KR20000015805A

KR20000015805A - 일산화질소 합성을 증가시키는 방법

Info

Publication number: KR20000015805A
Application number: KR1019980709354A
Authority: KR
Inventors: 자이 피. 싱; 대니 엘. 우드
Original assignee: 피터 지. 스트링거; 일라이 릴리 앤드 캄파니
Priority date: 1996-05-21
Filing date: 1997-05-16
Publication date: 2000-03-15
Also published as: NO985357L; NZ332841A; EP0954306A1; CN1219128A; EA199801023A1; AU3134497A; PL330146A1; EP0954306A4; JP2000512272A; IL127152A0; NO985357D0; WO1997044029A1; YU52498A; CA2255792A1; EA001911B1; US5811437A; AU716064B2

Abstract

본 발명은 하기 화학식 I의 화합물 또는 제약학적으로 허용되는 그의 염 또는 용매화물을 투여하는 것을 포함하는, 혈관 상피 세포에서 일산화질소(NO)의 농도를 증가시키는 방법을 제공한다.

<화학식 I>

상기 식에서,

R은 수소, -OH, -O(C₁-C₄알킬), -OCO(C₁-C₄알킬) 또는 -OCOAr (여기에서, Ar은 페닐 또는 임의로 치환된 페닐임)이고;

R₁은 R, -Cl 또는 -F이며;

R₂는 1-피롤리디닐, 1-피페리디닐 또는 1-헥사메틸렌이미노이다.

Description

일산화질소 합성을 증가시키는 방법

일산화질소는 심혈관계, 장관계, 중추신경계 및 면역계의 정상적인 생리 기능에서 중요한 역할을 하는 조절 분자이다. 일산화질소는 NO 합성효소 (NOS)로 알려져 있는 일군의 효소에 의해 L-아르기닌으로부터 합성된다. 본 발명에는 특히 eNOS로 알려져 있는, 혈관 내피 세포에서 생산되는 칼슘 의존성 NOS가 관계된다. 최근, 수많은 연구에서 eNOS 유전자의 조절이 에스트로겐 호르몬과 연관되는 것으로 나타났다. 에스트로겐은 eNOS m-RNA의 생산을 상향 조절하여, 결과적으로 내피 세포에서 eNOS의 합성을 상향 조절하는 것으로 나타났다. 이러한 eNOS의 양 증가로 인해 내피 세포에서는 혈관계의 적절한 자극에 반응하여 보다 많은 NO를 생산할 수 있게 된다.

맥관 구조에서, 내피 유래 NO는 혈소판 응집, 염증 세포 유착과 평활근 세포 증식의 억제를 포함한 몇몇 작용을 나타낸다. 내피 유래 NO는 혈관 긴장의 중요한 조절 인자이다. 일반적으로 이용되는 내피 기능 지표인 혈류 의존성 확장은 대부분 NO에 의해 매개된다.

NO에 의한 혈관 긴장의 조절 기전은 내피 내층(lining) 세포에 대한 아세틸콜린, 브래디키닌 및 전단 응력 등의 자극에 의해 개시된다. 내피 세포는 eNOS에 의해 L-아르기닌으로부터 NO를 생산함으로써 반응한다. 생산된 NO는 내피 세포를 떠나, 인접한 평활근 세포에서 활성 구아닐레이트 시클라제를 자극한다. 구아닐레이트 시클라제가 활성화되면 cGMP의 수준을 상승시키고 평활근 세포를 이완시켜, 혈관을 확장시키고 혈류를 증가시킨다. 보다 자세한 내용은 문헌 [몬카다(Moncada) 등, New Eng. J. Med., 329, pp. 2002-2012 (1993); 및 밸랜스(Vallance) 등, J. Royl. Coll. Physician London, 28, pp. 209-219 (1994)]을 참조하시오.

