JPH07177877A - イーストによるガス及びアルコール生成の改良 - Google Patents
イーストによるガス及びアルコール生成の改良Info
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- JPH07177877A JPH07177877A JP6229120A JP22912094A JPH07177877A JP H07177877 A JPH07177877 A JP H07177877A JP 6229120 A JP6229120 A JP 6229120A JP 22912094 A JP22912094 A JP 22912094A JP H07177877 A JPH07177877 A JP H07177877A
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
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- Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
- Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
- Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel
Abstract
(57)【要約】
【目的】 イーストによる気体及びアルコール生成率を
改良する。 【構成】 イーストがガス及びアルコールの生成に関し
て１以上のストレス因子にさらされるような条件下で醗
酵の解糖経路に１回以上の無益回路を導入する。
改良する。 【構成】 イーストがガス及びアルコールの生成に関し
て１以上のストレス因子にさらされるような条件下で醗
酵の解糖経路に１回以上の無益回路を導入する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はイーストによるガス及び
アルコール生成の改良に関する。
アルコール生成の改良に関する。
【０００２】
【従来の技術】例えば、サッカロミセス属に属するよう
なイースト菌株は、エタノールの生成及びパンの醗酵に
広く使用されている。イースト細胞は、例えばマルトー
ス、グルコース及びサッカロースのようなドウ内で有効
な醗酵可能な糖を等モル量のＣＯ2 及びエタノールに迅
速に醗酵変換させるのに非常に効果的な機構を具備す
る。長年、イースト研究における重要な目的の一はパン
イースト（乾燥物質が９２〜９４％の活性ドライ、９４
〜９７％の即席ドライ、２６〜３３％の圧搾、又は１５
〜２１％のクリームドライとして入手しうる）のＣＯ2
生成率の改良である。このため、種々の古典的な雑種生
成及び分子遺伝による方法が適用されている。
なイースト菌株は、エタノールの生成及びパンの醗酵に
広く使用されている。イースト細胞は、例えばマルトー
ス、グルコース及びサッカロースのようなドウ内で有効
な醗酵可能な糖を等モル量のＣＯ2 及びエタノールに迅
速に醗酵変換させるのに非常に効果的な機構を具備す
る。長年、イースト研究における重要な目的の一はパン
イースト（乾燥物質が９２〜９４％の活性ドライ、９４
〜９７％の即席ドライ、２６〜３３％の圧搾、又は１５
〜２１％のクリームドライとして入手しうる）のＣＯ2
生成率の改良である。このため、種々の古典的な雑種生
成及び分子遺伝による方法が適用されている。
【０００３】そのような方法の一は、国際特許願第WO 8
7/03006 号に記載されている。この出願には、イースト
細胞にＡＴＰの細胞レベルを減少させるプロセスを導入
すると、おそらくＡＴＰが発生する解糖工程を刺激する
ことにより解糖を刺激することが記載されている。この
ため、fdp * 遺伝子をサッカロミセス・セレビシアエに
導入し、構成的に発現した。突然変異体fdp * 遺伝子
は、グルコースにおける成長中にアロステリック的に負
の制御を妨げることによりAla をSer-12に置換するグル
コネオゲネシス酵素フルクトース-1,6- ビスフォスター
ゼ(FBPase)の変種を記号化したものである。更に、グル
コースにおける成長中に転写の抑制を防ぐために、fdp
* 遺伝子を構成的gpdhプロモーターの制御下においた。
このようにしてサッカロミセス・セレビシアエの解糖経
路にホスホフルクトキナーゼ酵素のレベルで無益回路を
導入すると、ＡＴＰが正味加水分解する。嫌気性の成長
サイクルの終了時に、有意に増大した（２５％増大）Ｃ
Ｏ2 の生成が観察された。しかしながら、嫌気性の成長
の指数的な成長相においてはＣＯ2 の生成の増大は観察
されなかった。脂肪の少ないドウ（０〜２％の糖）にお
いては、ＣＯ2 の生成率は全く増大しないか僅かに増大
した。従って、脂肪の少ないドウにおいてガスの生成の
改良ためにfdp * 遺伝子のみを使用すると、改良が醗酵
の終了時に制限されるので限定された値となる。
7/03006 号に記載されている。この出願には、イースト
細胞にＡＴＰの細胞レベルを減少させるプロセスを導入
すると、おそらくＡＴＰが発生する解糖工程を刺激する
ことにより解糖を刺激することが記載されている。この
ため、fdp * 遺伝子をサッカロミセス・セレビシアエに
導入し、構成的に発現した。突然変異体fdp * 遺伝子
は、グルコースにおける成長中にアロステリック的に負
の制御を妨げることによりAla をSer-12に置換するグル
コネオゲネシス酵素フルクトース-1,6- ビスフォスター
ゼ(FBPase)の変種を記号化したものである。更に、グル
コースにおける成長中に転写の抑制を防ぐために、fdp
* 遺伝子を構成的gpdhプロモーターの制御下においた。
このようにしてサッカロミセス・セレビシアエの解糖経
路にホスホフルクトキナーゼ酵素のレベルで無益回路を
導入すると、ＡＴＰが正味加水分解する。嫌気性の成長
サイクルの終了時に、有意に増大した（２５％増大）Ｃ
Ｏ2 の生成が観察された。しかしながら、嫌気性の成長
の指数的な成長相においてはＣＯ2 の生成の増大は観察
されなかった。脂肪の少ないドウ（０〜２％の糖）にお
いては、ＣＯ2 の生成率は全く増大しないか僅かに増大
した。従って、脂肪の少ないドウにおいてガスの生成の
改良ためにfdp * 遺伝子のみを使用すると、改良が醗酵
の終了時に制限されるので限定された値となる。
【０００４】アンジェレス・ナバス(Angeles Navas) ら
は、２種類のＡＴＰ消費反応をサッカロミセス・セレビ
シアエに導入することのＣＯ2 生成率に及ぼす影響を研
究した（Angeles Navas,M.,Cerdan,S.,& Gancedo,J.M.
によるProc.Natl,Acad.Sci.USA第90巻の第1290〜1294頁
(1993)のFutile cycles in Saccharomyces cerevisiae
strains expressing gluconeogenic enzymes during gr
owth on glucoase）。fdp 遺伝子、pck 遺伝子又は両方
の遺伝子を複数のコピープラスミド上でサッカロミセス
・セレビシアエに導入し、生理学的な効果を研究した。
pck 遺伝子は、１ＡＴＰの消費でオキサル酢酸塩からホ
スホエノールピルビン酸塩を形成するのを触媒するグル
コネオゲネシス酵素ホスホエノールピルビン酸塩カルボ
キシキナーゼ(PEPcarboxykinase)を記号化したものであ
る。両方の遺伝子はadc プロモーターの制御下で構成的
に発現された。無益回路を含まない、1 回又は両方の無
益回路を含む細胞において、二酸化炭素及びエタノール
の生成を測定した。両方の無益回路を含む細胞において
のみ、ＣＯ2 及びエタノールの生成率の有意量の増大が
観察された。しかしながら、非ストレス条件下における
同一のイースト細胞の成長中には、親の菌株と比較して
ＣＯ2 の生成率の増大は全く又は極僅かも見いだされな
かった。
は、２種類のＡＴＰ消費反応をサッカロミセス・セレビ
シアエに導入することのＣＯ2 生成率に及ぼす影響を研
究した（Angeles Navas,M.,Cerdan,S.,& Gancedo,J.M.
