CN108186678A - 羟基化碳纳米管在制备抑制β-淀粉样蛋白聚集的药物的用途 - Google Patents

Abstract

本公开提供了一种羟基化碳纳米管在制备抑制β‑淀粉样蛋白聚集的药物的用途，涉及医药技术领域，提供了羟基化碳纳米管的一种新用途，作为Aβ42聚集抑制剂用于制备用于治疗阿尔兹海默症的药物。本公开适用于阿尔兹海默症的治疗。

Description

羟基化碳纳米管在制备抑制β-淀粉样蛋白聚集的药物的用途

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体涉及羟基化修饰碳纳米管在制备抑制β-淀粉样蛋白聚集的药物的用途，尤其涉及羟基化碳纳米管作为Aβ42聚集抑制剂用于制备阿尔兹海默症的药物中的用途。

背景技术

阿尔兹海默症(Alzheimer’s Disease，AD)是最为常见的老年痴呆症之一。其病症表现为认知和记忆功能障碍、情绪不稳定等症状。很多研究表明，AD患者脑内的神经突触损伤，神经细胞凋亡，大脑萎缩，脑组织呈现神经元纤维缠结，脑血管和神经细胞外有淀粉样斑块沉积。其主要成分为磷酸化的Tau蛋白和β-淀粉样蛋白(amyloid β-protein，Aβ)。因此，AD与Aβ聚集之间存在极为密切的联系。

Aβ是由其前体蛋白质在β-和γ-分泌酶的水解作用下形成的含有39～43个氨基酸的多肽——Aβ肽段。由于γ-分泌酶的水解位点不同从而产生不同类型的Aβ肽段，如Aβ39，Aβ40，Aβ42和Aβ43。其中Aβ40和Aβ42是最主要的两种肽段。与Aβ40相比Aβ42在羧基端多出两个疏水性氨基酸残基(I和A)，因此其疏水性增强，更易聚集，且聚集形成的聚集体的毒性更大。

越来越多的研究表明单体没有毒性，但其聚集体通过多种作用方式产生细胞毒性，引起神经元变性甚至凋亡，脑内胶质细胞活性增高，从而激发体内炎症反应。研究表明，这些症状的出现均先于淀粉样斑块的形成，与病人体内的可溶性寡聚体的浓度密切相关。因此目前将聚集以及可溶性寡聚体的形成视为研究重点。

由于AD与Aβ的聚集沉淀密切相关，因此如何阻止Aβ的聚集沉淀就成为当前研究者关注的热点问题。目前，稳定Aβ初始结构及抑制其聚集也是最安全和可靠的治疗AD的方法。

现有的聚集抑制剂主要分为有机小分子类、多肽类、蛋白及酶类、抗体类、纳米颗粒类和金属鳌合剂类等。近年来，由于纳米粒子具有独特的特殊物理化学特性以及良好的生物相容性，已被广泛用于蛋白、小分子和细胞的相互作用研究。

因此，提供更多的纳米粒子型β-淀粉样蛋白聚集抑制剂，促进AD的治疗进展，是本领域的一个重点。

发明内容

本发明旨在提供羟基化碳纳米管在制备抑制β-淀粉样蛋白聚集的药物中的用途，提供了羟基化碳纳米管的一种新用途，为Aβ42聚集抑制剂提供一种新的纳米粒子型候选者。

本发明的技术方案如下：

本发明提供一种羟基化碳纳米管在制备抑制β-淀粉样蛋白聚集的药物的用途，所述β-淀粉样蛋白为Aβ42。

其中，所述羟基化碳纳米管的外径1～2纳米、长度0.5～2微米。

所述羟基化碳纳米管的羟基含量为3wt％～6wt％。

所述药物用于治疗阿尔兹海默症。

所述羟基化碳纳米管由化学气相沉积法制备得到。

进一步地，所述羟基化碳纳米管以羟基化碳纳米管水分散体系存在。特别地，以浓度为0.006mg/mL～0.06mg/mL的羟基化碳纳米管水分散体系存在。进一步地特别地，以浓度为0.012mg/mL～0.06mg/mL的羟基化碳纳米管水分散体系存在。

