KR101418545B1 - 카르복시 디하이드로 에보다이아민을 포함하는 퇴행성 신경계 뇌 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 퇴행성 신경계 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 화학식 1의 화합물을 포함함으로써, 종래 사용된 약학 조성물에 비해 물에 대한 용해도가 약 2,000배 이상 높아 생체이용율(bioavailability)이 매우 높으며, 활성산소 감소 효과 및 신경세포 보호 효과가 있어 감퇴된 기억력 증진에 유용할 뿐만 아니라, 베타 세크레타제의 활성을 저해하여 베타 아밀로이드 펩티드의 생성을 감소시킬 뿐만 아니라, 알파 세크레타제 활성을 증가시켜 베타 아밀로이드 펩티드의 생성을 근본적으로 억제할 수 있는 퇴행성 신경계 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

Description

카르복시 디하이드로 에보다이아민을 포함하는 퇴행성 신경계 뇌 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물 {PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR PREVENTION OR TREATMENT OF NEURODEGENERATIVE BRAIN DISEASES INCLUDING CARBOXY DEHYDRO EVODIAMINE}

본 발명은 퇴행성 신경계 뇌질환의 치료 또는 예방용 약학 조성물에 관한 것이다.

치매는 노령인구의 증가와 더불어 그 유병률이 증가하고 있는 질환으로서, 알츠하이머 질환이 가장 흔한 원인으로 알려져 있다.

알츠하이머 질환은 해마 및 피질부위에 아밀로이드 반(amyloid plaque) 및 신경섬유의 꼬임(neurofibrillar tangle)을 가지는 것을 조직학적 특징으로 하는 질환으로, 알츠하이머 질환의 병인론에서 원인 물질로 가장 중요하게 지적되는 것은 베타 아밀로이드 펩티드이다.

베타 아밀로이드 펩티드는 아밀로이드전구단백질이 베타 세크레타제와 감마 세크레타제에 의해 잘려져 생성된다. 그래서 이들의 활성이 높아지면 베타 아밀로이드 펩티드의 생성이 증가하게 되고 이는 알츠하이머 치매 질환과 밀접하게 관련이 되어 있다. 그러나 알파 세크레타제는 베타 아밀로이드 펩티드의 중간 부위를 잘라내게 되어 이의 활성이 증가하게 되면 오히려 베타 아밀로이드 펩티드의 생성이 줄어들게 된다. 정상인에서는 알파 세크레타제가 우세하여 베타 세크레타제에 의한 아밀로이드 베타 절단을 방해한다.

이러한 베타 아밀로이드 펩티드가 뇌 내에 축적되면 활성산소를 다량 생산하여 산화적인 손상을 일으켜 신경세포의 죽음을 일으킨다. 또한 베타 아밀로이드 펩티드는 과량의 세포 내 칼슘 축적을 일으켜 흥분 독성으로 세포사를 일으키기도 한다. 이러한 베타 아밀로이드 펩티드로 인한 신경세포의 죽음은, 특히 기억과 관련된 부위인 해마에서의 세포사는 치매의 대표적인 증상인 기억력 감퇴를 유발한다.

따라서 치매 치료제 개발에 있어서 근본적으로 이러한 베타 아밀로이드 펩티드를 줄이는 것이 필요하다. 그 노력의 일환으로 아밀로이드전구단백질로부터 베타 아밀로이드 펩티드를 생성시키는 베타 세크레타제라는 효소의 저해제가 개발되었다.

한국공개특허 특1997-0000234호에는 디하이드로 에보다이아민을 포함하는 알츠하이머 병에 의한 치매치료제가 개시되어 있다.

디하이드로 에보다이아민은 독성이 적고 장기 복용 시에도 부작용이 나타나지 않으며, 항아세틸콜린분해효소 억제제 기능을 하고, 활성산소 및 흥분성 뇌신경전달물질에 의한 신경세포사멸을 억제하여 기억력 개선에 효과가 있다(Park et al., Novel anticholinesterase and antiamnesic activities of dehydroevodiamine, a constituent of Evodia rutaecarpa. Planta Med 1996; 62(5): 405-9; Park et al., Dehydroevodiamine.HCl prevents impairment of learning and memory and neuronal loss in rat models of cognitive disturbance. J Neurochem 2000; 74(1): 244-53).

그러나 현재까지 개발된 약제들은 수용성이 낮고, 충분한 혈중 농도에 이르지 못하는 등의 문제가 있다.

한국공개특허 특1997-0000234

Park et al., Novel anticholinesterase and antiamnesic activities of dehydroevodiamine, a constituent of Evodia rutaecarpa. Planta Med 1996; 62(5): 405-9 Park et al., Dehydroevodiamine.HCl prevents impairment of learning and memory and neuronal loss in rat models of cognitive disturbance. J Neurochem 2000; 74(1): 244-53

본 발명은 약리 효과가 우수하며, 수용성이 현저히 개선되어 약물로서 이용가능성이 뛰어나며, 약리효과가 우수한 퇴행성 신경계 뇌질환의 치료 또는 예방용 약학 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

1. 화학식 1의 화합물을 포함하는 퇴행성 신경계 뇌질환의 치료 또는 예방용 약학 조성물:

[화학식 1]

(식 중, n은 1, 2 또는 3임).

2. 위 1에 있어서, 상기 퇴행성 신경계 뇌질환은 알츠하이머 치매, 파킨슨병, 루게릭병, 픽크병, 크로이츠펠트 야콥병, 헌팅톤병, 진행성 핵상마비, 척수소뇌 변성증, 소뇌 위축증, 다발성 경화증, 신경세포의 소실에 의해 발생하는 노인성 치매, 뇌졸중, 기억상실증 및 외상 후 스트레스 장애로 이루어진 군에서 선택되는 질환인 약학 조성물.

3. 위 1에 있어서, 알파 세크레타제 활성 증가 및 베타 세크레타제 활성 억제를 나타내는 약학 조성물.

4. 위 1에 있어서, p-당단백질 억제제 및 전사활성화 전사(Trans Activating Transcriptional) 펩티드로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 1종을 더 포함하는 약학 조성물.

