CZ375098A3

CZ375098A3 - Farmaceutický prostředek pro zvyšování syntézy endothelového oxidu dusičného

Info

Publication number: CZ375098A3
Application number: CZ19983750A
Authority: CZ
Inventors: Jai Pal Singh; Danny Lee Wood
Original assignee: Eli Lilly And Company
Priority date: 1997-05-16
Filing date: 1997-05-16
Publication date: 2000-01-12

Abstract

Použití derivátu 2-aiylbenzo[b]thiofenu obecného vzorce I, kde znamenáRH, OH, -O-CMalkyl, -OCO-C|.4alkyl nebo -OOOAr, kde znamenáAr popřípadě substituovaný fenyl, R1 R Cl nebo F a R21-pyrrolidinyl, 1 -piperidinyl nebo 1-hexamethylenimino, nebo jeho fermaceuticky vhodné soli nebo solvátu pro přípravu farmaceutických prostředkůpro zvyšování syntézy oxidu dusičného ve vaskulámích endotheliálních buňkách lidí a pro přípravu farmaceutického prostředku pro inhibici fyziologických stavů spojených s nedostatkemnebo s potřebou oxidu dusičného.

Description

Tento vynález se týká použití určitých derivátů 2-arylbenzo[b]thiofenu nebo jejich farmaceuticky vhodných soli nebo solvátů pro přípravu farmaceutických prostředků pro zvyšování syntézy oxidu dusnatého ve vaskulárních endotheliálních buňkách lidí a pro přípravu farmaceutického prostředku pro inhibici fyziologických stavů spojených s nedostatkem nebo s potřebou oxidu dusnatého. Vynález tak patří do oboru organické chemie a farmakologie.

Dosavadní stav techniky

Oxid dusnatý je regulátorová molekula, která má životní úlohu v normální fyziologii kardiovaskulárního, střevního, centrálního nervového a imunitního systému. Oxid dusnatý se syntetizuje z L-argininu rodinou enzymů známých jako syntáza oxidu dusnatého (NOS). Zvláště podstatná pro vynález je na vápníku závislá NOS, produkovaná ve vaskulárních endotheliálních buňkách, známá jako eNOS. V novější době byly provedeny četné studie, které spojily řízení eNOS genu s hormonem estrogen. Ukázalo se, že estrogen řídí produkci eNOS m-RNA a tak syntézu eNOS v endotheliálních buňkách. Tento vzrůst množství eNOS umožňuje endotheliálním buňkám produkovat více oxidu dusnatého v odezvu na vhodné stimuly ve vaskulárním systému.

Ve vaskulatuře endotheliálně derivovaný oxid dusnatý má četná působení, například inhibuje agregaci krevních destiček, adhezi zánětlivých buněk a proliferaci hladkých svalových buněk. Endotheliálně derivovaný oxid dusnatý je důležitým regulátorem vaskulárního tonusu. Na průtoku závislá dilatace, běžně « ·

• 9, · 9

9 9 9

9 999

99 používaný index endotheliální funkce, je ve velké míře zprostředkovávaná oxidem dusnatým.

Mechanismus regulace vaskulárního tonusu oxidem dusnatým je iniciován stimuly, například acetylchlolinem, bradykininen a smykovým napětím atd. na endotheliální výstelkové buňky. Endothe liální buňky odpovídají produkcí oxidu dusnatého z L-argininu působením eNOS. Produkovaný oxid dusnatý opouští endotheliální buňky a stimuluje aktivitu guanylátcyklázy ve vedlejších buňkách hladkého svalstva. Aktivace guanylátcyklázy zvyšuje koncentraci cGMP a způsobuje uvolnění hladkých buněk, tím dilataci cév a zvýšený průtok krve (Moncada a kol., New Eng.J.Med.,

329, 2002 až 2012 (1993); a Vallance a kol., J.Royl. Coll.

Physician London, 28., 209 až 219 (1994).

