CN1109750A - 抑制成淀粉样蛋白的作用的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了抑制与成淀粉样蛋白有关的生理 疾病的方法，该方法包括给需要这种抑制的人施用式 I化合物或其药学上适用的盐或溶剂化物，其中R1和R3独立地为氢、
Figure 94112880.6_AB_0
烷基)或
Figure 94112880.6_AB_1
这里Ar是任意取代的苯基；
R2选自吡咯烷子基、六亚甲基亚氨基和哌啶子基。

Description

阿尔茨海默症（AD）是一种脑变性疾病，其临床特征在于逐渐丧失记忆、认知、推理、判断力和情绪稳定性，这将逐渐导致极度精神衰退并最终死亡。AD是老年人进行性精神衰退（痴呆）的常见原因，并且据信在美国它是第四位最常见的医学死因。AD已经广泛地发现于世界范围的不同人种及人群中，并且表明是目前和将来主要的公共健康问题。目前估计仅在美国就有约2-3百万人患有此疾病。迄今为止证明AD是不能治愈的。
AD患者的脑显示出神经元变性，以及被不同地称作为成淀粉样（amyloidogenic）斑、血管淀粉样血管病和神经原纤维昆布（tangles）的各种特征损伤。大多数这类损伤、特别是成淀粉样斑和神经原纤维昆布一般发现于AD患者有关记忆和认知的几个重要人脑区。在更限制的解剖学分布中更少数的这类损伤发现于大多数临床未患有AD的老年人的大脑中。成淀粉样斑和血管淀粉样血管病也是Trisomy21（唐氏综合征）和具有Dutch-Type淀粉样变性的遗传性大脑出血（HCHWA-D）患者脑的特征。目前，确诊AD通常需要观察患有上述疾病的已死亡患者的大脑组织中的上述损伤，或者偶尔有时观察侵入性神经外科手术过程中取出的少量脑组织的活检样品中的上述损伤。
几种证据表明，具体的成淀粉样蛋白，β-淀粉样蛋白（βAP）的进行性大脑沉积在AD的发病机理中扮演了种子的作用，并且可能先于认知症状几年或几十年。参见Selkoe，（1991）Neuron6：487。近来已表明βAP从培养基中生长的神经元细胞中释放出来，并且既存在于正常人的脑脊髓液（CSF）中也存在于AD患者的脑脊髓液中。参见Seubert等人，（1992）Nature    359：325-327。
除了阿尔茨海默症和其他与成淀粉样肽βAP有关的疾病之外，还存在与其他成淀粉样肽有关的疾病，这些成淀粉样肽结构上类似于βAP，但是与βAP无同源序列。近来的研究已证明了与神经毒性有关的许多这些成淀粉样肽的功能互换性。P.C.May等人，Journal    of    Neurochemistry，（1993年12月）；未决美国专利申请08/109，782，1993年8月19日申请（Docket-X-9342）。
尽管在了解AD和其它成淀粉样相关疾病的根本机理方面已经取得了进展，仍然需要寻找治疗这些疾病的组合物和方法。治疗方法应该有利地以药物为基础，这些药物能够抑制成淀粉样蛋白的产生或影响。
本发明包括抑制与成淀粉样蛋白有关的生理疾病的方法，该方法包括给需要这种治疗的人施用有效量的式Ⅰ化合物，或其药学上适用的盐或溶剂化物，
其中R1和R3独立地为氢、-CH3、
Figure 941128806_IMG20
（C1-C6烷基）或
Figure 941128806_IMG21
，其中Ar是任意取代的苯基；
R2选自吡咯烷子基（pyrrolidino）、六亚甲基亚氨基和哌啶子基。
本发明还提供了抑制成淀粉样蛋白产生的方法，该方法包括给需要这种抑制的人施用有效量的式Ⅰ化合物。
本发明还提供了抑制淀粉样斑沉积的方法，该方法包括给需要这种抑制的人施用有效量的式Ⅰ化合物。
