子に対する哺乳動物の身体の細胞、組織および器官の予備条件付けについて
示される。

【００５０】詳細には、ミトコンドリア膜電位の保存は、ミトコンドリアを保護し、これに
よりアポトーシスに対して細胞を予備条件付けする治療の能力を証明する。

【００５１】（実施例２）１２匹の雄性ＳＨＲラットの群を、実施例１に記載のようにストレスをかけた
（ｓｔｒｅｓｓｅｄ）プールされた血液の注射、またはコントロール動物におい
ては、生理食塩水の注射のいずれかで処理した。この遺伝子系統の全ての動物由
来の血液は同一であるので、この同じ系統の一匹の動物由来の血液を、試験動物
への投与のために、本発明のプロセスにより処理した。この血液を、抗凝血剤と
してクエン酸ナトリウムで処理し、そして滅菌容器中に入れた。それらは、−１
４日および−１３日で１５０μｌのストレスをかけた血液の注射、その後休息期
間１１日そして虚血手術の前に第３の注射を受けるか、または並行して生理食塩
水の注射をうけるかのいずれかであった。手術の日に、ラットを浅いフルラン（
ｆｌｕｒａｎｅ）で麻酔し、そして右腎臓を腹部中央の切開から取り出した。次
いで、マイクロクリップを用いた左腎の動脈および静脈の閉塞により、左の腎臓
を一過性虚血に供した。次いで皮膚を一時的に閉鎖した。閉鎖の６０分後、この
クリップを除去し、そして創傷を縫合により閉鎖した。再灌流の１２時間後、こ
の動物を屠殺した。

【００５２】試験動物の虚血腎臓および非虚血腎臓を取り出し、そしてＤＮＡラダー化試験
に供した。１８０〜２００塩基対へのオリゴヌクレオソームのＤＮＡ断片化は、
特定のパターンであり、これは、アポトーシスを受ける種々の器官におけるアガ
ロースゲル電気泳動後にラダーとして現れる。腎臓皮質におけるＤＮＡ断片化の
程度を評価するため、粉砕された腎皮質のアリコートを秤量し、そしてＥＤＴＡ
の存在下で、プロテイナーゼＫおよびＲＮａｓｅＡでの組織消化後、フェノール
クロロホルム手順により、総組織ＤＮＡを、抽出した。抽出したＤＮＡの１μｇ
を、Ｐ³²−ｄＣＴＰを用い、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラ
ーゼを用いる酵素アッセイにより標識した（Ｔｅｉｇｅｒら「Ａｐｏｐｔｏｓｉ
ｓｉｎｐｒｅｓｓｕｒｅｏｖｅｒｌｏａｄ−ｉｎｄｕｃｅｄｈｅａｒｔ
ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｙｉｎｔｈｅｒａｔ」Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓ
ｔ．９７，２８９１〜２８９７，１９９６を参照のこと）。漸増量の放射線標識
ＤＮＡを、１．５％アガロースゲル上にロードした。電気泳動後、ＤＮＡをナイ
ロンメンブレン（Ｈｙｂｏｎｄ）上に転写し、そして１５０〜１５００ｂｐのＤ
ＮＡ断片に関する放射活性を、ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒＤｙｎａｍｉｃｓ）上で定量した。各サンプルについての回帰直線を、放
射活性について、ゲル上にロードされたＤＮＡの関数として描いた（ｄｅＢｌｏ
ｉｓら、「Ｓｍｏｏｔｈｍｕｓｃｌｅｃｅｌｌａｐｏｐｔｏｓｉｓｄｕ
ｒｉｎｇｖａｓｃｕｌａｒｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎｉｎｓｐｏｎｔａｎｅ
ｏｕｓｌｙｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｖｅｒａｔｓ」Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ
２９，３４０〜３４９，１９９７）。この直線の回帰直線の勾配は、ＤＮＡ断
片化係数（１μｇのＤＮＡあたりのｃｐｍ／ｐｉｘｅｌ（ピクセル））として有
用であった。

【００５３】虚血−再灌流（Ｉ／Ｒ）腎臓および正常な非Ｉ／Ｒ腎臓からの結果（全ては、
ストレスをかけた血液の注射を受けなかった動物から）を、図２に図示する。こ
れは、再灌流の開始後の時間に対する、種々のサンプルについての回帰直線の勾
配のプロット（縦軸）である。ＤＮＡのラダー化（ＤＮＡ断片化の指標）は、反
対側の非虚血器官に比べて、虚血腎皮質において明白に増大した。そして１２時
間で最大に達し、４８時間でほぼベースライン値に戻った。従って、早期虚血誘
導腎アポトーシスへの本発明のストレスをかけた血液の効果の研究のための時点
として、１２時間を選択した。