Snížená generace oxidu dusnatého může vést ke zhoršené vasodilataci, k abnormálnímu angiospazmu, ke zvýšené agregaci destiček a ke zvýšené adhezi a infiltraci zánětlivých buněk. Zhoršení endoteliálního oxidu dusnatého a endotheliální funkce jsou spojeny s rizikovými faktory pro koronární artriální nemoci včeně odvykání kouření, hyperchlosterolemie, homocycteinurie a diabetes. Změny aktivit modulovaných oxidem dusnatým v koronárních arteriích mohou přispívat k akutnímu koronárnímu syndromu vedoucímu k infarktu myokardu. Zhoršení endotheliálního oxidu dusnatého systému a následná vasokonstrikce se podílejí na zhoršení poškození neuronů při mozkových ischemických příhodách, jako je mrtvice. Kromě toho novější studie naznačují, že endotheliální oxid dusnatý zprostředkovává vaskulární citlivost k inzulínu, takže podpořená produkce oxidu dusnatého může být užitečná při ošetřování vaskulárních působení diabetes.

Obecné je velký rozsah poznatků jak experimentálních tak t ·* ·* ·*

9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 999 999

9 9 9 9

999 99 99 *» e · ···· klinických, které naznačují, že zvýšení hladiny oxidu dusnatého v cévním systému je příznivé v mnohých patologických stavech, jako jsou diabetes, mrtvice, atheroskleróza a vysoký krevní tlak.

Současná terapie k podpoře hladin oxidu dusnatého v cévním systému je buď podávání vysokých dávek L-argininu (eNOS substrát) nebo sloučenin, jako je nitroglycerin nebo nitroprussid sodný, které metabolicky uvolňují oxid dusnatý. Jakkoliv může být tato terapie účinná, má každá nežádoucí vedlejší účinky. Přídavně je nedostatkem těchto terapií neschopnost udržet pozdržené uvolňování oxidu dusnatého v důsledku jejich rychlého vylučování z těla.

Bylo by velkým přínosem, kdyby byla dostupná nová terapie ke zvýšení koncentrace oxidu dusnatého v cévním systému.

Podstata vynálezu

Předmětem tohoto vynálezu je použití derivátu 2-arylbenzo[b]thiofenu obecného vzorce I

kde znamená

R atom vodíku, hydroxylovou skupinu, -O-alkylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku, -OCO-alkylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku v alkylovém podílu nebo -OCOAr skupinu, kde znamená Ar fenylovou skupinu nebo substituovanou fenylovou skupinu

R¹ skupinu R, atom chloru nebo fluoru a

R⁴ skupinu 1-pyrrolidinylovou, 1-piperidinylovou nebo 1-hexamethyleniminoskupinu, nebo jeho farmaceuticky vhodné soli a solvátu pro přípravu farmaceutického prostředku pro zvyšování syntézy oxidu dusnatého ve vaskulárních endotheliálních buňkách lidí.

Předmětem tohoto vynálezu je také použití derivátu 2-arylbenzo[b]thiofenu svrchu uvedeného obecného vzorce I, nebo jeho farmaceuticky vhodné soli a solvátu pro přípravu farmaceutického prostředku pro inhibice fyziologických stavů spojených s nedostatkem nebo s potřebou oxidu dusnatého.

Vynález je založen na zjištění, že vybrané deriváty 2-aryl[bjbenzothiofenu (benzothiofeny) obecného vzorce I jsou užitečné pro zvyšování eNOS a koncentrace endotheliálně odvozeného oxidu dusnatého.

Obecné výrazy používané k popisu mají běžný význam. Například výrazem alkýlová skupina s 1 až 4 atomy uhlíku se vždy míní alifatická skupina s přímým nebo s rozvětveným řetězcem s 1 až 4 atomy uhlíku, včetně skupiny methylové, ethylové, propylové, isopropylové a n-butylové skupiny a podobně.

Výrazem substituovaná fenylová skupina se vždy míní fenylová skupina s jedním nebo se dvěma substituenty volenými ze ··· ··· • · · * souboru zahrnujícího alkylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku, alkoxyskupínu s 1 až 4 atomy uhlíku, hydroxylovou skupinu, nitroskupinu, atom chloru, fluoru a tri(chlor nebo fluor)methylovou skupinu. Výrazem -O-alkylová skupina s 1 až 4 atomy uhlíku se vždy míní alkylová skupina s 1 až 4 atomy uhlíku, vázaná prostřednictvím kyslíkového můstku, jako je například methoxyskupina, ethoxyskupina, n-propoxyskupina a isopropoxyskupina a podobně.