によるProc.Natl,Acad.Sci.USA第90巻の第1290〜1294頁
(1993)のFutile cycles in Saccharomyces cerevisiae
strains expressing gluconeogenic enzymes during gr
owth on glucoase）。fdp 遺伝子、pck 遺伝子又は両方
の遺伝子を複数のコピープラスミド上でサッカロミセス
・セレビシアエに導入し、生理学的な効果を研究した。
pck 遺伝子は、１ＡＴＰの消費でオキサル酢酸塩からホ
スホエノールピルビン酸塩を形成するのを触媒するグル
コネオゲネシス酵素ホスホエノールピルビン酸塩カルボ
キシキナーゼ(PEPcarboxykinase)を記号化したものであ
る。両方の遺伝子はadc プロモーターの制御下で構成的
に発現された。無益回路を含まない、1 回又は両方の無
益回路を含む細胞において、二酸化炭素及びエタノール
の生成を測定した。両方の無益回路を含む細胞において
のみ、ＣＯ2 及びエタノールの生成率の有意量の増大が
観察された。しかしながら、非ストレス条件下における
同一のイースト細胞の成長中には、親の菌株と比較して
ＣＯ2 の生成率の増大は全く又は極僅かも見いだされな
かった。
【０００５】
【課題を解決するための手段】しかしながら、驚くべき
ことに１回以上、好ましくは２回の無益回路をイースト
に導入し、イーストにストレスを生じさせる条件下でイ
ーストを例えばドウ内における醗酵に使用すると、イー
スト、特にパンイーストのガス発生能力が非常に増大す
ることが見いだされた。更に、驚くべきことにこれらの
無益回路の存在がイーストの乾燥に対する抵抗を有意に
改良することが見いだされた。無益回路とは、それぞれ
ＡＤＰ及びＡＴＰが発生する異化及び対応する同化生化
学反応が同時に起こることを意味し、ＡＴＰが正味加水
分解する（例えばWO 87/03006 参照）。本発明に有用な
無益回路の例には、フルクトース-1,6- ビスホスファタ
ーゼとPEP-カルボキシキナーゼの活性がある。イースト
のストレスとは、醗酵能、すなわち二酸化炭素及びエタ
ノールの生成率に負の影響を及ぼす条件下にイーストが
あることを意味する。イーストのストレス因子には、
（ｉ）高い糖濃度及び／又は高い塩濃度による高い浸透
圧（例えば、小麦粉に対する重量％で３％より高い糖濃
度、例えば約２０％以上の糖濃度、及び約１乃至４％の
塩濃度のドウ内）、（ｉｉ）弱酸の存在（例えば、小麦
粉に対する重量％で約０．１％以上、例えば０．６％以
下のカルシウムプロピオネートの存在するドウ内）、
（ｉｉｉ）低いpH（１乃至４）、（ｉｖ）高いエタノー
ル濃度（約５％）、（ｖ）例えば窒素又は燐酸塩のよう
な養分の欠乏、（ｖｉ）高温及び（ｖｉｉ）低い水分活
性（０．６２乃至０．９０）が含まれる。
ことに１回以上、好ましくは２回の無益回路をイースト
に導入し、イーストにストレスを生じさせる条件下でイ
ーストを例えばドウ内における醗酵に使用すると、イー
スト、特にパンイーストのガス発生能力が非常に増大す
ることが見いだされた。更に、驚くべきことにこれらの
無益回路の存在がイーストの乾燥に対する抵抗を有意に
改良することが見いだされた。無益回路とは、それぞれ
ＡＤＰ及びＡＴＰが発生する異化及び対応する同化生化
学反応が同時に起こることを意味し、ＡＴＰが正味加水
分解する（例えばWO 87/03006 参照）。本発明に有用な
無益回路の例には、フルクトース-1,6- ビスホスファタ
ーゼとPEP-カルボキシキナーゼの活性がある。イースト
のストレスとは、醗酵能、すなわち二酸化炭素及びエタ
ノールの生成率に負の影響を及ぼす条件下にイーストが
あることを意味する。イーストのストレス因子には、
（ｉ）高い糖濃度及び／又は高い塩濃度による高い浸透
圧（例えば、小麦粉に対する重量％で３％より高い糖濃
度、例えば約２０％以上の糖濃度、及び約１乃至４％の
塩濃度のドウ内）、（ｉｉ）弱酸の存在（例えば、小麦
粉に対する重量％で約０．１％以上、例えば０．６％以
下のカルシウムプロピオネートの存在するドウ内）、
（ｉｉｉ）低いpH（１乃至４）、（ｉｖ）高いエタノー
ル濃度（約５％）、（ｖ）例えば窒素又は燐酸塩のよう
な養分の欠乏、（ｖｉ）高温及び（ｖｉｉ）低い水分活
性（０．６２乃至０．９０）が含まれる。
【０００６】従って、本発明の１つの面は、イーストが
ＣＯ2 及びエタノールの生成に対して１以上のストレス
因子に支配されている条件下で醗酵に対して１回以上の
無益回路、好ましくは２回の無益回路実施するイースト
を使用することである。本発明は、ドウばかりでなく、
イーストのストレス因子を生じうるその他の醗酵系、例
えば加水分解された澱粉から工業的にエタノールを製造
する醗酵系（実施例５参照）にも適用しうることが見い
だされた。本発明により用途を見いだしうる変換された
イースト菌株には、構成的に発現されたFDPase遺伝子及
び／又は構成的に発現されたPEP カルボキシキナーゼ遺
伝子を有するパンイーストの変換された菌株ばかりでな
く、例えば解糖経路において１回又は２回の無益回路を
示すように変換されたワイン及びウィスキーイースト菌
株が含まれる。
ＣＯ2 及びエタノールの生成に対して１以上のストレス
因子に支配されている条件下で醗酵に対して１回以上の
無益回路、好ましくは２回の無益回路実施するイースト
を使用することである。本発明は、ドウばかりでなく、
イーストのストレス因子を生じうるその他の醗酵系、例
えば加水分解された澱粉から工業的にエタノールを製造
する醗酵系（実施例５参照）にも適用しうることが見い
だされた。本発明により用途を見いだしうる変換された
イースト菌株には、構成的に発現されたFDPase遺伝子及
び／又は構成的に発現されたPEP カルボキシキナーゼ遺
伝子を有するパンイーストの変換された菌株ばかりでな
く、例えば解糖経路において１回又は２回の無益回路を
示すように変換されたワイン及びウィスキーイースト菌
株が含まれる。
【０００７】ドウを膨らませるのに本発明を適用する場
合には、最も好ましくは、構成的に発現されたFDPase遺
伝子及び構成的に発現されたPEP カルボキシキナーゼ遺
伝子の両方を構成的に強いプロモーターの制御下で導入
したパンイーストサッカロミセス・セレビシアエを使用
する。望ましい２回の無益回路を供給する遺伝子をイー
スト細胞に導入し、複数のコピープラスミド上に安定に
保持する。あるいは、FDPase遺伝子及びPEP カルボキシ
キナーゼ遺伝子は単一のあるいは複数のコピー遺伝子と
して統合し、宿主細胞ゲノムとしうる。前述のように無
益回路酵素を記号化する遺伝子をパンイーストに導入し
た後には、ストレス条件の不在下ではガス生成が有意に
減少するのに対し、高濃度の糖（３％以上、例えば約２
０％以上、例えば約３０％以下）、高濃度の塩（約２％
以上、例えば約２乃至４％）、又はカルシウムプロピオ
ネート（例えば約０．６％以下）を含むドウ内ではガス
生成の増大が観察されうる。プロピオネートを含む糖を
多く含むドウ内で観察された効果は相乗的に見いださ
れ、親の菌株のそれと比較してガス生成は有意に増大し
た。従って本発明者は、高い糖及び／又は塩濃度（浸透
圧ストレス）、例えばプロピオン酸のような弱酸の存
在、乾燥、低pH、高いエタノール濃度、又は窒素の欠乏
のようなストレスを含む条件下でドウ内のイースト細胞
のガスの生成を増大させるのに無益回路を有利に使用し
うることを確立した。そのようなストレス条件は種々の
公知の目的のためにドウ内で生ずることが可能であり、
脂肪の少ない(例えば０％の糖）ドウ内の非ストレスイ