5. 위 1 내지 4 중 어느 한 항의 약학 조성물이 나노리포좀, 나노미립자, 폴리(D-아르기닌) 및 나노덴드리머로 이루어진 군에서 선택되는 운반체 내부에 포함된 퇴행성 신경계 뇌질환의 치료 또는 예방용 약제.

6. 위 5에 있어서, 과립제, 산제, 시럽제, 액제, 현탁제, 정제, 캡슐제, 트로키제, 환제, 주사제, 경피흡수제, 로션제, 연고제, 첩부제, 카타플라즈마제, 페이스트제 또는 좌제로 제형화된 약제.

7. 위 5에 있어서, 상기 퇴행성 신경계 뇌질환은 알츠하이머 치매, 파킨슨병, 루게릭병, 픽크병, 크로이츠펠트 야콥병, 헌팅톤병, 진행성 핵상마비, 척수소뇌 변성증, 소뇌 위축증, 다발성 경화증, 신경세포의 소실에 의해 발생하는 노인성 치매, 뇌졸중, 기억상실증 및 외상 후 스트레스 장애로 이루어진 군에서 선택되는 질환인 약제.

8. 화학식 2의 화합물을 N-알킬레이션시키는 제1 단계; 제1 단계에서 얻어진 화합물을 산화시키는 제2 단계; 및 제2 단계에서 얻어진 화합물에 나트륨을 포함하는 염기를 가하는 제3 단계를 포함하는 화학식 1의 제조 방법:

[화학식 1]

(식 중, n은 1, 2 또는 3임)

[화학식 2]

.

9. 위 8에 있어서, 제1 단계 이전에, 오수유로부터 화학식 2의 화합물을 분리하는 단계를 추가로 포함하는 화학식 1의 제조 방법.

10. 위 9에 있어서, 화학식 2의 화합물은 오수유의 메탄올 추출물의 디클로로메탄 분획에서 얻어진 것인 화학식 1의 제조 방법.

11. 위 8에 있어서, 제1 단계 이전에,

화학식 3의 화합물을 화학식 4의 화합물과 반응시켜 화학식 5의 화합물을 수득하는 S1 단계; 화학식 5의 화합물을 클로로폼과 반응시켜 화학식 6의 화합물을 수득하는 S2 단계; 화학식 6의 화합물을 화학식 7의 화합물과 반응시켜 화학식 8의 화합물을 수득하는 S3 단계; 화학식 8의 화합물을 과망간산칼륨과 반응시켜 화학식 9의 화합물을 수득하는 S4 단계; 및 화학식 9의 화합물을 염산과 반응시키는 S5 단계를 추가로 포함하는 화학식 1의 제조방법:

[화학식 3]

[화학식 4]

[화학식 5]

[화학식 6]

[화학식 7]

[화학식 8]

[화학식 9]

.

본 발명의 퇴행성 신경계 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물은 종래 사용된 약학 조성물에 비해 물에 대한 용해도가 약 2,000배 이상 높아 생체이용율(bioavailability)이 매우 높다.

본 발명은 활성산소 감소 효과 및 신경세포 보호 효과가 있어 감퇴된 기억력 증진에 유용하다.

본 발명은 베타 세크레타제의 활성을 저해하여 베타 아밀로이드 펩티드의 생성을 감소시킬 뿐만 아니라, 알파 세크레타제 활성을 증가시켜 베타 아밀로이드 펩티드의 생성을 근본적으로 억제할 수 있다.

도 1은 아밀로이드전구단백질의 절단 과정을 나타낸 것이다.
도 2는 화학식 1의 화합물을 얻는 일 구현예를 나타낸 것이다.
도 3은 화학식 1의 화합물의 베타 아밀로이드 펩티드를 생성하는 베타 세크레타제에 대한 저해능을 나타낸 그래프이다.
도 4는 화학식 1의 화합물의 베타 세크레타제에 대한 Lineweaver-Burk plot이다.
도 5는 화학식 1의 화합물의 베타 아밀로이드 펩티드 생성을 방해하는 알파 세크레타제에 대한 활성화능을 나타낸 그래프이다.
도 6은 화학식 1의 화합물의 알파 세크레타제에 대한 Lineweaver-Burk plot이다.
도 7은 화학식 1의 화합물의 베타 아밀로이드 펩티드에 대한 세포보호 효과를 나타낸 그래프이다.
도 8은 화학식 1의 화합물의 활성산소에 대한 세포보호 효과를 나타낸 그래프이다.
도 9는 화학식 1의 화합물의 흥분성 뇌신경전달물질에 대한 세포보호 효과를 나타낸 그래프이며,
도 10은 화학식 1의 화합물의 활성산소 감소 효과를 나타낸 그래프이다.
도 11은 생쥐 신경세포에서 화학식 1의 화합물의 베타 아밀로이드 펩티드 감소 효과를 나타낸 그래프이다.
도 12는 생쥐 뇌 조직에서 화학식 1의 화합물의 베타 아밀로이드 펩티드 감소 효과를 나타낸 그래프이다.
도 13은 생쥐 뇌 조직에서 화학식 1의 화합물의 베타 아밀로이드 펩티드 감소 효과를 나타낸 그래프이다.
도 14는 생쥐 뇌 조직에서 화학식 1의 화합물의 베타 아밀로이드 펩티드 감소 효과를 나타낸 그래프이다.
도 15는 화학식 1의 화합물의 해마 부위의 세포보호효과를 나타낸 것이다.
도 16은 도 15의 결과를 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 17은 화학식 1의 화합물의 기억 증진 효과(Y자 미로 테스트)를 나타낸 그래프이다.
도 18은 화학식 1의 화합물의 기억 증진 효과(수동회피시험)를 나타낸 그래프이다.
도 19는 화학식 1의 화합물의 기억 증진 효과(수중미로테스트)를 나타낸 그래프이다.
도 20은 화학식 1의 화합물의 기억 증진 효과(수중미로테스트의 탐침시험)를 나타낸 그래프이다.
도 21은 화학식 1의 화합물의 기억증진효과(수중미로테스트)를 나타낸 그래프이다.