本发明还提供了抑制阿尔茨海默症（AD）的方法，该方法包括给需要这种治疗的人施用有效量的式Ⅰ化合物。
本发明涉及发现了式Ⅰ的一组经选择的苯并噻吩类化合物适用于抑制成淀粉样蛋白的影响，尤其是该化合物抑制成淀粉样蛋白形成。本发明包括的用途是通过给需要抑制与成淀粉样蛋白特别是β-淀粉样蛋白有关的生理疾病的人施用抑制有效剂量的式Ⅰ化合物或其药学上适用的盐或溶剂化物来实施。
术语“抑制”包括其通常可接受的意义，包括阻止、防止、遏制和减缓、终止或逆转疾病的进程、严重程度或者所发生的症状。因此该方法包括治疗和预防给药。
术语“与成淀粉样蛋白有关的生理疾病”包括至少一种成淀粉样蛋白在例如脑、肝、肾或其他器官中不适当的或不希望的沉积，因此包括AD（包括家族的AD）、唐氏综合征，HCHWA-D以及脑高度衰老等。
术语“有效量”视具体情况是指抑制与成淀粉样蛋白有关的生理影响或疾病、或者抑制成淀粉样蛋白产生或沉积、或者抑制阿尔茨海默症所需化合物的量。
本文所用术语“成淀粉样蛋白”是指能够自缔合成更高度有序的聚集体并最终聚集为淀粉样斑的那些肽。优选的目的成淀粉样蛋白是β-淀粉样蛋白。
通常可以将本发明化合物与普通的赋形剂、稀释剂或载体一起配制，并压制成片剂、或者配制成方便口服给药的酏剂或溶液剂；或者通过肌内或静脉途径给药。该化合物可以经皮给药，并且可以配制成缓释剂型等。
本发明方法所使用的化合物可以按已有的和类似的方法（例如US4，133，814、4，418，068和4，380，635中所述的方法，这些专利引入本文作为参考）制备。一般，该方法用具有6-羟基和2-（4-羟苯基）基团的苯并[b]噻吩开始。将起始化合物保护、烷基化并脱保护，得到式Ⅰ化合物。在上述美国专利中以及该申请的实施例中提供了这些化合物的制备实例。任意取代的苯基包括苯基和由C1-C6烷基、C1-C4烷氧基、羟基、硝基、氯、氟或三（氯或氟）甲基取代一次或二次的苯基。
本发明包括下式化合物，即雷洛昔芬：
用于本发明方法的化合物可以与多种有机和无机酸、碱生成药学上适用的酸和碱加成盐，药学上适用的酸和碱加成盐包括通常用于药物化学上的生理上适用的盐。所述盐也包括在本发明的范围内。用于生成上述盐的典型的无机酸包括盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硝酸、硫酸、磷酸、连二磷酸等。可以应用由有机酸生成的盐，有机酸包括脂肪族一或二羧酸、苯基取代的链烷酸、羟基链烷酸和羟基链烷二酸，以及芳香族酸、脂肪族和芳香族磺酸。因此所述药学上适用的盐包括乙酸盐、苯基乙酸盐、三氟乙酸盐、丙烯酸盐、抗坏血酸盐、苯甲酸盐、氯代苯甲酸盐、二硝基苯甲酸盐、羟基苯甲酸盐、甲氧基苯甲酸盐、甲基苯甲酸盐、邻-乙酰氧基苯甲酸盐、萘-2-苯甲酸盐、溴化物、异丁酸盐、苯基丁酸盐、β-羟基丁酸盐、丁炔-1，4-二酸盐、己炔-1，4-二酸盐、癸酸盐、辛酸盐、氯化物、肉桂酸盐、柠檬酸盐、甲酸盐、富马酸盐、羟基乙酸盐、庚酸盐、马尿酸盐、乳酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、羟基马来酸盐、丙二酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐、烟酸盐、异烟酸盐、硝酸盐、草酸盐、邻苯二甲酸盐、对苯二甲酸盐、磷酸盐、磷酸一氢盐、磷酸二氢盐、偏磷酸盐、焦磷酸盐、丙炔酸盐、丙酸盐、苯基丙酸盐、水杨酸盐、癸二酸盐、琥珀酸盐、辛二酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、焦硫酸盐、亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、磺酸盐、苯磺酸盐、对溴苯磺酸盐、氯代苯磺酸盐、乙烷磺酸盐、2-羟基乙烷磺酸盐、甲磺酸盐、萘-1-磺酸盐、萘-2-磺酸盐、对甲苯磺酸盐、二甲苯磺酸盐、酒石酸盐等。优选的盐是盐酸盐。
