JPH07500017A - 抗体の調製 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 舊体９震梨 本発明は新しい抗体、特にＣＤ３抗原抗原体に対する抗体に関する。

プチドの固定された、すなわち不変の配列が見られ、Ｆｃ断片（断片−結晶）と 様なモノクローナル抗体は診断薬として、あるいは治療用として広く使われてい る。

の可変部と並んでおり、また定常部は重鎮の最初の定常部（ＣＨＩ）と並んでい て連結されている（Ｋａｂａｔら、５ｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎ ｓ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、Ｕ、Ｓ、Ｄｅｐａ ｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ　ａｎｄ　Ｈｕｍａｎ　５ｅｒｖｉｃｅｓＣ １９８７）　）。４つのフレームワーク領域はたいてい、βシート構造を形成し 、のドメインのＣＤＲと共に抗原結合サイトの形成に寄与している。

ヒトＣＤ３抗原は少なくとも４つの不変ポリペプチド鎖から成り、各ポリペプチ ド鎖はＴ細胞の表面上のＴ細胞受容体と非共を結合で結合する。そして、現在一 般的にＣＤ３抗原抗原体と呼ばれている。その複合体はＴ細胞受容体による抗原 認識に応答したＴ細胞活性化に関与することが示唆されている。

すべてのＣＤ３モノクローナル抗体はＩＬ−１（インターロイキン１）やＩＬ− ２（インターロイキン２）のような二次増殖刺激剤に対するＴ細胞の感受性を高 めるために使用される。さらに、ＣＤ３モノクローナル抗体の中には、それ自身 がＴ細胞に対して増殖促進活性を有するものもある。この性質はアイソタイプ依 存性で、ＣＤ３抗原のＦｃ部と補助細胞の表面にあるＦｃ受容体との相互作用に 起因する。

薩歯類のＣＤ３抗体は、Ｔ細胞の抗原に対する反応を抑制、促進、再促進するこ とにより免疫反応に影響を与えるために利用される。従って、それらはヒトの免 疫抑制剤として治療に用いることができる可能性がかなり高い。例えば、腎臓、 肝臓、心臓の他家移植後の拒否反応に対する治療のために使用できる。しかし、 それらの価値は２つの主要な要因に左右される。１つは、抗体の異物的な性質に より引き起こされる抗グロブリン反応である。２つは、患者に抗体を初めて投与 した際に起こる“−次反応“症候群である。症状としては、熱、悪寒から肺炎に まで渡る苦痛を伴い、稀に死を招くこともあるが、これは、ＣＤ３抗体によって 誘導されたＴ細胞活性化に伴って循環サイトカインのレベルが上昇することに起 因する。この現象はＴ細胞表面のＣＤ３抗原と補助細胞とのＦｃ受容体を通した クロスリンクを必要とする。このような増殖はＣＤ３抗体のＦ　（ａｂ−）＊断 片を用いても起こらない。

最初の問題は、抗体の可変部の遺伝子を再編成、あるいは″人体と適応”させ、 そしてそれらを関連したヒトの定常部遺伝子と共に発現させることによって対処 することができる。これにより、抗グロブリン反応が起こり得ないくらいの低レ ベルまで、モノクローナル抗体の非ヒト部分の割合が下げることができる。ＣＤ ３抗原抗原体に対する結合性を持つこのような再編成された抗体については英国 特許出願第９１２１１２６．８号（ＧＢ２２４９３１０Ａとして公開された）お よびその対応出願（欧州特許出願第９１９１７１６９．４、日本特許出願第５１ ６１１７／９１号および米国特許出願第０７／８６２５４３号）に記載されてい る。

しかし、これら抗体が治療に使用されても、−次反応の問題は残つたままである 。ある場合には抗体の脱グリコジル化により、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで抗体のＦｃ受 容体に対する結合力が低下したと記載されている。しかし、この現象がすべての 抗体で、特に±ｎ　ｖｉｖｏでも起こるのかを予想することはできず、また脱グ リコジル化によって、他の好ましくない効果を引き起こす新規なＦｃ結合特性を 含む新規な予想できない性質が抗体に与えられる可能性もある。またＦｃ結合性 とは関連のない好ましくない特徴を抗体に与えてしまう可能性もある。

さらに極めて重要なことは、脱グリコジル化によって、−次反応へ寄与するよう な好ましくない特徴と共に、Ｆｃ結合性の好ましい特徴まで失ってしまわないこ とである。

しかし、本発明ではＩｇＧサブクラスの脱グリコジル化ＣＤ３抗体の産生が可能 であることを見いだした。この抗体は驚くべきことに、Ｆｃへの結合能力をある 程度残しており、その抗原結合特異性および免疫抑制活性を保持したまま、±ｆ ｌ　ｖｉｔｒｏではＴ細胞の分化を誘導せず、モしてｉｎ　ｖｉｖｏでサイトカ イン放出のレベルを下げることができる。

従って、本発明は、ＣＤ３抗原抗原体への結合親和力を有する脱グリコジル化Ｔ ｇＧ抗体を提供する。

説グリコジル化という用語は通常の意味で用いられ、発明された抗体はグリコジ ル化されていないことを示す。本発明は、ヒト以外のＣＤ３抗原抗原体、例えば 様々な他の哺乳類ＣＤ３抗原への結合親和性を有する抗体に適用して家畜病治療 に用いることもできるが、発明の主な価値は、脱グリコジル化抗体が、ヒトに対 して適用できるように、ヒトＣＤ３抗原複合体と親和性を持つことであり、次の 記載では特にその内容に注目している。

ＣＤ３抗原についてのさらなる論議は、第一回国際ワークショップや、ヒト白血 球分化抗原会議の報告にも見られ、ＣＤ３抗原に対するグリコジル化された様々 な抗体についての記述も、このシリーズのワークショップおよび会議（特に第３ 回、第４回）の報告（オックスフォード社出版）にも見られる。そのような抗体 の具体的な例としては、Ｖａｎ　Ｌｌｅｒ　ら、Ｅｕｒｏ　Ｊ、Ｉｍｍｕｎ。

１、、１９８７．１１．１５９９−１６０４、Ａｌｅｇｒｅら、、Ｊ、Ｉｍｍｕ ｎｏｌ、、１９９１．工土立、１１８４、およびＳｍ１ｔｈら＋　１ｂｉｄ、１ ９ｇ６，１６，４７８．の中に記載されたものも含まれ、Ｓｍ１ｔｈの文献は、 ■ｇＧ１抗体ＵＣＨＴ１およびその派生体に関している。しかし、本発明の、脱 グリコジル抗体の基本的特徴として特に興味深いのは、抗体Ｃ）ＫＴ　３とＹＴ Ｈ１２、５，１４，２に含まれるＣＤＲである。抗体０ＫＴ３はＣｈａｔｅｎａ ｕｄら、、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｉｏｎ、１９９１，５１，３３４およびＮｅｗ 　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　ｐａｐｅｒ、１ ９８５．３１３，３３９、さらに、欧州特許出願第００１８７９５号と米国特許 出願第４、３６１．５３９号中に記載されている。抗体ＹＴＨ１２，５，１４， ２（今後ＹＴＨ１２，５とする）については、Ｃ１ａｒｋ　ら、、Ｅｕｒｏｒｅ ａｎ　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、、１９８９，１９．３８１−３８８に述べられてお り、そして、再構成されたＹＴＨ１２，５抗体は、英国特許出願第９１２１１２ ６．８号とその対応出願の主題となっており、この出願にはこの抗体に存在する ＣＤＨについて詳細に記載されている。

、上述の出願に記載されているＣＤＲを１つ若しくは複数含んでいる脱グリコジ ル抗体は特に興味深い。従って、本発明の抗体は下記のアミノ酸配列から選択さ れる少なくとも１つのＣＤＲをもつことが好ましい。

（ａ　）　Ｓｅｒ−Ｐｈｉ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ−Ａｌａ（配列ＩＤ　Ｎｏ、１）。

（配列ＩＤ　Ｎｏ、２）。

（Ｃ）　Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−τｙｒ−５ｅｒ−Ｇ＋ｙ−Ｇｌｙ−ρｈａ− Ａｓｐ−丁ｙｒ（配列ＩＤ　Ｎｏ、３）。

（ｄ）　Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−５ｉｒ−５ｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−１１ｅ−Ｇｌｕ− Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｈｌｓ（配列ＩＤ　Ｎｏ、４）。

（ｅ　）　Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−ｐｒｏ−Ａｓｐ（配列Ｉ Ｄ　Ｎｏ、５）。

（ｆ　）　Ｈｌｓ−５ｅｒ−Ｔｙｒ−Ｖａｔ−５ｓｒ−５ｅｒ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ −Ｖａｔ（配列ＩＤ　Ｎｏ、６）。