내피 NO 생성이 감소되면 혈관 확장 장해, 이상 혈관 경련, 증가된 혈소판 응집과 증가된 염증 세포의 유착과 침윤을 일으킬 수 있다. 내피 NO와 내피 기능의 장해는 흡연, 고콜레스테롤혈증, 호모시스테인뇨증 및 당뇨병을 포함한 관상동맥 질병에 대한 위험 인자와 연관된다. 관상동맥에서 NO 조정된 활성이 변경되면 급성 관상동맥 증후군이 심근 경색에 이를 수 있다. 내피 NO 시스템의 손상과 그 결과 혈관 수축은 뇌졸중과 같은 대뇌 허혈증에서 뉴런에 대한 손상을 악화시키는 것에 관련된다. 또한, 최근의 연구에서는 내피 NO가 인슐린에 대한 혈관 민감도를 조정하여, NO 생산을 증가시키면 당뇨병의 혈관 효과를 치료하는데 유용할 수 있는 것으로 나타났다.

일반적으로, 맥관 구조내에서 NO 수준을 증가시키는 것이 당뇨병, 뇌졸중, 아테롬성 동맥경화증 및 고혈압과 같은 많은 병리 상태에서 유익함을 나타내는 실험 및 임상적 증거가 많이 있다.

맥관 구조내에서 NO 수준을 상승시키기 위한 현재의 치료법은 고용량의 L-아르기닌 (eNOS의 기질), 또는 대사적으로 NO를 방출하는 니트로글리세린 또는 나트륨 니트로프루시드와 같은 화합물을 투여하는 것이다. 이들 치료법이 효과적일 수 있지만, 이들 각각은 바람직하지 않은 부작용을 나타낸다. 또한, 이들 치료법은 그들의 인체로부터의 신속한 청소율로 인해 NO를 지속적으로 방출하지 못하는 점에서 불리하다.

맥관 구조내에서 NO의 농도를 증가시킬 수 있는 신규한 치료법이 존재한다면 매우 유익할 것이다.

본 발명은 유기 화학과 약물학 분야에 속하며, 특히, 혈관 내피 세포에서 내피 일산화질소(NO)의 합성을 증가시키기 위한 화합물 및 방법을 제공한다.

본 발명은 하기 화학식 I의 화합물 또는 제약학적으로 허용되는 그의 염 또는 용매화물 유효량을 내피 유래 NO의 증가를 요하는 사람에게 투여하는 것을 포함하는 내피 유래 NO를 증가시키는 방법을 제공한다.

상기 식에서,

R₁은 R, -Cl 또는 -F이며;

본 발명은 화학식 I의 화합물인 선택된 군의 2-아릴 벤조[b]티오펜이 eNOS와 내피 유래 NO 농도를 증가시키는데 있어서 유용하다는 발견에 관한 것이다.

본 명세서에서 화합물의 설명에 사용한 일반 용어는 그의 통상의 의미를 포함한다. 예를 들면, "C₁-C₄알킬"은 메틸, 에틸, 프로필, 이소-프로필 및 n-부틸 등을 포함하는 1 내지 4개의 탄소 원자의 직쇄 또는 분지쇄 지방족 사슬을 나타낸다.

용어 "치환된 페닐"은 C₁-C₄알킬, C₁-C₄알콕시, 히드록시, 니트로, 클로로, 플루오로 또는 트리(클로로 또는 플루오로)메틸로 이루어진 군 중에서 선택된 1 또는 2개의 치환기를 갖는 페닐기를 나타낸다. 용어 "O(C₁-C₄알킬)"은 메톡시, 에톡시, n-프로폭시 및 이소-프로폭시 등과 같이 산소 브릿지를 통해 결합된 C₁-C₄알킬기를 나타낸다.