본 발명은 화학식 1의 화합물을 포함함으로써, 종래 사용된 약학 조성물에 비해 물에 대한 용해도가 약 2,000배 이상 높아 생체이용율(bioavailability)이 매우 높으며, 활성산소 감소 효과 및 신경세포 보호 효과가 있어 감퇴된 기억력 증진에 유용할 뿐만 아니라, 베타 세크레타제의 활성을 저해하여 베타 아밀로이드 펩티드의 생성을 감소시킬 뿐만 아니라, 알파 세크레타제 활성을 증가시켜 베타 아밀로이드 펩티드의 생성을 근본적으로 억제할 수 있는 퇴행성 신경계 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명의 퇴행성 신경계 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물은 하기 화학식 1의 화합물을 포함한다:

[화학식 1]

식 중, n은 1 내지 3의 정수이며, 약효 측면에서 바람직하게는 1일 수 있다.

화학식 1의 화합물은 오수유(Evoida rutaecarpa Benth.)로부터 분리될 수 있는 하기 화학식 2의 디하이드로 에보다이아민의 유도체이다. 오수유는 콜레라균 및 회충을 포함한 기생충에 대하여 강한 항균활성을 가지고 있고, 자궁수축, 혈압강하 및 체온상승 등의 효과가 있는 것으로 알려져 있다.

[화학식 2]

종래 디하이드로 에보다이아민은 기억항진 및 치매 치료제로 사용되었으나, 디하이드로 에보다이아민은 수용성이 낮아 약제로서 이용이 어렵고, 충분한 혈중농도에 이르지 못하는 등의 문제가 있다.

반면, 본 발명의 화학식 1의 화합물은 디하이드로 에보다이아민보다 물에 대한 용해도가 2000배 이상 높아 생체이용율(bioavailability)이 우수하여 약제로서 이용이 용이하며, 알파 세크레타제 활성화 효과도 있어 약리효과도 보다 우수한 장점이 있다.

일반적으로 약물의 생체막 투과나 뇌로의 전달 정도는 약물의 지용성이 높을수록 증가하지만, 알츠하이머를 비롯한 퇴행성 신경계 뇌질환 환자의 경우 뇌-혈관 장벽(Blood Brain Barrier)에 문제가 생겨, 일반적인 경우와 다르게 수용성이 증가할수록 약물 전달 효율이 개선된다.

따라서, 본 발명의 화학식 1의 화합물은 현저히 개선된 수용성을 가지므로 약물 전달 효율이 우수하다.

화학식 1의 화합물을 얻는 방법은 특별히 한정되지 않으며, 도 2를 참조하여 예를 들면 화학식 2의 화합물을 N-알킬레이션시키는 제1 단계; 제1 단계에서 얻어진 화합물을 산화시키는 제2 단계; 및 제2 단계에서 얻어진 화합물에 나트륨을 포함하는 염기를 가하는 제3 단계를 포함하여 얻어질 수 있다.

화학식 2의 화합물을 얻는 방법은 특별히 한정되지 않으며, 오수유로부터 분리할 수 있고, 화학적으로 합성하여 얻어질 수도 있다.

오수유로부터 화학식 2의 화합물을 분리하는 방법은 특별히 한정되지 않으며, 예를 들면 오수유의 메탄올 추출물의 디클로로메탄 분획에서 얻어질 수 있다.

화학식 2의 화합물을 합성하는 방법은 특별히 한정되지 않으며, 예를 들면 화학식 3의 화합물을 화학식 4의 화합물과 반응시켜 화학식 5의 화합물을 수득하는 S1 단계; 화학식 5의 화합물을 클로로폼과 반응시켜 화학식 6의 화합물을 수득하는 S2 단계; 화학식 6의 화합물을 화학식 7의 화합물과 반응시켜 화학식 8의 화합물을 수득하는 S3 단계; 화학식 8의 화합물을 과망간산칼륨과 반응시켜 화학식 9의 화합물을 수득하는 S4 단계; 및 화학식 9의 화합물을 염산과 반응시키는 S5 단계를 거쳐 합성될 수 있다.

[화학식 3]

[화학식 4]

[화학식 5]

[화학식 6]

[화학식 7]

[화학식 8]

[화학식 9]

본 발명의 퇴행성 신경계 뇌 질환은 알츠하이머 치매 및 이와 공통적인 병리 기작을 갖는 파킨슨병 또는 루게릭병, 픽크병, 크로이츠펠트 야콥병, 헌팅톤병, 진행성 핵상마비, 척수소뇌 변성증, 소뇌 위축증, 다발성 경화증, 신경세포의 소실에 의해 발생하는 노인성 치매, 뇌졸중, 기억상실증 및 외상 후 스트레스 장애 등의 퇴행성 신경계 뇌 질환 중에서 선택된 단독 또는 혼합형 질환일 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 p-당단백질(Glycoprotein) 억제제 및 전사활성화 전사(TransActivating Transcriptional, TAT) 펩티드로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 1종을 더 포함할 수 있다.

p-당단백질은 막 수송 단백질로서, 세포로부터 생체이물을 밀어냄으로써 약물이 세포 내에 축적되는 것을 감소시킬 뿐만 아니라, 장의 내피세포 등에 존재하며 약물의 생체흡수를 방해한다. 따라서 p-당단백질을 억제하면 약물의 생체 흡수가 증대되므로, p-당단백질 억제제는 화학식 1의 화합물의 생체 흡수를 증대시키는 역할을 한다.

p-당단백질 억제제의 종류는 특별히 한정되지 않으며 당 업계에서 공지된 p-당단백질 억제제일 수 있고, 예를 들면 시클로스포린 a, 케토코나졸, 베라파밀, 퀴니딘, GF120918(elacridar) 등을 들 수 있다.

HIV 유래의 전사활성화 전사 펩티드는 세포막 투과 능력이 있으므로, p-당단백질 억제제와 마찬가지로 화학식 1의 화합물의 흡수를 증대시키는 역할을 한다.

본 발명의 약학 조성물의 유효성분의 양은 의사 또는 숙련자에 의해 결정될 수 있으며, 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 간 및 신장 기능, 투여경로 및 기간에 따라 달라질 수 있다. 예컨대, 0.1 내지 200㎎/㎏의 양을 1일 1회 내지 수회 투여할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 약학 조성물을 운반체 내부에 포함하는 약제일 수 있다.

운반체는 약학 조성물에 포함되는 유효성분의 세포 내 유입도를 개선하는 역할을 한다.

