JPH07500724A - 核酸ポリメラーゼ増幅 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 核酸ポリメラーゼ増幅 本発明は、分子生物学の分野及び生化学の関連領域で使用される新しいクラスの 試薬に関する。これらの試薬の広（一般的な有用性は、核酸を含む反応での２価 のカチオン、マグネシウム（Ｍｇ２つ及びカルシウム（Ｃａ”っの広範な役割に 基づく。マグネシウムカチオンは、特に核酸鎖のアニーリングパターン、ＤＮＡ 。

ＲＮＡ又はＲＮＡ／ＤＮＡの二次又は三次構造、及び２価のカチオンと複合体を 作る一般的傾向のあるヌクレオチドの性質に影響する。

加えて、２価のカチオンは核酸鎖をそれらの成分上ツマ−のヌクレオチド及びヌ クレオノドに分解する広範囲のヌクレアーゼ酵素の使用を緩和するのに非常に重 要であり、又、それらの成分ヌクレオチドからＤＮＡ及びＲＮＡ鎖をまとめるＤ ＮＡ及びＲＮＡポリメラーゼ酵素の作用にも重要である。核酸ポリメラーゼの使 用の速度、所持性（ｐｒｏｃｅｓｅｉｖｉｔｙ）　（鋳型鎖に沿って前進反応を 続ける傾向）、正確度及び間違った又は異常な塩基配列或は置換ヌクレオチドへ のトレランスが、反応媒体中のマグネシウム濃度の変化により影響することはよ （知られている。

長年にわたって、種々の他の２価のカチオン、特にマンガンはマグネシウムに置 き換えることができ、しばしば少し低濃度でその作用を実質的に複現すると思わ れて来た。しかしながら、マグネシウムはありきたりの安価な試薬であるので、 又、これらのカチオン１換は生化学的に何らの新規な又は有用な付加的結果を達 成しなかったので、そのような置換の工業的適用はなかった。さらに遷移金属の 多くの２価のカチオンは、これらの還元体が遷移金属カチオンを還元し沈殿する 傾向があるので、適当な作用には幾つかのポリメラーゼ酵素によって必要とされ るイオウ保護体（ｔｈｉｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ）及び還元体、例えばβ−メル カプトエタノール及びジチオトレイトール（ＤＴＴ）　、に耐えることができな い。

しかしながら、本発明者等は、非常に驚くべきことに、ある明らかでない因子を 調節すると、そして幾つかの一般的でないカチオン、特に３価のカチオンをマグ ネシウム又はカルシウム又はそれらの混合物の代わりに用いると、幾つかの新し くて非常に有用な効果を達成できることを発見した。これらのカルシウムはＤＴ Ｔ又はβ−メルカプトエタノールにより還元されないことが有益である。幾つか のそのような３価のカチオンは、幾つかの酵素で例えばカルシウムと置換するこ とができ、酵素阻害効果を発揮することが判った。この方法でヌクレアーゼ酵素 を阻害することが可能であることが本発明者等により示された。

しかしながら、最も重要なことに本発明者等は、多（の３価のカチオンが幾つか の核酸ポリメラーゼ酵素の所持性を実際に増加することができるという驚くべき 科学的発見をなした。幾つかの病原性レトロウィルス、例えばエイズを起こすＨ ＩＶウィルスにより用いられる逆転写酵素の場合、ＤＮＡ生成の速度を増すこと 及び酵素により作られるＲＮＡ鋳型のＤＮＡコピーの平均長を増加することが可 能である。これは、例えばＲＮＡ鋳型によりＤＮＡを生成する能力を有する何ら かのウィルス逆転写酵素を有するかどうかを見るため、そして人が血液のＨＩＶ 感染を受けているかどうかを知るため、潜在的に感染したヒト血液の試料を検定 したい場合に最も重要である。

反応において、マグネシウムの代わりに適当な３価のカチオンを使用することは 、従って二重の有用な効果がある。同時に、それは正規に逆転写酵素（ＲＴ）反 応の生成物を死滅する傾向のあるヌクレアーゼを阻害し、所持性、従ってウィル スＤＮＡの生成の速度を増加する。このように、２価カチオンとしてのマグネシ ウムにより、ゆるやかに生成されるＤＮＡはしばしばヌクレアーゼにより破壊さ れ、そのため検出することができない。従って、検定はＲＴが比較的大量に存在 するまで感染を検出することができない。しかしながら、適当なカチオン置換を 用いると、診断上重要なりＮＡが急速に生成し、ヌクレアーゼにより破壊される のが少な（なるようであり、従って診断生成物従って、二つの相乗作用の方法で の検定の感度を増す。

二次又は三次構造の核酸アニーリング、初回免疫及び折りたたみの操作は、又、 分子生物学の全領域で巨大な工業上の重要性を有するポリメラーゼ連鎖反応（Ｐ ＣＲ）の使用の分野で、極めて大きな重要性を有する。適当なキレート化剤と共 に置換カチオン又はカチオンの混合物を使用することは、ＰＣＲ反応の幾つかの 局面を操作するのに用いることができる。

ＰＣＲにおいて、反応の最も重要な点は、核酸ポリメラーゼ、例えば高温度、例 えば７２℃で機能的であるＴａｑポリメラーゼ（サーモフィラス・アクアティク スから）又は、ポリメラーゼ、例えば低温でのみ用いることができるがより正確 であるＴ４　ＤＮＡポリメラーゼを含む。単−ＤＮＡ鎖の多数のコピーを作るた めに、ＤＮＡ鎖、単量体ヌクレオチド、及び問題のＤＮＡに対し幾らかの相補性 を有する長さ３０−５０塩基対プライマー鎖と共に、少量のＴａｑを反応ウェル 中に置く。

混合物を三段階サイクルを経て取り、そこでそれを９２℃に加熱してＤＮＡをそ の分離単一鎖に変性し、次いで５５℃に冷却してプライマーに鋳型のアニーリン グを行ない、次いで７２℃に上げて鋳型をコピーするためＴａｑがプライマーを 延ばさせるようにする。次いで二つの得られるＤＮＡ鎖を、約２０サイクル後、 沢山のコピーが存在し、反応が停滞期に入りはじめるまで四コピーを得る同じサ イクル等を経て取る。