ースト細胞のＣＯ2 生成率と比較してイースト細胞のＣ
Ｏ2 生成率は減少する。
合には、最も好ましくは、構成的に発現されたFDPase遺
伝子及び構成的に発現されたPEP カルボキシキナーゼ遺
伝子の両方を構成的に強いプロモーターの制御下で導入
したパンイーストサッカロミセス・セレビシアエを使用
する。望ましい２回の無益回路を供給する遺伝子をイー
スト細胞に導入し、複数のコピープラスミド上に安定に
保持する。あるいは、FDPase遺伝子及びPEP カルボキシ
キナーゼ遺伝子は単一のあるいは複数のコピー遺伝子と
して統合し、宿主細胞ゲノムとしうる。前述のように無
益回路酵素を記号化する遺伝子をパンイーストに導入し
た後には、ストレス条件の不在下ではガス生成が有意に
減少するのに対し、高濃度の糖（３％以上、例えば約２
０％以上、例えば約３０％以下）、高濃度の塩（約２％
以上、例えば約２乃至４％）、又はカルシウムプロピオ
ネート（例えば約０．６％以下）を含むドウ内ではガス
生成の増大が観察されうる。プロピオネートを含む糖を
多く含むドウ内で観察された効果は相乗的に見いださ
れ、親の菌株のそれと比較してガス生成は有意に増大し
た。従って本発明者は、高い糖及び／又は塩濃度（浸透
圧ストレス）、例えばプロピオン酸のような弱酸の存
在、乾燥、低pH、高いエタノール濃度、又は窒素の欠乏
のようなストレスを含む条件下でドウ内のイースト細胞
のガスの生成を増大させるのに無益回路を有利に使用し
うることを確立した。そのようなストレス条件は種々の
公知の目的のためにドウ内で生ずることが可能であり、
脂肪の少ない(例えば０％の糖）ドウ内の非ストレスイ
ースト細胞のＣＯ2 生成率と比較してイースト細胞のＣ
Ｏ2 生成率は減少する。
【０００８】
【実施例】以下の実施例は、２回の無益回路を含むパン
イーストに関して本発明を説明する。（ｉ）工業的なエ
タノールの製造を改良するため及び（ｉｉ）高濃度の糖
（２０％）、高濃度の塩（２％）、カルシウムプロピオ
ネート（０．３％）、pH３．５、又はそれらの組み合わ
せを含むドウ内でのＣＯ2 の生成を改良するためにその
ようなイーストを使用する。更に、２回の無益回路を含
むパンイーストの醗酵に及ぼす正の効果がストレス条件
の増大に伴って増大する実施例を提供する。
イーストに関して本発明を説明する。（ｉ）工業的なエ
タノールの製造を改良するため及び（ｉｉ）高濃度の糖
（２０％）、高濃度の塩（２％）、カルシウムプロピオ
ネート（０．３％）、pH３．５、又はそれらの組み合わ
せを含むドウ内でのＣＯ2 の生成を改良するためにその
ようなイーストを使用する。更に、２回の無益回路を含
むパンイーストの醗酵に及ぼす正の効果がストレス条件
の増大に伴って増大する実施例を提供する。
【０００９】二酸化炭素の生成の測定 ａ．合成ドウ媒体又は緩衝液中 イースト、サッカロミセス・セレビシアエの細胞を、２
％のグルコース、（菌株CJM-152 に対して）０．１mg/m
l のウラシル、（菌株CJM-152 に対して）０．４mg/ml
のロイシン、及び５０mMの燐酸カルシウムを用い、pH
５．５においてフィルター滅菌（０．２２μm ）Yeast
Nitrogen Base(w/o アミノ酸,DIFCO製造業者による濃
度) 中で成長させた。遅れて指数的に成長したイースト
細胞（５０ml）を採取し、水で２回洗浄し、５．４mgの
乾燥重量/ml の濃度で再び水中に懸濁させた。その後、
２．５mlのイースト懸濁液を２．０mlの合成ドウ媒体
（１リットル当たりの組成：１１０ｇのグルコース、３
ｇの(NH4)2SO4 、４ｇのMgSO4 ・7H2O、４ｇのKH2PO4、
４ｇのカザミノ酸、４ｇのクエン酸一水塩、４５ｇのク
エン酸三ナトリウム二水塩、１０mgのビタミンＢ1 及び
Ｂ6 、４０mgのニコチン酸、２０mgのパントテン酸カル
シウム、及び０．０２mgのビチオン：pH５．６）又はME
S 緩衝液（２００mM、pH５．６、１０％グルコース）に
添加し、２８℃において１６５分培養させた。培養中に
生成したＣＯ2 をキャリヤーガス(N2)により溶液からフ
ラッシし、赤外検出器(Leybold-Heraeus) を用いて１６
５分間測定した。生成したＣＯ2 の総量及び比ＣＯ2 率
速度をオンラインで計算した。
％のグルコース、（菌株CJM-152 に対して）０．１mg/m
l のウラシル、（菌株CJM-152 に対して）０．４mg/ml
のロイシン、及び５０mMの燐酸カルシウムを用い、pH
５．５においてフィルター滅菌（０．２２μm ）Yeast
Nitrogen Base(w/o アミノ酸,DIFCO製造業者による濃
度) 中で成長させた。遅れて指数的に成長したイースト
細胞（５０ml）を採取し、水で２回洗浄し、５．４mgの
乾燥重量/ml の濃度で再び水中に懸濁させた。その後、
２．５mlのイースト懸濁液を２．０mlの合成ドウ媒体
（１リットル当たりの組成：１１０ｇのグルコース、３
ｇの(NH4)2SO4 、４ｇのMgSO4 ・7H2O、４ｇのKH2PO4、
４ｇのカザミノ酸、４ｇのクエン酸一水塩、４５ｇのク
エン酸三ナトリウム二水塩、１０mgのビタミンＢ1 及び
Ｂ6 、４０mgのニコチン酸、２０mgのパントテン酸カル
シウム、及び０．０２mgのビチオン：pH５．６）又はME
S 緩衝液（２００mM、pH５．６、１０％グルコース）に
添加し、２８℃において１６５分培養させた。培養中に
生成したＣＯ2 をキャリヤーガス(N2)により溶液からフ
ラッシし、赤外検出器(Leybold-Heraeus) を用いて１６
５分間測定した。生成したＣＯ2 の総量及び比ＣＯ2 率
速度をオンラインで計算した。
【００１０】ｂ．ドウ中 サッカロミセス・セレビシアエ 菌株CJM-152 及びCJM-18
6 のＣＯ2 生成率を、添加剤を含まない、あるいは２％
の塩化ナトリウム又は０．３％のカルシウムプロピオネ
ートを含む３％及び２０％の糖濃度のドウ中で測定し
た。ドウは以下のようにして調製した。３％の糖濃度のドウ ２ｇの圧搾イースト（乾燥物質２８．５％）又は６００
mgのドライイースト、６２．５ｇの小麦粉、１．８７ｇ
のサッカロース（小麦粉に対して３％の糖）及び３５ml
の蒸留水（添加剤Ａ）、１．２５ｇの塩化ナトリウム
（添加剤Ｂ、小麦粉に対して２％のNaCl）、又は０．１
９ｇのカルシウムプロピオネート（添加剤Ｃ、小麦粉に
対して０．３％のCaP)をホバート(Hobart)装置中で混合
した。２０％の糖濃度のドウ ２ｇの圧搾イースト（乾燥物質２８．５％）又は６００
mgのドライイースト、６２．５ｇの小麦粉、１２．５ｇ
のサッカロース（小麦粉に対して２０％の糖）及び３５
mlの添加剤Ａ、Ｂ、又はＣを、３％の糖濃度のドウに関
して記載したようにして混合した。pH３．５においてガ
ス生成を測定するために、１．３８％のラクテート溶液
３５mlを３５mlの蒸留水の代わりにドウに添加する。調
製後、ドウを２８℃に平衡させた鋼製のバレルに移し
た。バレルを閉じ、７分間平衡させた後、ＣＯ2 検出器
を用い、ＣＯ2 の生成を１６５分間測定した。
6 のＣＯ2 生成率を、添加剤を含まない、あるいは２％
の塩化ナトリウム又は０．３％のカルシウムプロピオネ
ートを含む３％及び２０％の糖濃度のドウ中で測定し
た。ドウは以下のようにして調製した。３％の糖濃度のドウ ２ｇの圧搾イースト（乾燥物質２８．５％）又は６００
mgのドライイースト、６２．５ｇの小麦粉、１．８７ｇ
のサッカロース（小麦粉に対して３％の糖）及び３５ml
の蒸留水（添加剤Ａ）、１．２５ｇの塩化ナトリウム
（添加剤Ｂ、小麦粉に対して２％のNaCl）、又は０．１
９ｇのカルシウムプロピオネート（添加剤Ｃ、小麦粉に