운반체의 종류는 특별히 한정되지 않고, 예를 들면 나노리포좀, 나노미립자, 폴리(D-아르기닌), 나노덴드리머 등을 들 수 있다.

나노리포좀의 종류는 특별히 한정되지 않으며, 예를 들면, 세라마이드-함유 나노리포좀, 프로테오리포좀 등을 들 수 있다.

나노미립자의 종류는 특별히 한정되지 않으며, 예를 들면 칼슘 인-실리케이트 나노미립자, 인산칼슘 나노미립자, 이산화규소 나노미립자, 나노결정질 미립자, 반도체 나노미립자 등을 들 수 있다.

본 발명의 약제는 통상의 방법을 통해 제제화될 수 있다. 예컨대, 제제 형태는 경구 투여를 위한 과립제, 산제, 시럽제, 액제, 현탁제, 정제, 캡슐제, 트로키제 또는 환제일 수 있으며, 비경구 투여를 위한 경피흡수제, 로션제, 연고제, 첩부제, 카타플라즈마제, 페이스트제, 현탁제, 액제, 주사제 또는 좌제일 수 있다.

또한, 약제는 당 분야에서 통상적으로 사용되는 적절한 담체 또는 부형제 등을 더 포함할 수 있다. 담체로는 약학적으로 허용 가능한 것으로서, 물, 식염수, 용액이나 현탁액을 형성하는 인산, 아세트산, 구연산, 타르타르산 및 기타 완충액과 같은 완충액, 천연 또는 합성 생분해성 중합체 또는 공중합체를 포함하는 액체, 고체 또는 반고형 담체를 들 수 있다. 부형제로는 미세결정 셀룰로오스, 락토오스, 전분, 탄산칼슘, 당, 덱스트로스, 이염기성 인산칼슘 2수화물, 삼염기성 인산칼슘, 카올린, 말토텍스트린 또는 만니톨과 같은 희석제; 아카시아, 알긴산, 카보머, 카르복시메틸셀룰로오스 나트륨, 에틸셀룰로오스, 젤라틴, 구아검, 히드록시에틸셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 말토덱스트린, 메틸셀룰로오스, 폴리메타크릴레이트, 포비돈 또는 알긴산나트륨염과 같은 결합제; 겔화된 전분, 알긴산, 카르복시메틸셀룰로오스 칼슘, 크로스카멜로즈 나트륨, 크로스포비돈 또는 나트륨 전분 글리코레이트와 같은 붕해제; 알코올, 벤조산나트륨, 부틸화된 히드록시 톨루엔, 부틸화된 히드록시아니솔 또는 에틸렌디아민테트라아세트산과 같은 킬레이트제 및 산화방지제; 메틸파라벤 또는 프로필파라벤과 같은 항균제; 글루콘산, 락트산, 시트르산 또는 아세트산, 글루콘산나트륨, 락트산나트륨, 시트르산나트륨 또는 아세트산나트륨과 같은 완충제; 이산화티탄, 산화제일철 또는 산화제이철과 같은 착색제; 및 수크로즈 또는 아스파르탐과 같은 감미료 및 향신료 등을 들 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시하나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범주 및 기술사상 범위 내에서 다양한 변경 및 수정이 가능함은 당업자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연한 것이다.

실시예

1. 화학식 1의 화합물의 합성

DMSO 용매에 화학식 2의 화합물을 녹이고, 수산화칼륨 하에서 브로모에틸렌을 첨가하여 인돌기에 있는 N(질소 원자)을 알킬레이션하였다. N-알킬레이션된 화합물을 충분히 얻은 후에, 과망간산칼륨(KMnO₄)을 첨가하여 N-알킬레이션 된 올레핀을 카르복시산으로 산화시켰다.

그 후 수산화나트륨을 첨가하여 화학식 1의 화합물을 얻었다(도 2 참조).

2. 화학식 1의 화합물의 용해도 평가

화학식 1의 화합물의 용해도 증가 정도를 화학식 2의 화합물과 비교하기 위해 용해도 실험을 실시하였다.

생리학적 조건 하에서 용해도를 비교하기 위해 용매는 pH 7.4의 PBS (Phosphate-buffered saline)을 사용하였다.

실시예 1에서 제조된 화학식 1의 화합물과 화학식 2의 화합물을 각각 일정 부피의 용매에 과량 녹인 후, UV 367nm 하에서 정량적으로 빛을 흡수하는 성질을 이용하여 흡광도를 측정하고 과량 녹아있는 용액의 농도를 역으로 추산하고 이를 하기 표 1에 나타내었다.

구분	용해도(㎍/ml)	용해도(g/100ml)
화학식 2의 화합물	58.594	0.005859
화학식 1의 화합물	138399.4704	13.83994

상기 표 1을 참고하면, 화학식 1의 화합물의 용해도는 화학식 2의 화합물에 비해 약 2000배 이상 높은 것을 확인할 수 있었다.

3. 화학식 1의 화합물의 혈중 농도 측정

화학식 1의 화합물의 수용성 증가로 인해 실제 생체 내에서도 혈중 농도가 높아지는 지를 확인하기 위해 생쥐에 각각 약물을 복강투여한 후 혈액을 채취하여 농도를 측정하였다.

실시예 1의 화학식 1의 화합물과 화학식 2의 화합물 각각 10mg/kg를 생쥐에 복강투여하고 30분 후에 혈액을 채취하였고, 또 다른 생쥐에게 각각 20mg/kg을 복강투여하고 60분 후에 혈액을 채취하여 흡광도를 측정하고, 표준물질의 흡광도와 비교하여 혈중 농도를 역으로 추산하고 이를 하기 표 2에 나타내었다.

구분		화학식 2의 화합물	화학식 1의 화합물
10mg/kg투여30분	area (ng*min/ml)	175563	97060
	농도 (ng/ml)	1200.974	13943.4
20mg/kg투여 60분	area (ng*min/ml)	807877	476973
	농도 (ng/ml)	5279.104	68520.76

상기 표 2를 참고하면, 화학식 1의 화합물의 혈중농도는 10mg/kg와 20mg/kg를 투여하였을 때 화학식 2의 화합물에 비해 10배 이상 증가한 것을 볼 수 있다.

