KR100609381B1

KR100609381B1 - 인지 장애 치료방법

Info

Publication number: KR100609381B1
Application number: KR1020047014635A
Authority: KR
Inventors: 그레이그나이젤; 브루인스마고쎄
Original assignee: 액소닉스, 아이엔씨.; 거번먼트 오브 더 유나이티드 스테이츠 오브 어메리카, 애즈 리프리젠티드 바이 더 시크리터리 오브 더 디파트먼트 오브 헬쓰 앤드 휴먼스 서비시스
Priority date: 2002-03-22
Filing date: 2003-03-18
Publication date: 2006-08-08
Also published as: HRP20040992A2; WO2003082270A1; AU2003230683B2; MXPA04009136A; BR0306855A; EP1490057A1; NO20044530L; RU2280449C2; CN1642541A; PL372315A1; RU2004131214A; CA2476923A1; NZ534726A; EP1490057A4; KR20040101319A; JP2005526806A; US20040024043A1; IL163993A0; AU2003230683A1

Abstract

(+)9-N-페닐 카르비놀 에세롤린을 활성성분으로서 포함하는, 알츠하이머병과 같은 인지 장애로 인한 질병의 치료에 사용되는 조성물과 치료방법을 제공한다.

Description

인지 장애 치료방법{Method for treating cognitive disorders}

본 발명은 알츠하이머병과 같은 인지 장애로 인한 질병을 치료하여 그로 인한 영향을 완화시키고 그러한 질병의 진행 속도를 늦추기 위한 방법에 관한 것이다.

과거에는 알츠하이머병과 같은 인지 장애를 치료하는데 유용한 화합물로서 아세틸콜린에스테라제 저해제로서의 활성을 기본으로 하는, 미국 특허 제5,409,948호에 개시된 바와 같은 도네페질(donepezil), 리바스티그민(rivastigmine) 및 갈란타민(galanthamine)이 거론되었다. 이와 더불어, 다른 아세틸콜린에스테라제 저해제인, 하기 화학식(I)의 구조를 갖는 펜세린, 네가티브 광학 에난티오머 (-)N-(-)-N 페닐 카르바모일에세롤린과 그의 염이 인지 장애 치료에 임상적으로 사용되고 있다.

[화학식 I]

이들 화합물은 모두 안티콜린에스테라제 저해제이기 때문에 아세틸콜린에스테라제 저해제로서의 활성에 의해 야기되는 바람직하지 않은 부작용을 일으킨다는 심각한 결함을 가지고 있다. 이러한 바람직하지 못한 부작용은 아세틸콜린에스테라제의 억제에 의해 야기되는 독성과 관련이 있다. 장기 투여되는 이들 화합물은 낮은 치료율 (즉, 독성과 치료 효과 간의 비율)을 갖기 때문에 활성 상태의 콜린 작용성과 관련이 있는 수많은 병적 상태를 발생시킨다. 따라서, 장기간의 치료를 요하는 인지 장애 치료의 특성상 효과적이면서 아세틸콜린에스테라제 저해제의 사용으로 인한 유해한 부작용을 일으키지 않는 약제의 제공이 오랫동안 소망되어 왔다.

발명의 개요

본 발명에 따르면, 하기 화학식(Ⅱ)의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염이 알츠하이머병과 같은 인지 장애 및 노화와 관련된 인지력 손상을 갖는 환자들을 아세틸콜린에스테라제 저해제의 유독성 프로파일에 의해 야기되는 부작용 없이 치료하는데 사용될 수 있다는 것을 발견하였다.

본 발명은 상기 화학식(Ⅱ)의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 경구 투여하여 인지 장애를 갖는 환자를 치료하는 방법, 및 그러한 화합물 또는 염을 환자에게 투여하기 위한 조성물에 관한 것이다.

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발명의 상세한 설명

본 발명에 따르면, 화학식(Ⅱ)의 화합물과 그의 약학적으로 허용가능한 염이 인지 장애를 앓고 있는 환자의 치료에 효과적이며, 펜세린, 리바스티그민, 도네페질 및 갈란타민과 같은 화합물과 관련된 안티콜린에스테라제 활성에 의해 야기되는 유해한 부작용 없이 환자에게 경구투여될 수 있다는 것을 발견하였다. (+)9-N-페닐카르비놀 에스롤린인 화학식(Ⅱ)의 화합물이 펜세린의 비자발적 (+) 이성체인 화학식(I)의 화합물이고 최소한의 안티콜린에스테라제 활성을 갖는다는 사실에 비추어볼 때 본 발명의 발견은 특히 놀랄만한 것이다. 사실 화학식(I)의 화합물과 그의 염은 펜세린과는 달리 매우 약한, 그렇지 않으면 소정의 안티콜린에스테라제 저해제 활성을 갖는다. 따라서, 안티콜린에스테라제 제제가 투여될 때 나타나는 오심, 구토, 어지럼증, 서맥 등과 같은 유해한 작용이 본 발명의 방법을 사용하면 나타나지 않는다.