およびこれらの保存的に修飾された派生体である。

“保存的に修飾された派生体″とは当該技術分野においてよく知られており、抗 体−抗原の親和力に本質的に影響を与えることのない変化を有する派生体を意味 する。

ＣＤＲは、重鎮可変部のフレームワーク領域中（（ａ）、（ｂ）、（ｃ）の場合 ）および軽鎖可変部のフレームワーク領域中（（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）の場合） に位置している。抗体はさらに定常部も含んでいる。

好ましい態様では、脱グリコジル抗体は、上述アミノ酸配列（ａ）、（ｂ）。

（ｃ）に相当する、若しくはそれらの保存的に修飾された派生体に相当する３つ のＣＤＲ，および／あるいは、アミノ酸配列（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）に相当する 、若しくはそれらの保存的に修飾された派生体に相当する３つのＣＤＲを有する が、最も重要なのは重鎖ＣＤＲ（ａ）、（ｂ）、（ｃ）である。

従って、ＣＤ３抗原に対する結合親和性を有する好ましい脱グリコジル抗体は、 少なくとも１つ、特に３つのＣＤＲがアミノ酸配列：（Ｂ　）　５ａｒ−Ｐｈｅ −ρｒｏ−Ｍｅｔ−Ａ＋ａ（配列ＩＤ　Ｎｏ、１）。

（ｂ）　Ｔｈｒ−Ｈｅ−５ｅｒ−Ｔｈｒ−５ｅｒ−Ｇｌｙ−ＧＴｙ−Ａｒｇ−Ｔ ｈｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−５ｅｒ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ （配列ＩＤ　Ｎｏ、２）。

（ｃ）　ρｈｅ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−５ｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ− Ａｓｐ−Ｔｙｒ（配列ＩＤ　Ｎｏ、３）。

および、これらの保存的に修飾された派生体から選択された重鎮、および／また は、少なくとも１つ、特に３つのＣＤＲがアミノ酸配列：（ｄ）　Ｔｈｒ−Ｌ＠ ｕ−５ｅｒ−５ｅｒ−ＧＴｙ−Ａｓｎ−ｔｌｅ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｔｙ ｒ−Ｖａｔ−Ｈｌｓ（配列ＩＤ　Ｎｏ、４）。

（ｅ　）　Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｅ−Ａｒ９−Ｐｒｏ−Ａｓｐ（配列Ｉ Ｄ　Ｎｏ、５）。

（ｆ　）　１１ｉｓ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−ＶａＴ−５ｅｒ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ａｓ ｎ−Ｖａｔ（配列ＩＤ　Ｎｏ、６）。

およびこれらの保存的に修飾された派生体から選択される軽鎖を宵する。

本発明の脱グリコジル抗体は、前述のような好ましいＣＤＲを含んでいる場合、 都合のいいことに、特異的な重鎖ＣＤＲを１つ以上と特異的な軽鎖ＣＤＲを１つ 以上を両方とも有している。ＣＤＲ（ａ）、（ｂ）、（ｃ）は重鎮中で次のよう に配列される。リーダー配列から定常部（Ｎ末端からＣ末端へ）の方向へ、フレ ームワーク領域１／　（ａ）／フレームワーク領域２／　（ｂ）／フレームワー ク領域３／　（ｃ）／フレームワーク領域４°また、ＣＤＲ（ｄ）、（ｅ）、（ ｆ）は軽鎖中で次のように配列される。リーダー配列から定常部（Ｎ末端からＣ 末端へ）の方向へ、フレームワーク領域１／　（ｄ）／フレームワーク領域２／ 　（ｅ）／フレームワーク領域３／　（ｆ）／フレームワーク領域４°そこで３ つの配列が全て存在する場合には、重鎖ＣＤＲはリーダー配列から定常部の方向 へ、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）と並び、軽鎖ＣＤＲはリーダー配列から定常部の方 向へ、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）と並ぶのが好ましい。

しかし、本発明の脱グリコジル抗体が、前述のような配列とはまったく異なるＣ ＤＲを含んだり、あるいは全く異なることはないとしても、重鎮や特に軽鎖が、 各々（ａ）、（ｂ）、（ｃ）という配列のＣＤＲ１（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）とい う配列のＣＤＨのうち、たった１つまたは２つしか持たない可能性もあり得るこ とを認識しておく必要がある。しかし、本発明の脱グリコジル抗体に上述の６つ のＣＤＨ全てが存在することが必要とされているわけではないが、大半の好まし い抗体中には通常存在するであろう。従って、特に好ましい脱グリコジル抗体は 、アミノ酸配列（ａ）、（ｂ）、（ｃ）若しくはこれらの保存的に修飾された派 生体から成る３つのＣＤＲを持つ重鎮、及び、アミノ酸配列（ｄ）、（ｅ）。

（ｆ）若しくはこれらの保存的に修飾された派生体から成る３つのＣＤＲを持つ 軽鎖を有し、そして、重鎮ＣＤＲはリーダー配列から定常部の方向へ、（ａ）。

（ｂ）、（ｃ）と並び、軽鎖ＣＤＲはリーダー配列から定常部の方向へ、（ｄ） 、（ｅ）、（ｆ）と並ぶ。

ＣＤＲは可変フレームワーク領域、および／または、定常部とは異なった起源を 持っていてもよい。そして、ＣＤＲは通常、ラット若しくはマウス由来であるの で、本発明がラットやマウス由来のそのような領域を持った抗体を包含しても、 ヒトでの抗グロブリン反応が起こらないという利点がある。

さらに通常は、ＣＤＲは、例えばヒトのキメラ抗体の一部の様に可変フレームワ ーク領域と同じ起源であって、定常フレームワーク領域とは起源が異なるか、ま たは、より一般には、可変フレームワーク領域とも起源が異なる。

上述の望ましいＣＤＲはラットＣＤ３抗体より得られる。従って、可変部フレー ムワーク領域は様々な形態を取り得るが、音線類（例えばラットやマウス）のも の、または音線類由来のものが都合がよく、ヒトのものまたはヒト由来のもので あるのがより望ましい。１つの可能性として、抗体の定常部はヒトのものまたは ヒト由来のもののままで、可変部フレームワーク領域はＹＴＨ１２，５ハイブリ ドーマのものに相当するものを持たせることもできる。しかし、本発明の抗体は 、好ましくは可変部フレームワーク領域も、さらに後述するように定常部フレー ムワーク領域もヒト由来のものに近付けた方が良い。

従って、本発明はさらに、ヒトＣＤ３抗原に結合親和性を有し、・且つ、可変部 フレームワーク領域、および／または、定常部フレームワーク領域がヒトのもの またはヒト由来のものである脱グリコジル抗体を含む。

ヒトの可変部フレームワーク領域の配列のあるものは、望ましいＣＤＲ配列を繋 ぎ合わせるのに好ましい。なぜなら、そのような配列中においてはＣＤＲの３次 元構造がより保持され、且つ、抗体が抗原に対して高い結合親和性を維持するで あろうからである。そのような可変部フレームワーク領域における望ましい特徴 は、主要なアミノ酸が存在していることであり、それらのアミノ酸はＣＤ３抗原 に対する抗体の親和性と特異性を確実にするため、ＣＤＲループ構造、すなわち 、軽鎖にとって望ましいλ型の構造を維持する。

上述のＣＤＲとの結合に特に適するヒト可変フレームワーク領域は、英国特許出 願第９１２１１２６．８号で既に同定されている。重鎮可変（Ｖ）領域フレーム ワークは、ヒトＶＨＩＩＩ型遺伝子ＶＨ２６，Ｄ、Ｊ、によりコードされており ・Ｂ細胞ハイブリドーマ細胞系１８／２　（Ｇｅｎｂａｎｋ　コード：Ｈｕｍｉ ｎｇｈａｔ、Ｄｅｒｓｉｍｏｎｉａｎ　ら、、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｍｍｕ ｎ。

１ａｇｙ、１３９．２４９６−２５０１）に由来する。軽鎖可変領域フレームワ ークは、ヒト■、λ型■遺伝子ＳＵＴ　（Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ　コード、ＬＶ６ ＣｓＨｕｍ、Ｓｏｌｏｍｏｎら、、Ｉｎ　Ｇｌｅｎｎｅｒら（Ｅｄ　ｓ）　、Ａ ｍｙ　１ｏｉｄｏｓｉｓ、Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ　Ｎ、Ｙ、、１９８６．ｐ 、４４９）にコードされている。

従って、ラットＣＤ３抗体の重鎖の１つ、或いはそれ以上の好ましいＣＤＲは好 ましくはヒトの可変部類域フレームワークに存在し、この領域の配列は、リーダ ー配列から定常領域へ向かい、次のようなものである。ＣＤＲは、前述のような （ａ）、（ｂ）、（ｃ）、それらの保存的に修飾された派生体、若しくは別の選 択可能なＣＤＲを示す。

Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−５ｅｒ−Ｇｌｙ−ＧＴｙ− Ｇ　１ｙ−Ｌｅｕ−Ｖａ　１−Ｇ　１ｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−U１ｙ− ５ｅ　ｒ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−５ｅ　ｒ−Ｃｙｓ　−Ａ　ｌａ　−Ａ　＋ ａ−５ｅ　ｒ−Ｇ　Ｔｙ−Ｐｈｅ−Ｔｈ　ｒ−ρｈｅ−５ｅ秩|／ＣＯＲ／− Ｔｒｐ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−ρｒａ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ− Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｖａｌ−５ｅｒ−／ＣＯＲ／−（配列Ｎｏ、７／ＣＤ Ｒ／配列Ｎｏ、８／ＣＤＲ／配列Ｎｏ、９／ＣＤＲ／配列Ｎｏ、１０） ３つの望ましいＣＤＲをすべて含む説グリコジル抗体においては、重鎮可変部は 下記の配列： Ｇｌｕ−Ｖａｌ−ＧＩｎ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−５ｅｒ−ＧＴｙ−ＧＴｙ− Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−６１ｙ−Ｇｌｙ| ５ｅ　ｒ−Ｌｅｕ　−Ａｒｇ−Ｌｓｕ−５ｅ　ｒ−Ｃｙｓ　−Ａ　Ｔａ　−Ａ　 Ｔａ−５ｓ　ｒ−Ｇ　１　ｙ−Ｐｈｅ−Ｔｈ　ｒ−Ｐｈｅ−Tｓ　ｒ−５ｅ　ｒ −Ｐｈｅ− Ｐｒｏ−Ｍｅｔ−Ａ　１　ａ−Ｔｒｐ−Ｖａ　１−Ａｒｇ−Ｇ　１　ｎ−Ａ　１ ａ−Ｐ　ｒｏ−Ｇ１　ｙ−Ｌｙｓ　−Ｇ　１ｙ−Ｌｅｕ−Ｇ@＋ｕ−Ｔｒｐ−Ｖ ａ　］− ５ｅ　ｒ−Ｔｈ　ｒ−１１ｓ−５ｅ　ｒ−Ｔｈ　ｒ−５ｓ　ｒ−Ｇ　１ｙ−Ｇ　 ＋ｙ−Ａｒｇ　−Ｔｈ　ｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｓ@ｐ−５ｅ　ｒ−Ｖ ａ　ｌ− Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−ｒ　１ｅ−５ｅｒ−Ａｒｇ−ＡｓＣ １−Ａｓｎ−５ｅｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｔ凾秩| Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ａｓｎ−５ｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｕ− Ａｓｐ−丁ｈｒ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ| Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ＧＩｎ−Ｔｙｒ−５ｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ− Ｐｈｅ−Ａｓ　ｐ−丁ｙｒ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−ＧＴｎ−Ｇｌ凵| Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｖａ　１−Ｔｈｒ−Ｖａ　ｌ−５ｅｒ−５ｅｒ（配列Ｎｏ、１ １） より成る。

同様にラットＣＤ３抗体の軽鎖の１つ、或いはそれ以上の好ましいＣＤＲは好ま しくはヒトの可変部類域フレームワークに存在し、この領域の配列は、リーダ− 配列から定常領域へ向かい、次のようなものである。ＣＤＲは、前述のような（ ｃｉ）、（ｅ）、（ｆ）、それらの保存的に修飾された派生体、若しくは別の選 択可能なＣＤＲを示す。

（配列Ｎｏ、１２／ＣＤＲ／配列Ｎｏ、１３／ＣＤＲ／配列Ｎｏ、１４／ＣＤＲ ／配列Ｎｏ、１５） ３つの望ましいＣＤＲをすべて含む脱グリコジル抗体においては、軽鎖可変部は 下記の配列： （配列Ｎｏ、１６） より成る。

可変部は、例えば上述のように１つ若しくは複数の好ましいＣＤＲを含むが、好 ましくはヒト抗体由来の可変フレームワーク領域を有する人体に適応した形で、 適切な定常部に結合している。

重鎮と軽鎖の定常部は、任意の異なるタイプの抗体（ＩｇＧ抗体であることを条 件とする）に基づくことができる。しかし、それらは、ラットやマウスのものま たはそれらに由来のものでもよいが、ヒトのものまたはヒト由来のもののほうが 望ましい。軽鎖の定常部はλ型のものが好ましく、重鎮の定常部はＩｇＧアイソ タイプ、特に脱グリコジル化に適切に影響を与えるように修飾を受けたＩｇＧ１ が望ましい。ＩｇＧアイソタイプのヒト定常部は全て、２９７番目のアスパラギ ンがグリコジル化されていることが知られており、該アスパラギンは、次のよう なＮグリコジル化モチーフ：アスパラギン″＠？−Ｘ＠ｍｍ−セリン”９若しく はスレオニン２０（Ｘはプロリン以外のどんな残基でもよい）：の一部を構成し ている。よって、本発明の抗体は、このような定常部中の２９７番目のアスパラ ギンをグリコジル化されない他のアミノ酸と置換することにより、脱グリコジル 化される。アスパラギン以外の任意のアミノ酸残基を利用できるが、アラニンが 最も望ましい。

別法として、Ｎグリコジル化モチーフの他の残基のうち１つを変えることによっ て、２９７番目のアスパラギンのグリコジル化を防ぐことができる。例えば２９ ８番目の残基をプロリンと置換する、或いは、２９９番目の残基をセリンまたは スレオニン以外のアミノ酸と置換することが考えられる。この部位特異的突然変 異誘発を行うにあたっての方法は当該技術分野においてよく知られており、例え ば部位特異的突然変異誘発キット（例えばアマジャム社から市販されているもの ）を利用して行うことができる。この方法については後にさらに例示する。

ＣＤＲの１つのアミノ酸を同様の性質を有する他のアミノ酸と置換させても、例 えば、グルタミン酸残基をアスパラギン酸残基と置換させた場合でも、置換を起 こされたペプチドやタンパク質の性質や構造を実質的には変化させないであろう ことは当該技術分野においてよく知られている。従って、本発明の脱グリコジル 化抗体には、その内部においてＣＤＲの結合親和性や結合特異性を実質的に変化 させることのない置換を起こさせた特定のアミノ酸配列を持つ望ましいＣＤＲを 有する抗体も含まれる。また、活性を保持したまま、ＣＤＨのアミノ酸配列中に 欠失を起こさせたり、Ｎ末端やＣ末端の一方、あるいは両方に配列を延長させた りすることも可能である。

本発明の好ましい脱グリコジル化抗体は、１０ｓ１モル若しくはそれ以上、例え ば１０１！１モルもの抗原に対する親和定数を有するものである。異なる親和力 を持つリガンドは、異なった利用に適している。よって、例えば親和力が１０６ ．１０７．１０”１モルやそれ以上で最適な場合もあるかもしれない。しかし、 ａカニ０′〜１０ｓ１モルの抗体が最適である場合が多い。

都合良くは、本抗体は他の抗原と強い結合親和力示すことがない。抗体の結合親 和力および抗体特異性は後述の実施例の欄で記述されているような分析法（エフ ェクター細胞再標的分析法）、またはＥＬｒＳＡや他の免疫分析法で測定するこ とができる。

本発明の抗体は、２つの同一の軽鎖および２つの同一の重鎮を持つＹ字型の脱グ リコジル化ＩｇＧ　ＣＤ３抗体であり得、従って、ＣＤ３抗原に対する親和力を 持つ各抗原結合部位が２箇所あり得る。または、本発明は一方のアームのみがＣ Ｄ３抗原に対する親和力を持つ抗体にも適用できる。そのような抗体は様々な形 を取り得る。従って、抗体のもう片方のアームはＣＤ３以外の抗原に対する結合 親和力をもち、このような抗体は、例えば米国特許第４．４７４．８９３号及び 欧州特許出願第８７９０７１２３．１号と第８７９０７１２４．９号に記載され ているように、２種の抗原に特異的な抗体（二価抗体）である。また、１つのア ームのみが結合親和力を示す抗体もあり、そのような抗体は、”単価”　（ｍ。