용어 "제약학적으로 허용되는 염"은 비독성인 것으로 알려져 있는 산 부가염 또는 염기 부가염을 나타내며, 약학 문헌에 일반적으로 사용된다. 일반적으로 사용되는 산 부가염은 황산, 질산, 염산, 브롬화수소산, 인산 및 아인산 등을 첨가하여 형성된 무기산염; 또는 아세트산, 포름산, 벤조산, 시트르산 및 메탄술폰산 등을 첨가하여 형성된 유기산염을 포함한다. 일반적으로 사용되는 염기 부가염은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 수산화물, 수산화암모늄 및 알킬 또는 방향족 아민 등에 의해 형성된 염을 포함한다. 본 발명의 바람직한 염은 염산염이다.

용어 "일산화질소(NO)가 결핍되거나 이를 요하는 생리학적 질환을 억제하는"은 상기 생리학적 질환의 진행, 심각도 또는 결과의 증상이나 효과를 억제하거나, 예방하거나, 방지하거나, 느리게하거나, 중단시키거나 역전시키는 것을 포함한다. 그러한 생리학적 질환은 병적 혈소판 응집, 병적 혈관 수축, 당뇨병의 혈관 효과, 뇌졸중, 아테롬성 동맥경화증 및 이상 혈관 경련과 같은 본 명세서에서 언급한 것을 포함한다.

용어 "용매화물"은 화학식 I의 화합물과 같은 하나 이상의 용질 분자를 하나 이상의 적당한 용매 분자와 함께 포함하는 응집물을 나타낸다.

본 발명의 바람직한 실시태양인 랄옥시펜 염산염은 R 및 R₁이 각각 히드록실이고, R₂가 1-피페리디닐인 화학식 I의 화합물의 염산염이다. 랄옥시펜의 화학명은 [2-(4-히드록시페닐)-6-히드록시벤조[b]티엔-3-일][4-[2-(1-피페리디닐)에톡시]페닐]메타논 염산염이다.

일반적으로, 하나 이상의 화학식 I의 화합물은 통상의 부형제, 희석제 또는 담체와 함께 제형화하여 정제로 압축하거나, 간편한 경구 투여용 엘릭서제 또는 액제로서 제형화하거나, 근육내 또는 정맥내 경로로 투여한다. 화합물은 경피 투여할 수 있고, 지속 방출 투여형 등으로 제형화할 수도 있다.

본 발명의 방법에 사용된 화합물은 모두 본원에 참고로 인용한 미국 특허 제4,133,814호, 동 제4,418,068호, 동 제4,380,635호 및 동 제5,393,763호에 상세히 기재된 바와 같은 확립된 방법에 따라 제조할 수 있다. 일반적으로, 그 방법은 6-히드록실기 및 2-(4-히드록시페닐)기를 갖는 벤조[b]티오펜을 출발 물질로 사용한다. 출발 화합물을 보호하고, 아실화시키고, 탈보호시켜 화학식 I의 화합물을 형성한다. 그러한 화합물의 제조예는 상기 미국 특허들에 나타나있다.

