JPH07188010A - アミロイド形成タンパクの作用を抑制するための医薬組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 アミロイド形成タンパクが関与する生理的障
害を抑制する方法を提供する。 【構成】 本発明の方法は、式Ｉ 【化１】 ［式中、Ｒ¹とＲ³は独立して水素、−ＣＨ₃、−Ｃ(Ｏ)
−(Ｃ₁〜Ｃ₆アルキル)、または−Ｃ(Ｏ)−Ａr(Ａrは置
換されていることあるフェニル)であり、またＲ²はピロ
リジノ、ヘキサメチレンイミノおよびピペリジノより成
る群から選択される］で示される化合物または製薬的に
許容し得るそれらの塩もしくは溶媒和物の有効量を、必
要とするヒトに投与することより成る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】アルツハイマー病(ＡＤ)は、記憶、認識、
推理、判断および情動安定性の進行性喪失を臨床的特徴
とする脳変性疾患であり、これが次第に深在性の精神薄
弱となって、最終的には死に至る。ＡＤは、老人におけ
る進行性精神不全症(痴呆)の一般的な原因であって、米
国における最も一般的な医学的死亡原因の第４位である
と考えられている。ＡＤは、世界中の様々な人種および
民族群に認められ、現在および未来の主要な公衆衛生問
題を成す。現在、米国だけでも約２００万〜３００万人
の人々がこの疾患に冒されていると見られている。現在
のところ、ＡＤは治療不可能であると示されている。

【０００２】ＡＤを患っている人々の脳は、神経細胞の
変性や、アミロイド形成斑、血管のアミロイド脈管障
害、および神経原線維のもつれとして種々に称される特
徴的な病変を示す。ＡＤを患っている患者において、一
般に、こういった病変の多く、特にアミロイド形成斑や
神経原線維のもつれは、記憶や認識機能に関して重要な
ヒトの脳における幾つかの領域で見受けられる。より限
定された解剖学的分布におけるこういった病変はこれよ
りも少数であるが、臨床的ＡＤを患っていない殆どの老
人の脳で見受けられる。アミロイド形成斑や血管のアミ
ロイド脈管障害はまた、２１トリソミー(ダウン症候群)
や、ダッチ型のアミロイド症に伴う遺伝性脳出血(ＨＣ
ＨＷＡ−Ｄ)を患っている人々の脳の特徴でもある。現
在、ＡＤの確定的な診断には、通常、病死した患者の脳
組織において、あるいは時に、観血的な神経外科的操作
の際に採取される脳組織の僅かな生検試料において、前
述の病変を観察することが必要である。

【０００３】特定のアミロイド形成タンパク、すなわち
β−アミロイドタンパク(βＡＰ)の進行性大脳沈着は、
ＡＤの病理発生に導く可能性をはらんだ役割を果たし、
また知覚症状が起こるより数年または何十年も前に起こ
り得るということが、幾つかの証拠概要により示されて
いる［ゼルケー(Ｓelkoe)，１９９１年，ニューロン(Ｎ
euron) ６：４８７を参照］。最近、βＡＰは、培養中
で増殖した神経細胞から遊離し、また健常者およびＡＤ
患者の両者の脳脊髄液(ＣＳＦ)中に存在することが示さ
れた［ゾイベルト(Ｓeubert)ら，１９９２年，ネイチャ
ー(Ｎature) ３５９：３２５〜３２７を参照］。

【０００４】アルツハイマー病や、アミロイド形成ペプ
チドであるβＡＰが関与する他の病態に加え、βＡＰと
構造的には類似しているが、βＡＰとは配列相同性を共
有しない他のアミロイド形成ペプチドが関与する病態が
実在する。神経毒性に関連し、多くのこういったアミロ
イド形成ペプチドが機能的に交換できることが、最近の
研究により実証された［Ｐ.Ｃ.メイ(Ｍay)ら，ジャーナ
ル・オブ・ニューロケミストリー(Ｊournal of Ｎeuroc
hemistry)，１９９３年１２月、および米国特許同時係
属出願 ０８／１０９,７８２，１９９３年８月１９日提
出，日本国特願平６−１９５４４６］。