対して０．３％のCaP)をホバート(Hobart)装置中で混合
した。２０％の糖濃度のドウ ２ｇの圧搾イースト（乾燥物質２８．５％）又は６００
mgのドライイースト、６２．５ｇの小麦粉、１２．５ｇ
のサッカロース（小麦粉に対して２０％の糖）及び３５
mlの添加剤Ａ、Ｂ、又はＣを、３％の糖濃度のドウに関
して記載したようにして混合した。pH３．５においてガ
ス生成を測定するために、１．３８％のラクテート溶液
３５mlを３５mlの蒸留水の代わりにドウに添加する。調
製後、ドウを２８℃に平衡させた鋼製のバレルに移し
た。バレルを閉じ、７分間平衡させた後、ＣＯ2 検出器
を用い、ＣＯ2 の生成を１６５分間測定した。
【００１１】圧搾イースト及び乾燥イーストの調製 イースト菌株CJM-152 、CJM-186 及びCJM-189(Angeles
Navas,M.,Cerdan,S.,&Gancedo,J.M.によるProc.Natl,Ac
ad.Sci.USA第90巻の第1290〜1294頁(1993)のFutile cyc
les in Saccharomyces cerevisiae strains expressing
gluconeogenicenzymes during growth on glucoaseに
記載されている）の培養物は、一連の醗酵器中無機質媒
体上で成長させた。細胞は正味の容量が６リットルの１
０リットル醗酵器中で培養させた。醗酵中、pH及び温度
は自動制御により所望の値に保持した。最終醗酵の培養
条件は以下のとおりであった。窒素をNH3 の１０％水溶
液として醗酵に供給し、窒素の総量を供給される炭素源
の１０％に保持した。醗酵中pHを５．６に保持した。CJ
M-152 の場合には、成長を容易にするためにロイシン及
びウラシルを培養物に供給した。この醗酵により得られ
るイーストを濃縮し、実験室のノズル遠心機中で水道水
を用いて洗浄した。イーストクリームを圧搾して乾燥物
質含量を２６乃至３２％とした。測定されたタンパク質
含量（％Ｎ*６．２５）は、供給された等量のアンモニ
アの炭素源に対する収率が異なるため４５乃至５５％で
あった。圧搾イーストの乾燥は、空気供給系に設けられ
た円錐状のガラス管からなる実験室規模の流動層乾燥器
で実施した。手順の詳細は、米国特許第３，８４３，８
００号の実施例に見いだされる。乾燥イーストの乾燥物
質含量は９６．５％であった。
Navas,M.,Cerdan,S.,&Gancedo,J.M.によるProc.Natl,Ac
ad.Sci.USA第90巻の第1290〜1294頁(1993)のFutile cyc
les in Saccharomyces cerevisiae strains expressing
gluconeogenicenzymes during growth on glucoaseに
記載されている）の培養物は、一連の醗酵器中無機質媒
体上で成長させた。細胞は正味の容量が６リットルの１
０リットル醗酵器中で培養させた。醗酵中、pH及び温度
は自動制御により所望の値に保持した。最終醗酵の培養
条件は以下のとおりであった。窒素をNH3 の１０％水溶
液として醗酵に供給し、窒素の総量を供給される炭素源
の１０％に保持した。醗酵中pHを５．６に保持した。CJ
M-152 の場合には、成長を容易にするためにロイシン及
びウラシルを培養物に供給した。この醗酵により得られ
るイーストを濃縮し、実験室のノズル遠心機中で水道水
を用いて洗浄した。イーストクリームを圧搾して乾燥物
質含量を２６乃至３２％とした。測定されたタンパク質
含量（％Ｎ*６．２５）は、供給された等量のアンモニ
アの炭素源に対する収率が異なるため４５乃至５５％で
あった。圧搾イーストの乾燥は、空気供給系に設けられ
た円錐状のガラス管からなる実験室規模の流動層乾燥器
で実施した。手順の詳細は、米国特許第３，８４３，８
００号の実施例に見いだされる。乾燥イーストの乾燥物
質含量は９６．５％であった。
【００１２】実施例１ ２回の無益回路導入後の合成ドウ媒体中におけるストレ
ス条件下の細胞のガス生成の改良。サッカロミセス・セレビシアエ に２回の無益回路を導入
した後の合成ドウ媒体中におけるＣＯ2 の生成率の増大
を測定するために、菌株CJM-152 及びCJM-186を前述の
ようにしてYNB 媒体中２８℃において一昼夜成長させ
た。培養物のpH値は（５．６から）３．９に低下させる
か、又は１００mMの燐酸カリウムを添加することにより
（６．６から）６．３に保持した。ＣＯ2 の生成率を炭
素源としてグルコースを用いた完全媒体中及びグルコー
スを用いたMES 緩衝液中（pH５．６）で前述のようにし
て測定した（表１）。完全媒体中のＣＯ2 の生成（成長
を許さない）は緩衝液中のそれより有意に高かった。こ
れらの相対的に最適な条件下では、pH４．５において予
め成長させたCJM-152 及びCJM-186 間にはガス生成率に
差はなかった。驚くべきことに、pH２．６のストレス条
件下で予め成長させ、完全媒体中で試験したCJM-186 の
細胞は、同様な条件下で成長させた親の菌株CJM-152 の
それより有意に高いＣＯ2 の生成を示した。更に、細胞
をグルコースを含む緩衝液中でＣＯ2 の生成について試
験した場合には、CJM-186 のほうが一貫して親の菌株CJ
M-152 より性能がよかった。これらの実験は、２回の無
益回路を含む形質転換された菌株CJM-186 が細胞にスト
レスを与える条件下におけるガス生成に関して有意に有
利であることを示す。このことは、無益回路がストレス
条件下で使用される細胞のガス生成の改良に特に有用で
あることを示す。本明細書に記載されている実施例にお
いては、これらのストレス条件は緩衝液中の媒体成分の
不在及び／又は適用相（ＣＯ2 測定）のまえの細胞の履
歴（pH）により引き起こされたり調整されたりしうる。
ス条件下の細胞のガス生成の改良。サッカロミセス・セレビシアエ に２回の無益回路を導入
した後の合成ドウ媒体中におけるＣＯ2 の生成率の増大
を測定するために、菌株CJM-152 及びCJM-186を前述の
ようにしてYNB 媒体中２８℃において一昼夜成長させ
た。培養物のpH値は（５．６から）３．９に低下させる
か、又は１００mMの燐酸カリウムを添加することにより
（６．６から）６．３に保持した。ＣＯ2 の生成率を炭
素源としてグルコースを用いた完全媒体中及びグルコー
スを用いたMES 緩衝液中（pH５．６）で前述のようにし
て測定した（表１）。完全媒体中のＣＯ2 の生成（成長
を許さない）は緩衝液中のそれより有意に高かった。こ
れらの相対的に最適な条件下では、pH４．５において予
め成長させたCJM-152 及びCJM-186 間にはガス生成率に
差はなかった。驚くべきことに、pH２．６のストレス条
件下で予め成長させ、完全媒体中で試験したCJM-186 の
細胞は、同様な条件下で成長させた親の菌株CJM-152 の
それより有意に高いＣＯ2 の生成を示した。更に、細胞
をグルコースを含む緩衝液中でＣＯ2 の生成について試
験した場合には、CJM-186 のほうが一貫して親の菌株CJ
M-152 より性能がよかった。これらの実験は、２回の無
益回路を含む形質転換された菌株CJM-186 が細胞にスト
レスを与える条件下におけるガス生成に関して有意に有
利であることを示す。このことは、無益回路がストレス
条件下で使用される細胞のガス生成の改良に特に有用で
あることを示す。本明細書に記載されている実施例にお
いては、これらのストレス条件は緩衝液中の媒体成分の
不在及び／又は適用相（ＣＯ2 測定）のまえの細胞の履