4. 알파, 베타 세크레타제 효소 활성에 미치는 영향 측정

화학식 1의 화합물이 화학식 2의 화합물과 같이 베타 세크레타제를 저해하는 능력을 가지는지 그리고 알파 세크레타제에 미치는 영향을 알아보기 위해 효소 실험을 시행하였다.

효소 실험에는 기질과 효소가 필요한데, 기질은 아밀로이드전구단백 중 베타 세크레타제에 의해 잘리는 부분에 형광을 붙인 것으로 Calbiochem사에서 만든 상품을 구입하였고, 효소는 쥐 뇌를 분쇄하여 얻어진 것을 사용하였다. 효소, 기질, 약물을 일정량을 넣고 양을 변화시켜가면서 형광측정기를 통해 효소 활성 정도를 측정하였다.

상기 전체 과정을 총 3회 반복하여 수행하였다.

도 3에 베타 세크레타제 저해 활성을 3회 반복하여 시행한 결과의 평균값으로 나타내었는데, 화학식 1의 화합물의 IC₅₀는 약 8μM로 화학식 2의 화합물과 유사한 베타 세크레타제 저해 활성을 나타내는 것을 볼 수 있다.

도 4는 화학식 1의 화합물이 효소 저해를 어떤 방식으로 하는가를 알아보기 위해 기질의 농도를 변화시켜가면서 측정한 Lineweaver-Burk plot으로, 이를 참조하면 화학식 1의 화합물이 효소 활성을 비경쟁적으로 저해하는 것을 확인할 수 있다.

도 5에 알파 세크레타제의 활성화능을 3회 반복하여 시행한 결과의 평균값으로 나타내었는데, 화학식 2의 화합물은 알파 세크레타제 활성화능이 거의 없었으나 화학식 1의 화합물의 EC₅₀는 약 69μM정도로 측정되어 알파 세크레타제 활성화능이 있음을 확인하였다.

도 6은 화학식 1의 화합물이 효소 활성화를 어떤 방식으로 하는가를 알아보기 위해 기질의 농도를 변화시켜가면서 측정한 Lineweaver-Burk plot으로, 이를 참조하면 화학식 1의 화합물이 효소 활성을 경쟁적으로 활성화하는 것을 확인할 수 있다.

5. 베타 아밀로이드 펩티드에 대한 세포보호 활성시험

96-웰 플레이트의 각 웰에 인간 신경암 유래의 SH-SY5Y 세포(5×10³개; 10% FBS 첨가된 DMEM 배지)를 넣고 37℃에서 24시간 배양하였다. 그 후, 화학식 2의 화합물 10μM, 화학식 1의 화합물 0.1, 1, 10μM을 각각 첨가하였다. 또한, 대조군으로서 약물을 첨가하지 않고 배양한 배양액도 준비하였다.

4시간 후, 베타 아밀로이드 펩티드 10μM을 더 첨가한 뒤 다시 24시간 더 배양하였다. 배양 후, 염수액(phosphate buffered saline; PBS)으로 세정하고 세포증식시약(cell proliferation reagent; WST-1)을 10% 넣은 배양액을 100㎕ 넣고 암 조건에서 1시간 동안 37℃ 배양기에서 반응시킨 뒤 450nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.

측정 결과, 화학식 1의 화합물이 화학식 2의 화합물과 유사하게 베타 아밀로이드 펩티드에 의한 세포사를 유의적으로 억제함을 확인하였다(도 7 참조).

6. 활성산소에 대한 세포보호 활성시험

96-웰 플레이트의 각 웰에 인간 신경암 유래의 SH-SY5Y 세포(5×10³개; 10% FBS 첨가된 DMEM 배지)를 넣고 37℃에서 24시간 배양하였다. 그 후, 화학식 2의 화합물 10μM, 화학식 1의 화합물 10μM, 비타민E 50μM를 각각 첨가하였다. 또한, 대조군으로서 약물을 첨가하지 않고 배양한 배양액도 준비하였다.

4시간 후, 활성산소를 유발하는 과산화수소수(H₂O₂) 250μM를 더 첨가한 뒤 다시 24시간 더 배양하였다. 배양 후, 염수액(phosphate buffered saline; PBS)으로 세정하고 세포증식시약(cell proliferation reagent; WST-1)을 10% 넣은 배양액을 100㎕ 넣고 암 조건에서 1시간 동안 37℃ 배양기에서 반응시킨 뒤 450nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.

측정 결과, 화학식 1의 화합물이 화학식 2의 화합물 및 비타민 E와 유사하게 활성산소에 의한 세포사를 유의적으로 억제함을 확인하였다(도 8 참조).

7. 흥분성 뇌신경전달물질에 대한 세포보호 활성시험

96-웰 플레이트의 각 웰에 인간 신경암 유래의 SH-SY5Y 세포(5×10³개; 10% FBS 첨가된 DMEM 배지)를 넣고 37℃에서 24시간 배양하였다. 그 후, 화학식 2의 화합물 10μM, 화학식 1의 화합물 10μM 및 MK-801 10μM를 각각 첨가하였다. 또한, 대조군으로서 약물을 첨가하지 않고 배양한 배양액도 준비하였다.

4시간 후, 흥분성 뇌신경전달물질인 글루탐산(glutamate) 1mM를 더 첨가한 뒤 다시 24시간 더 배양하였다. 배양 후, 염수액(phosphate buffered saline; PBS)으로 세정하고 세포증식시약(cell proliferation reagent; WST-1)을 10% 넣은 배양액을 100㎕ 넣고 암 조건에서 1시간 동안 37℃ 배양기에서 반응시킨 뒤 450nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.

측정 결과, 화학식 1의 화합물이 화학식 2의 화합물 및 MK-801과 유사하게 흥분성 뇌신경전달물질에 의한 세포사를 유의적으로 억제함을 확인하였다(도 9 참조).

8. 활성산소 발생량 감소 측정 시험

배양세포에서 화학식 1의 화합물이 세포사를 유발하는 활성산소의 생성을 저해할 수 있는지를 알아보기 위해 활성산소 저해능 시험을 실시하였다.

6 웰 플레이트의 각 웰에 인간 신경암 유래의 SH-SY5Y 세포(5×10⁴개; 10% FBS 첨가된 DMEM 배지)를 넣고 37℃에서 24시간 배양하였다. 그 후, 화학식 1의 화합물 0.1, 1, 10μM및 비타민 E 50μM을 각각 첨가하였다. 또한, 대조군으로서 약물을 첨가하지 않고 배양한 배양액도 준비하였다.