药学上适用的酸加成盐一般可通过式Ⅰ化合物与等摩尔或过量的酸反应制得。反应物通常于互溶剂如乙醚或苯中进行反应。盐一般在约1小时～10天内从溶液中析出，并且可以经过滤分离，或者按常规方法除去溶剂。
通常用于生成盐的碱包括氢氧化铵、碱金属和碱土金属氢氧化物、碳酸盐，以及脂肪族和芳香族胺，脂肪族二胺和羟基烷基胺。用于制备加成盐的碱尤其包括氢氧化铵、碳酸钾、碳酸氢钠、氢氧化钙、甲胺、二乙胺、乙二胺、环己胺和乙醇胺。
与化合物（由该化合物衍生得到盐）相比较，药学上适用的盐通常有提高溶解度的性质，因此通常更适用于配制成液剂或乳剂。
药物制剂可按本技术领域已知的方法制备。例如，将化合物与常用的赋形剂、稀释剂或载体一起配制，并可配制成片剂、胶囊剂、混悬液剂、粉剂等。适用于上述制剂的赋形剂、稀释剂和载体包括：填充剂和增量剂如淀粉、糖、甘露糖醇以及硅衍生物；粘合剂如羧甲基纤维素和其他的纤维素衍生物，藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮；湿润剂如甘油；崩解剂如碳酸钙和碳酸氢钠；阻滞溶解剂如石蜡；吸收促进剂如季铵化合物；表面活性剂如鲸蜡醇、单硬脂酸甘油酯；吸附载体如高岭土和膨润土；以及润滑剂如滑石、硬脂酸钙和硬脂酸镁以及固体聚乙二醇。
本发明的化合物也可以配制成方便口服给药的酏剂或溶液剂，或者配制成适于非经胃肠道（如经肌内、皮下或静脉途径）给药的溶液剂。另外，本发明化合物还非常适用于配制成缓释剂型等。缓释制剂可以这样构成，以使它们仅仅或最好在肠道的特定部位，可能在一定时间内释放活性成分。包衣、包膜和保护基质可以由例如聚合物质或蜡制成。
可以施用式Ⅰ化合物预防和/或治疗与一种或多种成淀粉样蛋白有关的疾病，例如阿尔茨海默症、唐氏综合征和脑高度衰老。当用于治疗时，给已患病的宿主施用该化合物。该化合物的用量足以抑制与成淀粉样蛋白、特别是β-淀粉样蛋白有关的生理影响或疾病。
当用于预防时，给对与成淀粉样蛋白有关的疾病（尤其是阿尔茨海默症）敏感的、但不是已患有该疾病的宿主施用式Ⅰ化合物。这些宿主可以按照医学文献（参见例如Goate，Nature，349:704-706（1991））中所述的基因筛选和临床分析识别。该化合物在症状早期抑制淀粉样蛋白斑，甚至优选防止与该疾病有关的成淀粉样蛋白的初始阶段。对于预防或治疗目的，优选接受本发明化合物的一组人是绝经后的妇女。
根据本发明，式Ⅰ化合物的具体剂量取决于由主治医生确定的疾病严重程度、给药途径和有关因素。一般来讲，每天可接受的有效剂量为约0.1至约1000mg/天，更通常为约50-200mg/天。可以每天一次至约三次给需要治疗的患者施用上述剂量，或者根据需要更经常地施用，用药时间达到足以抑制该疾病或症状。
经常希望或需要将药物组合物直接或间接引入脑中。直接引入技术通常包括将药物释放导管置于宿主的脑室系统中以绕开血-脑屏障。间接引入技术（通常优选这种技术）包括配制该组合物，以通过亲水性药物转化为脂溶性药物使药物潜伏（latentiation）下来。一般来说，通过保护药物上存在的羟基、羧基和伯胺基，使得药物脂溶性更强并且顺利地通过血-脑屏障，实现所述潜伏。或者，可以通过动脉内输注高渗溶液（该溶液可以瞬时打开血-脑屏障）促进亲水药物的释放。
如施用带有碱性基团（如哌啶子基环）的药物时惯用其酸加成盐一样，通常优选施用酸加成盐形式的式Ⅰ化合物。为此目的，以下剂型是适用的。
制剂在以下制剂中，“活性成分”是指式Ⅰ化合物。
制剂1：明胶胶囊剂
硬明胶胶囊剂按下面方法制备
成分        量(mg/胶囊)