本发明提供了一种羟基化碳纳米管在制备抑制β-淀粉样蛋白聚集的药物的用途，羟基化碳纳米管能够有效抑制Aβ42的聚集并改变聚集的形貌，阻止并减缓了其向纤维状形貌的转化；有效抑制了Aβ42聚集体对细胞产生的毒性。羟基化碳纳米管通过羟基化功能化用于制备抑制β-淀粉样蛋白聚集的药物中时，不仅减少了纳米材料本身的细胞毒性，而且可以作为一种潜在的新药分子，可以有效抑制Aβ42的聚集及其构象变化过程，并降低Aβ42聚集过程中所产生的细胞毒性作用，是Aβ42聚集的理想抑制剂。本发明发现了羟基化碳纳米管的一种新用途，为Aβ42聚集抑制剂提供一种新的纳米粒子型候选者。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1：本发明实施例1中不同浓度SWNT-OH与Aβ42共培养不同时间后培养物的ThT荧光图。

图2：本发明实施例2中SWNT-OH与Aβ42共培养不同时间后培养物的AFM图。

图3：本发明实施例3中不同浓度SWNT-OH与Aβ42共培养24h后培养物对PC12细胞的MTT细胞毒性图。其中，1～5分别为对照组(contro1)、Aβ42、0.0006mg/mL SWNT-OH-25μM Aβ42、0.0012mg/mL SWNT-OH-25μM Aβ42、0.006mg/mL SWNTOH-25μM Aβ42。

图4：本发明实施例4中SWNT-OH与Aβ42共培养24h后培养物对PC12的FDA/PI染色图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明实施例提供一种羟基化碳纳米管(SWNT-OH)在制备抑制β-淀粉样蛋白聚集的药物的用途，所述β-淀粉样蛋白为Aβ42。

在本发明实施例中，羟基化碳纳米管作为Aβ42聚集抑制剂，抑制Aβ42的聚集。

AD与Aβ的聚集沉淀密切相关。通过施用β-淀粉样蛋白聚集抑制剂稳定Aβ初始结构及抑制其聚集，是目前最安全也最可靠的治疗AD的方法。目前，提供更多的纳米粒子型β-淀粉样蛋白聚集抑制剂，是本领域的热点问题。

碳纳米管作为一维纳米材料，重量轻，六边形结构连接完美，除了具有纳米粒子的尺寸效应外，还具有力学强度大、柔韧性好、电导率高等独特性质，因而目前广泛用于储氢材料、双电层超级大容器、作为载体运送生物活性分子及药物、吸波和隐身材料、导电金属基复合材料以及高断裂应力陶瓷材料、催化剂。

本发明实施例为碳纳米管提供一种新的用途，具体提供了羟基化碳纳米管(SWNT-OH)的一种新用途，为Aβ42聚集抑制剂提供一种新的纳米粒子型候选者，提供了羟基化碳纳米管作为Aβ42聚集抑制剂用于制备β-淀粉样蛋白聚集的药物中的用途。

本发明实施例提供了一种羟基化碳纳米管在制备抑制β-淀粉样蛋白聚集的药物的用途，羟基化碳纳米管能够有效抑制Aβ42的聚集并改变聚集的形貌，阻止并减缓了其向纤维状形貌的转化；有效抑制了Aβ42聚集体对细胞产生的毒性。羟基化碳纳米管通过羟基化功能化用于制备抑制β-淀粉样蛋白聚集的药物中时，不仅减少了纳米材料本身的细胞毒性，而且可以作为一种潜在的新药分子，可以有效抑制Aβ42的聚集及其构象变化过程，并降低Aβ42聚集过程中所产生的细胞毒性作用，是Aβ42聚集的理想抑制剂。

其中，所述药物用于治疗阿尔兹海默症。本发明实施例提供了羟基化碳纳米管作为Aβ聚集抑制剂在制备用于治疗阿尔兹海默症的药物中的用途。阿尔兹海默症是最为常见的老年痴呆症之一。本发明实施例提供的用途促进了治疗阿尔兹海默症的研究进展。

本发明实施例适用的羟基化碳纳米管，其外径可以为1～2纳米、长度可以为0.5～2微米。

本发明实施例适用的羟基化碳纳米管，其羟基含量可以为3wt％～6wt％。即，羟基含量约为羟基化碳纳米管的3wt％～6wt％，例如可以为4.5wt％、4.8wt％、5wt％、5.6wt％、6wt％、6.8％、8wt％等。