出口で加えた少量のＴａｑポリメラーゼが全ての百方またはその程度の鎖を速や かにコピーできなくなるので、停滞期（ｐｌａｔｅａｕ）が起きる。非常に多く の単一鎖が存在するので、多くの鎖がプライマーよりもむしろ他の単一鎖にアニ ールし、従ってＴａｑが働きかけるさらされた鋳型の量を限定することも起きる 。

３価（例えばスカンジウム、イツトリウム及びランタニド系の成分）とのカチオ ン置換又は有用な２価（ＭｎＳＰｄ、Ｃｏ、Ｃｏ５５ｒ）との置換は、幾つかの 方法にＰＣＲを用いることができる。停滞期は上昇させることができ、従って、 Ｔａｑ又はＴ４　ＤＮＡポリメラーゼの速度及び所持性を増加することにより収 量を増加し、これによりコピーするのは鋳型の総数によって仲々抑制し得ない。

プライマーよりもむしろ単−饋がアニールする傾向に作用することも可能であり 、そして再び停滞期を作用しうる。所持性を増加することからの付加的利益は、 ポリメラーゼが鋳型の全コピーを完全にするであろうことから、より長い鋳型で 使用する能力である。ある状況では、最も正確な転写物が見られるので転写の正 確度の操作も可能であり、他方、変化したプライマーは最終生成物ＤＮＡに望ま しい配列を付加するのに用いることができることを保証するのが重要である。

プライマー及び鎖アニーリングへの効果も重要であり、そこで高温度で短いプラ イマー（例えば１２−１５ｂｐ）を用いること、又はサイクルの第三段階を避け るために７２℃でアニーリングさせることが望ましい。カチオン効果に感受性の あるＰＣＲにおける他の重要な現象は、プライマー−ダイマー汚染による及び「 非鋳型指定」プライマー拡張によるノイズである。アニーリング緊縮性における 変調は、プライマー上に修飾配列をわざわざアニーリングするために、又、生成 物のゲル電気泳動分析の単−関連均・−バンドを生成する能力により示されるよ うな問題のＤＮＡにとっても反応の基本的選択性及び特異性において重要である 。

ＰＴ検定での、及びＰＣＲでの用途に加えて、これらの試薬は、又、ヌクレアー ゼ、ポリメラーゼ及びプライマー／鋳型相互反応が顕著に現れる分子生物学及び 生化学での非常に種々の他の有用な反応でも用いうる。これらは、ＤＮＡ合成酵 素、遺伝修飾、遺伝子治療、遺伝子挿入又は他の遺伝試験、クローニング反応、 組立てベクター、初回抗原刺激、ニック翻訳、鎖の標識化及び非常に種々の他の 反応を含む。

これらの試薬の特異な特徴は、ある種のランタニド又は他の関連成分又は通常、 ヌクレアーゼと呼ばれるある種の細胞内酵素を阻害する特別な能力を有する同様 に作用する小分子のこれまで知られていない用途であり、そのあるものは、又、 ある種の核酸ポリメラーゼ、例えばＨＩＶの逆転写酵素の所持性を改良する（例 えば活性を刺激する）能力を有する。

医者又は実験化学者は、しばしばヒト免疫不全ウィルスの存在について血液又は 他の組織の試料を試験する問題に直面する。そのような試験を実施するために現 在広く用いられる二つの計画がある。一つのそのような計画は、ｐ２４と呼ばれ るＨＩＶの典型的な蛋白の存在を検出するために抗体を用いることを含む。これ らの検定は、高価な特別の抗体試薬を必要とし、変異が起きると、そのｐ２４蛋 白は用いた抗体試薬により認識され得ないＨＩＶの新しい株を生ずる効力の喪失 にさらされる。

ＨＩＶを検出するための別の試みは、潜在的にはるかに特異的、感受性であり、 そして変異による変調に対し免疫性であるが、この完全な潜在力は利用するのが 困難なことが証明された。この方法はウィルスの逆転写酵素（ＲＴ）の使用を含 む。

ＲＴ酵素は三つの重要な作用を有し、ウィルスの存在がそれらに依存する。この ことによりこれらの作用のいずれをもこわす変異がウィルスを非存在とする。

ＰＴ酵素の幾つかの分子は、ＲＮＡの特別の鍋中で暗号化されるウィルスのゲノ ムの二つのコピーと一緒にウィルスのヌクレオカプシド中に含まれる。ヒト細胞 の侵入によって、ＲＴ酵素は活性化され、徐々にＲＮＡ鎖の単一鎖ｃＤＮＡコピ ーを造る（　ｒＲＮＡ−依存ＤＮＡポリメラーゼ」）。次に、ＲＴ酵素の「リボ ヌクレアーゼＨ」作用は元のＲＮＡ鋳型鎖を切断する最後にｒＤＮＡ−依存ＤＮ Ａポリメラーゼ」作用は、相補ＤＮＡ鎖を造り、ヒト細胞が次に複製を開始する ときはいつも、ヒト細胞のＤＮＡ遺伝物質に挿入できるウィルスゲノムの最終二 本鎖ＤＮＡコピーを生成する。

ＲＴ酵素の非常にユニークなｒＲＮＡ−依存ＤＮＡポリメラーゼ」作用、その良 い例はボッツにより（アルドビニ、Ａ及びウォーカー、Ｂ、Ｄ、　Ｉｉ集「テク エックス・イン・ＨＩＶリサーチＪ　１０３−１０６頁、ストックトン・プレス 、Ｎ。

Ｙ、　１９９０）報告されている、を検出する多くのよく知られた検定が開発さ れた。

これらは広く用いられる一方、それらは低レベルの感染を検出する点で、ｐ２４ 検定と同じような感受性を有しない。実際、多（の報告は、ｐ２４　ＥＬＩＳＡ アッセイ法がＲＴに基づくアッセイ法よりも１０ないし１００倍感受性であるこ とを示す。