活性成分        0.1-1000
淀粉,NF        0-650
可流动的淀粉粉末        0-650
聚硅氧烷流体(350厘沲)        0-15
将上述成分混合，通过美国45号筛并将其装入硬明胶胶囊。
已经制备的化合物雷洛昔芬的具体胶囊剂实施例包括下列制剂：
制剂2：雷洛昔芬胶囊剂
成分        量(mg/胶囊)
雷洛昔芬        1
淀粉,NF        112
可流动的淀粉粉末        225.3
聚硅氧烷流体(350厘沲)        1.7
制剂3:雷洛昔芬胶囊剂
成分        量(mg/胶囊)
雷洛昔芬        5
淀粉,NF        108
可流动的淀粉粉末        225.3
聚硅氧烷流体(350厘沲)        1.7
制剂4:雷洛昔芬胶囊剂
成分        量(mg/胶囊)
雷洛昔芬        10
淀粉,NF        103
可流动的淀粉粉末        225.3
聚硅氧烷流体(350厘沲)        1.7
制剂5:雷洛昔芬胶囊剂
成分        量(mg/胶囊)
雷洛昔芬        50
淀粉,NF        150
可流动的淀粉粉末        397
聚硅氧烷流体(350厘沲)        3.0
按照合理的改变，还可以将上述具体的制剂进行变化。
用下述成分制备片剂：
制剂6：片剂
成分        量(mg/片)
活性成分        0.1-1000
微晶纤维素        0-650
煅制的二氧化硅        0-650
硬脂酸        0-15
将上述成分混合并压制成片剂。
另外，每片含0.1～1000mg活性成分的片剂可以按下法制备：
制剂7：片剂
成分        量(mg/片)
活性成分        0.1-1000
淀粉        45
微晶纤维素        35
聚乙烯吡咯烷酮(为10%的水溶液)        4
羧甲基纤维素钠        4.5
硬脂酸镁        0.5
滑石        1
将活性成分、淀粉和纤维素通过美国45号筛，并充分地混合。使聚乙烯吡咯烷酮溶液与得到的粉末混合，然后再通过美国14号筛。得到的颗粒于50～60℃干燥并通过美国18号筛。将预先通过美国60号筛的羧甲基纤维素钠、硬脂酸镁和滑石加到颗粒中，在混合以后将其在压片机上压制成片剂。
每5ml剂量含0.1-1000mg药物的各个混悬液剂可按下示制备：
制剂8：混悬液剂
成分        量(mg/5ml)
活性成分        0.1-1000mg
羧甲基纤维素钠        50mg
糖浆        1.25mg
苯甲酸溶液        0.10ml
调味剂        适量
着色剂        适量
纯水        加至        5ml
将药物通过美国45号筛并与羧甲基纤维素钠和糖浆混合，得到调匀的糊状物。苯甲酸溶液、调味剂和着色剂用一部分水稀释，并在搅拌下加入糊状物中。然后加入足够的水到所需体积。
试验方法
实验设计
对于试验1和2，进行下列实验设计。
淀粉不溶素可以从Bachem，Inc.（Torrance，California）、Peninsula Laboratories，Inc.（Belmont，California）、Sigma Chemicals（St.Louis，MO）购得，或者如下文所述合成。淀粉样蛋白-β（1-40）[Lot#ZK052]和逆β-淀粉样肽（40-1）[Lot#ZX299]可以从Bachem，Inc.购得。β2-小球蛋白可以从Sigma Chemicals（St.Louis，Missouri）购得。