【０００５】ＡＤや、他のアミロイド形成タンパクが関
与する疾患の基本的な機序の理解は進歩してきたにもか
かわらず、今だこういった疾患を処置するための組成物
や方法を開発する必要がある。アミロイド形成タンパク
の産生または作用を抑制することのできる薬物に基づい
た処置法は有利となり得る。

【０００６】本発明は、アミロイド形成タンパクが関与
する生理的障害を抑制する方法であって、式Ｉ

【化９】 で示される化合物または製薬的に許容し得るそれらの塩
もしくは溶媒和物の有効量を、そのような抑制を必要と
するヒトに投与することより成る方法を包含する。

【０００７】本発明はまた、アミロイド形成タンパクの
産生を抑制する方法であって、式Ｉで示される化合物の
有効量を、そのような抑制を必要とするヒトに投与する
ことより成る方法をも提供する。

【０００８】本発明はまた、アミロイド斑の沈着を抑制
する方法であって、式Ｉで示される化合物の有効量を、
そのような抑制を必要とするヒトに投与することより成
る方法をも提供する。

【０００９】本発明はまた、アルツハイマー病(ＡＤ)を
抑制する方法であって、式Ｉで示される化合物の有効量
を、そのような抑制を必要とするヒトに有効量投与する
ことより成る方法をも提供する。

【００１０】本発明は、選択されたベンゾチオフェン
群、つまり式Ｉで示される群が、アミロイド形成タンパ
クの作用を抑制するのに有用であり、また詳細には本化
合物がアミロイド形成タンパクの形成を抑制するという
発見に関する。本発明は、アミロイド形成タンパク、好
ましくはβ−アミロイドタンパクが関与する生理的障害
を抑制するのに有効である、式Ｉで示される化合物また
は製薬的に許容し得るそれらの塩もしくは溶媒和物のあ
る投与量を、必要とするヒトに投与することにより行わ
れる使用を包含する。

【００１１】「抑制」という語は、その一般的に容認さ
れた意味を包含し、これには、進行、重篤度、あるいは
結果として現れる症状を妨害すること、予防すること、
拘束すること、および緩徐すること、阻止すること、ま
たは回復させることが包含される。このように、本発明
の方法は、治療的投与および予防的投与の両方を包含す
る。

【００１２】「アミロイド形成タンパクが関与する生理
的障害」という語は、例えば、脳、肝臓、腎臓または他
の臓器等における、少なくとも一つのアミロイド形成タ
ンパクの不適当な、あるいは望ましくない沈着が関与す
る疾患を包含し、これには例えば、ＡＤ(家族性ＡＤを
含む)、ダウン症候群、ＨＣＨＷＡ−Ｄ、脳の老化進行
等が包含される。

【００１３】「有効量」という語は、アミロイド形成タ
ンパクが関与する生理的作用または障害を抑制するのに
必要な化合物の量、あるいはアミロイド形成タンパクの
産生もしくは沈着を抑制するのに必要な化合物の量、場
合によっては、アルツハイマー病を抑制するのに必要な
化合物の量を意味する。

【００１４】本明細書中で使用する「アミロイド形成タ
ンパク」という語は、より高次元の凝集体へと自己会合
する能力があって、最終的にはアミロイド斑を形成する
ペプチドを意味する。好ましい標的アミロイド形成タン
パクは、β−アミロイドタンパクである。

【００１５】通例、本化合物は、通常の賦形剤、希釈剤
または担体と配合して錠剤に圧縮成形するか、もしくは
経口投与に便利なエリキシル剤または溶液剤として製剤
化するか、もしくは筋肉内または静脈内経路で投与す
る。本化合物は、経皮投与することができ、また徐放性
投与形態等に製剤化することができる。