본 발명에 따르면, 펜세린의 (+) 에난티오머는 노화와 관련된 인지력 손상 또는 알츠하이머병의 진행을 억제하는 강력한 억제제라는 사실을 발견하였다. 화학 식(Ⅱ)의 화합물이 참고문헌 [Pei, Greig, et al. Article entitled "Inhibition of Human Acetycholinesterase" Med Cem Resarch Acad.(1995) 5: 265-270]에 개시되어 있다. 이 논문에는, 화학식(Ⅱ)의 화합물이 네가티브 에난티오머 펜세린과는 달리 인간 아세틸콜린에스테라제의 억제제로서의 작용이 훨씬 덜 하다고 개시하였다. 그러나, 이러한 개시에도 불구하고, 본 발명에 따르면, 화학식(Ⅱ)의 화합물이 잠재적으로 독성인 아밀로이드-β 펩티드(Aβ)의 농도를 감소시키는데 강력하다는 것과, 이러한 Aβ 단백질은 Aβ와 신경원섬유 엉김 덩어리로 주로 이루어진 노인반(senile plaques)의 형태로 특징지워지는 기억상실을 유발하는 점진적인 신경변성 상태를 감소시킨다는 것을 발견하였다. Aβ는 695-770개의 잔기를 포함하는 더 큰 단백질인 단백질 βAPP로부터 유래된 40- 내지 42개의 잔기를 갖는 펩티드이다. βAPP는 인지력 손상의 병리학적 특징을 일으킬 수 있는 Aβ 단백질로 전환된다.

본 발명의 일부로서, 화학식(Ⅱ)의 화합물과 그의 약학적으로 허용가능한 염을 펜세린과 마찬가지로 βAPP 단백질을 조작하여 비아밀로이드성 부산물을 생성함으로써 Aβ 단백질의 생성을 감소시킬 수 있다는 것을 발견하였다. 화학식(Ⅱ)의 화합물은 그의 네가티브 에난티오머 펜세린과는 달리 강력한 안티콜린에스테라제 억제제가 아니라는 사실에 비추어볼 때, 안티콜린에스테라제 저해 활성에 의해 유발되는 부작용을 일으키지 않는다. (+)에난티오머 형태가 아세틸콜린에스테라제의 매우 강력한 억제제가 아니라는 것은 참고문헌 [Shaw, et al., publication Proc.Natl.Academy Science USA(2001) 98(13, 76057610)]에 보고된 결과로부터 알 수 있는데, 상기 참고문헌에는 "아세틸콜린에스테라제 활성을 50% 저해하는데 필요한 화합물의 농도는 (-)-펜세린의 경우에는 22nM이었고, 반면 (+)-펜세린의 경우에는 >25,000nM에서 불활성이었다"라고 서술되어 있다. 따라서, Shaw 등의 공개에 개시된 방법과 결과에 의하면, 화학식(Ⅱ)의 화합물과 그의 염은 펜세린의 네가티브 에난티오머와는 달리 아세틸콜린에스테라제에 대하여 효과적인 저해제가 아니다.

본 발명에 따르면, 화학식(Ⅱ)의 (+) 에난티오머는 알츠하이머병, 인지력 손상과 관련된 다른 임의의 치매를 포함하여 연령-관련 기억력 손상에서 최소한의 인지력 손상을 치료하는데 효과적이다. 또한, 다른 인지력 손상 치료제를 사용하는 경우와는 달리, 화학식(Ⅱ)의 화합물과 그의 염은 안티콜린에스테라제 활성을 결여하고 있기 때문에 더 효과적이고 오심, 설사, 구토, 어지럼증 및 서맥과 같은 안티콜린에스테라제 저해제와 관련된 유해한 부작용을 갖지 않는다. 화학식(Ⅱ)의 화합물 및/또는 그의 염이 콜린에스테라제에 영향을 미치지 않기 때문에 본 발명의 화합물을 유해한 부작용의 위험성이 없이 치료시에 양호한 결과를 달성하는 정도의 고용량으로 환자에게 투여할 수 있다.

본 발명의 치료방법은 노화 또는 알츠하이머병과 관련된 인지력 손상 및 증상을 나타내는 질병 상태를 갖는 환자에 관한 것이다. 환자가 그러한 인지력 손상을 앓고 있는 경우에는 이러한 증상이 알츠하이머병 또는 노화 과정에 직접적으로 기인하는 것인지를 명확하게 진단하는 것이 어렵다. 따라서, 본 발명의 방법은 환자 중에서도 특히 노화 또는 알츠하이머병과 관련된 인지력 손상 증상을 나타내는 질병 상태에 있는 50세 이상의 환자에게 적용가능하다.