歴（pH）により引き起こされたり調整されたりしうる。
【００１３】
【表１】 pH２．６及び４．５において完全媒体及び
緩衝液中で成長させた細胞のＣＯ2 の生成（１６５分間
のml） CJM-152 CJM-186 完全媒体 (pH3.9) 287 401 完全媒体 (pH6.3) 431 405 緩衝液 (pH3.9) 144 307 緩衝液 (pH6.3) 216 307
緩衝液中で成長させた細胞のＣＯ2 の生成（１６５分間
のml） CJM-152 CJM-186 完全媒体 (pH3.9) 287 401 完全媒体 (pH6.3) 431 405 緩衝液 (pH3.9) 144 307 緩衝液 (pH6.3) 216 307
【００１４】実施例２ ２回の無益回路の導入後のパンイーストの糖抵抗の改
良。 ２回の無益回路の導入後、パンイーストの糖抵抗に及ぼ
す影響を測定した（表２）。このため、親の菌株CJM-15
2 及び形質転換菌株CJM-186 を合成媒体上の培養物（fe
d-batch)中で成長させた。次いで細胞を採取し、低い糖
濃度（３％）及び高い糖濃度（２０％）のドウ内のＣＯ
2 の生成を標準ドウ試験で測定した（表２）。菌株CJM-
152(-CaP) 及びCJM-186(-CaP) を比較すると、高い糖濃
度のドウ内の菌株CJM-186 の比ＣＯ2 生成量の有意な改
良がわかる( 無益回路刺激因子(FCSF)１１６％）。０．
３％のカルシウムプロピオネートが存在する場合にも、
菌株CJM-186 において糖抵抗の有意な増大が観察された
（FCSF２０６％）。更に、０．３％のCaP の存在下にお
いて２０％の糖濃度のドウ内のＣＯ2 の生成は親の菌株
の場合減少した（表２；１６５分，８４％対５０％）
が、菌株CJM-186 においてはＣＯ2 の生成の増大が観察
された（表２；１６５分，９９％対１０６％）。本明細
書に示された実験は、イースト菌株内の無益回路の存在
がドウ内でカルシウムプロピオネートの存在下でも不在
下でも高い糖濃度に対する抵抗を改良することを示す。
この結果、高い糖濃度のドウ内においてはこれらの無益
回路が欠けている菌株と比較してＣＯ2 の生成率が増大
することを示す。
良。 ２回の無益回路の導入後、パンイーストの糖抵抗に及ぼ
す影響を測定した（表２）。このため、親の菌株CJM-15
2 及び形質転換菌株CJM-186 を合成媒体上の培養物（fe
d-batch)中で成長させた。次いで細胞を採取し、低い糖
濃度（３％）及び高い糖濃度（２０％）のドウ内のＣＯ
2 の生成を標準ドウ試験で測定した（表２）。菌株CJM-
152(-CaP) 及びCJM-186(-CaP) を比較すると、高い糖濃
度のドウ内の菌株CJM-186 の比ＣＯ2 生成量の有意な改
良がわかる( 無益回路刺激因子(FCSF)１１６％）。０．
３％のカルシウムプロピオネートが存在する場合にも、
菌株CJM-186 において糖抵抗の有意な増大が観察された
（FCSF２０６％）。更に、０．３％のCaP の存在下にお
いて２０％の糖濃度のドウ内のＣＯ2 の生成は親の菌株
の場合減少した（表２；１６５分，８４％対５０％）
が、菌株CJM-186 においてはＣＯ2 の生成の増大が観察
された（表２；１６５分，９９％対１０６％）。本明細
書に示された実験は、イースト菌株内の無益回路の存在
がドウ内でカルシウムプロピオネートの存在下でも不在
下でも高い糖濃度に対する抵抗を改良することを示す。
この結果、高い糖濃度のドウ内においてはこれらの無益
回路が欠けている菌株と比較してＣＯ2 の生成率が増大
することを示す。
【００１５】実施例３ ２回の無益回路の導入後のカルシウムプロピオネートに
対する抵抗の改良。 ２回の無益回路のパンイーストへの導入の影響を、カル
シウムプロピオネートの存在下におけるＣＯ2 の生成に
関して研究した。このため、菌株CJM-152 及びCJM-186
の圧搾細胞のＣＯ2 の生成率を、０．３％のカルシウム
プロピオネートの存在下及び不在下において３％及び２
０％の糖濃度のドウ内で測定した。表２に、形質転換さ
れた菌株CJM-186 が親の菌株CJM-152 と比較して低い
（３％）及び高い（２０％）糖濃度のドウの両方におい
てプロピオネート抵抗に関してすぐれていることが明白
に示されている。３％の糖濃度のドウ内においては、菌
株CJM-186 のＣＯ2 の生成はCaP の存在の影響を受けな
いのに、親の菌株CJM-152 のＣＯ2 の生成はCaP の存在
下でかなり減少する（８４％，１６５分）。２０％の糖
濃度のドウ内においては、形質転換された菌株CJM-186
のＣＯ2 の生成はCaPの添加により２．５倍になったの
に（１０６：４３，１６５分）、親の菌株CJM-152 のＣ
Ｏ2 の生成はCaP の添加により１．４倍になった（５
０：３６，１６５分）。これらの実験は、ドウ内におい
てカルシウムプロピオネートに対するイースト菌株の抵
抗が２種の無益回路の存在により正の影響を受けること
を明白に示す。
対する抵抗の改良。 ２回の無益回路のパンイーストへの導入の影響を、カル
シウムプロピオネートの存在下におけるＣＯ2 の生成に
関して研究した。このため、菌株CJM-152 及びCJM-186
の圧搾細胞のＣＯ2 の生成率を、０．３％のカルシウム
プロピオネートの存在下及び不在下において３％及び２
０％の糖濃度のドウ内で測定した。表２に、形質転換さ
れた菌株CJM-186 が親の菌株CJM-152 と比較して低い
（３％）及び高い（２０％）糖濃度のドウの両方におい
てプロピオネート抵抗に関してすぐれていることが明白
に示されている。３％の糖濃度のドウ内においては、菌
株CJM-186 のＣＯ2 の生成はCaP の存在の影響を受けな
いのに、親の菌株CJM-152 のＣＯ2 の生成はCaP の存在
下でかなり減少する（８４％，１６５分）。２０％の糖
濃度のドウ内においては、形質転換された菌株CJM-186
のＣＯ2 の生成はCaPの添加により２．５倍になったの
に（１０６：４３，１６５分）、親の菌株CJM-152 のＣ
Ｏ2 の生成はCaP の添加により１．４倍になった（５
０：３６，１６５分）。これらの実験は、ドウ内におい
てカルシウムプロピオネートに対するイースト菌株の抵
抗が２種の無益回路の存在により正の影響を受けること
を明白に示す。
【００１６】実施例４ ２回の無益回路の導入後の塩化ナトリウムに対する抵抗
の改良。 塩の抵抗に及ぼす２回の無益回路の影響を試験するため
に、２％の塩化ナトリウムの存在下及び不在下の両方に
おいて３及び２０％の糖濃度のドウ内でCJM-186 及び親
の菌株CJM-152 のＣＯ2 の生成を測定した（表２）。親
の菌株CJM-152を用いドウ内にNaClを添加すると、３％
及び２０％の糖濃度の両方のドウ内でそれぞれ２０及び
４％の対照標準値を示した。形質転換された菌株CJM-18
6 の遺伝子の場合には、ガス生成の部分的な回復が観察
された（FCSF３２０％；表２）。本明細書に示された実
験は、イースト菌株への２回の無益回路の導入により塩
のストレスが有意に改良され、これらの２回の無益回路
が欠けている親の菌株のそれと比較して高いＣＯ2 の生
成率となることを示す。
の改良。 塩の抵抗に及ぼす２回の無益回路の影響を試験するため
に、２％の塩化ナトリウムの存在下及び不在下の両方に
おいて３及び２０％の糖濃度のドウ内でCJM-186 及び親
の菌株CJM-152 のＣＯ2 の生成を測定した（表２）。親
の菌株CJM-152を用いドウ内にNaClを添加すると、３％
及び２０％の糖濃度の両方のドウ内でそれぞれ２０及び
４％の対照標準値を示した。形質転換された菌株CJM-18