本发明实施例适用的羟基化碳纳米管可以由电弧法、化学气相沉积法、热分解聚合物法、离子束法等制备得到。本发明在此不作具体限定。

本发明一优选实施例中，适用的羟基化碳纳米管可以由化学气相沉积法制备得到。通过化学气相沉积法制备得到羟基化碳纳米管，尺寸分布均匀，具有高纯度的预期直径和长度。

本发明实施例的用途中，适用的羟基化碳纳米管可以以羟基化碳纳米管的粉末混合物的形式存在，即，羟基化碳纳米管可以用于制备用于抑制β-淀粉样蛋白聚集的粉末混合物型药物，如片剂、硬胶囊；或者，可以以羟基化碳纳米管的分散体系的形式存在，即，羟基化碳纳米管可以用于制备用于抑制β-淀粉样蛋白聚集的液体型药物，如注射液、软胶囊。

其中，羟基化碳纳米管的分散体系，是指羟基化碳纳米管以一定浓度分散在溶剂中形成的分散体系。

进一步地，在分散体系中，羟基化碳纳米管的的浓度可以为0.006mg/mL～0.06mg/mL。

在本发明一实施例中，适用的羟基化碳纳米管可以以羟基化碳纳米管水分散体系存在。其中，本发明实施例中，羟基化碳纳米管水分散体系是指羟基化碳纳米管以一定浓度分散在水中形成的分散体系。

具体地，适用的羟基化碳纳米管可以以浓度为0.006mg/mL～0.06mg/mL的羟基化碳纳米管水分散体系存在。优选地，以浓度为0.012mg/mL～0.06mg/mL，例如可以为0.012、0.018、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06mg/mL的羟基化碳纳米管水分散体系存在。

现有的纳米粒子用作纳米类抑制剂在纳米医学和生物医学领域中的使用，很大一阻碍因素在于现有的纳米粒子多为低溶解性颗粒。本发明实施例提供的羟基化碳纳米管在制备用于抑制β-淀粉样蛋白聚集的药物的用途，羟基化碳纳米管可以以羟基化碳纳米管水分散体系存在，不仅可以减少纳米材料本身的细胞毒性，而且改善了水溶性，有效抑制Aβ42的聚集并改变了聚集的形貌，阻止并减缓了其向纤维状形貌的转化；有效抑制了Aβ42聚集体对细胞产生的毒性。

下面对本发明实施例提供的羟基化碳纳米管在制备抑制β-淀粉样蛋白聚集的药物的用途进一步详细阐述。

其中，下述实验中使用的羟基化碳纳米管、阿尔茨海默氏病淀粉样多肽Aβ42、六氟异丙醇、PBS、PC12细胞等通过购买获得。

下述实验使用的羟基化碳纳米管，其外径1～2纳米、长度0.5～2微米、羟基含量6wt％。

实施例1：不同浓度SWNT-OH与Aβ42共培养不同时间后培养物的硫黄素(ThT)荧光强度变化

首先将Aβ42溶于六氟异丙醇溶液，得到1mg/mL的Aβ42溶液，超声10min，使Aβ42处于单分散状态，冷冻干燥，获得Aβ42干粉，于-20℃保存。

称取19.93mgThT溶于1L磷酸盐缓冲液(PBS，其中磷酸盐浓度为100mM，NaCL浓度为10mM)配制62.5μM ThT母液。

称取0.5mg上述得到的Aβ42干粉，溶于0.4mL 20mM的NaOH溶液中，使其终浓度为275μM，超声10min使之充分溶解，记为Aβ42母液。

将浓度为275μM的Aβ42母液，16000g离心20min去除已经发生聚集的多肽。取上清75％，加入ThT母液，按终浓度比为1∶1用PBS稀释至25μM，37℃原位培养。

称取1mg SWNT-OH溶于1mL DMSO中获得浓度为1mg/mL的SWNT-OH母液。

将浓度为275μM的Aβ42母液与SWNT-OH母液按梯度稀释，获得SWNT-OH终浓度分别为0.006mg/mL、0.012mg/mL、0.06mg/mL的Aβ42溶液(此时溶液中的Aβ42和ThT的浓度均为25μM)，分别记为Aβ42+0.006mg/mL SWNT-OH、Aβ42+0.012mg/mL SWNT-OH、Aβ42+0.06mg/mLSWNT-OH。将三种溶液在37℃进行原位培养。

在不同培养时间下测定其在440nm处激发波长和480nm处发射波长下的荧光强度，激发和发射缝宽均为5nm，扫描速度为100nm/min，扫描结果均为3次平均值。将480nm处的荧光强度对时间作图，结果如图1所示。