치료를 위한 용량은 통상 투여 경로, 연령, 체중, 치료해야 할 환자의 인지력 손상 상태에 따라서 달라진다. 통상, 화학식(Ⅱ)의 화합물 및/또는 그의 염을 하루에 0.5㎎/㎏ 내지 10㎎/㎏의 용량으로 환자에게 경구투여했을 때 유익한 효과가 얻어진다. 본 발명에 따르면, 일일 경구투여량이 1.0㎎/㎏ 내지 5.0㎏일 때 대체로 바람직하고, 1㎎/㎏ 내지 2㎎/㎏일 때 특히 바람직하다. 화학식(Ⅱ)의 화합물 및/또는 그의 염을 전술한 바와 같은 용량 수준으로 하루에 1 내지 4회 경구투여할 수 있다. 알츠하이머병과 같은 인지 장애 또는 다른 연령-관련 인지력 손상의 치료는 환자의 평생에 걸쳐 장기간 치료 (즉, 지속적인 치료)를 필요로 한다는 점을 염두에 두는 것이 중요하다. 이 방법에 의하면, 인지 장애로부터의 인지력 손상 및 그러한 인지력 손상 증상으로 인한 증세 악화가 안정화되거나 경감되고, 어떤 경우에는 개선될 수도 있다. 그러한 질병을 유발하는 인지 장애는 환자의 평생에 걸쳐 진행된다. 본 발명의 치료방법에 의하면 이러한 인지 장애의 진행이 방지된다. 따라서, 본 발명의 방법은 이러한 질병 상태의 진행을 감소시키는 수단을 제공한다.

화학식(Ⅱ)의 화합물 및/또는 그의 염의 인지 능력 개선 작용은 여러 가지 공지된 방법으로 평가될 수 있다. 그중에서 질병 상태의 진행을 측정하기 위한 표준 테스트(예를 들면, Mini, Mental State Examination and the Clinical Dementia Rating 및 Alzheimer's Disease Assessment Scale(ADAS-cog))가 있다. ADAS-cog는 기억력, 방향성, 유지력, 추리력, 언어구사력 및 응용력 등의 요소들을 포함하는 인지 능력을 측정하는 멀티 아이템 측정법이다. ADAS-cog 점수는 0에서 70까지로 부여되는데, 점수가 높은수록 인지력 손상인 것을 나타낸다. 초로의 정상인의 경우 에는 점수가 0 내지 1로 낮지만, 치매에 걸리지 않은 성인이면 점수가 좀 더 높더라도 비정상인 것은 아니다. ADAS-cog 테스트에 의한 측정에서, 치료 전과 치료중의 장기간에 걸친 변화를 측정해서 질병의 진행 여부를 확인하고 치료받지 않은 환자와의 등급을 비교한다. 본 발명의 방법에 따라서 치료된 환자의 경우, 치료 도중에 이 환자는 테스트에 따른 점수가 치료받지 않은 환자에 비하여 동일하거나 더 양호하다는 것을 발견하였다. 본 발명의 방법은 CIBIC 테스트(Clinical Interview Board Impression Of Change)에 의해 전반적인 결과를 임상적으로 나타낼 수 있는 능력을 평가할 수 있다. 이 테스트는 환자를 인터뷰하고 환자의 일반적인 인지 기능, 행동 기능 및 매일의 활동과 같은 환자의 기능을 테스트하는 의사를 포함하여 환자를 돌보는 사람들로부터 결과를 취합한다. CIBIC 점수는 현저하게 개선된 것을 나타내는 1점에서 아무 변화가 없음을 나타내는 4점, 현저하게 악화된 것을 나타내는 7점에 이르기까지 7개 등급의 점수로서 표시된다. 본 발명에 따른 치료가 이루어지는 동안 대부분의 환자는 4점을 받았고, 일부는 더 좋은 평가(즉, 더 낮은 점수)를 받았다. 한편, 동일한 시기에 동일한 평가를 받았으나 치료를 받지 않은 환자와 관련해서는, 대부분의 환자가 상태 악화를 나타내는 높은 점수(즉, 4점보다 높은 점수)를 받았다.

화학식(Ⅱ)의 화합물은 하기의 반응 도식을 통해 (+)에세롤린에 의해 생성된다.

식중, R¹은 페닐이다.

본 발명의 방법에 따르면, 수성 반응 매질에서, 화학식(Ⅲ)의 피소스티그민 화합물을 알칼리 금속 수산화물로 가수분해하는 반응에 의해 화학식(Ⅲ) 또는 그의 염으로부터 화학식(Ⅳ)의 (+)에세롤린 화합물을 형성한다. 수성 반응 매질로부터 화학식(Ⅳ)의 에세롤린 화합물을 순수한 형태로 분리한다.