6 の遺伝子の場合には、ガス生成の部分的な回復が観察
された（FCSF３２０％；表２）。本明細書に示された実
験は、イースト菌株への２回の無益回路の導入により塩
のストレスが有意に改良され、これらの２回の無益回路
が欠けている親の菌株のそれと比較して高いＣＯ2 の生
成率となることを示す。
【００１７】
【表２】 添加剤を含まない(-CaP)、０．３％のカル
シウムプロピオネートを含む(+CaP)、又は２％の塩化ナ
トリウムを含む３％及び２０％の糖濃度のドウ内におけ
る菌株CJM-152 及びCJM-186 による１００及び１６５分
後の比ＣＯ2 生成率（％）菌株 CJM-152 CJM-186 条件 100分 165分 100分 165分 FCSF 3%,-CaP 100 100 100 100 1%,+CaP 86 84 108 99 119 3%,+NaCl 21 20 77 73 366 20%,-CaP 41 36 46 43 116 20%,+CaP 61 50 122 106 206 20%,+NaCl 6 4 17 15 320
シウムプロピオネートを含む(+CaP)、又は２％の塩化ナ
トリウムを含む３％及び２０％の糖濃度のドウ内におけ
る菌株CJM-152 及びCJM-186 による１００及び１６５分
後の比ＣＯ2 生成率（％）菌株 CJM-152 CJM-186 条件 100分 165分 100分 165分 FCSF 3%,-CaP 100 100 100 100 1%,+CaP 86 84 108 99 119 3%,+NaCl 21 20 77 73 366 20%,-CaP 41 36 46 43 116 20%,+CaP 61 50 122 106 206 20%,+NaCl 6 4 17 15 320
【００１８】無益回路刺激因子(FCSF)の値は、CJM-186
の比ガス生成値をCJM-152 のそれで割ることにより算出
した。得られたFCSFは、１００及び１６５分に関して計
算した値の平均値である。１６５分後のCJM-152 及びCJ
M-186 の絶対的なガス生成率はそれぞれ１６５及び３３
３mlであった。データは４回の独立した実験の平均値で
ある。実施例５ ストレス条件の増大に伴って２回の無益回路の導入後の
パンイーストの二酸化炭素の生成に及ぼす正の効果は増
大する。この実施例は、イーストがドウ内における種々
の適用中に直面しうるストレス条件が増大する場合には
パンイーストのガス生成に及ぼす２回の無益回路（すな
わち、構成的のFBPase及びPEPCK 酵素添加剤）の存在の
正の影響が増大するという知見を支持する。更に、先行
の実施例で記載した正の影響が、無益回路の遺伝子の代
わりのプラスミドだけの存在の結果である可能性を排除
するために、同質遺伝子的な親の菌株CJM-189 を用いて
実験を実施した。プラスミドのない同質遺伝子的な親の
菌株であるCJM-152 とは異なり、菌株CJM-189 はFBPase
及びPEPCK 遺伝子の遺伝コードを指定する領域を除い
て、CJM-186 と同一のプラスミドを含む。このプラスミ
ドを含む菌株は、Angeles Navas らによる文献(1993,PN
AS 90,1290-1294)に記載されている。
の比ガス生成値をCJM-152 のそれで割ることにより算出
した。得られたFCSFは、１００及び１６５分に関して計
算した値の平均値である。１６５分後のCJM-152 及びCJ
M-186 の絶対的なガス生成率はそれぞれ１６５及び３３
３mlであった。データは４回の独立した実験の平均値で
ある。実施例５ ストレス条件の増大に伴って２回の無益回路の導入後の
パンイーストの二酸化炭素の生成に及ぼす正の効果は増
大する。この実施例は、イーストがドウ内における種々
の適用中に直面しうるストレス条件が増大する場合には
パンイーストのガス生成に及ぼす２回の無益回路（すな
わち、構成的のFBPase及びPEPCK 酵素添加剤）の存在の
正の影響が増大するという知見を支持する。更に、先行
の実施例で記載した正の影響が、無益回路の遺伝子の代
わりのプラスミドだけの存在の結果である可能性を排除
するために、同質遺伝子的な親の菌株CJM-189 を用いて
実験を実施した。プラスミドのない同質遺伝子的な親の
菌株であるCJM-152 とは異なり、菌株CJM-189 はFBPase
及びPEPCK 遺伝子の遺伝コードを指定する領域を除い
て、CJM-186 と同一のプラスミドを含む。このプラスミ
ドを含む菌株は、Angeles Navas らによる文献(1993,PN
AS 90,1290-1294)に記載されている。
【００１９】種々のストレス条件中のドウ内の二酸化炭
素の生成率は、成長した菌株CJM-186 及びCJM-189 の圧
搾細胞について測定した。１３のストレス条件を試験し
た。 0.3% CP # 20% サッカロース,2% NaCl 20% サッカロース 20% サッカロース,pH 3.5 pH 3.5 2% NaCl,0.3% CP,pH 3.5 0.3% CP,2% NaCl 20% サッカロース,0.3% CP,2% NaCl 0.3% CP,pH 3.5 20% サッカロース,0.3% CP,pH 3.5 2% NaCl,pH 3.5 20% サッカロース,2% NaCl,pH 3.5 20% サッカロース,0.3% CP# カルシウムプロピオネート 脂肪の少ないドウ（３％サッカロース）においては、い
かなる添加剤がなくてもイーストは最高のガス生成率を
示した。従って、これらのドウの条件は非ストレス条件
と考えられた。
素の生成率は、成長した菌株CJM-186 及びCJM-189 の圧
搾細胞について測定した。１３のストレス条件を試験し
た。 0.3% CP # 20% サッカロース,2% NaCl 20% サッカロース 20% サッカロース,pH 3.5 pH 3.5 2% NaCl,0.3% CP,pH 3.5 0.3% CP,2% NaCl 20% サッカロース,0.3% CP,2% NaCl 0.3% CP,pH 3.5 20% サッカロース,0.3% CP,pH 3.5 2% NaCl,pH 3.5 20% サッカロース,2% NaCl,pH 3.5 20% サッカロース,0.3% CP# カルシウムプロピオネート 脂肪の少ないドウ（３％サッカロース）においては、い
かなる添加剤がなくてもイーストは最高のガス生成率を
示した。従って、これらのドウの条件は非ストレス条件
と考えられた。
【００２０】添付図面は、無益回路刺激因子(FCSF)が残
余のガス生成（付与されたストレスの原因として）の減
少に伴って増大することを明らかに示す。残余のガス活
性は、脂肪の少ないドウ内の、すなわち非ストレス条件
中の菌株CJM-186 及びCJM-189 の（同一の）ガス生成の
百分率として与えられる（３００mlＣＯ2 ，１６５
分-1，６００mg乾燥物質-1；標準偏差：４％）、試験さ
れたストレス条件中の同質遺伝子的な対照菌株CJM-189
のガス生成である。残余のガス活性は、付与されたスト
レス条件による醗酵活性の損失と相関するので、ストレ
スの大きさと相関する。例えば、１０％の残留ガス生成
は、付与されたストレス条件のために可能なガス生成の
９０％を失うことを示す。FCSFは、CJM-186 の残余のガ
ス活性を、同質遺伝子の対照菌株CJM-189 のそれで割
り、百分率を得るために１００倍することにより計算し
た。従って、FCSFが１００ということは、２回の無益回
路の存在がガス生成に全く（正又は負の）影響を及ぼさ
ないことを意味する。FCSFが１００を越えるということ