【００１６】本発明の方法に使用する化合物は、米国特
許第４,１３３,８１４号、同第４,４１８,０６８号およ
び同第４,３８０,６３５号に詳述されているような確立
されている類似の手順に従って製造することができる
［これらは全て引用によって本明細書中に包含され
る］。通例、その製法は、６−ヒドロキシル基と２−
(４−ヒドロキシフェニル)基を有するベンゾ[ｂ]チオフ
ェンから開始される。その出発化合物を保護し、アルキ
ル化して、脱保護すると、式Ｉで示される化合物とな
る。そのような化合物の製造例は、上述の米国特許、お
よび本出願の実施例に記載されている。「置換されてい
ることあるフェニル」には、フェニル、およびＣ₁〜Ｃ₆
アルキル、Ｃ₁〜Ｃ₄アルコキシ、ヒドロキシ、ニトロ、
クロロ、フルオロまたはトリ(クロロもしくはフルオロ)
メチルで一または二置換されているフェニルが包含され
る。

【００１７】本発明には、以下の化合物、

【化１０】 すなわちラロキシフェンが包含される。

【００１８】本発明の方法に使用する化合物は、広範囲
にわたる種々の有機および無機酸並びに塩基と製薬的に
許容し得る酸および塩基付加塩を形成し、また製薬化学
において使用されることの多い生理学的に許容し得る塩
を包含する。そのような塩もまた本発明の一部である。
そのような塩を形成するのに使用される典型的な無機酸
には、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硝酸、硫酸、
リン酸、次リン酸等が包含される。また脂肪族モノおよ
びジカルボン酸、フェニル置換アルカン酸、ヒドロキシ
アルカン酸およびヒドロキシアルカン二酸、芳香族酸、
脂肪族および芳香族スルホン酸といったような有機酸か
ら誘導される塩を使用することもできる。従って、その
ような製薬的に許容し得る塩には、酢酸塩、フェニル酢
酸塩、トリフルオロ酢酸塩、アクリル酸塩、アスコルビ
ン酸塩、安息香酸塩、クロロ安息香酸塩、ジニトロ安息
香酸塩、ヒドロキシ安息香酸塩、メトキシ安息香酸塩、
メチル安息香酸塩、ｏ−アセトキシ安息香酸塩、ナフタ
レン−２−安息香酸塩、臭化物、イソ酪酸塩、フェニル
酪酸塩、β−ヒドロキシ酪酸塩、ブチン−１,４−二酸
塩、ヘキシン−１,４−二酸塩、カプリン酸塩、カプリ
ル酸塩、塩化物、桂皮酸塩、クエン酸塩、ギ酸塩、フマ
ル酸塩、グリコール酸塩、ヘプタン酸塩、馬尿酸塩、乳
酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、ヒドロキシマレイン
酸塩、マロン酸塩、マンデル酸塩、メシラート、ニコチ
ン酸塩、イソニコチン酸塩、硝酸塩、シュウ酸塩、フタ
ル酸塩、テレフタル酸塩、リン酸塩、リン酸一水素塩、
リン酸二水素塩、メタリン酸塩、ピロリン酸塩、プロピ
オール酸塩、プロピオン酸塩、フェニルプロピオン酸
塩、サリチル酸塩、セバシン酸塩、コハク酸塩、スベリ
ン酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、ピロ硫酸塩、亜硫酸塩、重
亜硫酸塩、スルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−
ブロモフェニルスルホン酸塩、クロロベンゼンスルホン
酸塩、エタンスルホン酸塩、２−ヒドロキシエタンスル
ホン酸塩、メタンスルホン酸塩、ナフタレン−１−スル
ホン酸塩、ナフタレン−２−スルホン酸塩、ｐ−トルエ
ンスルホン酸塩、キシレンスルホン酸塩、酒石酸塩等が
包含される。好ましい塩は塩酸塩である。

【００１９】製薬的に許容し得る酸付加塩は、一般的
に、式Ｉで示される化合物を当モル量または過剰量の酸
と反応させることにより形成される。反応体は、通例、
ジエチルエーテルまたはベンゼンといったような相互溶
剤中に混合する。塩は、通常、約１時間ないし１０日以
内に溶液から沈殿し、濾過により分離するか、もしくは
常法により溶媒を除去することができる。