이어서, 정제된 에세롤린을, 수혼화성 유기 용매를 포함하는 무수 반응 매질에서 강유기염기로 처리한다. 처리된 에세롤린 화합물을 상기 반응 매질로부터 분리하지 않고 화학식(Ⅴ)의 이소시아네이트와 반응시킨다. 이 반응은 화학식(Ⅴ)의 이소시아네이트 화합물을 상기 반응 매질에서 에세롤린 화합물과 혼합하여 상기 화 학식(Ⅱ)의 에난티오머를 형성함으로써 실시된다. 이어서, 물을 첨가해서 반응을 퀸칭함으로써 화학식(Ⅲ)의 (+)펜세린 화합물이 순수한 형태로 쉽게 분리되도록 한다. 첨가시에는, 물을 반응 혼합물에 첨가하거나 반응 혼합물을 물에 첨가할 수 있다. 통상, 반응 혼합물을 물에 첨가하는 것이 바람직하다.

본 발명에 따르면, 화학식(Ⅱ)의 화합물의 약학적으로 허용가능한 산부가염을 본 발명의 치료방법 및 조성물에 사용할 수 있다. "약학적으로 허용가능한 염"이라는 용어는 산부가염을 의미한다. "약학적으로 허용가능한 산부가염"이라는 표현은 화학식(Ⅱ)의 화합물의 임의의 무독성 유기 또는 무기 산부가염을 의미하며, 바람직한 염은 타르트레이트염이다. 적절한 염을 형성하는 예시적인 무기산으로는 염산, 브롬화수소산, 황산, 및 소듐 모노하이드로겐 오르토포스페이트와 황산수소칼륨 같은 인산과 산금속염이 있다. 적절한 염을 형성하는 예시적인 유기산으로는 모노-, 디- 및 트리카르복실산이 있다. 그러한 산의 예로는, 아세트산, 글리콜산, 락트산, 피루브산, 말론산, 숙신산, 글루타르산, 푸마르산, 말산, 타르타르산, 시트르산, 아스코르브산, 말레산, 하이드록시말레산, 벤조산, 하이드록시벤조산, 페닐아세트산, 신남산, 살리실산, 2-페녹시벤조산, 및 p-톨루엔설폰산, 메탄설폰산 및 2-하이드록시에탄설폰산과 같은 설폰산이 있다.

본 발명에 따르면, 전술한 화학식(Ⅰ)의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염은 약학적으로 허용가능한 경구 또는 경피 투여에 유용한데, 경구 투여가 바람직하다. 본 발명에 따른 경구 투여 또는 경피 투여용 약학적 조성물은 상기 화학식(Ⅰ)의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 혼화성이 있는 약학적으 로 허용가능한 캐리어 물질과 함께 포함한다. 종래의 캐리어 물질이 사용될 수 있다. 캐리어 물질은 경구 또는 경피 투여하기에 적합한 유기 또는 무기 캐리어 물질일 수 있다. 적절한 캐리어로는 물, 젤라틴, 아라비아 고무, 락토스, 스타치, 스테아르산 마그네슘, 탈크, 식물성 오일, 폴리알킬렌-글리콜, 페트롤륨 젤리 등이 있다. 또한, 약학적 제제는 다른 약학적 활성제를 포함할 수 있다. 허용되는 약학적 조제 실무에 따라 향미제, 보존제, 안정화제, 유화제, 버퍼 등과 같은 추가의 첨가제를 첨가할 수 있다.

화학식(Ⅱ)의 화합물 및/또는 약학적으로 허용가능한 염을 단위 경구 용량 형태로 본 발명의 바람직한 구현예에 따라서 투여할 수 있다. 종래의 단위 경구 투여 형태중 임의의 것을 사용할 수 있는데, 바람직한 단위 투여 형태는 타블렛이나 캡슐이다. 약 20 내지 300㎎의 활성 성분을 포함하는 단위 경구 투여 형태를 사용함으로써 소망하는 효과를 달성하는데 필요한 하루 용량을 얻을 수 있는데, 특히 바람직한 것은 약 50 내지 150㎎의 활성성분을 포함하는 단위 경구 투여 형태이다. 캐리어 이외에도, 경구 투여 형태는 바인더, 붕해제, 활제 및 글리단트(glydant)와 같은 종래의 성분들을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명에 따르면 단위 경구 투여 형태의 제형화에 사용되는 종래의 방법중 어떤 방법이라도 사용가능하다.

약학적 제제는 타블렛, 캡슐, 필, 파우더, 그래뉼 등과 같은 경구 투여용 고형제를 포함하는 종래의 임의의 단위 경구 투여 형태로 만들어질 수 있다. 약학적 제제는 멸균될 수 있고 / 있거나, 보존제, 안정화제, 습윤제, 유화제, 삼투압을 제공하는 염 및/또는 버퍼와 같은 보조제를 포함할 수 있다.

하기의 실시예를 들어 본 발명을 더 설명할 것인데, 이들 실시예는 본 발명의 설명을 위한 것일뿐이며 그로써 한정하기 위한 것이 아니다.