본 발명의 방법에 사용된 화합물은 매우 다양한 유기산과 무기산, 및 염기와 함께 제약학적으로 허용되는 산 부가염 및 염기 부가염을 형성하며, 제약 화학에서 종종 사용되는 생리학적으로 허용되는 염을 포함한다. 그러한 염은 또한 본 발명의 일부를 구성한다. 그러한 염을 형성하기 위해 사용된 전형적인 무기산은 염산, 브롬화수소산, 요오드화수소산, 질산, 황산, 인산 및 차인산 등을 포함한다. 지방족 모노카르복실산 및 디카르복실산, 페닐 치환 알칸산, 히드록시알칸산 및 히드록시알칸디오산, 방향족산, 지방족 및 방향족 술폰산과 같은 유기산으로부터 유도된 염을 또한 사용할 수 있다. 따라서, 그러한 제약학적으로 허용되는 염은 아세트산염, 페닐아세트산염, 트리플루오로아세트산염, 아크릴산염, 아스코르브산염, 벤조산염, 클로로벤조산염, 디니트로벤조산염, 히드록시벤조산염, 메톡시벤조산염, 메틸벤조산염, o-아세톡시벤조산염, 나프탈렌-2-벤조산염, 브롬화물, 이소부티르산염, 페닐부티르산염, β-히드록시부티르산염, 부틴-1,4-디오산염, 헥신-1,4-디오산염, 카프린산염, 카프릴산염, 염화물, 신남산염, 시트르산염, 포름산염, 푸마르산염, 글리콜산염, 헵탄산염, 히푸르산염, 락트산염, 말산염, 말레산염, 히드록시말레산염, 말론산염, 만델산염, 메실산염, 니코틴산염, 이소니코틴산염, 질산염, 옥살산염, 프탈산염, 테레프탈산염, 인산염, 일수소인산염, 이수소인산염, 메타인산염, 피로인산염, 프로피올산염, 프로피온산염, 페닐프로피온산염, 살리실산염, 세바신산염, 숙신산염, 수베린산염, 황산염, 중황산염, 피로황산염, 아황산염, 중아황산염, 술폰산염, 벤젠-술폰산염, p-브로모페닐술폰산염, 클로로벤젠술폰산염, 에탄술폰산염, 2-히드록시에탄술폰산염, 메탄술폰산염, 나프탈렌-1-술폰산염, 나프탈렌-2-술폰산염, p-톨루엔술폰산염, 크실렌술폰산염 및 주석산염 등을 포함한다. 바람직한 염은 염산염이다.

제약학적으로 허용되는 산 부가염은 전형적으로 화학식 Ⅰ의 화합물을 등몰량 또는 과량의 산과 반응시킴으로써 형성한다. 반응물들은 일반적으로 디에틸 에테르 또는 벤젠과 같은 공용매 중에서 혼합한다. 염은 일반적으로 약 1시간 내지 10일 내에 용액으로부터 석출되며, 이를 여과하여 단리할 수 있거나 통상의 방법으로 용매를 스트리핑시킬 수 있다.

본원에서 사용하는 용어 "유효량"은 치료를 요하는 사람에서 내피 유래 NO 농도를 증가시킬 수 있는 화학식 I의 화합물의 양을 의미한다. 치료를 요하는 사람은 관상동맥 질병 위험 인자 및 당뇨병 등에 의한 내피 NO 조절 경로의 손상으로 인해 혈관수축 또는 부적절한 혈소판 응집으로 고통받는 환자를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 본 발명에서 계획한 바와 같이, 화학식 I의 화합물은 내피 NO 조절 경로의 손상으로 인한 병리적 후유증을 억제하거나, 개선시키거나, 감소시키거나, 제한하거나 예방하는데 있어서 유용할 것이다.

물론, 본 발명에 따라 투여되는 화합물의 구체적인 투여량은 예를 들면, 투여되는 화합물, 투여 경로, 환자의 건강 상태와 치료할 병리적 질병을 포함하는 케이스를 둘러싼 구체적인 환경에 의해 결정될 것이다. 전형적인 일일 투여량은 본 발명의 화합물 약 0.1 내지 약 1000㎎/일의 비독성 투여 수준을 함유할 것이고, 더 특히 약 15 내지 약 80㎎/일로 매일 1회 내지 3회 또는 효능을 나타내기 위해 필요한 만큼 빈번하게 투여할 것이다.

또한, 화학식 I의 화합물은 내피 NO 경로와 서로 영향을 끼치는 다른 약물, 예를 들면, 니트로글리세린, 나트륨 니트로프루시드 및 L-아르기닌 등과 동시에 또는 순차적으로 사용할 수 있다.

용어 "제약학적으로 허용되는 제형"은 담체, 희석제, 부형제 및 염이 제형의 활성 성분(화학식 I의 화합물)과 상호 적합하여야 하고, 그의 수여자에게 유해하지 않아야 함을 의미한다.