4시간 후, 활성산소를 유발하는 과산화수소수(H₂O₂) 250μM을 더 첨가한 뒤 다시 24시간 더 배양하였다. 배양 후, 염수액(Hank's buffered salt solution; HBSS)으로 세정하고 활성산소 지시약(Dichlorofluorescein-diacetate; DCF-DA) 200μM을 암 조건에서 1시간 동안 37℃ 배양기에서 반응시킨 뒤 상층액을 따서 검은 96 웰 플레이트에 옮겨 담은 뒤 흥분파장 485nm, 방출파장 538nm에서 흡광도를 측정하였다.

측정 결과, 화학식 1의 화합물을 투여한 군에서 활성 산소 생성율이 감소하고, 1 및 10μM을 투여한 군의 경우 약물을 첨가하지 않은 대조군이나 비타민 E 첨가군보다 더 활성산소 생성율이 적은 것을 확인하였다(도 10 참조).

이러한 결과로 보아 화학식 1의 화합물은 활성산소에 대한 세포보호 효과는 활성산소 발생을 억제함으로써 가능함을 확인하였다.

9. 효소결합면역흡착 시험

치매 동물 모델로 유전적으로 아밀로이드전구단백질의 아미노산을 변이시킨 13개월된 수컷 Tg2576 마우스(초기 알츠하이머가 발병된 스웨덴 가족에서 발견된, Lys670이 Asn으로 Met671이 Leu(K670N, M671N)으로 변이된 humanAPP695를 발현하는 마우스임, Hsiao et al., Correlative memory deficits, Aβ elevation, and amyloid plques in transgenic mice. Science 1996 274: 99-102.)를 사용하였다. 대조군 동물로는 동일한 종의 수컷 마우스(wild type, wt)을 사용하였다.

임신한지 16일 된 Tg2576 마우스의 태아를 꺼내 1차 배양을 실시하였다. 신경세포로의 분화를 촉진하기 위해 배지에 태아혈청을 1%로 줄이고 신경세포성장인자를 1% 첨가하였다. 분화 7일째 되는 날, 화학식 1의 화합물 및 화학식 2의 화합물, PBS를 처리하고 3일째 되는 날 세포를 수확해 실험에 이용하였다.

화학식 1의 화합물의 투여는 9개월째부터 4개월간 매일 1회 같은 시간에 1mg/kg을 복강으로 투여하였고, 검사는 13개월째에 시행하였다. 화학식 2의 화합물 또한 같은 용량, 같은 방법, 같은 시간에 투여하였고 현재 치매 약물로 Aricept란 이름으로 시판 중인 donepezil을 양성 대조군으로 사용하였으며 역시 같은 방법, 같은 시간으로 투여하였고 용량은 0.5mg/kg로 투여하였다.

이후 실시예 14까지 동일한 동물모델을 사용하였다.

화학식 1의 화합물이 실제 생체 내에서 베타 세크레타제를 저해하여 베타 아밀로이드 펩티드를 생성을 억제하는지 알아보기 위하여 화학식 1의 화합물을 전처리한 신경세포와 화학식 1의 화합물을 투여한 쥐의 뇌를 적출하여 효소결합면역흡착법(ELISA)으로 베타 아밀로이드 펩티드의 양을 측정하였다.

효소결합면역흡착법은 시판되고 있는 인비트로젠(invitrogen)을 구매하여 시행하였다.

사전코팅되고 블록킹된 96-웰 고수준 결합성 플레이트 상에 침착되는 항-베타 아밀로이드 포획 항체에 세포 용해물 및 쥐 뇌 용해물을 4시간 동안 인큐베이션시켜 세포 용해물 및 쥐 뇌 용해물 내의 베타 아밀로이드 펩티드가 항-베타 아밀로이드 포획 항체에 붙도록 하였다.

세척 후, 항-베타 아밀로이드 항체를 인지하면서 발색 시약과 반응하는 효소가 붙어있는 2차 항체를 넣어 항-베타 아밀로이드 포획항체에 붙도록 하였다. 이후에 항체 반응에 따라 색깔을 내는 시약과 추가로 넣어 항원-항체 반응에 따라 변색되면 효소면역측정기(ELISA reader)로 측정하였다.

도 11에 베타 아밀로이드 펩티드의 신경세포에서의 농도를 나타내었는데, 세포 내에서 화학식 2의 화합물은 베타 아밀로이드 펩티드를 유의하게 감소시키지 못하지만, 화학식 1의 화합물은 베타 세크레타제 저해제와 유사한 감소 효과를 가지며, 감마 세크레타제 저해제인 DAPT보다 월등한 효과를 나타냄을 확인하였다(도 11 참조).

도 12에 생쥐 모델의 베타 아밀로이드 펩티드의 뇌 조직에서의 농도를 나타내었는데, 화학식 1의 화합물과 화학식 2의 화합물 모두에 의한 베타 아밀로이드 펩티드의 유의미한 감소효과를 관찰할 수 있다.

10. 생체 내 베타 아밀로이드 펩티드 감소 효과 확인

화학식 1의 화합물이 생체 내에서 베타 아밀로이드 펩티드의 감소를 가져오는지 화학식 1의 화합물을 투여한 쥐의 뇌를 적출하여 특수단백질 검출 실험(western blot)을 통하여 확인하였다.

쥐 뇌 용해물의 단백질을 전기 영동시켜 분자량 크기별로 분리시킨 뒤 membrane에 옮겨 베타 아밀로이드 펩티드에 대한 1차 항체와 2차 항체를 붙여 HRP(Horse radish peroxidase)의 반응으로 확인하였다.

도 13에서 4.3 kDa에 해당하는 밴드의 강도는 베타 아밀로이드 펩티드의 양을 나타낸다. 도 13의 GAPDH의 발현량을 기준으로 베타 아밀로이드 펩티드의 양을 비교했을 때, 치매동물모델에서 화학식 2의 화합물은 베타 아밀로이드 펩티드를 유의하게 감소하지는 못하지만, 화학식 1의 화합물은 유의미한 감소효과를 나타냄을 확인하였다(도 14 참조).