실시예 1

아르곤 분위기 하에, 45℃에서, 50wt%의 수산화나트륨 용액(67.7g, 0.8462몰)을 탈기된 탈이온수(D.I.Water)(300㎖) 중의 피소스티그민 살리실레이트의 (+) 에난티오머(100g, 0.2418몰)의 슬러리에 적가한다. 적가하는 동안 온도는 45 내지 55℃로 유지한다. 45℃에서 3시간 경과후, 황색 용액을 25 내지 30℃로 냉각시키고, tert-부틸메틸에테르(300㎖)을 첨가한다. 소듐메타비설파이트(54g, Na₂S₂O ₅, 250㎖의 물)의 수용액을 첨가하여 수성상의 pH를 9.1로 조절한다. 이 혼합물을 30분 동안 교반하고, 상을 정치시킨 다음, 분리한다. 수성상을 30분 동안 2회 추출하는데, 각각 tert-부틸메틸에테르(300㎖씩)로 추출한다. 유기상을 합하고 20wt% 염화나트륨 용액으로 3회(매회 200㎖) 세척한 다음, 황산마그네슘(150g) 상에서 밤새 건조한다. 셀라이트를 통해 슬러리를 여과하고, 필터 케이크를 tert-부틸메틸에테르로 세척한다. 여과물을 진공하에 25 내지 29in에서 300㎖로 농축한 다음, 잔류물을 디에톡시메탄으로 2회(매회 300㎖)로 공증류(co-distilation)한다. 잔류물을 디에톡시메탄(300㎖)으로 희석한 다음, 50℃로 가열한다. 얻어진 밝은색의 슬러리를 5℃로 냉각시키고 45분 동안 교반한 다음, 약 300㎖로 농축한다. 차가운 헵탄(300㎖)을 적가하고, 슬러리를 20분 동안 교반한 다음, 차가운 헵탄(125㎖)을 가하여 부피를 증가시킨다. 약 2시간 동안 교반후, 슬러리를 부쉬너 펀넬을 통해 여과한다. 수거된 고형물을 차가운 헵탄(200㎖)으로 세척한 다음, 진공하에서 밤새 건조한다. (+)에세롤린 염기(35.6g)을 백색 고형물로서 수득한다 (수율: 67.4%, 순도: 98.3%).

실시예 2

아르곤 분위기 하에서, (+)에세롤린 에난티오머(50g, 0.229몰)을 400㎖의 무수 디메톡시에탄에 용해시킨다. 헥산(6.4㎖, 16몰) 중의 2.5M n-부틸리튬 촉매량을 1분내에 가하고 용액을 10분 동안 교반한다. 페닐 이소시아네이트(27.269g, 0.2286몰)를 32분에 걸쳐서 가하는데, 이때 온도를 20 내지 23℃로 유지한다. 반응 용액을 실온에서 2시간 20분 동안 교반한 다음, 첨가 펀넬로 옮긴다. 반응 용액을 격렬한 교반하에 49분에 걸쳐서 탈이온수(630㎖)와 디메톡시에탄(42㎖)의 혼합물에 첨가한다. 얻어진 슬러리를 30분 동안 교반한 다음, 부쉬너 펀넬(와트만 여과지 #3)을 통해 여과한다. 고형의 잔류물을 탈이온수로 4회(매회 100㎖) 및 헵탄으로 1회(100㎖) 세척한 다음, 45℃ 및 >29 인치의 배큠에서 9시간 동안 건조시킨다. N-페닐 카르본아모일 에세롤린의 (+)에난티오머(74.4g)을 적색 고형물로서 수득한다 (수율: 96.2%, 순도: 95.1%).

실시예 3

아르곤 분위기하에, 무수 에탄올(131㎖)과 탈이온수(3.3㎖)의 혼합물 중의 타르타르산(17.12g, 0.114몰)의 용액을 전술한 바와 같이 제조된, 무수 에탄올(126㎖)과 탈이온수(3.1㎖)의 혼합물 중의 N-페닐 카르바노일 에세롤린의 (+)에난티오 머의 슬러리에 32분에 걸쳐서 첨가한다. 약 60 내지 75%의 타르타르산 용액을 첨가한후, 반응 용액에 펜세린 타르트레이트(72㎎)을 살포한다. 반응 혼합물을 실온에서 19시간 15분 동안 교반한 다음, 이소프로판올(490㎖)과 물(12㎖)의 혼합물을 30분에 걸쳐서 첨가한다. 슬러리를 3.5시간 동안 교반하고, 부쉬너 펀넬(와트만 여과지 #3)을 통해 여과한다. 백색 잔류물을 이소프로판올(100㎖)로 2회 세척한 다음, 45℃ 및 29인치의 배큠에서 19시간 동안 건조하여 N-페닐 카르바노일 에세롤린 타르트레이트의 (+)에난티오머의 타르타르산염(38.62g)을 수득한다 (수율: 76%, 순도: 99.4%, 백색 고형물).