ｎｏｖａｌｅｎｔ）と言われる。

単価抗体（或いは、抗体断片）は様々の方法で調製することができる。Ｇｌｅｎ ｎｉｅと５ｔｅｖｅｎｓｏｎ　（Ｎａｔｕｒｅ、２９５，７１２−７１３．（１ ９８２））は、酵素を用いた切断によって単価抗体を調製する方法を記載してい る。５ｔｅｖｅｎｓｏｎらは、酵素処理で生産されたＦａｂ−とＦｃ断片を化学 的に架橋させて単価抗体を調製する第二の方法を記載している。（Ａｎｔｉｃａ ｎｃｅｒ　Ｄｒｕｇ　Ｄｅｓｉｇｎ、３，２１９−２３０　（１９８９））ｏこ れらの方法では、得られた単価抗体は片方のＦａｂ−アームを欠いている。第三 の単価抗体調製法は、欧州特許出願第１３１４２４号に記載されている。この方 法では、抗体のＹ字型は保持されるが、２つのＦａｂ　一部のうち一方だけが抗 原に結合する。この方法は、不適切な軽鎖をコードする遺伝子をハイブリドーマ に導入するもので、その軽鎖は抗体の重鎮と結合して混合生成物が生成されるが 、該混合生成物の１つとして単価抗体が得られる。

しかし、さらに好ましくは本発明の単価説グリコジル化抗体は下記の方法で調製 される。この方法では適切な発現系、例えば、後述するような細胞系に、重鎮と 軽鎖をコードする遺伝子、および重鎮の可変部領域および第一定常部領域を欠い た欠損重鎮をコードする遺伝子（すなわちこれらの各部のエキソンを欠く遺伝子 ）を導入する。この結果、該細胞系の生成物として次のものが混在したものが得 られる。

（ａ）完全に２価抗体である抗体； （ｂ）２つの欠損重鎮（つまりＦｃ断片）のみから成る抗体断片；および（ｃ） 欠損重鎮と通常の重鎮に結合した軽鎖からなる、ＣＤ３抗原に対して単価な抗体 断片。

上記（Ｃ）の抗体断片は、Ｆａｂ−アームを１つだけ持つため、単価である。こ の方法によってこのような断片の形で単価抗体を生成することは、多くの理由か ら好ましい。すなわち、得られた抗体断片は、細胞系で生成された抗体混合物か ら精製することが容易である。なぜなら、例えば、分子量に基づいて簡単に分離 できるからである。欧州特許出願第１３１４２４号の方法では生成された単価抗 体は大きさや外見が２価抗体と似た性質を示すので、このような分離は不可能で ある。

また、新しい方法による単価抗体断片の生成では、より容易に調節可能な条件を 用いるので、複雑な反応生成物の分離を要する酵素処理／化学的結合法はど偶発 的な方法ではない。さらなる利点は、使用する細胞系は単価抗体断片を生成し続 けるため、酵素処理／化学的結合法のように合成操作を継続して行う必要がない 点である。

本発明における説グリコジル化抗体は自然界には存在せず、一般的にこの抗体は 多数の方法で人工的に作ることができる。しかし、抗体に存在する重鎮と軽鎖の 定常部と可変部の適切な遺伝子構築物を別々に得て、適した発現系に挿入するの が最も都合がよい。

望みの構造をしたリガンドの可変部をコードする遺伝子を生成し、部位特異的突 然変異誘発を受けた抗体の定常部をコードする遺伝子と共有結合させる。これら の定常部遺伝子は、ハイブリドーマｃＤＮＡまたは染色体ＤＮＡより得られ、脱 グリコジル化された定常部を生成するために（部位特異的な）突然変異誘発を受 けている。可変部をコードする遺伝子は、本明細書中のＣＤＲの同定に使用され た遺伝子合成技術により作ることもできる。ＤＮＡの適切なりローニングベクタ ーとしては様々なタイプのものを使用できる。

機能するＣＤ３リガンドを生産するための、細胞系の培養におけるこれらの遺伝 子の発現は、適切な原核細胞、または、真核細胞系、特にミエローマ細胞系のよ うな不死化哺乳類細胞［例えば、ＹＢ２／３．０１／Ａｇ２Ｏ（いかＹＯと呼ぶ ）ラットミエローマ細胞や、チャイニーズハムスター卵巣細胞（植物細胞の使用 も興味深い）］を様々な抗体領域を含む発現ベクターを用いて形質転換し、形質 転換した細胞系を培養して望みの抗体を生産させることによって、最も都合よく 得ることができる。本発明のリガンドを製造するために使用されるこのような一 般的技術は、遺伝子工学の非常に重要な分野においてよく知られており、Ｓａｍ ｂｒｏｏｋ、Ｆｒ１ｔｓｈ、Ｍａｎｉａｔｉｓらによる、　−Ｍｏｌｅｃｕｌａ ｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａ ｔｏｒｙｓ　１９８９　（第２版））などの刊行物に記載されている。これらの 技術については、本明細書中の実施例においてさらに詳述する。

従って、本発明は、抗体の発現に影響を与えるために、抗体を発現できる細胞を 培養する工程からなるＣＤ３抗原に対する結合親和力を有する脱グリコジル化Ｉ ｇＧ抗体の調製方法を含む。本発明は、本発明の脱グリコジル化抗体を発現可能 な細胞系も含む。

そのような細胞系の中で望ましいのは、前述の望ましいＣＤＲをコードするＤＮ Ａ配列を含むものである。前述のＣＤＲ（ａ）〜（ｆ）をコードする塩基配列の グループは、以下にそれぞれ（ａ）〜（ｆ）で示されている。しかし、遺伝子コ ードの縮重により、コードされるＣＤＲのアミノ酸配列は変えることなく塩基配 列のみが異なりでいる変異体も得られることは認識されるであろう。

（ａ）　ＡＧＣＴＴ丁ＣＣＡＡ　ＴＧＧＣＣ（配列ＩＤ　Ｎｏ、１７）。

（ｂ） ＡＣＣＡＴＴＡＧＴＡ　ＣＴＡＧＴＧＧＴＧＧ　ＴＡＧＡＡＣ７ＴＡＣＴＡＴＣ ＧＡＧＡＣＴ　ＣＣＧＴＧＡＡＧＧＧ　Ｃ（配列ＩＤ　Ｎｏ、１８）。

（Ｃ）　Ｔ１’ＴＣＧＧＣＡＧＴ　ＡＣＡＧＴＧＧＴＧＧ　ＣＴＴＴＧＡＴＴＡ Ｃ（配列ＩＤ　Ｎｏ、１９）。

（ｄ）　ＡＣＡＣｌＣＡＧＣＴ　ＣＴＧＧＴＡＡＣＡＴ　ＡＧＡＡＡＡＣＡＡＣ ＴＡＴＧＴＧＣＡＣ（配列ＩＤ　Ｎｏ、２０）。

（ｅ）　ＧＡＴＧＡＴＧＡＴＡ　ＡＧＡＧＡＣＣＧＧＡ　Ｔ（配列ＩＤ　Ｎｏ、 ２１）。

（ｆ　）　ＣＡＴＴＣＴＴＡＴＧ　ＴＴＡＧＴＡＧＴＴＴ　ＴＡＡＴＧＴＴ（配 列ＩＤ　Ｎｏ、２２）。

そのような細胞系は特に、次のような配列からなる長いＤＮＡ配列を有する：（ １）ヒト重鎮の可変フレームワーク領域および（ａ）、（ｂ）、（ｃ）のうちの １つまたは複数を発現するＤＮＡ； （２）ヒト軽鎖の可変フレームワーク領域および（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）のうち の１つまたは複数を発現するＤＮＡ。

その様なりＮＡ配列の具体例としては、下記に示したような：（１）前述のヒト ＶＨＩＩＩ型遺伝子ＶＨ２６，Ｄ、Ｊ、にコードされる重鎖フレームワーク領域 中に配列された（ａ）、（ｂ）、（ｃ）をコードしている配列：および （２）ヒトＶＬ　λ型遺伝子ＳＵＴにコードされる軽鎖フレームワーク領域中に 配列された（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）をコードしている配列；がある。ＣＤＲ配列 （ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、け）には下線が引いである。