【００２０】塩を形成するのに一般に使用される塩基に
は、水酸化アンモニウム、並びにアルカリおよびアルカ
リ土類金属水酸化物および炭酸塩、さらには脂肪族およ
び芳香族アミン、脂肪族ジアミン、並びにヒドロキシア
ルキルアミンが包含される。付加塩を製造する際に特に
有用な塩基には、水酸化アンモニウム、炭酸カリウム、
重炭酸ナトリウム、水酸化カルシウム、メチルアミン、
ジエチルアミン、エチレンジアミン、シクロヘキシルア
ミンおよびエタノールアミンが包含される。

【００２１】製薬的に許容し得る塩は、通例、それらが
誘導される化合物に比べて高い溶解性を有することか
ら、液体またはエマルジョンに製剤化されることがより
多い。

【００２２】当業者に知られている手順により、医薬品
製剤を製造することができる。例えば、本化合物は、通
常の賦形剤、希釈剤または担体と配合して、錠剤、カプ
セル剤、懸濁剤、粉末剤等に成形することができる。そ
のような製剤に適当な賦形剤、希釈剤および担体の例に
は、以下のものが包含される。デンプン、糖、マンニト
ール、およびケイ素誘導体といったような充填剤および
増量剤、カルボキシメチルセルロースおよび他のセルロ
ース誘導体、アルギン酸塩、ゼラチン、およびポリビニ
ルピロリドンといったような結合剤、グリセロールとい
ったような湿潤剤、寒天、炭酸カルシウム、および重炭
酸ナトリウムといったような崩壊剤、パラフィンといっ
たような溶解遅延剤、第四アンモニウム化合物といった
ような吸収促進剤、セチルアルコール、グリセロールモ
ノステアレートといったような界面活性剤、カオリンお
よびベントナイトといったような吸着担体、並びにタル
ク、ステアリン酸カルシウムおよびマグネシウム、およ
び固形ポリエチルグリコールといったような滑沢剤。

【００２３】本化合物はまた、経口投与に便利なエリキ
シル剤または溶液剤として、あるいは非経口(例えば、
筋肉内、皮下または静脈内経路)投与に適当な溶液剤と
して製剤化することができる。さらに、本化合物は、徐
放性投与形態等に製剤化するのにも十分適している。場
合によっては一定時間の間、好ましくは腸管の特定部位
またはその部位においてのみ活性成分を放出するように
製剤を設計することができる。例えば、高分子物質また
はワックスから、コーティング、エンベロープおよび保
護マトリックスを施すことができる。

【００２４】例えば、アルツハイマー病、ダウン症候
群、および脳の老化進行といったような、一つまたはそ
れ以上のアミロイド形成タンパクの沈着が関与する疾患
の予防的処置および／または治療的処置に対し、式Ｉで
示される化合物を投与することができる。治療的に適用
する際は、既に疾患を患っている患者に本化合物を投与
する。アミロイド形成タンパク、特にβ−アミロイドタ
ンパクが関与する生理的作用または障害を抑制するのに
十分な量で、本化合物を投与する。

【００２５】予防的に適用する場合には、アミロイド形
成タンパクが関与する疾患、好ましくはアルツハイマー
病にかかりやすい患者であるが、まだそのような疾患を
患っていない患者に、式Ｉで示される化合物を投与す
る。そのような患者は、医学文献に記載されている遺伝
学的スクリーニングや臨床分析を行うことにより識別す
ることができる［ゴーテ(Ｇoate)，ネイチャー，３４
９：７０４〜７０６，１９９１年を参照］。本化合物
は、初期症状の段階でアミロイドタンパク斑を抑制し、
好ましくはアミロイド形成タンパクが関与する疾患の開
始段階でさえも予防するであろう。予防的理由もしくは
治療的理由のいずれかより、本発明の化合物を与えるの
に好ましいグループは、閉経期後の女性である。

【００２６】本発明の式Ｉで示される化合物の個々の用
量は、容体の重篤度、投与経路、および関連要因によっ
て異なり、これらは担当医師により決定されるであろ
う。通例、一日の許容有効量は約０.１〜約１０００mg
／日、さらに一般的には約５０〜約２００mg／日であ
る。その疾患または障害を抑制するのに十分な期間にわ
たり、そのような用量を毎日１〜約３回、要すればそれ
以上の回数で、処置を必要とする対象患者に投与する。