실시예 4

실시예 2에서 제조된 화학식(I)의 (+)에난티오머를 β-APP 농도를 조절하는 것에 관해서 그의 펜세린, 및 참고문헌 [Shaw et al. Proc. Nat. Acad. Sci. USA(2001), 98(13), 7605-7610]에 개시된 대로 β-APP-단백질로부터 유도되는 결과물인 유해한 아밀로이드 단백질(Aβ 단백질)에 대하여 테스트하였다. 제7506면과 제7507면에는, 후술하는 테스트에 펜세린의 (+)에난티오머는 물론 펜세린 자체도 포함시켜서 펜세린과 그의 (+) 에난티오머가 β-APP 및 Aβ-단백질을 감소시킴에 있어 그의 효과를 차례로 테스트하도록 하는 것을 제외하다. 이 테스트들을 실시하기 위한 Shaw 등의 방법을 하기에 요약한다.

드러그 처리: SK-N-SH 신경모세포종 세포를 3 x 106 셀의 농도로 60㎜ 디쉬에 배양하고, SH-SY-5Y 신경모세포종 세포를 3 x 105 셀의 농도로 100㎜ 디쉬에 놓았다. 이 세포들이 70% 컨플루언스(confluence)에 도달할 때까지 세포들을 완전배 지(10% FSB, DMEM 중의 2mM 글루타민)에서 3 내지 4일간 성장시켰다. 실험을 시작하기 위해, 소모된 배지는 제거하고 0, 5 또는 50μM의 (-) 또는 (+) 펜세린을 포함하는 새로운 배지(DMEM + 0.5% FBS)로 교체하여 세포를 37℃, 5% CO₂에서 소정 시간 동안 인큐베이트하였다.

용해물(lysate) 제조: 매 시점에서, 소비된 배지를 수거하여 후속하는 분비성 βAPP 농도의 분석이 이루어지는 동안 -70℃에서 보관하였다. 셀 용해물을 참고문헌[Lahiri et al., 1997 및 1998]에 이미 보고된 바 있는 방법으로 제조하였다. 상등액의 단백질 농도를 브래드포드 프로테인 분석(Bradford protein assay: BioRad, Mellville, NY)에 따라 분석하였다.

웨스턴 블롯 : 각 샘플로부터 얻은 15㎍의 단백질을 ₁X NuPAGE MOPS SDS 러닝 버퍼중의 10% NuPAGE Bis-Tris 겔(NOVEX, San Diego, CA) 상에 놓고, 200V에서 45분 동안 단백질을 분리하였다. 이어서,이 겔을 25V에서 1.5시간 동안 니트로셀룰로스 상으로 옮겼다. 비특이적 바인딩을 차단하고, 각 블롯을 ₂₂C₁₁ 안티-βAPP N-말단 항체(2.5㎍/㎖, Boehringer Mannheim, Indianapolis IN) 또는 안티-활성화 ERK 항체(25ng/㎖, Promega, Madison, WI)중 하나로 2시간 동안 프로빙하였다. 홀스 래디쉬 퍼옥시다제에 콘쥬게이트된 안티-마우스 Igg 또는 안티-래빗 IgG를 2차 항체로서 사용하였다. Ponceau S 염색(Sigma, St. Louis, MO)에 의해 샘플의 등량 로딩을 확인하였다. CD 카메라와 NIH-IMAGE(version 4.1)을 이용하여 블롯의 화학발광의 사진농도 정량분석을 실시하였다.

용해물 디하드로게나제 분석: 전술한 참고문헌[Lahiri et al., 1997 및 1998)]에 따라서, 컨디셔닝된 배지 중의 락테이트 디하이드로게나제(LDH) 방출량을 측정하여 셀의 생존성과 보존성을 나타낸다.

A β 전체 농도 분석: SH-SY-₅Y 및 SK-N-SH 배양 샘플 중의 Aβ 펩티드 전체 농도를 민감성 ELISA (Suzuki et al., 1994)에 의해 분석하였다. Aβ 펩티드 Aβ1-40 및 Aβ1-42의 모든 종에 대한 캡쳐 항체인 1-40 잔기의 Aβ에 대한 래빗 폴리클론성 항체, 및 17-25 잔기의 Aβ에 대한 모노클론성 항체를 이용한 샌드위치 면역분석을 이용하여 Aβ 펩티드 농도를 검출하고, 그 값을 6개의 독립적 분석의 평균값으로서 표시하였다.