（１）（配列ＩＤ　Ｎｏ、２３） ＧＡＧＧＴＣＣＡＡＣＴＧＣＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＣＧＧＴ　ＴＴＡＧＴ ＧＣＡＧＣＣＴＧＧＡＧＧＧＴＣＣＣＴＧＡＧＡＣＴＣＴＣＣ丁ＧＴＧＣＡＧ　 ＣＣＴＣＡＧＧＡＴＴ　ＣＡＣＴＴＴＣＡＧＴ　ＡＧＣＴＴＴＣＣＡＡ工住巨Ｃ ＣＴＧＧＧＴ　ＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴ　ＣＣＡＧＧＧＡＡＧＧ　ＧＴＣＴＧＧＡ Ｇ丁Ｇ　ＧＧＴＣＴＣＡ八ＣＣＡＴＴへＧＴＡＣＴＡ　ＧＴＧＧＴＧＧＴＡＧ　 ＡＡＣＴＴＡＣＴＡＴ　ＣＧＡＧＡＣＴＣＣＧ　ＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＡＴＴＣ ＡＣＴＡＴＣＴＣＣＡＧＡＧＡＴＡ　ＡＴＡＧＣＡＡＡＡＡ　ＴＡＣＣＣＴＡＴ ＡＣＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＴＡＧＴＣＴＧＡＧ　ＧＧＣＴＧＡＧＧＡＣＡＣＧ ＧＣＣＧＴＣＴ　ＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＡＡＡＡＴＴＴＣ闇ＣＡＧＴＡＣＡＧＴ Ｇ　ＧＴＧＧＣＴＴＴＧＡ　ＴＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＡＧＧＧＡＣＣＣＴＧＧ ＴＣＡＣＣＧｌＣＴＣＣＴＣＡ （２）（配列ＩＤ　Ｎｏ、２４） ＧＡＣＴＴＣＡＴＧＣＴＧＡＣＴＣＡＧＣＣＣＣＡＣＴＣＴＧＴＧ　ＴＣＴＧＡ ＧＴＣＴＣＣＣＧＧＡＡＡＧＡＣ工ＧＡＣＡＧＧＴＣ丁　ＴＣＣＡＡＣＴＣＡＧ 　ＣＣＴＣＣＣＴＧＡＣＡＡＴＣＡＧＴＧＧ丁　ＣＴＧＣＡＡＡＣＴＧＡＡＧＡ ＴＧＡＡＧＣＴＧＡＣＴＡＣＴＡＣＴＧＴＣＡＴＴＣＴＴ　Ａ工ＧＴＴＡＧＴＡ Ｇ　ＴＴＴＴＡＡＴＧＴＴＴＴＣＧＧＣＧＧＴＧ　ＧＡＡＣＡＡＡＧＣＴ　ＣＡ ＣＴＧＴＣＣＴＴもちろん、細胞系は重鎮と軽鎖の定常部を発現するＤＮＡ配列 をも含んでいる本発明の、人体に適応させた脱グリコジル化抗体は治療用に用い ることができる。特に、人体に適応し、且つヒトＣＤ３抗原に特異性を持つよう な脱グリコジル化抗体は、免疫抑制のために適用できるという価値がある。特に 、免疫抑制が持続性ではなく一過性のものであることが望まれ、従って、Ｔ細胞 を完全に破壊するのではなくＣＤ３抗原−ＴＣＲ複合体による抗体防御によって 機能させないようにすることが強く望まれる移植拒絶反応の場合の免疫抑制のた めに有用である。さらに、脱グリコジル化Ｃ３抗体は、治療剤の有効性がエフェ クター細胞のＦｃを介した死またはＦｃ受容体発現細胞の非特異的な死のそれぞ れによって低下する可能性がある癌の治療において、特に（エフェクター細胞の 再標的のための）２価抗体を作成したり、抗体−毒素結合体を生成したりすると いったように、他の分野においても利用できる可能性を秘めている。

さらなる観点として、本発明は、癌患者、特に白血病患者を治療するための方法 、またはミ例えば、移植拒絶反応が起こった場合に本発明の脱グリコジル化抗体 を治療に有効な量だけ投与するといったような、免疫抑制のための方法を含む本 発明の脱グリコジル化抗体は、生理学的に許容できる希釈剤または担体と共に患 者に投与することによって処方することもできる。本発明の抗体を、無菌で発熱 原を含まない希釈剤または担体と共に、注射によって投与するのが望ましい。処 方の目安としては、抗体の適切な量を、例えば１０日間にわたって毎日約１〜１ ０ｍｇを投与するのが望ましい。しかし、最初の用量に対する反応が低下したら 、個々の患者の必要に応じて、より多量の抗体、例えば毎日１００ｍｇずつの抗 体を投与することも可能である。家畜の場合は、同様にｇ／ｋｇの単位で投与す る。

本発明は、下記の実施例、および、以下に列記する実施例の解説図によって説明 される。

図１−８：これらの図は、ＣＤ３抗体に対する末梢血液リンパ球の増殖分析の結 果を示している。異なる４人の健康な提供者により、この実験は行われた。人体 に適応させた抗リンパ球抗体ＣＤｗ５２の結果が、ネガティブコントロールとし て含まれている。

図９−１２：これらの図は、脱グリコジル化ＣＤ３抗体とグリコジル化ＣＤ３抗 体を、混合リンパ球反応で比較したものである。マウスＣＤ８抗原に特異的な脱 グリコジル化抗体がネガティブコントロールとして含まれている。

図１３＆１４：これらの図は、グリコジル化ＩｇＧ型のＣＤ３抗体と脱グリコジ ル化ＩｇＧ型のＣＤ３抗体の、エフェクター細胞再標的分析を比較した結果を示 しである。ＣＤｗ５２抗体の結果が、ネガティブコントロールとして含まれてい る。

実施例 １：ヒト可　フレームワーク　に、ＹＴＨ１２，５ラツト　体　来のＣＤＲを　 んだヒトＣＤ３　に　・な　グリコジル化　体の調ヒトＣＤ３抗原に特異的なＹ ＴＨ１２，５ラット抗体のＶ領域遺伝子のクローニングと再編成は、Ｒｏｕｔｌ ｅｄｇｅら、、１９９１．　Ｅｕｒ、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、、２上、２７１７及 び英国特許出願第９１２１１２６．８号とその対応出願に記載されている。ＹＴ Ｈ１２，５は、ＣＤ３抗原抗原体に特異的なＩｇＧ２ｂモノクローナル抗体を分 泌している、ラットハイブリドーマ細胞系である。

簡単には、０ｒｌａｎｄｉら、、１９８９．ＰＮＡＳ　ＵＳＡ、８６．３８３３ 　の複製連鎖反応（ＰＣＲ）を用いる方法に基づいて行った。ＶＨ遺伝子（重鎮 可変部遺伝子）は、オリゴヌクレオチドプライマーＶＨＩＦＯＲとＶＨＩＢＡＣ Ｋを用いて単離した。ＰＣＲ産物を、ベクター、Ｍｌ　３−ＶＨＰＣＲｌに挿入 し、このベクターに６オリゴヌクレオチドブライマーを用いて部位特異的突然変 異誘発を起こした。ｖＨ遺伝子（軽鎖可変部遺伝子）は、公知のＶＬ　λ塩基配 列に基づいてデザインされたプライマーを用いて単離した。遺伝子を、Ｍｌ３− ＶＫＰＣＲに、ヒトλ軽鎮定常部遺伝子と共に、挿入した。このベクターにおい て、５オリゴヌクレオチドを用い、■、フレームワーク領域の突然変異誘発を行 った。人体に適応させたＶＬ遺伝子を発現ベクターｐＨβＡｐｒ−１に挿入した 。

再編成されたＣＤ３ＶＨ３遺伝子が種々の異なる免疫グロブリン重鎖の定常部遺 伝子と共に発現されるように、ベクター（ｐ　３１６）を作成した。このベクタ ーはｐＨβＡｐｒ−ｇｐｔベクター（Ｇｕｎｎｉｎｇら、　、１９８７．　Ｐ、 　Ｎ。

Ａ、Ｓ、ＵＳＡ、８５．７７１９−７７２３）に基づいている。ジヒドロ葉酸レ ダクターゼ（ｄｈｆｔ）遺伝子およびＳＶ４０の発現シグナル（Ｐａｇｅ＆Ｓｙ ｄｅｎｈａｍ、１９９１．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、９．６４）をもつＤＮ Ａの１．６５Ｋｂ断片を、ｐＨβＡｐｒ−ｇｌ）ｔのユニークなＥｃｏＲＩ部位 へ遺伝子を（ゲノムの配置と一致するように）ＣＤ３−ＶＨ遺伝子の下流のユニ ークなりａｍＨＩ部位に挿入した。

脱グリコジル化ヒトＩｇＧ定常部は、後述するようにＴａｋａｈａｓｈｉら（１ ９８２、Ｃｅ１１．２９，６７１−６７９）により記載されている、野性型Ｇ１ ｍ　（１，１７）遺伝子に由来している。この遺伝子をベクター、Ｍ１３　ｔｇ １３１にクローン化し、このベクターの２９７番目のアミノ酸残基をアスパラギ ンからアラニンへ変えるため、部位特異的突然変異誘発（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｉ ｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　ＰＬＣ）を行った。

アスパラギン２９７のオリゴ糖鎖は、正常なヒトＩｇＧ抗体（Ｋａｂａｔら。

、１９８７．５ｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎ。

ｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、ＵＳ　Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｈｅ １ｔｈ　Ｈｕｍａｎ　５ｅｒｖｉｃｅｓ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ）の全てに特 徴的なものであり、ＩｇＧ分子の２つの重鎮のそれぞれが、アスパラギン残基の アミド基に結合した１箇所枝分かれした炭水化物基を有する（Ｒａｄｅｍａｃｈ れる。