は、２回の無益回路の存在が、所与の百分率だけガス生
成を刺激することを示す。データの点は、SliteWrite
４．０プログラムを用いてフィットさせた。試験したス
トレス条件を本明細書に示す。本明細書に示した実験
は、ドウ内で示されたストレスに対するパンイースト菌
株の抵抗が２回の無益回路の存在により正の影響を受け
ることを明らかに示す。更に、これらの実験は、この正
の影響がストレスの大きさの増大に従って増大すること
を示す。
余のガス生成（付与されたストレスの原因として）の減
少に伴って増大することを明らかに示す。残余のガス活
性は、脂肪の少ないドウ内の、すなわち非ストレス条件
中の菌株CJM-186 及びCJM-189 の（同一の）ガス生成の
百分率として与えられる（３００mlＣＯ2 ，１６５
分-1，６００mg乾燥物質-1；標準偏差：４％）、試験さ
れたストレス条件中の同質遺伝子的な対照菌株CJM-189
のガス生成である。残余のガス活性は、付与されたスト
レス条件による醗酵活性の損失と相関するので、ストレ
スの大きさと相関する。例えば、１０％の残留ガス生成
は、付与されたストレス条件のために可能なガス生成の
９０％を失うことを示す。FCSFは、CJM-186 の残余のガ
ス活性を、同質遺伝子の対照菌株CJM-189 のそれで割
り、百分率を得るために１００倍することにより計算し
た。従って、FCSFが１００ということは、２回の無益回
路の存在がガス生成に全く（正又は負の）影響を及ぼさ
ないことを意味する。FCSFが１００を越えるということ
は、２回の無益回路の存在が、所与の百分率だけガス生
成を刺激することを示す。データの点は、SliteWrite
４．０プログラムを用いてフィットさせた。試験したス
トレス条件を本明細書に示す。本明細書に示した実験
は、ドウ内で示されたストレスに対するパンイースト菌
株の抵抗が２回の無益回路の存在により正の影響を受け
ることを明らかに示す。更に、これらの実験は、この正
の影響がストレスの大きさの増大に従って増大すること
を示す。
【００２１】実施例６ 乾燥後パンイースト内に２回の無益回路が存在すること
による正の影響は保持される。２回の無益回路の導入後
の乾燥に対する抵抗の改良。 パンイーストは活性ドライ(ADY) 又は即席ドライ(IDY)
イーストとして売買されるので、“無益回路”の技術の
適用の必要条件の一は、圧搾イーストに関して前述した
ような正の効果が乾燥後も保持されるということであ
る。従って、（前述の実験に使用した）CJM-186 及びCJ
M-189 の圧搾物質の一部を乾燥させ、種々のストレス条
件下でガス生成を測定した。表３はこれらの実験の結果
を示す。
による正の影響は保持される。２回の無益回路の導入後
の乾燥に対する抵抗の改良。 パンイーストは活性ドライ(ADY) 又は即席ドライ(IDY)
イーストとして売買されるので、“無益回路”の技術の
適用の必要条件の一は、圧搾イーストに関して前述した
ような正の効果が乾燥後も保持されるということであ
る。従って、（前述の実験に使用した）CJM-186 及びCJ
M-189 の圧搾物質の一部を乾燥させ、種々のストレス条
件下でガス生成を測定した。表３はこれらの実験の結果
を示す。
【００２２】
【表３】乾燥後のイースト菌株CJM-186 及びCJM-189 の
種々のドウ内におけるガス生成。ガス生成は、その他の
添加剤を含まないで２０％のサッカロースを含むドウ内
において対照菌株CJM-189 の圧搾イーストのガス生成か
ら百分率として与えられる（２０７mlＣＯ2 、１６５分
-1、６００mg乾燥物質-1）。乾燥能力は、乾燥イースト
のガス生成を等量の圧搾イースト内の乾燥物質のそれで
割ることにより計算した。 条件 CJM-189 CJM-186 FCSF 圧搾，20% サッカロース 100 121 121 乾燥, 20% サッカロース 37 58 157 乾燥, 20% サッカロース,2% NaCl 24 49 204 乾燥, 20% サッカロース,pH 3.5, 0.3% CP 19 44 231 乾燥能力 37 48 130
種々のドウ内におけるガス生成。ガス生成は、その他の
添加剤を含まないで２０％のサッカロースを含むドウ内
において対照菌株CJM-189 の圧搾イーストのガス生成か
ら百分率として与えられる（２０７mlＣＯ2 、１６５分
-1、６００mg乾燥物質-1）。乾燥能力は、乾燥イースト
のガス生成を等量の圧搾イースト内の乾燥物質のそれで
割ることにより計算した。 条件 CJM-189 CJM-186 FCSF 圧搾，20% サッカロース 100 121 121 乾燥, 20% サッカロース 37 58 157 乾燥, 20% サッカロース,2% NaCl 24 49 204 乾燥, 20% サッカロース,pH 3.5, 0.3% CP 19 44 231 乾燥能力 37 48 130
【００２３】表３から、乾燥後も２回の無益回路の存在
の正の効果が保持されることが明らかである。更に、圧
搾イーストにおける場合と同様に、乾燥イーストのガス
生成の改良に及ぼす無益回路の衝撃はストレス条件の増
大に伴って増大する。この実験において“最少の”スト
レス条件である２０％のサッカロースのドウにおいて、
FCSF値は１５７％であった。FCSF値は、ガス生成が低下
することから分かるようにストレス条件の増大する、２
％のNaCl又はpH３．５、０．３％CPの添加後、かなり高
くなった（それぞれ２０４％及び２３１％）。驚くべき
ことに、菌株CJM-186 を含む無益回路の乾燥能力も増大
することが見いだされた。この場合のFCSF値は１３０％
であった。本明細書に記載した実験は、前述の圧搾イー
ストのガス生成に及ぼす２回の無益回路の正の効果が乾
燥イーストにもあることを示す。更に、２回の無益回路
の存在はイーストの乾燥に対する抵抗も有意に増大させ
た。
の正の効果が保持されることが明らかである。更に、圧
搾イーストにおける場合と同様に、乾燥イーストのガス
生成の改良に及ぼす無益回路の衝撃はストレス条件の増
大に伴って増大する。この実験において“最少の”スト
レス条件である２０％のサッカロースのドウにおいて、
FCSF値は１５７％であった。FCSF値は、ガス生成が低下
することから分かるようにストレス条件の増大する、２
％のNaCl又はpH３．５、０．３％CPの添加後、かなり高
くなった（それぞれ２０４％及び２３１％）。驚くべき
ことに、菌株CJM-186 を含む無益回路の乾燥能力も増大
することが見いだされた。この場合のFCSF値は１３０％
であった。本明細書に記載した実験は、前述の圧搾イー
ストのガス生成に及ぼす２回の無益回路の正の効果が乾
燥イーストにもあることを示す。更に、２回の無益回路
の存在はイーストの乾燥に対する抵抗も有意に増大させ
た。
【００２４】実施例７ ２回の無益回路の導入によるイースト内のグルコアミラ
ーゼ／アミラーゼ処理澱粉からのエタノールの生成の改
良。 燃料アルコールを発生させるためには、炭素／エネルギ
ー源としてグルコースを使用し、エタノールに変換させ
る。使用するグルコースは例えば、グルコアミラーゼ／
アミラーゼ処理により澱粉を加水分解させることにより
発生しうる。使用する澱粉は、例えばトウモロコシ、糖
蜜中に存在しうる。この種の方法の効率の問題は比較的
ゆっくりしたエタノールの生成速度であり、醗酵時間が
長く、総収量（すなわち、グルコースから形成されるエ
タノールの量）は低い。これらの欠点は、従来使用され
るイースト菌株のエタノールストレスに対する耐性が比
較的弱いため、増大するエタノール濃度の関数としてエ
タノールの生成が減少することよりある程度説明でき