결과

이 테스트의 결과는, βAPP농도 감소는 시간 간격을 다양하게 하면서 펜세린을 0.5μM 내지 50μM의 여러 농도로 이용하여 측정한 대조군인 것으로 판명된다는 것을 하기에서와 같이 설명한다. 1) 대조군에 비하면, 고농도의 펜세린 사용으로 인해 SK-N-SH 셀 중의 βAPP 농도가 대조군에 비해 감소하였다. 모든 경우에, βAPP 단백질 농도는 16시간 후에도 펜세린 사용에 의해 감소하였다; 2) Aβ 단백질의 농도가 대조군, 특히 펜세린을 사용한지 10시간 후의 대조군 농도로부터 실질적으로 감소하였다; 3) 펜세린의 네가티브 거울상이성체(antipode) 및 포지티브 거울상이성체 모두가 대조군에 비해서는 물론이고 Aβ 단백질의 농도에 있어 βAPP 농도를 대조군의 그것보다 낮추는데 효과적이다. 따라서, 안티콜린에스테라제 활성을 결여하는 (+)-펜세린 거울상이성체는 β-APP 단백질 및 Aβ 단백질 상에서, SK-N-SH 셀에서 (-) 거울상이성체인 펜세린 자체로서 유사한 작용을 갖는다.

실시예 5

생체내 연구방법

i.p. 경로로 설치류에게 (-)-펜세린을 투여(등장성 염수에서 1㎖/㎏)함에 있어서, 5㎎/㎏의 용량에서 미세한 경련이 감지된다. 이것은 전형적인 중추 (즉, 뇌)의 콜린작동성 과도 자극(오버드라이브) 효과이다. 그러한 경련이 약 1시간 동안 지속되었다. 경련은 말초의 과도-자극 증세(구체적으로는, 유루 및 타액 분비)와 함께 7.5㎎/㎏ (-)-펜세린의 용량에서 나타났다. 20㎎/㎏ (-)-펜세린 용량에서는, 설치류가 심한 경련과 말초의 부작용 (특히, 타액 분비: 호흡 곤란을 일으킴)에 의해 무기력하게 되었고, 5마리 동물중 2마리는 빈사상태에서 사망하였다. 그러나, 동일한 20㎎/㎏ 용량이 투여되더라도 (+)-펜세린이면 동물들에게는 아무런 증상이 전혀 나타나지 않았다 (심지어는 미세한 경련이나, 비히클 처리동물과 미처리 동물 모두에서와 유사한 외형상의 특징도 나타나지 않음).

결과: 생체내 연구

(-)-펜세린은 안티콜린에스테라제로서 작용함으로써 설치류(는 물론 사람)에서 학습과 수행능력을 증진시켜서 알츠하이머 뇌에서는 결핍된 콜린작동성 신경전 달물질인 아세틸콜린의 농도를 증가시킨다. 신경전달물질인 아세틸콜린은 뇌 외부에서 각종 기능, (미주 신경을 통한) 심장박동의 조절, 위액 이동, 발한, 타액분비, 유루 등의 기능을 갖는다. 이러한 작용의 자극뿐 아니라 뇌의 콜린작동성 시스템의 과도-자극을 통해 전형적인 안티콜린에스테라제(예를 들면, 안티콜리에스테라제 드러그: 리바스티그마인 및 갈라타민뿐 아니라 고용량의 펜세린)의 독성을 일으킨다. 한편, 전술한 바로부터 알 수 있듯이, (+)-펜세린은 안티콜린에스테라제 활성을 결여하고 있으므로 콜린성 작용도 부족하다. 따라서, (-)-펜세린보다 다량 투여될 것이다.

실시예 6

활성 성분으로서 화학식 I의 화합물의 타르트레이트염("활성성분")을 이용하여 캡슐을 제조한다:

㎎당 함량

활성성분 50.0

미세결정질 셀룰로스 NF(Avicel, PH101) 165.9

소듐 스타치 글리콜레이트 NF(Primojel) 9.0

약 260㎎의 캡슐 필의 실중량

실시예 7

1. 100㎎, 활성성분을 포함하는 경질 젤라틴 캡슐:

조성: 캡슐 하나의 함유량 ㎎당 함량

활성성분 90.0

젤라틴 블룸 30(Gelatine Bloom 30) 70.0

말토덱스트린 MD 05 108.0

dl-a-토코페롤 2.0

아스코르빈산 나트륨 10.0

미세결정성 셀룰로스 48.0

스테아르산 마그네슘 2.0

(캡슐 함량 중량) 260.0

제조법:

활성성분을 젤라틴, 말토덱스트린, dl-a-토코페롤 및 아스코르빈산 나트륨의 용액에 넣어 습식 밀링한다.

습식 밀링된 현탁액을 스프레이 건조한다.

스프레이 건조된 분말을 미세결정질 셀룰로스 및 스테아르산 마그네슘과 혼합한다.

이 혼합물 각 260㎎을 적절한 크기와 색상의 경질 젤라틴 캡슐에 채운다.