【００５４】図３Ａの添付の図面は、ＤＮＡ断片へ放射性標識を結合することが記載されて
いる放射標識された、１５０〜１５００ｂｐ範囲の、断片化ＤＮＡの電気泳動ゲ
ルの写真である。トレース（ｔｒａｃｅ）Ｓは、腎臓虚血−再灌流前の生理食塩
水注射を受けた動物由来の腎臓のＤＮＡに由来し、そしてトレースＶは、腎臓虚
血−再灌流の前にストレスをかけた血液の注射を受けた動物の腎臓のＤＮＡに由
来する。この図は、６０分の腎虚血が１２時間で両群のラットにおいて断片化Ｄ
ＮＡの明白な蓄積を誘導したが、このパラメーターのレベルは、処理された血液
を受けている動物においては有意に低かった（ｐ＜０．０５）ことを示す。図３
Ｂは、任意の単位での、サンプルからの照射の量を定量する。そしてＤＮＡ断片
化ラダー化が、虚血／再灌流の結果として、ＳサンプルおよびＶサンプルの両方
で生じるが、その程度はＳサンプルに比べてＶサンプルでは顕著に低下している
ことを示す。図３Ｂ上で示されたこの結果は、各場合における６匹の動物の平均
である。

【００５５】これらの結果は、腎再灌流障害に対する本発明によるストレスをかけた血液の
投与の細胞保護的効果が、早期アポトーシスまたは後期アポトーシスの阻害を含
むことを確認する。

【００５６】（実施例３−心臓研究−取り出した器官の保護）ラットで、より詳細には雄性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットで、実験を
実行し、古典的な虚血予備条件付けプロトコール（Ｋ．Ｐｒｚｙｌｅｎｋおよび
Ｒ．Ａ．Ｋｌｏｎｅｒ，Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｎｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｄｉ
ｓ．第４０巻、５１７〜５４７，１９９８）で代表的には観察されるような持続
した虚血傷害に対して、取り出した器官（ドナーの血液を枯渇した）の保護を実
証した。

【００５７】４匹のラットの２群（体重、２７０〜２８５ｇ）を用いた。１群のラット（ｎ
＝４）に生理食塩水を注射し、そしてコントロールとして用いた。もう一群のラ
ットに本発明に従うプロトコールにより処理した血液を投与した。この遺伝子系
統の全ての動物由来の血液は、同一であるので、この同じ系統の１匹の動物由来
の血液を試験動物への投与のために本発明のプロセスにより処理した。この血液
を抗凝血剤として、クエン酸ナトリウムで処理し、そして滅菌容器に入れた。こ
れを、熱し、そして、上記実施例１に示す量および条件下で、ＵＶストレッサー
および酸素／オゾンストレッサーに同時に供した。

【００５８】それぞれの試験動物は、処理した血液の１５０μｌの注射を１日目に受け、そ
の後、１０日間休息期間をおいた。次いで、それぞれの動物は、１２日目および
１３日目に処理した血液の１５０μｌの注射を受けた。それぞれのコントロール
動物は、同じスケジュールで、生理学的食塩水の同様の注射を受けた。次いで、
この動物を１４日目に屠殺した。

【００５９】それぞれの動物から、心臓を取り出し、そして９５％酸素／５％二酸化炭素、
ｐＨ７．４でガス化した非再循環ＫｒｅｂｓＨｅｎｓｅｌｅｉｔ緩衝液（エネ
ルギー基質としてグルコースを含有）を用いて、Ｌａｎｇｅｎｄｏｒｆ様式に従
ってエキソビボで灌流した。この心臓を、代表的には心虚血予備条件付けの研究
において使用されるように、虚血−再灌流傷害に供した（例えば、Ｒ．Ｔ．Ｒｏ
ｗｌａｎｄら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７２、Ｈ２７０８〜Ｈ２７１５；
Ｅ．Ｏ．Ｗｅｓｅｌｃｏｕｃｈら、Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．２９：１２
６〜１３２，１９７）。手短には、正常酸素状態下での２０分間の平衡期間後、
この心臓を３７℃で２５分の全虚血に供した。次いで、これを、以下のように４
５分間、再灌流した：（ｉ）再灌流の最初の２５分間、心臓を自発的に拍動させ
た、（ｉｉ）右房に固定されたペーシングワイヤを用いて、これをペーシングさ
せ、３００拍／分のリズムを達成した。

【００６０】図４は、標準的な酵素アッセイにより評価されるように、細胞壊死の指標であ
る、浸出灌流液に放出された乳酸デヒドロゲナーゼについての灌流プロトコール
を測定するデータを示す。図面の図４において、三角形の点に基づく曲線は、記
載されるようなストレッサーで処理した血液を投与された動物の器官から誘導さ
れる。四角形の点に基づく曲線は、生理食塩水溶液を投与されたコントロール動
物の器官に由来する。図４は、記載されたストレッサーで処理した器官における
有意に低下した細胞壊死の指標である、ＬＤＨ放出の有意な低下（４５分間の再
灌流期間のＬＤＨ放出の蓄積；ｐ＜０．０５；処理対生理食塩水）を示す。