しかしながら、わずか２５ＨＩＶ陽性担体がスクリーンされた１０．０００臨床 試料中に見出されうるのでＥＬＩ　ＳＡ技術は９９％正確であり、そのような群 から１００の間違った陽性結果がある。これは各正しい結果につき４つの不正な 結果を意味し、その全ては第二の方法でスクリーンされなければならない。又、 病気の患者の血液中の血清ｐ２４抗原レベルと感染ウィルスの量の間には劣った 相関がある。高い感受性ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術は、この第二段階 を擁護して来た。しかしながら、ＥＬＩＳＡ技術は又、ＲＴ検定がＰＣＲよりも ずっと適するであろう第二の速くて安価なスクリーニング技術によってのみ検出 されうる間違った負のリスクを負う。

感受性ＲＴ検定を開発するのに関心をもつ第二の理由は、逆転写酵素がエイズに 対する唯一存在する投薬についての標的であり、現在、新規な特異的逆転写酵素 インヒビターを発見するために１０００の化合物から１０をスクリーンする大き な努力がなされつつあり、又、ＨＩＶ感染患者の処置のための新しい治療法を開 発するためにこれらの試薬の種々の組合わせをスクリーンする大きな努力がなさ れている。

薬物のスクリーニングの努力においてＲＴ検定に適用する一連の限定は、測定さ れたＲＴ活性と真の感染性又は存在するウィルス粒子の数との間の関係での重要 な変異性に関係する。これらの変調は、幾つかの細胞系又は患者血清での種々の ヌクレアーゼ又は池の阻害物質の存在による。それは正しくこれらの限定並びに 本明細書においた記載される本発明により示される低感受性の問題である。

精製酵素及び注意深（選択された補助因子による純インビトロ条件下で、ＲＴ酵 素検定は少量の酵素に非常に感受性である。しかしながら、感受性は検定を「細 胞フリー上清」又は感染したヒトの血清について実施すると太き（減少する。こ の感受性の減少の原因は完全には明らかでなく、血漿又は細胞フリー培養上清の 複合生化学セラティラングで種々の交互反応及び汚染があると考えられて来た。

ＤＮＡ又はＲＮＡ鋳型を切断又は破壊しＲＴ酵素に逆に働く幾つかのヌクレアー ゼ酵素が存在するかも知れないという幾つかの示唆があった。ヌクレアーゼが非 常に効果的であると、それはＲＴにより生成される全てのＤＮＡをそれが生され るのと同じ速さで破壊したかも知れない。これらの条件下では、検定は試料中の ウィルスの存在を検定するのに間違って失敗したであろう。しかしながら、通常 はヌクレアーゼは生成したＤＮＡの量で相対的減少を生じ、しかしこの減少の量 は知られていなかった。

検定の基本的考えは、ポリアデノシンＲＮＡの鋳型にオリゴｄＴ（８−１２）プ ライマーＤＮＡを供給し、ＫＣＩ、ＭｇＣｌ２、ジチオトレイトール、ｐＨ８， ０緩衝液、例えばトリス、及びデターンエント、例えばＮＰ−４０を加えてウィ ルスを破壊し、含まれたＲＴ酵素を露出することである。３！Ｐ放射樟識ｄＴＴ Ｐ　（、デオキシチミジン三リン酸）を加えると、ＲＴ酵素はＲＮＡ鋳型に対し 、３２Ｐ標識一本鎖ボリｄＴＤＮＡを作り始める。９０分後、反応生成物の試料 をＤＮＡがペーパーに付着するＤＥ８１ワットマンペーパー上にドツトする。未 結合の５ｔｐｄＴＴＰを洗浄除去し、次いでβ−カウントし、ＲＮＡ鋳型に対し 生成する又は予備的評価用のオートラジオグラフィにより暴露されるＤＮＡの量 を測定する。

本明細書に記載される方法が、”Ｐ％　”Ｈ％　”Ｓ又は他の種々の放射標識で 標識化されたヌクレオチドと共に用いることができることに注意すべきである。

加えて、ｂｒｄＵ（５−ブロモ−２°−デオキシウリジン三リン酸）で、又はジ ゴキシゲニンで標識化したヌクレオチドを用いることが可能である。本発明者等 は、免疫試薬検出用の放射活性ヌクレオチド標識によって検出用のＲＴ反応を実 施した。

幾つかのランタニド、例えばスカンジウムが本発明者等によってＲＴ酵素の所持 性を増加することが示されたことにも注意を要する。酵素は通常、ＲＮＡ鋳型の 二次又は三次構造に依存する特徴的な点で切られたＤＮＡの多数の小断片を生成 する。１１ＩＭでの種々のランタニドの存在で、又は低親和キレート化剤、例え ばニトリロ三酢酸と金属緩衝試薬の存在で、特に２価カチオンを供給しない場合 、ＲＴ酵素は与えられた量の時間でより多くのＤＮＡ転写物を生じ、これらの転 写物は、平均して２価カチオン、例えばＭｇ！４の存在下の反応から得られるも のよりも長い（図１参照）。

所持性によるこの直接効果によって、ヌクレアーゼを阻害することにより得られ る付加的効果に依存して、これらのランタニド増加試薬は、たとえ精製された、 微生物的にクローン化されたＲＴ酵素を用いる場合でも用いることが可能である 。

さらに、この所持性効果は、ランタニド試薬をボーストマン等により記載される （ジャーナル・オブ・バイオロロジカル・メリーズ３１　：　１８１−１８８． １９９１）免疫抗ＲＴ抗体の手段により細胞培養上清又は血清から分離する場合 でも、非常に有用であることを意味する。

３族（ＩＵＰＡＣ）元素、例えばＳｃ、Ｙ或はランタニド、特にランタン又はス カンジウムのイオンが反応混合物に存在すると、逆転写酵素によるｃＤＮＡの生 成速度は５００％に増加することを発見した。さらに、検定はごく少量の酵素に も感受性となる。ランタンがカルシウム依存酵素を阻害することはよく知られて いる。又、多くのヌクレアーゼがそれらの活性に関しカルシウム依存であること も知られている。従って、例えばランタン又は他の幾つかのヌクレアーゼ阻害剤 を反応混合物に導入することにより、ヌクレアーゼがプロ・ツクされ、ＤＥ８１ ベーパー上での新たに合成されたｃＤＮＡの回収が劇的に増加する。