Výrazem farmaceuticky vhodná sůl se vždy míní adiční soli s kyselinou nebo se zásadou, které jsou netoxické a běžně se používají pro farmaceutické účely. Běžně používané adiční soli s kyselinami zahrnují: anorganické soli vytvořené adicí například kyseliny sírové, dusičné, chlorovodíkové, bromovodíkové, fosforečné a fosforné nebo organické soli vytvořené adicí organické kyseliny, například kyseliny octové, mravenčí, benzoové, citrónové a methansulfonové. Běžně používané adiční soli se zásadou zahrnují soli vytvořené adicí hydroxidů alkalických kovů a kovů alkalických zemin, hydroxidu amonného, alkylaminů a aromatických aminů. Výhodnou solí podle vynálezu je hydrochloridová sůl.

Výraz inhibice fyziologického stavu spojeného s nedostatkem nebo s potřebou oxidu dusnatého zahrnuje prohibici, prevenci, potlačení, zpomalení a zastavení recidivy progrese, závažnosti stavu nebo následných symptomů nebo vlivů uvedeného fyziologického stavu. Takové fyziologické stavy zahrnují stavy shora uvedené, například patologickou agregaci destiček, patologickou vasokontrikci, cévní projevy diabetes, mrtvici, atherosklerozu a abnormální vasospasmus.

Výrazem solvát se vždy míní agregát, který obsahuje jednu nebo několik molekul rozpouštědla, například sloučenina o-

- 5a becného vzorce I s jednou nebo s několika molekulami vhodného rozpouštědla.

Raloxifenhydrochlorid, který je výhodným ztělesněním tohoto vynálezu, je sloučenina spadající pod obecný vzorec I, kde znamená R a R¹ vždy hydroxylovou skupinu a R² 1-piperidinylovou skupinu, přičemž je tato sloučenina v podobě hydrochloridové soli. Chemicky se raloxifen jmenuje [2-(4-hydroxyfenyl)-6-hydroxybenzo[b]thien-3-yl][4-[2-(1-piperidenyl)ethoxy] fenyl]methanonhydrochlorid.

Obecně se alespoň jedna sloučenina obecného vzorce I zpracovává s běžnými excipienty, ředidly nebo nosiči a lisuje se na tablety nebo se zpracovává na elixíry nebo roztoky pro běžné orální podání nebo pro intramuskulární nebo intravenózní podání. Sloučeniny obecného vzorce I se také mohou podávat transdermálně a mohou se formulovat na farmaceutické prostředky s prodlouženým uvolňováním a podobně.

Sloučeniny používané podle vynálezu se mohou připravovat zavedenými způsoby, jako jsou podrobně popsanými v US patentových spisech číslo 4 133 814, 4 418 068, 4 380 635 a

• *	·· · ·
»	99	··
	99		9
• ·		9 9	9
• 9		9	•
• ·	99		»· ·	··

« · ·

9

9 9 9 9 •

··

393763. Obecně se vychází z benzofb]thiofenu majícího v poloze 6 hydroxylovou skupinu a 2-(4-hydroxyfeny1)ovou skupinu. Do výchozí látky se zavádí chránící skupina, sloučenina se acyluje, chránící skupina se odstraní za získání sloučeniny obecného vzorce I. Příklady způsobu přípravy takových sloučenin jsou popsány ve shora uvedených amerických patentových spisech

Sloučeniny obecného vzorce I, používané podle vynálezu, vytvářejí farmaceuticky vhodné adiční soli s kyselinou nebo se zásadou s nejrůznějšími anorganickými a organickými kyselinami a zásadami a vynález se tedy také týká fysiologicky vhodných solí, běžně používaných ve farmaceutickém průmyslu. Vynález zahrnuje také tyto soli.