由图1可知，加入SWNT-OH后Aβ42的ThT荧光强度明显下降，且ThT荧光下降程度与SWNT-OH浓度呈正比，说明SWNT-OH有效抑制了Aβ42的聚集。

实施例2：SWNT-OH与Aβ共培养不同时间后培养物的聚集形态变化

按照与实施例1相同的方式处理Aβ分子，并配制含有浓度为0.06mg/mL SWNT-OH的Aβ42溶液，溶液中Aβ42的终浓度为25μM。将上述溶液于37℃、200rpm条件下进行培养。

在不同培养时间下，取100μL Aβ42培养液，超声10min，在干净的培养皿中用双面胶固定好圆形铁片，再在圆形铁片上用双面胶固定好云母片，然后用透明胶带连续将云母片粘三次，去掉云母片的不干净层数。后用20μL的移液枪，取20μL超声好的样品滴在云母片上，待5-10min后，再用移液枪取200μL屈臣氏纯净水缓慢冲洗5次(总共冲洗用水量为1mL)，后自然晾干。然后用原子力显微镜(AFM)(JEOL Inc.，Tokyo，Japan)进行观察，检测电压为100KV，选取放大尺度为1μm的图像进行观察，结果如图2所示。

由图2可知，加入SWNT-OH后Aβ聚集的速度和聚集体的形貌发生了变化，例如在未培养时溶液多中多为圆点状的单体和很小的聚集体；培养时间为1d时，Aβ单独培养时出现了寡聚体和少量的纤维聚集体(图2b)，加入SWNT-OH组则以小的寡聚体为主，并伴有小的短棒状聚集体(图2e)；培养时间为3d时，Aβ单独培养组出现了大量的成熟纤维，小的寡聚体基本消失(图2c)，加入SWNT-OH组则出现少量的短棒状和丝状聚集体，并未出现成熟的纤维聚集体(图2f)。这说明SWNT-OH的存在改变了Aβ聚集体的形貌，阻止了其向纤维的转化。也证实了SWNT-OH对于Aβ聚集具有抑制的效果。

实施例3：用MTT方法检测不同浓度的SWNT-OH与Aβ42共培养24h后培养物对PC12细胞的细胞毒性

细胞毒性实验中使用的细胞为鼠肾上腺嗜铬瘤细胞株(PC12)。首先，取低分化细胞，用含有10％胎牛血清和1％青霉素一链霉素的培养基进行培养，并向培养基中加入神经细胞生长因子(nerve growth ractor，NGF)，使其终浓度为50ng/mL，5％CO₂，37℃培养3天。观察到PC12细胞在NGF诱导下长出较长的突起，成为高分化细胞后向培养瓶中加入含有0.25％胰酶的溶液对高分化细胞进行消化，再用含有10％胎牛血清和1％青霉素一链霉素的DMEM培养基以适当浓度稀释细胞，以5×10³cell/孔的细胞浓度加入到96孔板，每孔90μL。5％CO₂，37℃培养24h。

配制Aβ42，SWNT-OH终浓度分别为0.006mg/mL，0.012mg/mL，0.06mg/mL的Aβ42溶液(此时溶液中的Aβ的浓度均为30μM)，其中Aβ42的处理方法与实施例1相同，37℃培养24h。

将上述老化好的Aβ42和加入不同浓度的SWNT-OH的Aβ42溶液加入到已经培养24h的含有PCI2的96孔板中，10μL/孔。空白对照孔中不加SWNT-OH和Aβ42溶液，而加入PBS缓冲液10μL/孔。最终使加药孔每孔中SWNT-OH终浓度为0.0006mg/mL，0.0012mg/mL，0.006mg/mL，Aβ42的终浓度为3μM。细胞在培养箱中以5％CO₂，37℃培养48h后，加入10μL/孔的MTT溶液，使得培养基中的MTT终浓度为0.5mg/mL。5％CO₂，37℃条件继续培养4h。

移除96孔板中溶液。每孔加入100μL的DMSO摇床震荡10min，检测570nm处吸光值。将培养基中不合Aβ42和SWNT-OH孔作为空白对照组，记为细胞活性为100％，然后将其作为对照计算加药组的细胞存活率(图3)。