【図面の簡単な説明】

【図１】添付の図面の図１は、上記実施例１から得られた結果をグラフで
表したものである。

【図２】添付の図面の図２は、上記実施例２から得られた結果を表すグラ
フである。

【図３】添付の図面の図３は、上記実施例２から得られた結果を表すグラ
フである。

【図４】添付の図面の図４は、上記実施例３に従って得られた結果を表す
グラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 25/00 Ａ６１Ｐ 25/00 25/16 25/16 25/28 25/28 37/04 37/04 39/02 39/02 43/00 １０５ 43/00 １０５ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (71)出願人デスロジエール，クリスティーヌカナダ国ケベックエイチ２エル３ブイ６，モントレール，ストリートアンドレ 3741 (71)出願人チェン，フイファンカナダ国ケベックエイチ９アール２ゼット３，ポワント−クレール，イングルウッドアベニュー 271 (72)発明者ハメット，パヴェルカナダ国ケベックエム２ダブリュー１ティー８，モントレール，リュサン−トゥルベン， 3850，パビリオンオテル−デュ，チャム気付 (72)発明者トレンブレイ，ヨハネカナダ国ケベックエイチ２ダブリュー１ティー８，モントレール，リュサン−トゥルベン， 3850，パビリオンオテル−デュ，チャム気付 (72)発明者デスロジエール，クリスティーヌカナダ国ケベックエイチ２エル３ブイ６，モントレール，ストリートアンドレ 3741 (72)発明者チェン，フイファンカナダ国ケベックエイチ９アール２ゼット３，ポワント−クレール，イングルウッドアベニュー 271 Ｆターム(参考） 4C087 AA01 AA02 BB34 DA02 DA03 DA05 ZA02 ZA16 ZA51 ZA75 ZA81 ZA89 ZB07 ZB21 ZC37

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】哺乳動物の身体の組織および器官のアポトーシスもしくは壊
死の速度を減少させること、または哺乳動物の身体の組織および器官のアポトー
シスもしくは壊死に対する感受性を減少させることを通して、哺乳動物の身体に
おけるアポトーシスまたは壊死の加速した速度に関係する医学的障害の症状を軽
減させるかまたは該症状に対して保護する際における、該哺乳動物の身体由来の
血液のアリコートの使用であって、該アリコートは、該哺乳動物から採取され、
そして体温よりも高いかまたは体温よりも低い温度、紫外光、および酸化的環境
からなる群から選択される少なくとも１つのストレッサーとエキソビボで反応さ
れており、該障害は、放射線曝露障害；化学薬品曝露障害および化学薬品摂取障
害；神経学的障害；および物理的外傷障害から選択される、使用。
【請求項２】エキソビボで反応される前記血液のアリコートが、約０．１
〜１００ｍｌの容量を有する、請求項１に記載の使用。
【請求項３】前記少なくとも１つのストレッサーが、約−５℃〜５５℃の
範囲の温度である、請求項１または請求項２に記載の使用。
【請求項４】前記少なくとも１つのストレッサーが、約４０℃〜５０℃の
範囲の温度である、請求項３に記載の使用。
【請求項５】前記少なくとも１つのストレッサーが、前記血液のアリコー
トを通して通気した、オゾンおよび医学的等級の酸素の混合物を含む酸化的環境
である、請求項１または請求項２に記載の使用。
【請求項６】前記気体混合物が、約１０〜１００μｇ／ｍｌのオゾン含量
を有する、請求項５に記載の使用。
【請求項７】前記少なくとも１つのストレッサーが、ＵＶ−Ｃ帯波長の紫
外光である、請求項１または請求項２に記載の使用。
【請求項８】３つすべての前記ストレッサーが、前記アリコートに同時に
適用される、請求項１〜７のいずれかに記載の使用。
【請求項９】前記ストレッサーが、０．５〜６０分間の時間の期間適用さ
れる、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】前記時間が、約２〜５分間である、請求項９に記載の使用
。
【請求項１１】前記医学的障害が、放射線曝露障害である、請求項１〜１
０のいずれかに記載の使用。
【請求項１２】前記障害が、電離放射線曝露障害または紫外光曝露皮膚障
害である、請求項１〜１０のいずれかに記載の使用。
【請求項１３】前記医学的障害が、化学薬品曝露障害または化学薬品摂取
障害である、請求項１〜１０のいずれかに記載の使用。
【請求項１４】請求項１３に記載の使用であって、前記障害が、以下：化学中毒；細菌毒素からの食中毒；毒性薬物摂取過量および副作用；神経ガスお
よびマスタードガスへの曝露に由来する障害；化学薬品および毒素に由来する肝
障害；アミノグリコシド系抗生物質の摂取、Ｘ線撮影用造影色素から生じる腎臓
障害、またはシクロスポリン腎毒性；薬物または毒素誘導型骨髄抑制に由来する
造血障害および免疫不全障害；細菌毒素からの感染；オゾン曝露；溶媒曝露；あ
るいは免疫抑制剤の影響、である、使用。
【請求項１５】前記医学的障害が、神経学的障害である、請求項１〜１０
のいずれかに記載の使用。
【請求項１６】前記神経学的障害が、パーキンソン病、老人性痴呆、また
はアルツハイマー病である、請求項１５に記載の使用。
【請求項１７】前記医学的障害が、物理的外傷障害である、請求項１〜１
０のいずれかに記載の使用。
【請求項１８】前記物理的外傷障害が、創傷、熱傷、血液の損失、または
物理的事故から生じる物理的外傷である、請求項１７に記載の使用。