２．３Ｋｂの脱グリコジル化ＩｇＧ定常部を、ＢａｍＨＩとＢｇｌＩＩの二重制 限酵素処理でＭ１３から切り出してｐ３１６ベクターのＢａｍＨ１部位へ挿入し 、クローンｐ３２３を作成した。

ｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞の準集密的（ｓｕｂｃｏｎｆ　１ｕｅｎｔ）細胞単層を、 重鎮遺伝子を含むｐ３２３ベクターと、再編成されたヒトλ軽鎖（Ｒｏｕｔｌｅ ｄｇｅら、、１９９１．Ｅｕｒ、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、、２１．２７１７−２７ ２５）を含むｐ２７４ベクターとで同時にトランスフェクションした。トランス フェクションの前に、両プラスミドＤＮＡを制限酵素ＰｖｕＩで線状（ｌｉｎｅ 重鎮と軽鎖を含む形質転換体は、５％（ｖ／ｖ）透析ずみのウシ胎児血清（ＦＣ Ｓ）を含み、キサンチン／ヒポキサンチンを含まないＩＭＤＭで選択された。

野性型ヒトＩｇＧ−ＣＤ３重鎖ベクター、ｐ２７８の類似体の作成方法は、種々 の文献に記載されている（Ｒｏｕｔ　ｌ　ｅｄｇｅら、、１９９１．Ｅｕｒ、Ｊ 。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、、２１．２７１７−２７２５）、ヒトＩｇＧ２　（Ｆｌａｎａ ｇａｎ＆Ｒａｂｂｉｔｔｓ、１９８２．Ｎａｔｕｒｅ　３００，７０９−７１３ ）、ＩｇＧ３　（Ｈｕｃｋら−、１９８６，Ｎｕｃ、Ａｃ１ｄ、Ｒｅｓ、、１４ ．１７７９−１７８９）、ＩｇＧ４　（Ｆｌａｎａｇａｎ＆Ｒａｂｂｉｔｔｓ、 １９８２、Ｎａｔｕｒｅ　３００，７０９−７１３）、イプシロン（ｇ）（Ｆｌ ａｎａｇａｎ＆Ｒａｂｂｉｔｔｓ、１９８２．ＥＭＢＯ，Ｊｏｕｒｎａｌ　上、 ６５５−６６０）およびａ−２（Ｆｌａｎａｇａｎ＆Ｒａｂｂｉｔｔｓ、１９８ ２．Ｎａｔｕｒｅ　３００，７０９−７１３）の定常部遺伝子の非変異体を有す るＨ鎖発現ベクターは、ｐ３１６ベクターから作成した（各々、ベクターｐ３１ ７．ｐ３１８、ｐ３２０．ｐ３２１．ｐ３２５）。軽鎖ベクターｐ２７４と結合 したこれらベクターを、前述のｄｈｆ　ｒ”’　ＣＨＯ細胞へ導入することによ り、各々γ１、γ２、γ３、γ４、εおよびα−２のアイソタイプに対するＣＤ ３抗体を分泌する細胞系が作成された。ＣＤ３抗体を発現している細胞を用いて 軟寒天中で２回クローニングを行い、その後回転式ボトル培養装置で大量培養を 行った。各々の細胞系の約４リツトルの組織培養上清から、免疫グロブリンを硫 酸アンモニウム沈殿法によって採集し、ＰＢＳ中で透析を行い、次の方法で定量 した。

抗体の純度が高くないので、競合アッセイはＣＤ３抗原への結合能力をもつ抗体 の濃度を、特異的に定量することで行われた。ヒトＴ細胞未分化細胞を、ＵＣＴ Ｈ−１ラベルされたＦＩＴＣ，すなわち、キメラパネルとしてＣＤ３抗原の同じ エピトープにして結合する抗体と共に、インキュベートした。使用するＦＩＴＣ 試薬の濃度は、半飽和状態になるようあらかじめ定められた。ラベルされてい？ ＣいＹＴＨ１２，５（ＨＰＬＣ精製）について、既知の出発濃度から滴定を行い 、Ｔ細胞とＵＣＴＨ−１を含んでいるウェルに加えた。未標識抗体は、抗原結合 部位への競合体として機能する。これは、ＦＡＣ３分析を用いて細胞を分析する 際に、平均の蛍光量が減少することによって検出された。よって、未知の出発濃 度からのキメラ抗体の滴定を行い、平均蛍光を抗体の希釈に対してプロットする ことで、シグモイド型曲線が得られた。これらは、ＹＴＨ１２，５の標準カーブ と直接比較可能である。

衷塵例呈上壜稙分丘 ＣＤ３抗体が溶液中のＴ細胞の増殖を支持する能力は、抗体のＦｃ領域と補助細 胞上のＦｃ受容体との相互作用に関係している。

実施例１に示されたように調製された脱グリコジル化キメラＣＤ３抗体を、可変 部構造は同一であるがＨ鎖定常部（実施例１参照）は異なる他の一群のキメラ抗 体と、ヒト末梢血液リンパ球の増殖促進力について比較した。健康な提供者の血 液から得られたリンパ球を、リンホバーク勾配で分離、洗浄し、熱失活させたヒ トＡＢ血清を５％（ｖ／ｖ）含むＩＭＤＭに再懸濁し、ＣＤ３抗体の溶液をウェ ル中に含むプレートに５Ｘ１０’〜１Ｘ１０’細胞／ウエルになるよう播種した 。培養３日後、細胞をトリチウムを含んだチミジンでパルスラベルし、６時間後 に採集し、細胞の３Ｈ取り込みレベルを、シンチレーションカウンターで測定し た。滴定された抗体に対する増殖反応を４人の血液提供者について調べた。５人 目の提供者については、増殖反応は１重ｇについてのみ調べた。その結果は、図 １〜８に示されている。

試験を行った提供者については、“野性型°の抗体は全てＴ細胞増殖を引き起こ した。だが、変異型の脱グリコジル化ＩｇＧ１アイソタイプは増殖促進作用を持 たず、このことは炭水化物側鎖が重要な役割果たしていることを意味する。

別の実験では、溶液中ＣＤ３モノクローナル抗体のパネルがＴ細胞増殖を促進す る能力が、様々な人種の１０人の提供者から得られたリンパ球を用いて調べられ た。自然発生的アイソタイプはすべて、５％ヒヒトＢ血清存在下で増殖を引き起 こしたが、抗体により起こされた反応の程度は、Ｔ細胞の提供者によって異なっ た。一般的に、γ１、εモノクローナル抗体は増殖促進活性が最も高く、最も低 濃度で細胞分化を起こし、γ３と７２はこれらよりも活性が低い。γ１モノクロ ーナル抗体の説グリコジル化誘導体は、テストされたどの提供者においてもＴ細 胞増殖を誘導せず、コントロールとして用いた非活性化性のモノクローナル抗体 Ｃａｍｐａｔｈ−ＩＨと同様の反応を起こす、唯一のＣＤ３抗体であった。α２ とεの調製品においてみられた増殖を起こす原因が内毒素の混入である可能性を 除くため、過剰量の脱グリコジル化ＣＤ３　ｍＡｂを加えると増殖を抑制できる ことを確認したが、このことは活性化の過程にＣＤ３抗原が関与していることを 意味する。

脱グリコジル化γ１ＣＤ３モノクローナル抗体に見られるような増殖促進活性の 完全な欠失は、ＥＣＲ活性レベル（後述の実施例５を参照）における順位を考慮 すると驚くべきものである。この不活性化の原因は、おそらく、脱グリコジル化 により増殖に必要な結合後の事象を誘導する能力を（例えば、モノクローナル抗 体の２つ目の認識部位の破壊等によって）失ったことよりもむしろ、ＦｃＲに対 する親和力が減少したことにある。このことは、ＩｇＧのない培地中でアッセイ を行った場合、脱グリコジル化γ１　ｍＡｂはかなりの程度まで増殖を促進する 、というような観察結果からも支持される。おそらく、Ｔ細胞と補助細胞との接 触回数若しくは相互作用の強度には、増殖の開始前に越えていなければならない 最小閾値があり、競合する免疫グロブリンが十分なレベルで存在する場合、脱グ リコジル化γ１ｍＡｂによってはこの閾値を越えられないのであろう。

施　３：混Ａリンパ　応におけるキメラＣＤ３　の実施例１の脱グリコジル化１ ｇＧＩＡｇ抗体が、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）においてＴ細胞増殖を抑制する 能力があるかを調べるための一連の実験を行った。２つの実験の結果を図９乃至 図１２に示しである。

末梢血管リンパ球を２人の提供者から単離した。刺激細胞をセシウム照射した。

照射された刺激細胞を加える前に、反応細胞集団を滴定された抗体と共に３０分 インキュベートシた（図９．１０，１１）。反応細胞のコントロールウェルにつ いても、各抗体条件の照射された反応細胞と共にインキュベートし、抗体の反応 細胞に対する特異的な影響を調べた（図９．１０．１１）。