Jakožto příklady farmaceuticky vhodných minerálních kyselin, použitelných pro přípravu farmaceuticky vhodných solí, se uvádějí příkladně kyselina chlorovodíková, bromovodíková, jodovodíková, dusičná, fosforečná, fosforná a sírová. Může se také používat solí odvozených od organických kyselin, jako jsou například alifatické monokarboxylové a dikarboxylové kyseliny, fenylovou skupinou substituované alkanoové kyseliny, hydroxyalkanoové a hydroxyalkandioové kyseliny, aromatické kyseliny, alifatické a aromatické sulfonové kyseliny.

Jakožto takové farmaceuticky vhodné soli, připravené za použití minerálních nebo organických kyselin, se uvádějí příkladně acetát, fenylacetát, trifluoracetát, akrylát, askorbát, benzoát, chlorbenzoát, methylbenzoát, methoxybenzoát, dinitrobenzoát, hydroxybenzoát, o-acetoxybenzoát, naftalen-2-benzoát, bromid, isobutyrát, fenylbutyrát, beta-hydroxybutyrát, butin1,4-dioát, hexin-1,4-dioát, kaprát, kaprylát, chlorid, cinnamát, citrát, formát, fumarát, glykolát, heptanoát, hippurát, laktát, malát, maleát, hydroxymaleát, malonát, mandelát, mesylát, nikotinát, isonikotinát, nitrát, oxalát, ftalát, tereftalát, fosfát, monohydrogenfosfát, dihydrogenfosfát, metafosfát, • · · · · · · · · « · · ··· pyrofosfát, propiolát, propionát, fenylpropionát, salicylát, sebakát, sukcinát, suberát, sulfát, hydrogensulfát, pyrosulfát, sulfit, hydrogensulfit, sulfonát, benzensulfonát, p-bromfenylsulfonát, chlorbenzensulfonát, ethansulfonát, 2-hydroxyethansulfonát, methansulfonát, naftalen-l-sulfonát, naftalen2-sulfonát, p-toluensulfonát, xylensulfonát, tartráta podobně. Výhodnou solí je hydrochloridová sůl.

Farmaceuticky vhodné adiční soli s kyselinou se zpravidla připravují reakcí sloučeniny obecného vzorce I s ekvimolárním nebo s nadbytečným množství kyseliny. Reakční složky se zpravidla mísí v rozpouštědle obou složek, jako jsou diethylether nebo benzen. Soli se zpravidla vysrážejí z roztoku v průběhu jedné hodiny až deseti dnů a mohou se izolovat filtrací nebo se rozpouštědlo může stripovat o sobě známými způsoby.

Výrazem účinné množství se vždy míní množství sloučeniny obecného vzorce I, které je schopné zvyšovat endotheliálně odvozenou koncentraci oxidu dusnatého v lidském těle, které potřebuje takové ošetření. Jakožto lidé, kteří takové ošetření potřebují, se uvádějí bez záměru na jakémkoliv omezení jedinci trpící například patologickou vasokontrikcí nebo nevhodnou agregací destiček jako následek zhoršení endotheliální regulační dráhy oxidu dusnatého rizikovými faktory koronárního onemocnění nebo diabetes a podobné. Jak je zřejmé z tohoto vynálezu, jsou sloučeniny obecného vzorce I užitečné pro inhibici, zlepšení, snížení, omezení nebo předcházení patologických potíží v důsled ku zhoršení endotheliální regulační dráhy oxidu dusnatého.

Určitá dávka podávané sloučeniny obecného vzorce I, podávaná podle vynálezu, závisí samozřejmé na zvláštních okolnostech ošetřovaného stavu, jako jsou například podávaná sloučenina, cesta podání, stav pacienta určeného k ošetření a

-8-ošetřovaných patologických potíže. Zpravidla je netoxická denní dávka účinné látky přibližně 0,1 až přibližně 1000 mg sloučeniny podle tohoto vynálezu za den a zvláště přibližně 15 až přibližně 80 mg za den. Taková dávka se podává najednou nebo až třikrát každý den nebo i častěji podle potřeby.