ランタンの最も劇的な増加効果は、精製酵素の検定では見られない。というのは 高精製調製品には典型的にヌクレアーゼが存在しないからである。ある増加効果 は、所持性の効果のために、依然見られうる。しかしながら、これらの酵素は、 細胞フリー上清及び血漿に可変的に存在する。従って、逆転写酵素検定の均一性 、適合性及び感受性を改良するために、新規な反応緩衝混合物又は「カクテル」 を調製する。これらの抗ヌクレアーゼカクテルは、血清又は細胞フリー上清で或 は細胞内部でのヌクレアーゼ酵素による分解からＤＮＡ又はＲＮＡを保護するの に重要である広範囲の他の検定又は遺伝子導入に用いることができる。

不適合なりＮＡ合成を行うＨＩＶから高能力のＲＴの利点を取ることにより、上 清又は血清の検定でＲＴの選択性を得る手順もある。このことは、ポリｒＡ鋳型 に対するポリｄＧ鎖を作るＲＴの能力を指し、ポリｒＡ鋳型に対してポリｄＡ鎖 を作る能力を含む。この不適合な組合せは、ランタニド試薬により促進し、上清 又は血清に存在するかも知れない他の核酸ポリメラーゼによって作られるＤＮＡ 鎖の検出を避けるのを助ける利益をもたらすことができる。

非常に多（の金属カチオンによるＲＴ検定をポ・ソズ方法（上述）を修飾するこ とにより実施でき、種々の元素の化学により課せられる溶解性に対する特別な要 求に適応できる。ジチオトレイトール（ＤＴＴ）又は高ｐＨは遷移金属を直ちに 沈殿させ、従って例えば検定を０ないし４℃で行った場合、ＤＴＴによることな く良好な活性を示すチミン及びミズタニの方法、ネイチャー２２６　：　１２１ １−１２１３（１９７０）を用いるのが適当である。ｐＨ７，３の緩衝液はほと んどのカチオンに、又、酵素に許容される。銅カチオンはＨＥＰＥＳ緩衝液中で 沈殿するがトリス中では沈殿しない。第−鉄及び第二鉄カチオンは４．０よりも 大きなｐＨで不溶性であり、イオンは、「金属緩衝」キレート化剤を用いること なく太き（減少した有効濃度でこれらの検定に用いることができない。ランタニ ドは、カチオン対ｄＴＴＰのモル比が１；２より大のとき、ｐＨが８．２より大 であり、カチオンモル濃度が１ミリモルに等しいかそれより小である場合を除き ｄＴＴＰ　（デオキシチミジン三リン酸）の存在で沈殿する。

酵素のＶ　ｗａｘは通常増加する。しかしながらレトロウィルス逆転写酵素のイ ンビトロ研究は、ＲＴがかなりの時間繰り返してその鋳型を「フォーリングオフ 」（ｆａｌｌｉｎｇ　ｏｆｆ）するのを増すことを示した；アルオード等、パイ ロロジイ、１８３．６１１−６１９（１９９１）参照。完全な転写が完了するま で鋳型に付着し続けることにより慣用の高忠実度ポリメラーゼにより似せてＲＴ を作用させる酵素形での変調は、ｃＤＮＡ生成の速度をはっきりと上昇させるよ うに見える。理論により結合することを望むことなく、これは高活性の理由を明 らかにする機構でありうる。

本発明は、この効果が必ずしも酵素自体への直接効果ではないが、「増幅」の発 見に基づく。それはむしろ所持性の増強である。当業者により当然でもあり、直 ちに認められるように、ある実験作用は、どれが増強された所持性が要求される 酵素と共に用いるのに好ましいイオンであるかを確立するにのに必要でありうる 。

影響するポリメラーゼは、レトロウィルス、例えばＡＭＶ又はＨＩＶ逆転写酵素 でありうる。特に、逆転写酵素（ＲＴ）にとって、これは比較的反応しないＲＴ 検定を、レトロウィルス例えばＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２及ＣＦＨＴＬＶ−１１： ：ついて血液生成物をスクリーニングするのに用いることができる潜在的診断キ ットにする適用を有する。それは、又それらの存在が予想されるが検定法がない 条件でレトロウィルス（確認された及び未確認の）の証拠を探すのに潜在的に用 いることもできる。ｒＨＩＶネガティブＡＩＤＳＪについての現在の関係は、一 つのそのような実施例である。それは、又、ＲＴを測定するのが非常に困難で、 これが非常に有用な実験器具である研究で普通に用いられる多くのレトロウィル ス（そのあるものは遺伝子治療に用いうる）について研究応用を有する。

ポリメラーゼ連鎖反応は、広範囲の研究と診断応用を有し、これを増強する方法 は極めて貴重である。その方法は、ＰＣＲ含有酵素、所持性、アニーリング温度 、−次結合操作等の種々の局面を適正化しつる。核酸ポリメラーゼ及び他の酵素 が第三族及び他のイオンの範囲に対し特異的応答を有するように見える。本発明 の次の局面では、複数（通常３、好ましくは少なくとも４、より好ましくは少な （とも５）のイオンを、どの酵素が試料中に存在するか、応答の特徴的「指紋」 から確認する検定に用いる。

適切な試験方法を本明細書に記載する。本発明のいずれの検定も、キレート剤及 び／又は適当な緩衝液の存在でしばしば、実施されよう。そのような材料の例を 以下に示す。

逆転写のための基本的必要物は、イオウ保護剤、例えばＤＴＴ、用の絶対必要物 、鋳型としてのポリｒＡのオリゴｄＴ感作鎖の採択、ｐＨｓ、ｏ近（に存在する 至適ｐＨ，及び２価カチオン、例えばＭｎ”“又はＭｇ２′″用の必要物を含む 。本検定において、２価カチオンは最初の「カクテル」から省略する。代わりに ２価又は３価カチオンの望ましい混合物を、全ての望ましいキレート剤、例えば ＮＴＡ、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ又はＤＴＰＡと共に用い、０．０５Ｎ　Ｈｃｌでの 望ましい最終強度を１０倍まで上げ、次いでＲＴをカクテルに加えたのちに、検 定混合物に加える。本ファッションにおいて、選択ランタニド３価カチオン又は 他の選択カチオンは、反応を実際に開始させるのに用いる。ある種の２価カチオ ンを用いる場合、ＤＴＴの使用を避けることが必要である。このような場合では 、反応は０−４℃で実施し、通常行なわれるような３７℃では行ってはならず、 反応時間は倍加しなければならない。