【００２７】医薬組成物を脳へ直接的に、または間接的
に取り入れることが望ましく、あるいは必要であること
が多いであろう。直接法では、通常、血液−脳関門を迂
回させるよう、投薬カテーテルを患者の脳室系に配置す
る。一般に好ましいとされている間接法では、親水性薬
物を脂溶性薬物へと転化することにより薬物潜在性を提
供する組成物を製剤化する。一般に、薬物をより脂溶性
として血液−脳関門を通して輸送されやすいものとする
よう、薬物に存在するヒドロキシル基、カルボキシル
基、および第一アミン基をブロックすることで、潜在性
が得られる。あるいはまた、血液−脳関門を一時的に開
かせることのできる高張液を動脈内へ注入することによ
り、親水性薬物の移送を高めることができる。

【００２８】ピペリジノ環といったような塩基性基を有
する医薬品を投与する際はいつもそうであるように、通
常、式Ｉで示される化合物は酸付加塩形態で投与するの
が好ましい。そのような目的のためには、以下の投与剤
形を利用できる。

【００２９】製 剤 例 以下の製剤例において、「活性成分」とは、式Ｉで示さ
れる化合物を意味する。

【００３０】 〈製剤例 １〉 ゼラチンカプセル剤 以下の成分を用いて、ゼラチン硬カプセル剤を製造する。 成 分 量（mg／カプセル） 活性成分 ０.１〜１０００ デンプン，ＮＦ ０ 〜 ６５０ デンプン流動性粉末 ０ 〜 ６５０ シリコーン流体３５０センチストークス ０ 〜 １５ 各成分を混合し、米国Ｎo.４５メッシュの篩にかけて、
ゼラチン硬カプセルに充填する。

【００３１】製造した本化合物であるラロキシフェンの
カプセル製剤の具体例を以下に示す。

【００３２】 〈製剤例 ２〉 ラロキシフェンカプセル剤 成 分 量（mg／カプセル） ラロキシフェン １ デンプン，ＮＦ １１２ デンプン流動性粉末 ２２５.３ シリコーン流体３５０センチストークス １.７

【００３３】 〈製剤例 ３〉 ラロキシフェンカプセル剤 成 分 量（mg／カプセル） ラロキシフェン ５ デンプン，ＮＦ １０８ デンプン流動性粉末 ２２５.３ シリコーン流体３５０センチストークス １.７

【００３４】 〈製剤例 ４〉 ラロキシフェンカプセル剤 成 分 量（mg／カプセル） ラロキシフェン １０ デンプン，ＮＦ １０３ デンプン流動性粉末 ２２５.３ シリコーン流体３５０センチストークス １.７

【００３５】 〈製剤例 ５〉 ラロキシフェンカプセル剤 成 分 量（mg／カプセル） ラロキシフェン ５０ デンプン，ＮＦ １５０ デンプン流動性粉末 ３９７ シリコーン流体３５０センチストークス ３.０

【００３６】上記個々の製剤は、与えられた穏当な変化
に応じて変更することができる。

【００３７】以下の成分を用いて、錠剤を製造する。

【００３８】 〈製剤例 ６〉 錠剤 成 分 量（mg／錠剤） 活性成分 ０.１〜１０００ セルロース，微晶質 ０ 〜 ６５０ 二酸化ケイ素，フュームド ０ 〜 ６５０ ステアリン酸塩 ０ 〜 １５ 各成分を混合し、圧縮して錠剤を成形する。

【００３９】あるいはまた、活性成分を各々０.１〜１
０００mg含有する錠剤は以下のようにして製造される。

【００４０】 〈製剤例 ７〉 錠剤 成 分 量（mg／錠剤） 活性成分 ０.１〜１０００ デンプン ４５ セルロース，微晶質 ３５ ポリビニルピロリドン（１０％水溶液として） ４ カルボキシメチルセルロースナトリウム ４.５ ステアリン酸マグネシウム ０.５ タルク １ 活性成分、デンプン、およびセルロースを米国Ｎo.４５
メッシュの篩にかけて、完全に混合する。その結果得ら
れた粉末とポリビニルピロリドン溶液とを混合した後、
これを米国Ｎo.１４メッシュの篩にかける。このように
して製造した顆粒を５０〜６０℃で乾燥し、米国Ｎo.１
８メッシュの篩にかける。次いで、あらかじめ米国Ｎo.
６０メッシュの篩にかけておいたカルボキシメチルセル
ロースナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、および
タルクを顆粒に加え、混合した後、これを打錠機で圧縮
して、錠剤を得る。