11. 해마 및 대뇌피질 부분의 세포보호효과 확인

화학식 1의 화합물이 생체 내에서 세포 보호 효과를 가지는지 확인하기 위하여 뇌 조직 절편을 만들어 헤마토실린-에오신 염색법을 통해 기억력과 관련되어 있다고 알려진 해마 부위의 죽은 세포의 정도를 현미경을 통해 관찰하고 측정하였다.

쥐 뇌를 꺼내어 4% 파라포름알데하이드 용액에 고정시킨 뒤 파라핀 절편을 만들어 슬라이드에 올린 다음, 헤마토실린 5분, 에오신 1분 동안 인큐베이션하여 염색을 한 뒤 70%, 80%, 90%, 100% 알코올 용액에 차례대로 수분제거 과정을 거쳐 자일렌 용액에 인큐베이션하고 커버 유리로 마무리하였다.

도 15에 해마에서 통상 치아이랑이라고 불리는 DG 부위, 그 다음에 이어서 나오는 부분들 중 CA3, CA1 부위와 대뇌피질 부위 세포를 염색하여 확대해서 나타냈으며, 진한 보라색으로 염색된 세포(eosinophilic cell)는 죽은 세포를 의미한다.

도 16에서 전체 세포수 대비 죽은 세포를 세어 비율로 나타내었다. 이를 참고하면, 화학식 1의 화합물의 투여로 인해 죽은 세포의 수가 유의미하게 감소하여 해마 및 대뇌피질 부분의 세포보호효과가 있음을 확인하였다.

12. Y자 미로 테스트

생체 내에서 화학식 1의 화합물이 감퇴된 기억력을 증진시킬 수 있는지를 확인하기 위하여 기억감퇴를 유발한 동물모델을 이용하여 Y자 미로 테스트를 실시하였다.

Y자형 미로 측정장치는 3개의 통로(arm)를 뻗어 알파벳 Y자 모양을 하고 있으며 각 가지는 길이 35㎝, 높이 9㎝, 폭 5㎝이고 동일한 각도로 위치한다. Y자형 미로의 한 통로의 끝에 실험동물의 머리 부분이 향하도록 두고 8분 동안 자유롭게 통로를 돌아다니도록 한다. 동물의 움직임을 기록하고 동물의 뒷발까지 통로로 들어간 경우를 통과한 것(arm entry)으로 본다.

동물의 움직임을 교차횟수(alternation)로 나타내는데, 동물이 연속적으로 3개의 통로를 통과하였을 때 한 번 교차한 것으로 정의된다. 자발적인 교차 행동량은 실제 교차횟수와 최대 가능한 교차횟수(즉, 총 교차횟수에서 2를 뺀 값)의 백분비이다.

도 17에 Y자 미로테스트에서의 교차 비율을 나타내었는데, 화학식 1의 화합물 투여군에서 화학식 2의 화합물 및 donepezil 투여군과 유사하게 교차 비율이 증가한 것을 볼 수 있다. 교차 비율이 높다는 것은 연속적으로 3개의 통로를 다 통과한 확률이 높은 것이므로, 화학식 1의 화합물이 기억력 증진에 효과가 있음을 확인하였다.

13. 수동회피 시험

실험기구로는 가로, 세로, 높이가 50, 15, 40㎝이고, 바닥에는 전기 전도성 망이 깔려져 있는 셔틀박스(Shuttle box)를 이용하였다. 또한, 상자는 칸막이문(connecting guillotine door: 10×10㎝)을 사용하여 반으로 나누어 25×15㎝의 방을 2개 만들었다. 각 방에는 20W 전구를 설치하였다. 소음이 60데시벨 이하이고, 조명을 어둡게 한 방에서 실험을 실시하였다.

칸막이로 나누어진 방 2개 중 한쪽(A)에 생쥐를 넣고 1500럭스(lux)의 조명을 켜면서 칸막이를 열어주었다. 그러면 생쥐는 방안을 여기저기 살피다가 조명이 없는 건너편 방(B)으로 들어가게 되는데, 이때 자동적으로 칸막이가 닫히도록 하였다. 불을 켜면서 칸막이가 열릴 때부터 칸막이가 닫힐 때까지의 시간을 측정함으로써 도달시간(latency time)을 측정하는데, 이러한 과정을 반복 수행하면 생쥐는 방 A에서 방 B로 넘어간다. 이와 같은 시도를 계속하여, 생쥐가 20초 이내에 방 A에서 방 B로 건너가게 되면 훈련과정을 완료하였다. 다음 날에 상기 훈련을 거친 생쥐를 방 A에 넣고 생쥐가 방 B로 넘어가면 불이 꺼진 상태에서 방밑의 스테인레스 망(stainless grid)을 통해 0.25㎃의 전류를 2초 동안 흘려 생쥐의 발바닥에 쇼크를 주었다.

생쥐는 어두운 방과 발바닥 쇼크(foot-shock)와의 관계를 기억하게 되며, 24시간 후에 방 A에 넣어주면 조명이 들어와도 방 B에 들어가기를 망설이게 된다. 이때의 도달시간(latency time)을 비교하였다.

1일 후에 다시 이 생쥐들을 방 A에 넣고 불을 켜 주었을 때 방 B로 넘어가기 전까지의 시간을 측정하였다. 5분을 최대 측정시간으로 하였다.

도 18에 생쥐의 방 A에서 방 B로의 도달 시간을 나타내었는데, 화학식 1의 화합물 투여군에서 화학식 2의 화합물 및 donepezil 투여군과 유사하게 도달시간이 증가하여, 화학식 1의 화합물이 기억력 증진에 효과가 있음을 확인하였다(도 18 참조).

14. 수중미로 테스트

수중미로 테스트는 주변 지형지물을 이용하여 플랫폼의 위치를 찾아가는 공간감각 기억력(spatial memory)을 측정하는 것이다.

지름 1.4m의 수조에 플랫폼이 보이지 않게 숨기고 실험동물이 플랫폼을 찾아가는 도달시간(latency time)을 비교하였다. 최대 시간은 1회당 1분으로 하였고, 6일 동안 하루 4회씩 인식시행(acquisition trial)을 하였다.