Sloučenina obecného vzorce I se může podávat současně nebo následně s jinými činidly, která vzájemně působí s endotheliální dráhou oxidu dusnatého, jako jsou například nitroglycerin, nitroprussid sodný, L-arginin a podobně.

Výrazem farmaceuticky vhodný prostředek se vždy míní prostředek obsahující nosič, ředidlo, excipienty a sůl kompatibilní s účinnou látkou (sloučeninou obecného vzorce I), nepůsobící nepříznivě na příjemce.

Farmaceutické prostředky se mohou připravovat způsoby známými v oboru. Například se sloučeniny obecného vzorce I mohou zpracovávat s běžnými excipienty, ředidly nebo nosiči na formu tablet, kapslí a podobně. Jakožto příklady vhodných nosičů, excipientů a ředidel se uvádějí plnidla a nastavovače, jako jsou škrob, cukry, mannitol a deriváty kyseliny křemičité; pojidla, jako jsou karboxymethylcelulóza a jiné deriváty celulózy, algináty, želatina a polyvinylpyrrolidon; zvlhčovadla, jako je glycerol; rozptylovací přísady, jako je agar agar, uhličitan vápenatý a hydrogenuhlióitan sodný; činidla zpomalující rozpouštění, jako je parafin; činidla urychlující resorpci, jako jsou kvartérní amoniové sloučeniny; povrchové aktivní činidla, jako je cetylalkohol, glycerolmonostearát; adsorpční nosiče, jako jsou kaolin a bentonit; a mazadla, jako jsou mastek, stearát vápenatý a hořečnatý a pevné polyethylenglykoly. Konečnými farmaceutickými prostředky mohou být pilulky, fe · • · · · ·

- 8a tablety, prášky, pastilky, sirupy, aerosoly, sáčky, kašety, elixíry, suspenze, emulze, masti, čípky, sterilní vstřikovatelné roztoky nebo sterilně balené prášky V závislosti na použitém excipientu.

Kromě toho jsou sloučeniny obecného vzorce I velmi dobře • · • · • · · ΒΒΒ Β vhodné pro přípravu farmaceutických prostředků s pozdrženým uvolňováním účinné látky. Farmaceutické prostředky se mohou připravovat také tak, aby uvolňovaly účinnou látku pouze nebo výhodně v určité části zažívacího traktu po možnosti po určitou dobu. Povlaky, obaly a chránící matrice se mohou připravovat například z polymerních látek nebo z vosků.

Následující příklady farmaceutických prostředků vynález toliko objasňují a nijak jej neomezují. Celkové množství účinné látky v takových prostředcích je hmotnostně 0,1 až 99,9 %, vztaženo na hmotnost prostředku jako celku. Účinnou látkou se vždy myslí sloučenina obecného vzorce I nebo její sůl nebo solvát. Procenta a díly jsou míněny vždy hmotnostně, pokud není uvedeno jinak.

Příkladv provedení

Příklad farmaceutického prostředku 1 - želatinová kapsle

Tvrdé želatinové kapsle se připravují z následujících slo-

žek:
Složka		Množství	(mg/kapsle)
účinná	látka	0, 1	až	1000
škrob,	NF	0	až	650
škrob,	rozplývavý prášek	0	až	650
silikonová kapalina 350 mPas	0	až	15

Uvedené složky se smísí, vedou se sítem No.45 mesh U.S. (průměr ok 355 mikrometrů) a plní se do tvrdých želatinových kaps1í .

Tableta se připravuje z následujících složek:

Příklad farmaceutického prostředku 2 - tablety • · · ·

Složka	Množství	(mg/tableta
účinná látka	2,5	až	1OOO
celulóza, mikrokrystalická	200	až	650
oxid křemičitý, sublimovaný	10	až	650
kyselina stearová	5	až	15

Uvedené složky se smísí a lisují se o sobě známým způsobem na tablety.