【００４１】５ml用量につき、薬物を各々０.１〜１０
００mg含有する懸濁液剤を以下のようにして製造する。

【００４２】 〈製剤例 ８〉 懸濁液剤 成 分 量（mg／５ml） 活性成分 ０.１〜１０００mg カルボキシメチルセルロースナトリウム ５０ mg シロップ １.２５ mg 安息香酸溶液 ０.１０ ml 香料 適量 着色料 適量 精製水を加えて５mlとする 薬物を米国Ｎo.４５メッシュの篩にかけ、カルボキシメ
チルセルロースナトリウムおよびシロップと混合して、
滑らかなペーストとする。安息香酸溶液、香料、および
着色料を少量の水で希釈して、撹拌しながら加える。次
いで、水を加え、所望の容量とする。

【００４３】アッセイ 〈実験計画〉アッセイ１〜３に関し、以下の実験計画を
立てる。

【００４４】アミリンは、バケム社(Ｂachem,Ｉnc.)
［トーランス(Ｔorrance)，カリフォルニア］、ペニン
シュラ・ラボラトリーズ社(Ｐeninsula Ｌaboratories,
Ｉnc.)［ベルモント(Ｂelmont)，カリフォルニア］、シ
グマ・ケミカルズ(Ｓigma Ｃhemicals)［セント・ルイ
ス(Ｓt．Ｌouis)，ミズーリ］から入手するか、もしく
は以下に記載するようにして合成することができる。ア
ミロイド−β(１−４０)［ロット ＃ ＺＫ０５２］およ
び逆β−アミロイドペプチド(４０−１)［ロット ＃Ｚ
Ｘ２９９］は、バケム社から入手できる。β₂−マイク
ログロブリンは、シグマ・ケミカルズ［セント・ルイ
ス，ミズーリ］から入手できる。

【００４５】発熱物質を含まない滅菌水を用いて、ペプ
チドの保存溶液(１mＭ)を新たに調製し、それを規定培
養培地中で目的の濃度に希釈する。ラットの海馬培養物
(インビトロで１０〜１４日)をペプチドまたはビヒクル
で４日間処理する。ラットの皮質培養物の生存力を位相
差顕微鏡検査法により目視で評価し、培養培地中に遊離
される乳酸脱水素酵素(ＬＤＨ)を測定することにより定
量する。

【００４６】ヒトの皮質培養物(インビトロで１９〜２
２日)をペプチドまたはビヒクルで３日間処理する。細
胞の生存力を位相差顕微鏡検査法により目視で評価し、
テトラゾリウム塩のＸＴＴの減少を測定することにより
定量する。

【００４７】例えば、カルシウムレベルをモニターする
といったような他の技法を用いて、細胞の生存力、また
その結果毒性を測定することができるということは、当
業者には分かっている。ＬＤＨ法およびＸＴＴ法、並び
にカルシウムレベルをモニターするアッセイは以下で説
明する。

【００４８】〈アッセイ １〉 カルシウムレベルを測
定する神経毒性アッセイ ポリエチレンイミンで被覆した組織培養皿にＥＤ１８の
皮質細胞の部分標本を播種し、３〜５日インビトロ培養
した後、新たに溶解する(主としてランダムコイル構造)
かまたは放置する(７日，主としてβ−シート構造)かい
ずれかの２５μＭのβ−アミロイドペプチド溶液で処理
した。この神経毒性アッセイは、ウシの胎児血清を含有
する、既知組成のヘペス(ＨＥＰＥＳ)緩衝化ＤＭＥＭ中
で行う。