제약 제형은 당업계의 공지 절차에 의해 제조할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 화합물은 통상의 부형제, 희석제 또는 담체와 함께 제형화하여 정제 및 캡슐제 등으로 형성할 수 있다. 그러한 제형화에 적합한 부형제, 희석제 및 담체의 예로는 전분, 당, 만니톨 및 규산 유도체와 같은 충전제 및 증량제; 카르복시메틸 셀룰로스 및 기타 셀룰로스 유도체, 알긴산염, 젤라틴 및 폴리비닐 피롤리돈과 같은 결합제; 글리세롤과 같은 보습제; 한천, 탄산칼슘 및 중탄산나트륨과 같은 붕해제; 파라핀과 같은 용해 지연제; 4급 암모늄 화합물과 같은 재흡수 촉진제; 세틸 알코올 및 글리세롤 모노스테아레이트와 같은 계면활성제; 카올린 및 벤토나이트와 같은 흡착성 담체; 및 탈크, 칼슘 및 마그네슘 스테아레이트, 및 고체 폴리에틸 글리콜과 같은 윤활제를 포함한다. 최종 약제 형태는 사용되는 부형제의 유형에 따라 환제, 정제, 분말제, 로젠지제, 시럽제, 에어로졸제, 사세제, 카세트제, 엘릭서제, 현탁액제, 유화액제, 연고제, 좌제, 멸균 주사액제, 또는 멸균 포장 분말제일 수 있다.

또한, 본 발명의 화합물은 지속 방출 투여형으로 제형화하기에 매우 적합하다. 제형은 또한 활성 성분만을 방출하거나, 또는 바람직하게는 장관의 특정 부위에서, 가능하게는 장기간에 걸쳐 방출하도록 조성할 수 있다. 그러한 제형은 고분자 물질 또는 왁스로부터 제조할 수 있는 코팅, 엔벨롭 및 보호 매트릭스를 포함한다.

하기 제형예는 예시의 목적으로 제공하며, 어떠한 방식으로도 제한하는 것을 의도하지 않는다. 제형 중 총 활성 성분은 제형의 0.1 중량% 내지 99.9 중량%를 구성한다. 용어 "활성 성분"은 화학식 I의 화합물 또는 그의 염 또는 용매화물을 의미한다.

제형예

제형예 1: 젤라틴 캡슐제

경질 젤라틴 캡슐제를 하기 성분을 사용하여 제조한다:

성분	양 (㎎/캡슐)
활성 성분	0.1 - 1000
전분, NF	0 - 650
유동성 전분 분말	0 - 650
실리콘 유액 (점도 350 센티스톡크스)	0 - 15

상기 성분들을 배합하고, 45 메쉬 U.S. 체를 통하여 통과시킨 다음, 경질 젤라틴 캡슐에 충전하였다.

상기 제형은 제공되는 적당한 변수에 따라 변화시킬 수 있다.

정제 제형은 하기 성분들을 사용하여 제조한다:

제형예 2: 정제

성분	양 (㎎/정제)
활성 성분	2.5 - 1000
셀룰로스 (마이크로결정성)	200 - 650
이산화규소 (발연)	10 - 650
스테아르산	5 - 15

상기 성분들을 배합하고 압축하여 정제를 형성하였다.

별법으로, 각각 2.5 내지 1000㎎의 활성 성분을 함유하는 정제는 하기와 같이 제조한다:

제형예 3: 정제

성분	양 (㎎/정제)
활성 성분	2.5 - 1000
전분	45
셀룰로스 (마이크로결정성)	35
폴리비닐피롤리돈 (10% 수용액)	4
나트륨 카르복시메틸 셀룰로스	4.5
마그네슘 스테아레이트	0.5
탈크	1