「マクロアッセイ」検定は、標識化ｄＴＴＰを含む反応物のカクテルの調製を含 む。デタージエント、例えばＮＰ−４０をウィルスを不活性化するのに用ＧＡ１ ウィルス粒子当りＲＴの１００コピーまで含むヌクレオカプシドコアのアンコー ティングを行う。処理ウィルス試料を、次いでカクテルに加え、カチオンを加え てポリｒＡ鋳型に対する放射標識チミジン鎖を合成させる。この反応は、９０分 後、冷１０％ＴＣＡ、ビロリン酸塩及び未標識オリゴｄＴ又はｔＲＮＡの添加に より停止する。次いでＴＣＡ沈殿をＧＦ／Ａガラスミクロフィルターに注ぎ、５ ％ＴＣＡで十分に洗浄する。標識化沈殿ＤＮＡ鎖をフィルターに採取し、一方、 未結合ヌクレオチドを洗浄、除去する。最後にフィルターをエタノールで洗浄す ることにより乾燥し、シンチレーションノくイアルに移し、ンンチラントでカウ ントする。この方法は１日当り約３０試料しか実施できない。その利点（ま反応 の正確なタイミング及びそれが定量的であろう期待値である。

ＲＴについてのミクロアッセイは反応を停止し、未結合ヌクレオチドからＤＮＡ を分離するより簡単な技術を用いる。最初のカクテルは実質的に同一である力（ 、反応は９６ウエルプレート中少量で行う。９０分後、レプリケータ−又１よ多 重チャンネルピペッタ−を用い、ワットマンＤＥ−８１ペーノ（−（ジエチルア ミノエチル又はＤＥＡＥセルロース）上にド・ソトする。ド・ソテイング後、Ｄ Ｅ−８１シート空気乾燥後、反応が停止する。ＤＮＡはＤＥ−８１ペーノ＜−の 電荷を帯びた表面に付着するが、未結合ヌクレオチドは２ＸＳＳＣ（生理食塩ク エン酸ナト「ノウム）の数回のリンスにより容易に洗浄、除去される。これらの 技術で１ヨ、ぺ−７（−を最終的にエタノールでリンスし、乾燥し、９６の小片 １こカットし、それら１よそれぞれカウント用にンンチレイションノくイアル中 に置く。

ウシ血清アルブミンを含有させることは逆転写酵素を安定化し試料中番二存在す るプロテアーゼを減少させるために理論的に有用である。しかしな力くら、高価 Ｉこ調製されたりボヌクレアーゼフリーＢＳＡを用いる場合でも、それ（ま変異 性を増加させ最大ＲＴ活性レベルを現実に減少させるので、このカクテルシカ＼ ら省かれる。

本技術は、キャンベラ・パラカードマトリ・ソクス９６による検定１二最少修飾 で用いうる。しかしながら、多数の試料を実施する場合、幾つ力Ａの役立つ変更 を行うことができる。主として２価カチオンを最初の反応カクテルから省き、０ ，１ｍＭＥＤＴＡを加える。従って、ウィルス試料をカクテル番＝加えると、反 応（ま直ち（こは開始しない。ＥＤＴＡは二つの方法で役立つ。それ（ま媒体中 １こ存在する全てのマグネシウムを包含するが、それはカルシウムをも含む。こ の後者の工作（ま、３価カチオンの添加前、多くの細胞に存在するカルシウム依 存ヌクレアーゼの阻害に役立つ。カルシウムに対するＥＤＴＡの親和性（ｌｏｇ 　Ｋ＝　１０．７）　Ｉｔマグネシウムに対するもの（ｌｏｇ　Ｋ＝８．７）よ りずっと大であるので、カルシウムはたとえカルシウムを後で付加的に加えても 依然結合しているであろう。３価カチオンはマグネシウム又はカルシウムを置換 しつるがそれら自身の保護効果を発揮する。

ＥＧＴＡ　（シダ？　Ｅ　４３７８）は大きな特異親和性（Ｃａに対し１ｏｇＫ ＝　１１．０゜Ｍｇに対し１ｏｇＫ＝５．２）を与えるが、その溶解性はより少 で、試薬について濃縮プレミックスを調製するのに用いるにはより問題である。

ＥＧＴＡは、（Ｒ１反応に効果がないＮ−メチルグルカミンの同量を加えること によって）そのメグルミン塩としてＥＧＴＡを作り上げることにより可溶性に導 くことができる。しかしながら、ＥＧＴＡは、反応の未熟な開始を防止するため に培養媒地に存在するマグネシウムを作るために必要であるこの技術のためには ＥＤＴＡよりも効果的でない。

このターニオン（ｔａｒｎｉｏｎ）において、非常に多くの試料を、反応を開始 させることに関係なく、数時間にわたりウェルに導くことができる。ＲＴ自体は 、この短い間隔で室温では非常に安定であるが、完全トレーを正確な検定を行う 前に冷却又は凍結できる。検定行使のために全てのトレーを完全にまとめる場合 、最初にトレーを３７℃に上げ、次いでカチオン溶液を加えることにより反応を 開始する。この技術は、検定試料を５１１１定量で個々の試験管から取る場合に 特に有用である。本ステップは検定トレー当り４５分を要し、完全な感染ウィル スの転移を含みつる。マグネシウムの付加は多重チャンネルピペッタ−により行 うことができ、トレー当りわずか２−３分しか要しない。

正確な検定は、５分間隔でマグネシウムの添加により各トレーを開始し、２゜ト レーの連続「飛行（ｆｌｉｇｈｔ）　Ｊとして行う。各トレーでの反応は１００ 分間行う。このファッションで、最初のトレーは、最後の（２０番目の）トレー がマグネシウムの添加により開始した直後にその１００分インキューベーンヨン を完了する。反応は、乾燥のためにＤＥ−８１ペーパー上にドツトすることによ り停止する。別法として、より正確な反応の停止を多重チャンネルピペッタ−を 用いることにより、ドツティング前に２５０ｍＭビロリン酸塩中１ｍＭ冷ｄＴＴ Ｐの停止溶液を５μｍ／ウェル加えて達成できる。