用无热源无菌水即时配制肽贮液（1mM），用确定的培养基稀释至指定浓度。将大鼠海马培养物（体外10-14天）用肽或赋形剂处理4天。通过相衬显微镜目视估测大鼠皮质培养物的存活力，并通过测量释放在培养基中的乳酸脱氢酶（LDH）进行定量。
用肽或赋形剂处理人皮质培养物（体外19-22天）三天。用相衬显微镜目视评估细胞存活力，并通过测量四唑鎓盐XTT的减少进行定量。
本领域专业人员能够理解，可以用其他技术（例如监测钙离子水平）测量细胞的存活力，以及随后测量毒性。下文描述了LDH和XTT技术以及钙离子水平监测试验。
试验1
测定钙离子水平的神经毒性试验
将各等份ED18皮质细胞体外接种于涂覆有聚亚乙基亚胺的组织培养皿中保持3-5天，然后用25μMβ-淀粉样肽溶液处理，该溶液可以是新溶解的（主要是无规则的螺旋状）也可以是制备好的（7天，主要是β-片状）。于补充有胎牛血清的、化学确定的、HEPES缓冲的DMEM中进行神经毒性试验。
用β-淀粉样肽培养2天后，用荧光钙染料测定谷氨酸脉冲后胞液钙离子（Ca+2）浓度的上升（J.Wahl等人，Journal of Neurochemistry，53:1316（1989））。胞内Ca+2水平的上升损害细胞的完整性。再次进行上述操作，不同的是采用本发明化合物。与第一次操作相比，胞内Ca+2水平的下降说明了本发明化合物的活性。
试验2
测定XTT的神经毒性试验
将各等份ED18皮质细胞体外接种于涂覆有聚亚乙基亚胺的组织培养皿中保持3-5天，然后用25μMβ-淀粉样肽溶液处理，该溶液可以是新溶解的（主要是无规则的螺旋状）也可以是制备好的（7天，主要是β-片状）。于补充有胎牛血清的、化学确定的、HEPES缓冲的DMEM中进行神经毒性试验。
将这些细胞体外培养3-5天，然后用25μMβ-淀粉样肽溶液处理，该溶液可以是新溶解的（主要是无规则的螺旋状）也可以是制备好的（7天，主要是β-片状）。培养2天后，采用N.Roehm等人所述方法（Journal    of    Immunological    Methods，142：257（1992）），通过测量四唑鎓盐XTT[2，3-二（2-甲氧基-4-硝基-5-磺苯基）-2H-四唑鎓-5-甲酰苯胺内盐]的减少评估细胞的存活力。再次进行上述操作，不同的是采用本发明化合物。与第一次操作相比，细胞的存活力的增加说明了本发明化合物的活性。
试验3
测定LDH的神经毒性试验
在96孔检测板中，使用标准340mm动力学LDH测验系统（assay）（Sigma    Catalog    Number    #228-20）在20μ1各等份条件限定的DMEM中测定乳酸脱氢酶（LDH）。在37℃，于PC驱动的EL340Microplate    Biokinetics板阅读器（Bio-Tek    Instruments）中进行测定，用Delta    SoftⅡ软件（V.3.30B，BioMetallics，Inc.）进行数据分析。每次试验都运行含有正常和升高的血清LDH水平的质量控制标准（例如，Sigma    Enzyme    Controls    2N和2E）。向一部分孔中加入不同浓度的本发明化合物。结果以LDH/L为单位表示，其中1单位定义为在试验条件下每分钟催化形成1微摩尔烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的酶量。与对照相比，神经毒性指示剂水平的下降表明了本发明化合物的活性。
试验4