활성 성분, 전분 및 셀룰로스를 45 메쉬 U.S. 체를 통하여 통과시킨 다음, 충분히 혼합하였다. 폴리비닐피롤리돈의 용액을 생성된 분말과 혼합한 다음, 이를 14 메쉬 U.S. 체를 통하여 통과시켰다. 이렇게 생성된 과립을 50 내지 60℃에서 건조시키고, 18 메쉬 U.S. 체를 통하여 통과시켰다. 이어서, 미리 60 메쉬 U.S. 체를 통하여 통과시킨 나트륨 카르복시메틸 셀룰로스, 마그네슘 스테아레이트 및 탈크를 과립에 첨가하고, 혼합시킨 후에 타정기 상에서 압축시켜 정제를 얻었다.

각각 5㎖ 투여량 당 0.1 내지 1000㎎의 활성 성분을 함유하는 현탁액제는 다음과 같이 제조한다:

제형예 4: 현탁액제

성분	양 (㎎/5㎖)
활성 성분	0.1 - 1000 ㎎
나트륨 카르복시메틸 셀룰로스	50 ㎎
시럽	1.25 ㎎
벤조산 용액	0.10 ㎖
향미료	충분량
착색제	충분량
정제수	총 5 ㎖가 되게 하는 양

활성 성분을 45 메쉬 U.S. 체를 통하여 통과시키고, 나트륨 카르복시메틸 셀룰로스 및 시럽과 혼합하여 부드러운 페이스트를 형성하였다. 벤조산 용액, 향미료 및 착색제를 약간의 물로 희석하여, 교반하면서 첨가하였다. 이어서, 충분한 물을 첨가하여 요구되는 부피를 채웠다.

하기 성분들을 함유하는 에어로졸 액제를 제조한다:

제형예 5: 에어로졸제

성분	양 (중량%)
활성 성분	0.25
에탄올	25.75
프로펠란트 22 (클로로디플루오로메탄)	70.00

활성 성분을 에탄올과 혼합하고, 혼합물을 프로펠란트 22 일부에 첨가하고, 30℃로 냉각시키고 충전 장치에 옮겨담았다. 이어서, 필요한 양을 스테인레스강 용기에 넣고 나머지 프로펠란트로 희석하였다. 이어서, 밸브 유닛을 용기에 달았다.

좌제는 하기와 같이 제조한다:

제형예 6: 좌제

성분	양 (㎎/좌제)
활성 성분	250
포화 지방산 글리세리드	2,000

활성 성분을 60 메쉬 U.S. 체를 통하여 통과시키고, 최소의 필요열을 이용하여 미리 용융시킨 포화 지방산 글리세리드에 현탁시켰다. 이어서, 혼합물을 공칭 2g 용적의 좌제틀에 붓고 냉각시켰다.

정맥내 제형은 하기와 같이 제조한다:

제형예 7: 정맥내 액제

성분	양
활성 성분	50 ㎎
등장 염수	1,000 ㎖

상기 성분들의 용액은 약 1㎖/분의 속도로 환자에게 정맥내 투여한다.

시험 절차

내피 조직에서 NO의 농도를 상승시키는 본 발명의 화합물의 효능을 증명하기 위해 하기 시험 시스템을 이용하였다.

세포 배양:

냉동 보관된 단일 기증자의 사람 태정맥 내피 세포(HUVEC)를 클로네틱스 코퍼레이션(Clonetics Corporation, 캘리포니아주 샌디에고)에서 구입하였다. 클로네틱스에서 이들 세포를 1°(1회 통과 세포)로 정의하였다. 세포를 액체 질소 내에 보관하고, 매회 실험마다 새로 분취액을 취했다. 세포를 해동시키고 75㎖의 배지를 포함하는 T-75 플라스크에 넣었다. 모든 HUVEC 배양에 대해, 모든 실험 기기 (코닝(Corning))를 37℃에서 20분 동안 M199 배지 (깁코(Gibco)) 중 0.2% 젤라틴 (시그마 케미칼 캄파니(Sigma Chemical Co.))으로 피복하였다. 세포를 10% 태송아지 혈청 (깁코), 50 ㎍/㎖의 내피 세포 정상 보충물 (콜래보래티브 바이오케미칼 프로덕츠(Collaborative Biochemical Products, 매사추세츠주 베드포드)), 100㎍/㎖의 돼지 헤파린 (깁코), 10 단위/㎖의 페니실린, 10㎍/㎖의 스트렙토마이신 및 0.2mM의 L-글루타민을 함유하는, 페놀 레드가 없는 M199 배지 중에서 37℃ 및 5% CO₂에서 배양하였다. 2°배양 세포가 70-90% 융합되었을 때, 이를 15㎖의 배지를 포함하는 젤라틴 피복된 T-75 플라스크 상에 1:3으로 나누어 3°배양 세포를 얻었다. 이들 배양물이 70-90% 융합된 이후, 전형적으로는 3 내지 4일 후, 이들 4°배양 세포를 1㎖의 배지 중의 피복된 12웰 평판 상에 1:3으로 나누었다. 모든 실험은 이들 4회 통과 세포를 사용하여 수행하였다. 72시간 후, 세포가 융합되었고 약물 처리를 개시하였다. 사용된 배지는 흡인 제거하고, 약물을 함유하는 약물 시험 배지 1㎖를 첨가하였다 (15% 젤화 말 혈청 (제미니 바이오프로덕츠(Gemini Bioproducts, 캘리포니아주 캘러바사스); 10 단위/㎖의 페니실린, 10㎍/㎖의 스트렙토마이신 및 0.2mM의 L-글루타민). 화학식 I의 시험 화합물 또는 17-β-에스트라디올의 원액을 DMSO 중에 10mM로 제조하였다. 세포를 37℃에서 48시간 동안 약물로 처리하였다.

일산화질소 의존성 cGMP의 유도

배양기에서 3개의 평판(1 실험)을 꺼내어 냉각되는 것을 방지하기 위해 종이 타월 위에 놓았다. 한번에 1개 평판에서 배지를 제거하고 1㎖의 따뜻한 HBSS (깁코)를 첨가하였다. 이를 제거하고, 0.5㎖의 평형 완충액+/-200㎕의 L-NAME (N-니트로-L-아르기닌 메틸 에스테르, 시그마)으로 교체하였다. 평형 완충액은 HBSS, 10mM HEPES, 1.2mM CaCl₂, 0.6mM MgSO₄및 0.5mM 이소부틸 메틸 잔틴 (IBMX)과 10uM의 L-아르기닌으로 이루어지며, 이들은 각각의 원액에 새로 첨가하였다. IBMX는 37℃에서 DMSO 중 200mM 원액으로서 제조하였다. 세포를 5% CO₂중에서 37℃에서 30분 동안 평형화시켰다. 배양시킨 후, 자극제를 포함하는 "자극" 완충액 0.5㎖을 10분 동안 첨가하였다. 대조군들에 대한 자극 완충액은 평형화 완충액+다음 지정된 자극제: 1) 네가티브 대조군, 2) 포지티브 대조군, 1 mM 나트륨 니트로프루시드 (시그마), 3) 1uM의 A-23187 (칼슘 이오노포어) (시그마), 4) 1uM의 A-23187 및 200uM의 L-NAME (이 대조군은 본 분석에서 나타나는 효과(cGMP 증가)가 완전히 내피 세포에서 생산된 NO에 의한 것임을 증명한다)로 이루어진다. 화학식 I의 화합물로 처리한 시험 세포를 1uM의 A-23187로 자극하였다. 10분후, 완충액을 제거하고 200㎕의 0.01N HCl을 첨가하고, 세포를 4℃에서 30분 동안 진동(rocking)시킴으로써 cGMP를 추출하였다. 각각 200㎕의 분취액을 1N NaOH 2㎕를 포함하는 튜브에 넣었다. 샘플을 -20℃로 냉동시켜 보관하였다. 평판의 각 웰에 0.1N NaOH 중 0.5% SDS 250㎕를 첨가하여 부착된 세포들을 가용화시켰다. 평판을 플라스틱 랩으로 둘러싸고 -20℃로 냉동시켜, 이후 BCA법 (피어스 케미칼 캄파니(Pierce Chemical Co.))으로 단백질 분석하였다. (본 실험에서 모든 웰에 대해 단백질의 평균 총량(㎎)을 측정하여, cGMP 함량을 표준화하기 위해 사용하였다.) cGMP 함량은 효소 면역 분석 (애머샴 캄파니(Amersham Co.), RPN.226)으로 아세틸화 프로토콜에 대한 제조업자의 지시에 따라 측정하였다. 1㎖ 샘플에 대해 100㎕의 시약을 사용하는 대신, 200㎕ 샘플의 아세틸화에 20㎕의 시약을 사용하는 것을 제외하고는 지시에 따라 분석을 수행하였다. 분석은 터모맥스(thermomax) 분광광도계 상에서 450㎚에서 정량하였다.