実施例１ カクテル 各９６ウエルトレーは４ＩｌｌのＲＴカクテルを必要とする。以下に表示した必 要物は２０トレ一検定行使用の８０ｍ１のカクテルを調製するための量を含む。

全試薬はりボヌクレアーゼ活性を含まない清浄さを有する「分子生物学」グレー ドを購入しつる。カクテルを４０μｍ量、ウェルに加える。次いで試料を５ｓｌ 容量加え、最後に２価カチオンを５Ｉｌｌ容量加える。表示される濃度は、５０ μｍのこの最終運行容量に基づく。

最終　濃度 ｄｄ）１２０　７８　ｍｌ カクテルの最終容量は８０ｍ１まで上り、それを０．２２μ又は０．４５フイル ターを通過させる。完全なカクテルは巨大パンチ作ることができ、２０トレイ実 験について８０ｍ１アリコートで、又は単一トレイ実験について４ｍｌアリコー トで、−２０℃にて凍結保存する。

ヌクレオチド カクテルについての最終試薬は標識チミジン５゛三リン酸（ｄｒＴＰ）で、これ は３Ｈ標識（ｉ　Ｉ　／　２　＝　１２　、　ａ年）又はＢ２ｐ標識（ｔ”＝１ ４．３年）しつるか又は免疫標識（例えばジコキンゲニン）しつる。トリチウム 標識ｄＴＴＰを用いる場合（例えばアマー／ヤムＴＲＫ、５７６）は、これを、 保存のために凍結する前にカクテルに加えるのが便利である。

トリチウムは３２ｐより小エネルギ−アイソトープであり、そのためキャンベラ −パンカード・マトリックス９６は同量のｓｔｐにより産生されたカウントの約 １１５を検出し、それゆえより高い濃度のトリチウム標識ヌクレオチドは、低活 性が予期される（例えばＴ細胞よりもむしろ感染マクロファージの場合）ある検 定で要求されつる。この感受性の喪失のあるものは、３！Ｐによるものの（５− １０）約半分であるトリチウムによる非常に低い背景（０−５）によりとりもど され、これは多分、ベーパーに残っているご（少量の未結合ヌクレオチドが、ト リチウムを用いたときに有効に検出されないからである。

トリチウムは、幾つかのウェルが他のものよりずっと高い活性を有することが期 待される場合、トリチウムは全ての「こぼれ（ｓｐｉｌｌ　ｏｖｅｒ）　Ｊ活性 を最小にするので、本当に好ましい。３２ｐからのより張力なβ−粒子は、ウェ ル間の約０゜５％ないし１％の潜在クロストークを起こす９６ウエルグリツドで 、隣接箇所の検出器領域に渡ることができる。従って、特にランタニドによる強 力な促進のセツティングで、トリチウムよりも３２ｐを用いると比較的わずかな 利点がありうる。

はとんどのシンチレーションカウンターに関連するキャンベラ・バラカード９６ −マトリックスにより達成される一般的な低背景カウントの理由から、他の技術 により要求されるよりも少しの放射核種を使用することが可能である。背景カウ ントは機械から機械に変るが、トリチウム及び３２ｐについて、共に６０−１０ ０のシンチレー／ヨンカウンター背景が普通である。３２ｐの２．５１１（ｊ／ ｍｌの最終濃度が全く適切である。アマ−ジャムは４００Ｃｉ／ｍモルの活性及 び１０ｍＣ１／鳳ｌの濃度で２５μｌにて２５０μＣｉとして３２Ｐ−ｄＴＴＰ を与える（　Ｐ　Ｂ　１０１６７）。

この量は、使用前に８０＋ａｌアリコートまで増すことができる。

トリチウムによるマトリックス９６の低効率は全く超低背景によりなされる。そ れにもかかわらず、トリチウムは検定についての適当な感受性を確認するために ５ないし１０ｕＣｉ／履ｌの濃度で用いることが必要であろう。

非放射活性標識の検定は、ヌクレアーゼフリーＢＳＡ又は非特異抗体でＤＥ−８ １ベーパーに結合している非特異蛋白をブロックしたのち、ジゲトキシゲニン基 本反応についてベーリンガー・マンハイムよりの製造者指示に従う。

開始及び停止溶液 反応を開始させるための２価カチオンは、金属塩化物を１２■１の濾過０．０５ ＮＨＣＩに加えることにより１０−５０ｍＭ溶液として提供する。低ノイズの最 適結果は１０ｍＭランタンで得られ、最高活性は１０ｍＭスカンジウムで得られ る。

最適「停止溶液」は１２ｍ１ｄＨｔｏ中、５＋ｇｄＴＴＰ（ジグｖＴ８６３５） 及び１．１ｇビロリン酸塩（シグマＳ　９５１５）として作る。これは正確な停 止時間が必要な場合に、５μｌ量加えて反応を停止する。

洗浄溶液 洗浄用に、２０ＸＳＳＣを７００ｇのＮａＣ１（ジグ７Ｓ３０１４）及び２５０ ｇのクエン酸三ナトリウム（シグマＣ８５３２）を３．５１のｄＨ，Ｏに加え、 最終容量を４１にすることにより調製できる。これは数百のプレートに十分な洗 浄を与える。

検定プロトロール １．０Ｅ−８１のシート（４８Ｘ５７ｃｍ）を６つの断片（３つは２４Ｘ１５Ｃ ｍで、３つは３２Ｘ１５ｃｍ）にカットし、レーザープリンターによりシート上 に９６ウエルパターンをプリントする。シートは、シート当り３又は４の９６ウ エルグリツドパターンをプリントして用いる。使用の際に、個々の同定を検定の 開始前に鉛筆で各グリッド上に記載すべきである。