실시예 8

2. 150㎎, 활성성분을 포함하는 타블릿 :

조성:

타블릿 커넬 (tablet kernel):

㎎당 함량

활성성분 150.0

무수 락토스 130.5

미세결정질 셀룰로스 80.0

dl-a-토코페롤 2.0

아스코르빈산 나트륨 10.0

폴리비닐피롤리돈 K30 5.0

스테아르산 마그네슘 2.5

(커넬 중량) 250.0

필름 피복:

하이드록시프로필 메틸셀룰로스 3.5

폴리에틸렌글리콜 6000 0.8

탈크 1.3

산화철, 황색 0.8

이산화티탄 0.8

(필름 중량) 7.4

제법:

활성성분을 무수 락토스 및 미세결정질 셀룰로스와 혼합한다.

이 혼합물을 폴리비닐피롤리돈, dl-a-토코페롤 및 아스코르빈산 나트륨의 용액/분산액과 함께 물에서 과립화한다.

이 과립 물질을 스테아르산 마그네슘과 혼합하고 중량이 250㎎인 커넬로서 압착하였다.

전술한 바와 같은 조성의 용액/분산액으로 커넬을 필름 코팅한다.

실시예 9

이 실시예는 타트타레이트염인 화학식(I)의 (+) 에난티오머의 약효를 측정할 수 있는 방법을 나타낸다.

알츠하이머병(PAD)에 의해 유발된 것과 유사한 증세를 갖는 것으로 진단된 60명의 환자에게 (+)-펜세린 타르트레이트 또는 실시예 6에서와 같은 제제를 12주에 걸쳐 매일 투여한 후 그 약효를 측정함으로써 임의 선택된 이중맹 프라시보-제어 연구를 실시하였다. 이 연구에서, 60명의 유자격 환자 전부는 제1 국어가 영어이며, 연령 분포가 50 내지 85세인 남성 및 여성 환자로 이루어져 있다.

연구 계획

전반적인 연구 디자인

개요

40명의 환자에게 2주 동안 PT와 50㎎ BID 용량을 투여하고 그 용량이 100㎎ BID로 상승할 때에 마지막 10주 동안 유지될 것이다. 동시에, 플라시보 약물이 배정된 20명의 환자에서 연구기간인 12주 동안 맞춤형 플라시보 캡슐을 투여한다. 충분한 숫자의 잠재적 환자를 스크리닝하여 60개의 유자격 케이스로 등록시킨다.

모든 연구 참여자들을 연구전에 측정(제1 농도)하고 하기의 표준 약효 테스트를 실시하는 중에도 주기적으로 측정하였다.

- NPI (Neuropsychiatric Inventory)

- CGIC(Clinician's Global Impression of Change)

- ADAS-cog (알츠하이머병 분석 스케일 - 인지력 서브스케일)

- MMSE(Mini-Mental State Exam)

- CANTAB(Cambrige Neuropsychological Test Automated Battery)

- ADCS-ADL(Activities of Daily Living)

12주간의 테스트 종반부에, 치료군의 환자들은 상기 테스트 모두에 대하여 치료하기 전의 제1 농도 이상의 농도를 유지한다. 환자의 약 30%에서는 12주간의 기간중 말기에 이 농도가 향상된다. 한편, 치료되지 않은 환자에 대해서는, 상기 테스트에 의해 측정한 제1 농도보다 더 개선되지 않았으며, 대조군에 있는 환자의 대부분은 상기 제1 농도보다 감소세를 나타낸다.

Claims

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하기 화학식(Ⅱ)의 화합물 및 그의 약학적으로 허용가능한 염으로 이루어진 군으로부터 선택된 활성성분, 및 내부 투여(internal administration)용으로 적합한 약학적으로 허용가능한 캐리어를 포함하며, 상기 활성성분이 인지 장애의 진행을 지연시키기에 적합한 양만큼 존재하는 것을 특징으로 하는, 인지 장애 환자 치료용 조성물.

[화학식 Ⅱ]
제7항에 있어서, 상기 활성성분을 환자에게 경구투여하기에 충분한 0.5㎎ 내지 10㎎/㎏/1일의 양만큼 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제8항에 있어서, 상기 활성성분을 환자에게 투여하기에 충분한 1㎎ 내지 5㎎/㎏/1일의 양만큼 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
활성 성분인 하기 화학식(Ⅱ)의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염, 및 경구투여하기에 적합한 약학적으로 허용가능한 캐리어를 포함하며, 상기 활성성분을 20 내지 300㎎의 양만큼 포함하는 것을 특징으로 하는, 단위 경구 투여 형태인 조성물.

[화학식 Ⅱ]
제10항에 있어서, 상기 경구 투여형태가 타블릿 또는 캡슐인 것을 특징으로 하는 조성물.
제11항에 있어서, 상기 활성성분의 함량이 50㎎ 내지 200㎎인 것을 특징으로 하는 조성물.