6일의 인식시행이 끝난 후 플랫폼을 치운 뒤 플랫폼이 있던 구역에 머무르는 시간을 측정하여 기억력의 정도를 알아내는데 이를 탐침 시험(probe trial)이라고 한다.

도 19에 인식 시행에서의 플랫폼 도달시간을 나타내었는데, 화학식 1의 화합물 투여군에서 화학식 2의 화합물 투여군과 플랫폼 도달 시간이 유사하게 나타나 화학식 1의 화합물이 기억력 증진에 효과가 있음을 확인하였다.

도 20에 탐침 시험에서 생쥐가 각 구역에서 머무르는 시간을 나타내었는데, 화학식 1의 화합물 투여군에서 화학식 2의 화합물 및 donepezil 투여군과 유사하게 플랫폼이 있던 구역에 머무르는 시간이 증가하여 화학식 1의 화합물이 기억력 증진에 효과가 있음을 확인하였다.

15. 일시적 기억감퇴동물모델을 이용한 수중미로 테스트

지름 1.4m의 수조에 플랫폼이 보이지 않게 숨기고 실험동물이 플랫폼을 찾아가는 도달시간(latency time)을 비교하였다.

실험동물은 5주된 수컷 백서(rat)를 사용하였으며, 최대 시간은 1회당 1분 30초로 하였고, 5일 동안 하루 2회 씩 인식시행(acquisition trial)을 하였다.

5일간의 인식시행이 끝난 후, 화학식 1의 화합물(10mg/kg)와 화학식 2의 화합물(10 mg/kg)을 각각 투여하고, 다시 30분 후에 스코폴아민(scopolamine, 1 mg/kg)을 복강 내로 투여하여 일시적인 치매를 유발하였다. 약물을 투여한지 1시간, 4시간 후에 다시 이 백서들을 수조에 넣고 플랫폼을 찾아가는 도달시간을 측정하였다.

도 21에 플랫폼 도달시간을 나타내었는데, 화학식 1의 화합물 투여군의 플랫폼 도달시간이 아무것도 투여하지 않은 대조군과 유사하게 나타나, 화학식 1의 화합물이 스코폴아민 투여에 의해 감퇴된 기억력을 증진시키는 효과가 있음을 확인하였다.

Claims (11)

1. 화학식 1의 화합물을 포함하는 퇴행성 신경계 뇌질환의 치료 또는 예방용 약학 조성물:
   [화학식 1]
   

   

   
   (식 중, n은 1임).
   
2. 청구항 1에 있어서, 상기 퇴행성 신경계 뇌질환은 알츠하이머 치매, 파킨슨병, 루게릭병, 픽크병, 크로이츠펠트 야콥병, 헌팅톤병, 진행성 핵상마비, 척수소뇌 변성증, 소뇌 위축증, 다발성 경화증, 신경세포의 소실에 의해 발생하는 노인성 치매, 뇌졸중, 기억상실증 및 외상 후 스트레스 장애로 이루어진 군에서 선택되는 질환인 약학 조성물.
   
3. 청구항 1에 있어서, 알파 세크레타제 활성 증가 및 베타 세크레타제 활성 억제를 나타내는 약학 조성물.
   
4. 청구항 1에 있어서, p-당단백질 억제제 및 전사활성화 전사(Trans Activating Transcriptional) 펩티드로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 1종을 더 포함하는 약학 조성물.
   
5. 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항의 약학 조성물이 나노리포좀, 나노미립자, 폴리(D-아르기닌) 및 나노덴드리머로 이루어진 군에서 선택되는 운반체 내부에 포함된 퇴행성 신경계 뇌질환의 치료 또는 예방용 약제.
   
6. 청구항 5에 있어서, 과립제, 산제, 시럽제, 액제, 현탁제, 정제, 캡슐제, 트로키제, 환제, 주사제, 경피흡수제, 로션제, 연고제, 첩부제, 카타플라즈마제, 페이스트제 또는 좌제로 제형화된 약제.
   
7. 청구항 5에 있어서, 상기 퇴행성 신경계 뇌질환은 알츠하이머 치매, 파킨슨병, 루게릭병, 픽크병, 크로이츠펠트 야콥병, 헌팅톤병, 진행성 핵상마비, 척수소뇌 변성증, 소뇌 위축증, 다발성 경화증, 신경세포의 소실에 의해 발생하는 노인성 치매, 뇌졸중, 기억상실증 및 외상 후 스트레스 장애로 이루어진 군에서 선택되는 질환인 약제.
   
8. 화학식 2의 화합물을 N-알킬레이션시키는 제1 단계;
   제1 단계에서 얻어진 화합물을 산화시키는 제2 단계; 및
   제2 단계에서 얻어진 화합물에 나트륨을 포함하는 염기를 가하는 제3 단계를 포함하는 화학식 1의 제조 방법:
   [화학식 1]
   

   

   
   (식 중, n은 1임)
   [화학식 2]
   

   

   .
   
9. 청구항 8에 있어서, 제1 단계 이전에, 오수유로부터 화학식 2의 화합물을 분리하는 단계를 추가로 포함하는 화학식 1의 제조 방법.
   
10. 청구항 9에 있어서, 화학식 2의 화합물은 오수유의 메탄올 추출물의 디클로로메탄 분획에서 얻어진 것인 화학식 1의 제조 방법.
    
11. 청구항 8에 있어서, 제1 단계 이전에,
    화학식 3의 화합물을 화학식 4의 화합물과 반응시켜 화학식 5의 화합물을 수득하는 S1 단계;
    화학식 5의 화합물을 클로로폼과 반응시켜 화학식 6의 화합물을 수득하는 S2 단계;
    화학식 6의 화합물을 화학식 7의 화합물과 반응시켜 화학식 8의 화합물을 수득하는 S3 단계;
    화학식 8의 화합물을 과망간산칼륨과 반응시켜 화학식 9의 화합물을 수득하는 S4 단계; 및
    화학식 9의 화합물을 염산과 반응시키는 S5 단계를 추가로 포함하는 화학식 1의 제조방법:
    [화학식 3]
    

    

    
    [화학식 4]
    

    

    
    [화학식 5]
    

    

    
    [화학식 6]
    

    

    
    [화학식 7]
    

    

    
    [화학식 8]
    

    

    
    [화학식 9]
    

    

    .

Images