17-β-에스트라디올의 포지티브 대조군은 NO 의존성 cGMP의 양에서 기대된 증가를 나타냈다. 화학식 I의 화합물은 이들 내피 세포에서 NO의 농도를 증가시키고 cGMP를 유도하는 것으로 밝혀졌다. 하기 표 1에 랄옥시펜 염산염에 대한 NO 의존성 cGMP의 증가를 나타냈다.

화합물	농도^a	cGMP 수준^b
대조약물	--	1.30
랄옥시펜	0.1	2.55^*
랄옥시펜	1.0	2.65^*
^apM/㎖
^bpM/㎎ (단백질)
^*p>0.01

Claims

하기 화학식 I의 화합물 또는 제약학적으로 허용되는 그의 염 또는 용매화물을 혈관 내피 세포에서 일산화질소(NO) 합성의 증가를 요하는 사람에게 투여하는 것을 포함하는 혈관 내피 세포에서 일산화질소(NO)의 합성을 증가시키는 방법.

<화학식 I>

상기 식에서,

R은 수소, -OH, -O(C₁-C₄알킬), -OCO(C₁-C₄알킬) 또는 -OCOAr (여기에서, Ar은 페닐 또는 임의로 치환된 페닐임)이고;

R₁은 R, -Cl 또는 -F이며;

R₂는 1-피롤리디닐, 1-피페리디닐 또는 1-헥사메틸렌이미노이다.
제 1 항에 있어서, 상기 화학식 I의 화합물이 [2-(4-히드록시페닐)-6-히드록시벤조[b]티엔-3-일][4-[2-(1-피페리디닐)에톡시]페닐]메타논 염산염인 방법.
하기 화학식 I의 화합물 또는 제약학적으로 허용되는 그의 염 또는 용매화물을 일산화질소(NO)가 결핍되거나 이를 요하는 생리학적 질환의 억제를 요하는 사람에게 투여하는 것을 포함하는, 일산화질소(NO)가 결핍되거나 이를 요하는 생리학적 질환의 억제 방법.

<화학식 I>

상기 식에서,

R은 수소, -OH, -O(C₁-C₄알킬), -OCO(C₁-C₄알킬) 또는 -OCOAr (여기에서, Ar은 페닐 또는 임의로 치환된 페닐임)이고;

R₁은 R, -Cl 또는 -F이며;

R₂는 1-피롤리디닐, 1-피페리디닐 또는 1-헥사메틸렌이미노이다.
제 3 항에 있어서, 상기 화학식 I의 화합물이 [2-(4-히드록시페닐)-6-히드록시벤조[b]티엔-3-일][4-[2-(1-피페리디닐)에톡시]페닐]메타논 염산염인 방법.