用能够形成淀粉样沉积的VV：99或VV：42感染细胞，（如WO91/04339中所述，1991年4月4日公开，该专利引入本文作为参考），并将细胞铺在96孔微滴板上。为了进行合适的稀释和添加，使用自动移液管将待试的式Ⅰ化合物引入细胞中。在37℃，于组织培养器中将各种浓度的所述化合物与细胞一起培养（或预培养）预定的时间，或者培养3-72小时。
培养后，除去培养基，并如下所述制备细胞，进行Preamyloid测定。固定细胞，用淀粉样蛋白抗体进行免疫细胞化学印染。引入一级抗体，然后用标记的二级抗-抗体进行培养，并用ELISA板阅读器测定一级与二级抗体间的结合水平，以记录标记抗体的光密度。与无试验药物存在下生长的细胞对照样品相比，较小的光密度读数表明了该药物抑制淀粉样蛋白沉积的能力。可以对该进行方法改变，以便采用校正的酶标记物检测preamyloid的溶解。与对照相比，preamyloid测量中的下降表明了式Ⅰ化合物的活性。
试验5
选择5-50名妇女进行临床研究。这些妇女均为绝经后妇女，即在研究开始前已停止行经6-12个月，并且已诊断出患有早期阿尔茨海默症（AD），预期在研究阶段其AD症状会恶化，但是总的来说其它方面是健康的。该研究设安慰剂对照组，即将这些妇女分为两组，一组接受本发明的活性剂，另一组接受安慰剂。对患者的与AD有关的记忆、认知、推理和其他症状测定基准点。试验组的妇女每天口服50-200mg活性剂。连续治疗6-36个月。准确记录各组基准点症状的情况，在研究结束时对这些结果进行比较。在每组受试者之间进行结果比较，还将每位患者的症状与研究开始前每位患者报告的症状进行比较。通过抑制了摄取试验药物的患者中AD的任何一或多个症状，说明了试验药物的活性。
通过至少一个上述试验中的活性说明了式Ⅰ化合物的效用。

Claims (8)

1、适于抑制与成淀粉样蛋白过量有关的生理疾病的药物组合物，该组合物含有式Ⅰ化合物或其药学上适用的盐或溶剂化物作为活性成分，
其中R1和R3独立地为氢、-CH3、
Figure 941128806_IMG5
，其中Ar是任意取代的苯基；
R2选自吡咯烷子基、六亚甲基亚氨基和哌啶子基。
2、权利要求1的药物组合物，其中所述化合物是下式化合物或其盐酸盐，
Figure 941128806_IMG6
3、适于抑制成淀粉样蛋白产生的药物组合物，该组合物含有式Ⅰ化合物或其药学上适用的盐或溶剂化物作为活性成分，
Figure 941128806_IMG7
其中R1和R3独立地为氢、-CH3、
Figure 941128806_IMG8
（C1-C6烷基）或
Figure 941128806_IMG9
，其中Ar是任意取代的苯基；
R2选自吡咯烷子基、六亚甲基亚氨基和哌啶子基。
4、权利要求3的药物组合物，其中所述化合物是下式化合物或其盐酸盐，
5、适于抑制淀粉样斑沉积的药物组合物，该组合物含有式Ⅰ化合物或其药学上适用的盐或溶剂化物作为活性成分，
Figure 941128806_IMG11
其中R1和R3独立地为氢、-CH3、
Figure 941128806_IMG12
（C1-C6烷基）或
Figure 941128806_IMG13
，其中Ar是任意取代的苯基；
R2选自吡咯烷子基、六亚甲基亚氨基和哌啶子基。
6、权利要求5的药物组合物，其中所述化合物是下式化合物或其盐酸盐，
7、适于抑制阿尔茨海默症的药物组合物，该组合物含有式Ⅰ化合物或其药学上适用的盐或溶剂化物作为活性成分，
其中R1和R3独立地为氢、-CH3、 （C1-C6烷基）或 ，其中Ar是任意取代的苯基；
R2选自吡咯烷子基、六亚甲基亚氨基和哌啶子基。
8、权利要求7的药物组合物，其中所述化合物是下式化合物或其盐酸盐，
Figure 941128806_IMG18
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