２、標識ｄＴＴＰをカクテルに加え、次いで標識９６ウエルトレイ（「組織培養 処理」　トレイを除（）に加え、４０ｇ１／ウエルの完全カクテルを与える。ト レイは凍結し、β−遮蔽箱（シグマＳ　４１４４又はノージン６７４０−１１０ ８）に貯蔵しつる。

３、細胞フリー組織培養上清、清澄血漿、又は組換え酵素（ウェル当り１−５単 位）をウェルに５μｍアリコート加える。この工程は、試料が、９６ウエル形式 に組立てることができる細いミクロ試験管に蓄え、多重チャンネルピペッタ−に よりカクテルに移すことができるならば、非常に簡単にできる。

４、トレイをインキュベーター内に置き３７℃に上げる。４０ラツクの９６ピペ ツトチツプが、２０トレイ検定の実施に必要である。

５．５分間隔で、トレイをインキュベーターから取り出し、多重チャンネルピペ ッタ−で５μｍのカチオン溶液を各ウェルに加えることにより反応を開始する。

カチオンの添加は、ピペッタ−に注意してボンピングすることにより良く混合す ることが重要である。トレイをインキュベーターに返し、次のトレイをカチオン 添加のために取り出す。

６１００分の最後で全２０１−１／イは全て反応続行でインキ、ベーター内にあ るべきである。最初のトレイは白やそのインキュベーターンを終了し、ドツトす るためにインキュベーターから取り出すことができる。

７、試料は、多重チャンネルピペッタ−を用いドツト当り５μｍの容量で適当な グリッド位置にＤＥ−８１ペーパー上にドツトする。ドツトするためのアリコー トを取り出す前にピペッタ−による簡単な混合のための時間があろう。未結合の ヌクレオチドの幾らかが付着することとなりうるので、この段階の間、ピペット チップでＤＥ−８１ペーパーを穿刺又は掻破するのを避けるために注意しなけれ ばならない。５μｍ容量で良好な精度でピペッタ−を用いることが１ｉＷである 。ＢＣＬ７０００（ベーリンガー・マンハイム）は良好に荷動し、グリッドへの ドツトの容易な整列を確かにする厳格にピペットで計ったチップ（シグマＰ５１ ６１）を用いる。

８３又は４の９６ウエルパターンの各シートは十分にドツトされるので、ハンガ ーとして用いるために部分的に曲がっていないペーパークリップで一角を穿刺す ることにより乾燥するのを遅らせうる。

９、全ての２０プレートが完了し、全てのソートが乾燥すると、されらは大きな パイレックス皿で一緒に洗浄しうる。シートは、洗浄に先たち、ソー１−当りそ れぞれ２又は３グリツドを含むようカットしなければならない。洗浄工程は、全 ノートを一緒に洗浄しても非常に低い背景となるよう十分に能率的である。

１０、各洗浄には、２０ＸＳＳＣをｄＨ！Ｏで１．１０に希釈する。１１の得ら れる２ＸＳＳＣを皿に注ぎ、ＤＥ−８１シートを浸漬する。トレイを５分間緩や かに撹拌し、洗浄液を流し出す。これを４つの皿について繰り返す。回転ミキサ 一台を用いることができる。

１１゜最後にそれぞれ１分間９５−１００％エタノールで２つの皿を実施するこ とが必要である。もし水で湿っていると、使ったときＤＥ−８１ペーパーはちぎ れるので、たとえンンチレー／ヨン溶液を用いないでもこの段階が必要である。

しかしながら、エタノールで湿らせると、それは大きな湿潤力を有する。エタノ ールを注ぎ出したのち、シートは緩やかに浴から持ち上げて再び曲がっていない ペーパークリップで吊して乾燥する。４つのグリップを伴うシートは非常に重い ので、湿っているとちぎれることなく吊すことはできないであろう。そしてこれ が、シートを洗浄する前にわずかに２又は３グリツドを含むようカットしなけれ ばならない理由である。

１２、完全に乾燥すると、各９６ウエルパターンはキャンベラ・パラカード・マ トリックス９６機械で１分でカウントできる。検定の感受性は１０μＣｉ／暴１ の３！Ｐ−ｄＴＴＰを用いることにより、又、１０μｍの試料のアリコートを二 倍にすることにより増加することができる。

実施例２ ＲＴ活性は種々のカチオンを用いて比較した。添付図面は、イオン半径の順に並 べたカチオンによる、−価（Ｌｉ）及び３価（ＡＩ、Ｓｃ、Ｌｕ、Ｙ、Ｔｂ、Ｇ ｄ。

Ｃｅ、　Ｌａ）カチオンによるＨ　Ｉ　Ｖ−１逆転写酵素活性を示す。検定はＡ １３４を１５０ｃａＭ　ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７，３で行った外は、１５０ｍＭトリ ス、ｐＨ８，２中２ＩＩＭ　ＤＴＴにより３４℃で行った。比較のために、種々 の２価カチオンを、Ｃｕ”″を１５０ｍＭｌ−リス、ｐＨ７，５で行った外は、 １５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７，５中、ＤＴＴを存在させることなく０−４℃ で行った。種々の完全緩衝液を７５閤Ｍ　ＫＣＩ、ポリ−ｒＡ　５　ｐｇ／ｍｌ 、オリゴｄＴ　（１２−１８）　５μｇ／１１１、過酸化物フリーＮＰ−４００ ，０５％及び［３２Ｐｌ　ｄＴＴＰ　５μ（ｊ、／ｍｌを有する脱イオン、金属 フリー水中で作った。種々のカクテルを１００１１／ウエルの容量で９６ウエル プレートに移し、次いでプレートを凍結した。金属溶液を０．ｌＮＨＣｌ中２５ ０ｍＭに調製し、次いで０．ｌＮＨＣｌ中の一連の希釈液を作り、種々の最終濃 度に種々の金属を含む９６ウエルプレートを並べる。次いでＲＴカクテルプレー トを解凍し、２０μｌのＨＩＶ感染細胞フリー上清を１組のプレートに加え、一 方、コントロールの組は、同一の培養物及び媒体からの２０μｌの未感染細胞フ リー上涜を入れた。各完全緩衝液チャンネル用の内部コントロールウェルは、共 に１０単位の精製ＭｏＭｕＬＶ　ＲＴ　（ファルマンア）及び２０μｍの細胞フ リー未感染上清を入れた。反応は、種々の金属カチオン希釈液及びＭｇＣｌ２希 釈液を８μｍ容量で、各緩衝液／ＤＴＴ／温度条件でＨＩＶ、ＭｏＭｕＬＶ及び コントロールウェルに、適当な位置に、多重チャンネルピペッタ−を用い移入す ることにより開始した。反応開始後、２時間（３４℃プレート）又は４時間（０ −４℃プレート）でＤＥ８１ワットマンペーパー上の予め番号を付した配列位置 への５μｍドツト移行を乾燥し、洗浄し、四角にカットし、５■１のシンチラン ト中、β−カウントした。