Nebo se připravují tablety, obsahující vždy 2,5 až 1000 mg účinné látky obecného vzorce I následujícím způsobem:

Příklad farmaceutického prostředku 3 - tablety

Složka účinná látka škrob celulóza, mikrokrystalická polyvinylpyrrolidon (10% roztok ve natriumkarboxymethy1 ováná celulóza stearát hořečnatý mastek

Množství (mg/tableta) 25 až 1000

45,0

35,0 vodě) 4,0

4,5 0,5 1,0 účinná látka, škrob a celulóza se vedou sítem No.45 mesh U.S. (průměr ok 355 mikrometrů) a důkladně se promísí. Se získaným práškem se smísí roztok polyvinylpyrrolidonu a směs se vede sítem No. 14 mesh U.S. (průměr ok 1400 mikrometrů). Takto získané granule se suší při teplotě 50 až 60 °C, vedou sítem No.18 mesh U.S. (průměr ok 1000 mikrometrů). Natriumkarboxymethylovaná celulóza, stearát hořečnatý a mastek se vedou sítem No. 60 mesh U.S. (průměr ok 250 mikrometrů), přidají se do granulí, promísí se a směs se lisuje na tablety.

Supenze obsahující vždy 0,1 až 1000 mg účinné látky obecného vzorce I na 5 ml dávku se připravuje následujícím způso-
bem: Příklad farmaceutického	prostředku 4 - suspenze
Složka	Množství (mg/5 ml)
účinná látka	0,1 až 1000 mg
natriumkarboxymethylcelulóza 50,00 mg
sirup	1,25 mg
roztok kyseliny benzoové	0,10 ml
chutová přísada	q.V.
barvivo	q.V.
čištěná voda do	5,0 ml

účinná látka se vede sítem No. 45 mesh U.S. (průměr ok 355 mikrometrů) a smísí se s natriumkarboxymethylcelulózou a se sirupem za vzniku hladké pasty. Přidá se za míchání roztok kyseliny benzoové, chuíové přísady a barviva, zředěné trochou vody. Pak se přidá dostatečné množství vody k dosažení požadovaného objemu.

Aerosolový roztok se připravuje z následujících složek:

Příklad farmaceutického prostředku 5 - aerosol

Složka Množství (%) účinná látka 0,25 ethanol 25,75 hnací prostředek 22 (chlordifluormethan) 70,00

Účinná látka se smísí s ethanolem a směs se přidá do části hnacího prostředku 22, ochladí se na teplotu 30 °C a převede se do plnicího zařízení. Potřebné množství se zavádí do obalů z nerezavějící oceli a zředí se zbylým hnacím prostředkem. Obal se patří ventilovou jednotkou.

« · φ φ φ

Čípky se připravují následujícím způsobem:

Příklad farmaceutického prostředku 6 - čípky

Složka účinná látka glyceridy nasycené mastné kyseliny

Množství (mg/čípek) 250

2000

Účinná látka se se vede sítem No. 60 mesh U.S. (průměr ok 250 mikrometrů) a suspenduje se v glyceridech nasycené mastné kyseliny předem roztavených za využití minimálního potřebného množství tepla. Směs se pak lije do formy na čípky o jmenovité kapacitě 2 g a nechá se vychladnout.

Intravenózní prostředek se připravuje následujícím způsobem:

Příklad farmaceutického prostředku 7 - intravenózní roztok účinná látka izotonický fyziologický roztok mg do 1000 ml

Roztok výše uvedených složek se intravenózně podává pacinetovi rychlostí okolo 1 ml za minutu.

Testovací postup

K hodnocení použitelnosti sloučeniny obecného vzorce

I ke zvýšení hladiny oxidu dusnatého v endotheliální tkáni se použijí následující testovací systémy:

Buněčné kultury

Kryokonzervované jednodonorové lidské pupečníkové cévní endotheliální buňky (HUVEC) jsou získány od společnosti • fl