５日間インキュベーションした後、ウェルをトリチウムを含んだチミジンでパル スラベルし、６時間後に採集した。

説グリコジル化抗体は確かに混合リンパ球反応を抑制する：抗体が滴定（希釈） されていくに従い、抑制効果が低下し、増殖が促進される。゛野性型−ＩｇＧ１ は実際Ｔ細胞の分裂促進活性を有するので、この反応においては、ＭＣＨの抑制 は全く観察されない。

ネズミＣＤ８抗原に特異的な゛不適切な一説グリコシル化抗体をネガティブコン トロールとして使用した。この抗体は、予想通り、ＭＣＨにおいて何の影響も及 ぼさなかった。

４：Ｉ　Ｇ　体のｉｎ　ｖｉｖｏにおける　果実施例１の脱グリコジル化抗体（ ＩｇＧＩＡｇ）を含むヒトＣＤ３εサブユニットを遺伝子導入したマウスにおい て、キメラ抗ヒトＣＤ３抗体を用いて、土ユｖｉｖｏ実験を行った。注射を一回 行った後に、キメラＣＤ３抗体がＴＮＦ因子放出を引き起こす能力を比較した。

この一連の実験で、注射前、関連したＣＤ３抗体の１０μｇ静脈注射後９０分、 ４時間、の各時間にマウスから血清を採集した。５匹のマウスを１グループとし 、各々のグループから血清を集め、プールした。血清中のＴＮＦレベルの分析が 、Ｊｅａｎ−Ｆｒａｎｃｏｉｓ　Ｂａｃｈ教授の研究室で行われた。そこでは、 Ｌ９２９マウス繊維芽細胞での血清に対する、ＴＮＦ存在による細胞毒性の影響 を測定するパオイオアッセイが用いられた。

結果は、下の表に示されている。

、１ｃＤ３キメラ抗体の注射後にｈＣＤ３マウス血清中に検出されたＴＮＦサン プル　°　注射前の　９０分後の　４時間後のＴＮＦレベル　ＴＮＦレベル　Ｔ ＮＦレベル食塩水　Ｏｕｎｉｔｓ／ｍｌ　０ｕｎｉｔｓ／ｍｌ　Ｏｕｎｉｔｓ／ ａｌＩ　ｇ　Ｇ　１　０　ｕｎｉｔｓ／＋ｎｌ　＞４００ｕｎｉｔｓ／ｍ１　０ 　ｕｎｉｔｓ／＋＋１１　ｇ　Ｇ　２　０　ｕｎｉｔｓ／ｍｌ　＞４００ｕｎｉ ｔｓ／＊＋１　０　ｕｎｉｔｓ／ｍｌＩ　ｇ　Ｇ　Ｉ　Ａ　ｇ　Ｏｕｎｉｔｓ１ ０＋１　５０ｕｎｉｔｓ／ｍｌ　Ｏｕｎｉｔｓ／＋ｎｌＩ　ｇ　Ｅ　Ｏｕｎｉｔ ｓ／ｍｌ　５０ｕａｉｔｓ／ｍｌ　２５ｕｎｉｔｓ／ｍ１ＹＴＨ１２，５０ｕｎ ｉｔｓ／ｍｌ　５０ｕｎｉｔｓ／ｍｌ　Ｏｕｎｉｔｓ／ｍ１２種類のヒトＩｇＧ １の注射において、ＴＮＦレベルに有意な相違が観察される。説グリコジル化型 は、野性型ＩｇＧ１またはＩｇＧ２抗体よりも、ＴＮＦ放出が少なくとも８倍低 い。

実施例２−４の結果は、脱グリコジル化ＣＤ３抗体は溶液中のＴ細胞に対する増 殖促進因子ではないことを示しており、このことは、抗体の補助細胞のＦｃ受容 体と相互作用する能力が減少していることを示唆している。該抗体は、ＣＤ３抗 体に特徴的な免疫抑制作用は保持している。ｉｎ　ｖｉｖｏでは、脱グリコジル 化抗体がヒトＣＤ３トランスジエニツクマウスにおいて誘導する腫瘍破壊因子（ ＴＮＦ）の放出量は、元のＩｇＧ抗体の場合と比較して著しく少なかった。従っ て、もしマウスで観察されたようにヒトでもＴＮＦ放出量の減少が起こるならば 、この薬剤は免疫抑制のための゛改良型−ＣＤ３抗体として使用できるかもしれ ない。

５：Ｔ細　を　るＣＤ３　体を　るためのエフェクター再提似分近ム旦旦尺と この実験は、文献（Ｇｉ　１１　ｉ　１ａｎｄら、、１９８８．ＰＮＡＳ　ＵＳ Ａ。

８５．４４１９）の記載に従って行い、「活性化Ｔ細胞をＦｃγＲを産生してい る標的細胞にクロスリンクさせ、標的細胞の溶解を媒介する能力」がＣＤ３モノ クローナル抗体にあるかを測定した。簡単に述べると、Ｆｃγ受容体Ｉ、■およ び■を発現しているヒト単核細胞Ｕ９３７をＳ　ｒ　Ｃｒクロム酸ナトリウム塩 でラベルし、２Ｘ１０’細胞／ｍｌになるように再懸濁した。これらの細胞を標 的として用いた。ヒト末梢血液リンパ球を増殖促進ＣＤ３抗体によって活性化し 続いてＩＬ−２を含む培地で培養することによって生産したヒトＴ細胞未分化細 胞をエフェクター細胞として用いた。分析を行う前に、それらを洗浄し、２Ｘ１ ０’細胞／ｍｌの濃度で再懸濁した。精製キメラ抗体の調製液１００μｌをマイ クロタイタープレートのウェル中で３倍希釈とした。エフェクター細胞および標 的細胞を５０μｍずつ各々のウェルに加え、その混合物を３７℃で４時間以上イ ンキュベートした。この後１００μｍの上清を除去し、放出された’Ｃｒを測定 した。

各抗体の希釈液について二回ずつ実験を行った。

単核細胞系Ｕ９３７はヒトＦＣ受容体を発現し、Ｕ９３７とＴ細胞未分化細胞と をクロスリンクできるＣＤ３モノクローナル抗体存在下で、活性化ヒトＴ細胞未 分化細胞によって溶解される。実施例１のヒトＩｇｌＧ１抗体は脱グリコジル化 した場合でも、少ないレベルではあるが、まだＴ細胞をＵ９３７細胞にクロスリ ンクさせ、Ｔ細胞の細胞毒性を再向させることができることが、実験結果（図１ ３．１４）によって示された。既知の公表データから考えて、脱グリコジル化γ １モノクローナル抗体に媒介された効果的な殺傷現象は予想外であり、この結果 は驚くべき発見であった。

炭水化物を除去することによって、このモノクローナル抗体は粘着性が特に増し 、ＦｃγＲと相互作用せずにＵ９３７細胞と結合可能となったという可能性も考 えられた。しかし、その後、脱グリコジル化γ１モノクローナル抗体がマウスＬ 細胞標的（ヒトＦｃγＲＩを発現しているマウス細胞系）の破壊を媒介するか否 かはトランスフェクトされたヒトＦｃγＲＩ遺伝子の発現に依存していることが 示され（結果は示していない）、このモノクローナル抗体はＦｃγＲへの結合活 性を有することが確認された。我々は、Ｆｃ−Ｆｃ受容体相互作用を検出するの にＥＣＲ分析は特に感度の高い方法であると結論する。

ＥＣＲの結果より、ＩｇＧキメラ抗体の結合力の強さはγ２くγ３＜Ａｇγ１く γ４くγ１の順であることが示された。もし、抗体の増殖促進活性をＦｃ受容体 結合力から推定できるとすれば、Ｔ細胞増殖分析において上述の結合力順位付け が示されることを期待するであろう。しかし、この仮定は正しくない。すなわち 、Ｔ細胞増殖実験（実施例１−３）における活性の順は、Ａｇγ１くγ２くγ４ 〈γ３〈γ１であった。このことは、Ｆｃ−Ｆｃ受容体相互作用の測定結果から 抗体の増殖促進性を単純に予想することはできないことを示している。ＥＣＲア ッセイではあまり活性を示さなかったが、一定して高い増殖促進活性を示したε キメラ抗体の挙動からも、この見解が支持される。これにより、（Ｕ９３７細胞 の例で示されたように）抗体は補助細胞上のＦｃγ受容体以外の何かと結合する ことによってＴ細胞を活性化しうる可能性が出てきた。つまり、ＦＣ７受容体へ 結合することができないからといって、抗体が分裂促進活性を有しないとは限ら ないのである。