図に示される結果について、各コントロールからの活性をその対応する検定ウェ ルについての値（ＭｏＭｕＬＶ内部コントロールには示さず）から引く。ＣｕＳ Ｃｏ、Ｎｉ、Ｚｎ、、Ｍｎ、Ｐｄ及びＭｇについての比較試験は、約１２００に 最大ＲＴ活性（Ｍｎについて）を示した。他の結果はより低かった。

加えて、ゲルを実施し、大きさにより分けられた絞切り型のＤＮＡ長断片を示し た。Ｍｇ、Ｍｎ、Ｌａ、Ｌｕ、ＹＳＴｂ、Ｔｂ＋Ｍｇ及びＳｃ中Ｍｇの比較で、 ご（わずかな中断点があり、第３族元素のみによるチャンネル実施で、より長い ＤＮＡ断片があった。

実施例３ 検定を実施し、７０℃でＴａｑポリメラーゼの進歩増強を示した。一方、Ｍｇは ｃ、１６０の平均トリチウムカウントを示し、Ｃｏ、Ｃｕ、Ｎｉ、Ｍｎ及びＬａ についての対応カウントは低く、Ｓｃ、Ｃｅ、Ｎｄ及びＹについては、それぞれ 約４７０．４４０．２６０及び１８０であった。

実施例４ 検定を実施し、ＡＭＶ及びＨＩＶ逆転写酵素について、種々の第３族、２価及び 遷移金属イオンを用い進歩効果を示した。各酵素は、以下の表に示すように特徴 的パターンの効果を示した。

フンタノ　７ｃｈａｌ　ＡＭＶ ３．ＯｍＭ　Ｍｑ／ ３、ＯｍＭ　Ｍｅ　１０３１＋１　１２１７４　１９９１１　１コ１０７コ、Ｏ ｒｎＭ　Ｍｑ／ コ、ＯｍＭ　Ｍｅ　１：１２４２　１４７２１　１３１２３　１２６９９ランタ フ　／Ｃｈｅｌ　ＨＩＶ ランタン／Ｃｈｅｌ　コツトトル　（す１．　ＲＴＩ遷移金属　／ＡＭＶ 亜鉛　アバルト　マンガン　パラジウム遷移金属／Ｈ工Ｖ 銅　Ｍ工、Ｌｇ　マグ畢７ウム　ニアケルコ、ＯｍＭ　Ｍ９／ ］、Ｏ＋ＴＩＭＭｅ　１４１４７　１コア０８　１２９２８　１２６５５亜鉛　 コバルト　マンガン　バｔジｆエコ、ＯｒＩＩＭＭｑ／ １０ｒａＭＭｅ　１０９８８　１１９］１　１コア６８　１１０５遷移金属ｌ　 対照　（なしＲＴＩ ＃！　匙ヒ、６゜　マダ畢シウム　ニッケル［１コバルト　マｆｈウム　バラジ ウ１ＲＴ（朋ＬＶ）／ １、ｏｍＭＭｅ　１９７６１　７２８７３　４６９５　６９７５ＲＴｔＦｎ４Ｌ Ｖ）／ １、ｏｍＭＭｅ　１２５コ８０　６４１１５　５５９９５　１０５９フロントペ ージの続き （３１）優先権主張番号　９２０５４７０．９（３２）優先日　１９９２年３月 １３日（３３）優先権主張国　イギリス（ＧＢ）（３１）優先権主張番号　９２ ０６４０２．１（３２）優先日　１９９２年３月２４日（３３）優先権主張国　 イギリス（ＧＢ）Ｃ，ＮＬ、　ＳＥ）、　ＡＵ、　ＣＡ、　ＦＩ、　ＪＰ、　Ｎ ｏ、　Ｕエヌイー、ウィンブルドン、コツブス・ヒル　３１番

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. １．核酸ポリメラーゼを増幅すること、及び任意にヌクレアーゼ活性を阻害する ことについて第３族イオンの用途。
2. ２．増幅がＭｇ又はＭｎの存在で活性に関係する２又はそれ以上の因子による、 請求項１の用途。
3. ３．核酸ポリメラーゼ又は他の酵素の存在について試料を検定するための複数の イオンの用途。
4. ４．イオン又はイオン類がスカンジウムイオンであるかスカンジウムイオンを含 む先行請求項のいずれかの用途。
5. ５．イオン又はイオン類がランタンであるかランタンを含む請求項４の用途。
6. ６．ポリメラーゼがＤＮＡポリメラーゼである請求項１ないし５のいずれかの用 途。
7. ７．ポリメラーゼがＡＭＶ逆転写酵素である請求項１ないし５のいずれかの用途 。
8. ８．ポリメラーゼがＨＩＶ逆転写酵素である請求項１ないし５のいずれかの用途 。
9. ９．ポリメラーゼ又はそれについての鋳型を含むことが予想される試料のインビ トロで実施する検定でのいずれかの先行請求項の用途。
10. １０．血液試料中のＡＩＤＳについての診断検定での請求項９の用途。
11. １１．核酸ポリメラーゼ及び／又は鋳型、ポリメラーゼ活性に対し実質的に最適 であるｐＨを有する緩衝液及び第３族イオンを提供する化合物を含む内容物を詰 めた２又はそれ以上のコンテナーのキット。
12. １２．第３族イオンがスカンジウム又はランタンイオンである、請求項１１のキ ット。
13. １３．ポリメラーゼが請求項６−８のいずれかで定義されるものである、請求項 １１又は請求項１２のキット。