- 13 Clonetics Corporation, San Diego, CA. Tyto buňky se definují značením Clonetics 1 (buňky první pasáže). Buňky se uchovávají v kapalném dusíku a podíly se čerstvě odebírají pro každý pokus. Buňky se nechají roztát a umístí se do T-75 baněk se 75 ml prostředí. Pro všechny kultury HUVEC, všechno laboratorní zboží (Corning) se povléká 0,2 % želatiny (Sigma Chemical Co.) v prostředí M199 (Gibco) po dobu 20 minut při teplotě 37 C. Buňky se nechávají růst v prostředí M199, prostém fenolové červeně s 10 % zárodečného hovězího séra (Gibco), 50 μg/ml endoteliálního buněčného růstového doplňku (Collaborative Biochemical Products, Bedford ΜΑ), 100 μg/ml vepřového heparinu (Gibco), 10 jednotek/ml penicilinu, 10 μg/ml streptomycinu a 0,2 mM L-glutaminu při teplotě 37 C a v přítomnosti 5 % oxidu uhličitého. Když kultura 2 dosáhne 70 až 90% slinutí, rozestře se 1:3 do želatinou povlečené T-75 baňky s 15 ml prostředí k získání kultury buněk 3 . Když kultura dosáhne 70 až 90% slinutí, zpravidla za 3 až 4 dny, rozestře se tato kultury buněk 4 1:3 do 12-jamkových destiček v 1 ml prostředí. Všechny pokusy se provádějí s touto čtvrtou pasáží buněk. Po 72 hodinách buňky slynou a započne se se zkouškami látky. Staré prostředí se odsaje a přidá se 1 ml zkušebního prostředí s účinnou látkou (15% želatinované koňské sérum (Gemini Bioproducts, Calabasas CA), 10 jednotek/ml penicilinu, 10 μg/ml streptomycinu a 0,2 raM L-glutaminu). Zásobní roztoky zkoušených sloučenin obecného vzorce I nebo 17-p-estradiolu se připraví v 10 mM dimethylsulfoxidu. Buňky se ošetřují zkušební látkou po dobu 48 hodin při teplotě 37 C.

Zavedení cGMP závislé na oxidu dusnatém

Tři destičky (jedna experimentální) se vyjmou z inkubátoru a umístí se na papírovou utěrku k předcházení vychladnutí.

Z jedné destičky se odstraní prostředí a přidá se 1 ml teplého ·· · • ·

HBSS (Gibco). To se odstraní a nahradí se 0,5 ml vyvažujícího pufru ± 200 ml L-NAME (N-nitro-L-argininmethylester, Sigma). Vyvažující pufr sestává z HBSS, 10 mM HEPES, 1,2 mM chloridu vápenatého, 0,6 mM síranu hořečnatého a 0,5 mM isobutylmethylxanthinu (IBMX) a ίο μΜ L-argininu, které se přidají čerstvé do každého zásobního roztoku. IBMX se připraví jako 200mM zásobní roztok v dimethylsulfoxidu při teplotě 37 C. Buňky se nechají vyvažovat po dobu 30 minut při teplotě 37 C v prostředí s 5 % oxidu uhličitého. Po inkubaci se přidá 0,5 ml stimulačního pufru v průběhu 10 minut. Stimulační pufr pro kontrolu obsahuje vyvažující pufr plus určený stimulant, kterým je: 1) negativní kontrola, 2) pozitivní kontrola, 1 mM nitroprussidu sodného (Sigma), 3) 1 μΜ A-23187 (ionofor vápníku) (Sigma), 4) 1 μΜ A-23187 a 200 μΜ L-NAME (tato kontrolní skupina dokládá, že pozorované efekty (vzrůst cGMP) při této zkoušce jsou způsobeny toliko oxidem dusnatým, produkovaným v endotheliálních buňkách). Testované buňky, ošetřované sloučeninami obecného vzorce I, se stimulují 1 μΜ A-23187. Po 10 minutách se pufry odstraní a přidá se 200 μΐ 0,01 N kyseliny chlorovodíkové a cGMP se extrahuje znehybněním buněk na dobu 30 minut při 4 C. Každý 200 ml podíl se umnístí do zkumavky, obsahující 2 μΐ IN roztoku hydroxidu sodného. Vzorky se zmrazí při -20 C pro uložení. Do každé jamky destičky se vnese 250 μΐ 0,5% SDS v 0,1 N roztoku hydroxidu sodného za účelem solubilizace vázaných buněk. Destičky se zabalí do plastického obalu a zmrazí při teplotě -20 C pro další zkoušky proteinu způsobem BCA (Pierce Chemical CO.). (Střední množství proteinu v mg se stanovuje pro všechny jamky v jednom pokuse a použijí se pro normalizaci cGMP obsahu.) Obsah cGMP se stanovuje enzymovou imunozkouškou (Amersham Co, RPN.226) podle pokynů výrobců pro acelytační protokol. Zkoušky se provádějí podle instrukcí s tou výjimkou, že acetylace 200 μΐ vzorků se provádí se 20 μΐ reakčního činidla místo se 100 μΐ na 1 ml vzorku.