实验中每个SWNT-OH浓度梯度设置6个复孔。由图3可知，Aβ42单独存在时，细胞存活率为49％。而加入不同浓度的SWNT-OH(0.0006、0.0012、0.006mg/mL)后细胞存活率提高到51％、53％、59％，说明SWNT-OH能够有效抑制Aβ42产生的细胞毒性。

实施例4：用FDA/PI混合双染检测SWNT-OH与Aβ42共培养24h后培养物对PC12的细胞毒性

配制储藏液，称取FDA(荧光素双醋酸酯)5mg，加入15mL离心管。加入1mL的丙酮，振荡，包住锡纸并标记，-4℃度低温保存。称取PI(碘化丙啶)1mg，加入15mL离心管。加入1mL的PBS缓冲液，振荡，包住锡纸并标记，-4℃低温保存。配制工作液，取10mL的PBS到离心管，加入FDA储存液20μL.PI储存液50μL，使FDA终浓度为10μg/mL，PI终浓度为5μg/mL，包住锡纸并标记，-4℃度低温保存。

取与实施例3相同方法分化处理好的PC12细胞，以密度5×104cell/mL稀释细胞，加入到6孔板，每孔2mL。5％CO₂，37℃培养24h。

配制浓度为0.06mg/mL的SWNT-OH溶液、Aβ42、SWNT-OH终浓度为0.06mg/mL的Aβ42溶液(此时溶液中的Aβ42的浓度均为30μM)，其中Aβ42的处理方法与实施例1相同，37℃培养24h。

将上述老化好的SWNT-OH、Aβ42、SWNT-OH的Aβ42溶液加入到已经培养24h的含有PC12的6孔板中，200μL/孔。空白对照孔中加入PBS缓冲液200μL/孔。细胞在培养箱中以5％CO₂，37℃培养48h后，进行FDA/PI混合双染。

慢速轻轻吸出培养基。用PBS轻洗2次并吸出。慢速贴壁加入染色液染色1-2min，PBS轻洗后荧光显微镜进行观察(图4)。与对照组相比Aβ42可以使能被FDA染色的存活细胞数量减少，使能被PI染色的凋亡细胞数量增加。加入SWNT-OH后，可以明显降低Aβ42引起的细胞凋亡，并且其本身细胞毒性很小。

本公开提出了SWNT-OH在制备抑制β-淀粉样蛋白聚集的药物的用途，并将其应用于Aβ42聚集和细胞毒性抑制实验。通过实验进一步表明，SWNT-OH能够有效抑制Aβ42聚集，可作为Aβ42聚集抑制剂用于制备治疗阿尔兹海默症的药物。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应所述以权利要求的保护范围为准。

Claims (8)

1.羟基化碳纳米管在制备抑制β-淀粉样蛋白聚集的药物的用途，其中，所述β-淀粉样蛋白为Aβ42。

2.根据权利要求1所述的羟基化碳纳米管在制备抑制β-淀粉样蛋白的聚集的药物的用途，其特征在于，所述羟基化碳纳米管作为Aβ42聚集抑制剂用于制备治疗阿尔兹海默症的药物。

3.根据权利要求2所述的羟基化碳纳米管在制备抑制β-淀粉样蛋白的聚集的药物的用途，其特征在于，所述羟基化碳纳米管的羟基含量为4wt％～8wt％。

4.根据权利要求2所述的羟基化碳纳米管在制备抑制β-淀粉样蛋白的聚集的药物的用途，其特征在于，所述羟基化碳纳米管的外径1～2纳米、长度0.5～2微米。

5.根据权利要求2所述的羟基化碳纳米管在制备抑制β-淀粉样蛋白的聚集的药物的用途，其特征在于，所述羟基化碳纳米管由化学气相沉积法制备得到。

6.根据权利要求2所述的羟基化碳纳米管在制备抑制β-淀粉样蛋白的聚集的药物的用途，其特征在于，所述药物的剂型可以为片剂、硬胶囊或软胶囊。

7.根据权利要求1～5任一项所述的羟基化碳纳米管在制备抑制β-淀粉样蛋白的聚集的药物的用途，其特征在于，所述羟基化碳纳米管以羟基化碳纳米管水分散体系存在。

8.根据权利要求7所述的羟基化碳纳米管在制备抑制β-淀粉样蛋白的聚集的药物的用途，其特征在于，所述羟基化碳纳米管以浓度为0.006mg/mL～0.06mg/mL的羟基化碳纳米管水分散体系存在。