【００４９】β−アミロイドペプチドを用いて２日間イ
ンキュベーションした後、蛍光カルシウム色素を用い
て、グルタミン酸パルスを決定した後の細胞質ゾルのカ
ルシウム(Ｃa²⁺)濃度の上昇を測定する［Ｊ.ウォール
(Ｗahl)ら，ジャーナル・オブ・ニューロケミストリ
ー，５３：１３１６，１９８９］。細胞内Ｃa²⁺レベル
の上昇は、細胞の保存性を危うくする。本発明の化合物
を用いて、上記アッセイを再度行う。最初に行ったアッ
セイと比較して細胞内Ｃa²⁺レベルが下降すれば、本化
合物の活性が証明される。

【００５０】〈アッセイ ２〉 ＸＴＴを測定する神経
毒性アッセイ ポリエチレンイミンで被覆した組織培養皿にＥＤ１８の
皮質細胞の部分標本を播種し、３〜５日インビトロ培養
した後、新たに溶解する(主としてランダムコイル構造)
かまたは放置する(７日，主としてβ−シート構造)かい
ずれかの２５μＭのβ−アミロイドペプチド溶液で処理
した。このアッセイは、ウシの胎児血清を含有する、既
知組成のヘペス(ＨＥＰＥＳ)緩衝化ＤＭＥＭ中で行う。

【００５１】これらの細胞をインビトロで３〜５日間イ
ンキュベートした後、新たに溶解する(主としてランダ
ムコイル構造)かまたは放置する(７日，主としてβ−シ
ート構造)かいずれかの２５μＭのβ−アミロイドペプ
チド溶液で処理した。２日間インキュベーションした
後、Ｎ.レーム(Ｒoehm)らのジャーナル・オブ・イムノ
ロジカル・メソッズ［(Ｊournal of Ｉmmunological Ｍ
ethods)，１４２：２５７，１９９２年］に記載されて
いるようにして、テトラゾリウム塩のＸＴＴ［２,３−
ビス(２−メトキシ−４−ニトロ−５−スルホフェニル)
−２Ｈ−テトラゾリウム−５−カルボキシアニリドの分
子内塩］の減少を測定することにより、細胞の生存力を
評価する。本発明の化合物を用いて、上記アッセイを再
度行う。最初に行ったアッセイと比較して細胞の生存力
が増加すれば、本化合物の活性が示される。

【００５２】〈アッセイ ３〉 ＬＤＨを測定する神経
毒性アッセイ ９６ウェルのプレートを用い、標準的な３４０nm動力学
ＬＤＨアッセイ［シグマ・カタログ・ナンバー ＃ ２２
８−２０］を利用して、コンディションド規定ＤＭＥＭ
の部分標本２０μl中の乳酸脱水素酵素(ＬＤＨ)を測定
する。データ分析用のデルタ・ソフト(Ｄelta Ｓoft) I
I ソフトウェア［ｖ．３.３０Ｂ，バイオメタリクス社
(ＢioＭetallics,Ｉnc.)］を利用するＰＣ−駆動ＥＬ３
４０型マイクロプレート・バイオキネティクス(Ｍicrop
late Ｂiokinetics)プレート読み取り機［バイオ−テク
・インストロメンツ(Ｂio-Ｔek Ｉnstruments)］を用
い、３７℃でアッセイを行う。正常レベルおよび上昇レ
ベルの血漿ＬＤＨを含有する特性対照標準(例えば、シ
グマ・エンザイム・コントロールズ(Ｓigma ＥnzymeＣo
ntrols) ２Ｎおよび２Ｅ)についてもアッセイ毎に測定
する。本発明の化合物を種々の濃度でウェル部分に添加
する。結果をＬＤＨ／Ｌ単位として表わすが、この場
合、１単位とは、アッセイの条件下、ニコチンアミドジ
ヌクレオチド１μmol／分の形成を触媒する酵素の量と
して定義される。対照と比較して神経毒性指標物質レベ
ルが下降すれば、活性が示される。