·· · ···

Zkoušky se kvantifikují na spektrofotometru thermomax při 450 nM.

Pozitivní kontrola 17-pestradiolu dokládá očekávaný vzrůst množství oxidu dusnatého závislého na cGMP. Zjistilo se, že sloučeniny obecného vzorce I zvyšují koncentraci oxidu dusnatého a navozují cGMP v těchto endotheliálních buňkách. Tabulka I dokládá vzrůst oxidu dusnatého závislého na cGMP pro raloxifenhydrochlorid.

Tabulka I Sloučenina kontrola Raloxifen

Koncentrace³

0,1

1,0

Hladina cGMP^b1,30 2,55* 2,65* ^a pM/ml ^a pM/mg proteinu * p > 0,01

Průmyslová využitelnost

Derivát 2-aryl.benzo(b]thiofenu nebo jeho farmaceuticky vhodná sůl nebo solvát je vhodný pro výrobu farmaceutického prostředku pro zvyšováni syntézy oxidu dusnatého ve vaskulárních endotheliálních buňkách a pro přípravu farmaceutického prostředku pro inhibicí fyziologických stavů spojených s nedostatkem nebo s potřebou oxidu dusnatého.

• · • tttttt ·

• · tttttt· • · · · · tt • · · tttt · tttttt • · · · ·· tttt tttt

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY vzorce I (I) kde znamená

R atom vodíku, hydroxylovou skupinu, -O-alkylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku, -OCO-alkylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku v alkylovém podílu nebo -OCOAr skupinu, kde znamená Ar fenylovou skupinu nebo substituovanou fenylovou skupinu

R¹ skupinu R, atom chloru nebo fluoru a π

R skupinu l-pyrrolidinylovou, 1-piperidinylovou nebo l-hexamethyleniminoskupinu, nebo jeho farmaceuticky vhodné soli a solvátu pro přípravu farmaceutického prostředku pro zvyšování syntézy oxidu dusnatého ve vaskulárních endotheliálních buňkách lidí.
2. Použití podle nároku 1 derivátu 2-arylbenzo[b]thiofenu obecného vzorce I, kterým je [2-(4-hydroxyfenyl)-6-hydroxy17 ···« ·· ·· ·· • · · · 9 · • · 9 9 9 9

9 99 999 99 9 • · · · • ·9 99 99 benzo[b]thien-3-yl][4-[2-(1-piperidenyl)ethoxy]fenyljmethanonhydrochlorid.
3. Použití derivátu 2-arylbenzo[b]thiofenu obecného vzorce I kde znamená

R atom vodíku, hydroxylovou skupinu, -O-alkylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku, -OCO-alkylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku v alkylovém podílu nebo -OCOAr skupinu, kde znamená Ar fenylovou skupinu nebo substituovanou fenylovou skupinu

R skupinu R, atom chloru nebo fluoru a

R² skupinu 1-pyrrolidinylovou, 1-piperidinylovou nebo 1-hexamethyleniminoskupinu, nebo jeho farmaceuticky vhodné soli a solvátu pro přípravu farmaceutického prostředku pro inhibice fyziologických stavů spojených s nedostatkem nebo s potřebou oxidu dusnatého.
4. Použiti podle nároku 3 derivátu 2-arylbenzo[b]thiofenu obecného vzorce I, kterým je [2-(4-hydroxyfenyl)-6-hydroxybenzo[b]thien-3-ylJ[4-[2-(1-piperidenyl)ethoxy]fenylJmethanonhydrochlorid.