０２μｍ　ｒｇＧＩ　Ａ　１ｇＧ２　ｗｒ　［ｇＧ３　＊　ｒｇＧ４ＣＰＭ　ｅ 　ＩｇＧＩＡｇ　ムＩｇＥ　ｖａ　ＩｇＡ２　＊　Ｃａｍｐａｔｈ−ＩＧＣＦＩ Ｍ＠　ＩＣ１Ｇ１　ムＩｇＧ２　ｗｒ　１ｇＧ３　＋　ｒｇＧ４相対的抗体濃度 　（ｎｇ／ｍｌｌ Ｆｉｇ、３ 相対的抗体濃度　（ｎｇ／ｍｉｌ ＣＰＭ　・Ｉ＋ｇＧ１　ム１９Ｇ２　■１９Ｇ３　ΦＩｇＧ４相対的抗体濃度　 （ｎｇ／ｍｌｌ Ｆｉｇ、７ ＣＰＭ　ｅｓ　ＩｇＧＩＡｇ　ムＩｇＥ　ｍ　［ｇＡ２　＋　Ｃａｍｐａｔｈ− １Ｇ相対的抗体濃度（ｎｇ／ｍｌｌ Ｆｉｇ、８ 抗体濃度［ｎｇ／ｍｌｌ Ｆｉｇ、９ 抗体濃度（ｎｇ／ｍｌｌ Ｆｉｇ、１０ ＣＰＭ ｆＸ１０’ｌ　・ＩｇＧ１　ムＩｇＧＩＡｇ　ｉｓ　ＣＤ８ＡｇＰＭ （Ｘ１０−３１　・ＩｇＧ１　ムＩｇＧＩＡｇ■ＣＤ８Ａｇ抗体濃度　（ｎｇ／ ｍｌｌ ＊　ｒｇＧＩ　Ａ　ＩｇＧ２　ｍ　１ｇＧ３　＋　１ｇＧ４　＊　ＹＴ）１１２ ．５抗体濃度　ｊｎｇ／ｍｌｌ Ｆｉｇ、１３ ＊　ＩｇＧＩＡｇムＩｇＥ　ｗｇ　ＩｇＡ２　＋ＹＴＨ１２，５＊Ｃａｍｐａｔ ｈ−ＩＧ抗体濃度　ｆｎｇ／ｍｌｌ Ｆｉｇ、１４ 国際調査報告　。、ア７．．．。、７ｏ５°、。

フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、Ｃ１，６識別記号　庁内整理番号Ｃｌ２Ｒ１：９１） （７２）発明者　ゴーマン、スコツト・デヴイッドイギリス国ケシブリッジ　シ ービー２・５ジエイエヌ、プレイド・シェルフオード。

ケンブリッジ・ロード　１６７ Ｉ （７２）発明者　ルートリッジ、ニドワード・グラハムイギリス国ケシブリッジ 　シービー２・５エルジー、プレイド・シェルフオード、グランハムズ・クロー ズ　２２ （７２）発明者　ウォルドマン、バーマンイギリス国ケンブリッジ　シービー４ ・２イーデイー、ゴーニー・ウェイ　１１

Claims (27)

【特許請求の範囲】
1. １．ＣＤ３抗原複合体への結合親和性を有する脱グリコシル化抗体。
2. ２．ヒトＣＤ３抗原複合体への結合親和性を有する、請求項１に記載の脱グリコ シル化抗体。
3. ３．少なくとも１つのＣＤＲが次のアミノ酸配列：（ａ）【配列があります】 （ｂ）【配列があります】 （ｃ）【配列があります】 （ｄ）【配列があります】 （ｅ）【配列があります】 （ｆ）【配列があります】 またはその保存的に修飾された派生体より選択される、請求項２に記載の脱グリ コシル化抗体。
4. ４．少なくとも１つのＣＤＲが次のアミノ酸配列：（ａ）【配列があります】 （ｂ）【配列があります】 （ｃ）【配列があります】 またはその保存的に修飾された派生体より選択される重鎖を有し、および／また は、少なくとも１つのＣＤＲが次のアミノ酸配列：（ｄ）【配列があります】 （ｅ）【配列があります】 （ｆ）【配列があります】 またはその保存的に修飾された派生体より選択される軽鎖を有する、請求項２に 記載の脱グリコシル化抗体。
5. ５．次のアミノ酸配列： （ａ）【配列があります】 （ｂ）【配列があります】 （ｃ）【配列があります】 またはその保存的に修飾された派生体から成る３つのＣＤＲを有する重鎖、及び 、次のアミノ酸配列： （ｄ）【配列があります】 （ｅ）【配列があります】 （ｆ）【配列があります】 またはその保存的に修飾された派生体から成る３つのＣＤＲを有する軽鎖を有し 、かつ、重鎖ＣＤＲがリーダーから定常部の方向へ、（ａ），（ｂ），（ｃ）の 順に配列されており、かつ、軽鎖ＣＤＲがリーダーから定常部の方向へ、（ｄ） ，（ｅ），（ｆ）の順に配列されている、請求項２に記載の脱グリコシル化抗体 。
6. ６．可変部フレームワーク領域が、ラット若しくはマウスのもの、または、ラッ ト若しくはマウスに由来するものである、請求項１から５のいずれか１項に記載 の脱グリコシル化抗体。
7. ７．ＣＤＲが可変フレームワーク領域とは起源が異なるものである、請求項１か ら５のいずれか１項に記載の脱グリコシル化抗体。
8. ８．可変部フレームワーク領域が、ヒトのもの、または、ヒトに由来するもので ある、請求項７に記載の脱グリコシル化抗体。
9. ９．重鎖可変部フレームワーク領域が、リーダーから定常部の方向へ、次のアミ ノ酸配列： 【配列があります】 〔ＣＤＲは、少なくとも１つが（ａ），（ｂ）、（ｃ）、またはその保存的に修 飾された派生体から選択されるＣＤＲが存在することを示す。〕より成る、請求 項８に記載の脱グリコシル化抗体。
10. １０．軽鎖可変部フレームワーク領域が、リーダーから定常部の方向へ、次のア ミノ酸配列： 【配列があります】 ［ＣＤＲは、少なくとも１つが（ｄ），（ｅ）、（ｆ）、またはその保存的に修 飾された派生体から選択されるＣＤＲが存在することを示す。］より成る、請求 項８または９に記載の脱グリコシル化抗体。
11. １１．重鎖可変部が次のアミノ酸配列：【配列があります】 より成る請求項９に記載の脱グリコシル化抗体。
12. １２．軽鎖可変部が次のアミノ酸配列：【配列があります】 より成る請求項８または１１に記載の脱グリコシル化抗体。
13. １３．定常部が、ラット若しくはマウスのもの、または、ラット若しくはマウス に由来するものである、請求項１から１２のいずれか１項に記載の脱グリコシル 化抗体。
14. １４．ＣＤＲが定常領域とは異なる起源を持つ、請求項１から１２のいずれか１ 項に記載の脱グリコシル化抗体。
15. １５．定常部が、ヒトのもの、または、ヒトに由来のものである、請求項１から １２のいずれか１項に記載の脱グリコシル化抗体。
16. １６．定常領域がＩｇＧのアイソタイプである、請求項１から１５のいずれか１ 項に記載の脱グリコシル化抗体。
17. １７．定常領域がＩｇＧ１のアイソタイプである、請求項１６に記載の脱グリコ シル化抗体。
18. １８．各定常領域重鎖の２９７番目アスパラギン残基が他のアミノ酸残基と置換 された、請求項１５、１６または１７に記載の脱グリコシル化抗体。
19. １９．アスパラギンがアラニン残基と置換された請求項１８に記載の脱グリコシ ル化抗体。
20. ２０．片方のアームのみがＣＤ３抗原に対する親和性を有する、請求項１から１ ９のいずれか１項に記載の脱グリコシル化抗体。
21. ２１．単価抗体である請求項２０に記載の脱グリコシル化抗体。
22. ２２．半分が、完全な重鎖と軽鎖から成り、残りの半分が、類似しているが、軽 鎖への結合部位を欠いている不完全な重鎖から成る、請求項２１に記載の脱グリ コシル化抗体。
23. ２３．生理的に許容される希釈剤若しくは担体を含む薬剤組成物の形をした、請 求項１から２２のいずれか１項に記載の脱グリコシル化抗体。
24. ２４．治療に用いるための請求項１から２２のいずれか１項に記載の脱グリコシ ル化抗体
25. ２５．免疫抑制のための薬剤を製造するために、請求項１から２２のいずれか１ 項に記載の脱グリコシル化抗体を使用する方法。
26. ２６．薬剤が移植を受けた者の治原に用いるものである、請求項２５に記載の方 法。
27. ２７．請求項１から２２のいずれか１項に記載の、リガンド、抗体、或いはそれ らの断片を、治療に効果的な量患者に投与することより成る、癌患者または免疫 抑制を必要とする患者を治療するための方法。