【００５３】〈アッセイ ４〉アミロイド沈着物を形成
することができるＶＶ:９９またはＶＶ:４２を感染させ
た細胞［ＷＯ ９１／０４３３９に記載、１９９１年４
月４日公開，引用によって本明細書に包含される］を９
６ウェルのマイクロタイタープレートに入れる。希釈や
添加を適切に行うため、試験すべき式Ｉで示される化合
物を細胞へ加えるのに、自動ピペッターを使用する。組
織培養インキュベーター中、種々の濃度範囲の化合物を
細胞と共に、あらかじめ決められた時間、あるいはま
た、３〜７２時間、３７℃でインキュベートする(もし
くはあらかじめインキュベートしておく)。

【００５４】インキュベーションした後、培養培地を取
り除き、以下のようにして、細胞をプレアミロイド測定
のために調製する。細胞を免疫細胞化学染色のためにア
ミロイド抗体を用いて固定する。第一抗体を加えた後、
標識した第二抗体と共にインキュベーションし、エリザ
(ＥＬＩＳＡ)プレート読み取り機を用いて、第一抗体と
第二抗体との結合レベルを測定し、標識抗体の光学密度
を記録する。被験薬が存在していない状態で増殖した対
照試料の細胞と比較して、より小さな吸光度が読み取ら
れるなら、これは、その薬物のアミロイド沈着抑制能を
表す。こういった手順は、相関関係のある酵素マーカー
を用いて、プレアミロイドの溶解が検出できるように改
変することができる。対照と比較してプレアミロイド測
定値が減少すれば、式Ｉで示される化合物の活性が示さ
れる。

【００５５】試験方法 臨床試験を行うために、５〜５０人の女性を選ぶ。女性
は閉経期後、すなわち試験開始の６〜１２カ月前に月経
が止んでいる者であり、初期のアルツハイマー病(ＡＤ)
であると診断され、試験期間内にＡＤの症状が悪化する
と予期されるが、その他の点では、全身の健康状態は良
好である。試験にはプラセボ対照グループが存在する。
すなわち女性を２つのグループに分け、一方のグループ
には本発明の活性物質を与え、もう一方のグループには
プラセボを与える。患者は、記憶、認識、推理、および
ＡＤに伴う他の症状を基準とする。試験グループの女性
には、１日５０〜２００mgの活性物質を経口経路で与え
る。こういった治療を６〜３６カ月続ける。両グループ
で基準となる症状に関して正確に記録し続け、試験が終
わったら、これらの結果を比較する。結果は、各グルー
プのメンバー間で共に比較し、また試験を開始する前に
各々の患者より報告された症状と各々の患者に関する結
果を比較する。被験薬を服用した患者における、一つま
たはそれ以上のＡＤに関する症状の抑制により、被験薬
の活性が示される。

【００５６】少なくとも一つの上記アッセイにおける活
性により、式Ｉで示される化合物の有用性が実証され
る。

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 過剰のアミロイド形成タンパクが関与す
   る生理的障害を抑制するのに適した医薬組成物であっ
   て、式 【化１】 で示される化合物または製薬的に許容し得るそれらの塩
   もしくは溶媒和物を活性成分として含有する医薬組成
   物。
2. 【請求項２】 該化合物が 【化２】 またはその塩酸塩である、請求項１に記載の医薬組成
   物。
3. 【請求項３】 アミロイド形成タンパクの産生を抑制す
   るのに適した医薬組成物であって、式 【化３】 で示される化合物または製薬的に許容し得るそれらの塩
   もしくは溶媒和物を活性成分として含有する医薬組成
   物。
4. 【請求項４】 該化合物が 【化４】 またはその塩酸塩である、請求項３に記載の医薬組成
   物。
5. 【請求項５】 アミロイド斑の沈着を抑制するのに適し
   た医薬組成物であって、式 【化５】 で示される化合物または製薬的に許容し得るそれらの塩
   もしくは溶媒和物を活性成分として含有する医薬組成
   物。
6. 【請求項６】 該化合物が 【化６】 またはその塩酸塩である、請求項５に記載の医薬組成
   物。
7. 【請求項７】 アルツハイマー病を抑制するのに適した
   医薬組成物であって、式 【化７】 で示される化合物または製薬的に許容し得るそれらの塩
   もしくは溶媒和物を活性成分として含有する医薬組成
   物。
8. 【請求項８】 該化合物が 【化８】 またはその塩酸塩である、請求項７に記載の医薬組成
   物。