る。更に、廃物流においては窒素源として使用しうる限
られた窒素化合物のみが入手しうる。従って、アルコー
ル醗酵におけるある工程において窒素の欠乏の結果とし
てのストレスもこの方法に従来使用されているイースト
菌株の比較的弱い性能に寄与している。
ーゼ／アミラーゼ処理澱粉からのエタノールの生成の改
良。 燃料アルコールを発生させるためには、炭素／エネルギ
ー源としてグルコースを使用し、エタノールに変換させ
る。使用するグルコースは例えば、グルコアミラーゼ／
アミラーゼ処理により澱粉を加水分解させることにより
発生しうる。使用する澱粉は、例えばトウモロコシ、糖
蜜中に存在しうる。この種の方法の効率の問題は比較的
ゆっくりしたエタノールの生成速度であり、醗酵時間が
長く、総収量（すなわち、グルコースから形成されるエ
タノールの量）は低い。これらの欠点は、従来使用され
るイースト菌株のエタノールストレスに対する耐性が比
較的弱いため、増大するエタノール濃度の関数としてエ
タノールの生成が減少することよりある程度説明でき
る。更に、廃物流においては窒素源として使用しうる限
られた窒素化合物のみが入手しうる。従って、アルコー
ル醗酵におけるある工程において窒素の欠乏の結果とし
てのストレスもこの方法に従来使用されているイースト
菌株の比較的弱い性能に寄与している。
【００２５】驚くべきことに、イースト菌株CJM-186 に
おける２回の無益回路の存在が、自生の菌株CJM-152 の
それと比較してエタノールの生成速度及び収量を改良す
ることが見いだされた。表４は、自生の菌株CJM-152 及
び変換された菌株CJM-186 のエタノールの生成速度及び
総エタノール生成量を測定した実験結果を示す。澱粉を
含むグルコアミラーゼ／アミラーゼ処理廃物流をエネル
ギー／炭素源として使用した。エタノールの生成速度及
び総エタノール生成量を、自生の菌株CJM-152の結果を
１００％として百分率で示す。
おける２回の無益回路の存在が、自生の菌株CJM-152 の
それと比較してエタノールの生成速度及び収量を改良す
ることが見いだされた。表４は、自生の菌株CJM-152 及
び変換された菌株CJM-186 のエタノールの生成速度及び
総エタノール生成量を測定した実験結果を示す。澱粉を
含むグルコアミラーゼ／アミラーゼ処理廃物流をエネル
ギー／炭素源として使用した。エタノールの生成速度及
び総エタノール生成量を、自生の菌株CJM-152の結果を
１００％として百分率で示す。
【００２６】
【表４】 澱粉変性プロセスのグルコアミラーゼ処理廃物流上で成長させたイーストによる エタノールの生成速度及び総エタノール生成量に及ぼす２回の無益回路の影響。 エタノールの生成速度 総エタノール生成量 CJM-152 100 100 CJM-186 119 122
【図１】無益回路刺激因子(FCSF)を残留ガス生成率
（％）の関数として示す図である。
（％）の関数として示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:865） (72)発明者 ペーター ヨハネス ショッピンク オランダ国 1075イックスイェー アムス テルダム アムステルフェーンスウェッヒ 106
Claims (16)
- 【請求項１】 イーストが二酸化炭素及びエタノールの
生成に関して１以上のストレス因子にさらされるような
条件下で醗酵の解糖経路において１回以上の無益回路を
実施するイーストの使用。 - 【請求項２】 前記イーストが、フルクトース-1,6- ビ
スフォスターゼ及びホスホエノールピルビン酸塩カルボ
キシキナーゼの遺伝子の構成的発現による解糖経路にお
いて２回の無益回路を実施する請求項１記載のイースト
の使用。 - 【請求項３】 パン、ワイン又はウィスキーイーストで
ある請求項１又は２記載のイーストの使用。 - 【請求項４】 サッカロミセス・セレビシアエである請
求項１乃至３のいずれかに記載のイーストの使用。 - 【請求項５】 糖含量が３％以上、塩含量が約１乃至４
％及び／又はカルシウムプロピオネート含量が０．１乃
至０．６％（小麦粉に対する重量％）であるドウ内の醗
酵のための請求項１乃至４のいずれかに記載のイースト
の使用。 - 【請求項６】 糖含量が約３％以上（小麦粉に対する重
量％）であるドウ内の醗酵のための請求項１乃至５のい
ずれかに記載のイーストの使用。 - 【請求項７】 塩含量が約１％以上（小麦粉に対する重
量％）であるドウ内の醗酵のための請求項１乃至４のい
ずれかに記載のイーストの使用。 - 【請求項８】 カルシウムプロピオネート含量が約０．
１％以上（小麦粉に対する重量％）であるドウ内の醗酵
のための請求項１乃至４のいずれかに記載のイーストの
使用。 - 【請求項９】 イーストが高いエタノールストレス及び
／又は窒素欠乏にさらされている、加水分解された澱粉
からのエタノールの醗酵製造における請求項１乃至４の
いずれかに記載のイーストの使用。 - 【請求項１０】 （ｉ）解糖経路において１回以上の無
益回路を実施するイースト細胞及び（ｉｉ）醗酵性の糖
を含むドウであって、その組成が前記糖の醗酵中にイー
スト細胞が二酸化炭素及びエタノールの生成に関して１
以上のストレス因子にさらされるような組成であるド
ウ。 - 【請求項１１】 前記イースト細胞が、フルクトース-
1,6- ビスフォスターゼ及びホスホエノールピルビン酸
塩カルボキシキナーゼの遺伝子の構成的発現による解糖
経路において２回の無益回路を実施する請求項１０記載
のドウ。 - 【請求項１２】 糖含量が３％以上、塩含量が約１乃至
４％及び／又はカルシウムプロピオネート含量が０．１
乃至０．６％（小麦粉に対する重量％）である請求項１
０又は１１に記載のドウ。 - 【請求項１３】 糖含量が約３％以上（小麦粉に対する
重量％）である請求項１０乃至１２のいずれかに記載の
ドウ。 - 【請求項１４】 塩含量が約２％以上（小麦粉に対する
重量％）である請求項１０、１１及び１３のいずれかに
記載のドウ。 - 【請求項１５】 カルシウムプロピオネート含量が約
０．１％以上（小麦粉に対する重量％）である請求項１
０、１１、１３及び１４のいずれかに記載のドウ。 - 【請求項１６】 活性ドライ、即席ドライ、圧搾、又は
クリームイーストとして製造される、醗酵の解糖経路に
おいて２回以上の無益回路を実施するイースト。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP93202753 | 1993-09-24 | ||
| NL93202753:5 | 1993-09-24 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07177877A true JPH07177877A (ja) | 1995-07-18 |
Family
ID=8214118
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6229120A Pending JPH07177877A (ja) | 1993-09-24 | 1994-09-26 | イーストによるガス及びアルコール生成の改良 |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5968790A (ja) |
| EP (1) | EP0645094B1 (ja) |
| JP (1) | JPH07177877A (ja) |
| AT (1) | ATE187603T1 (ja) |
| AU (1) | AU673768B2 (ja) |
| CA (1) | CA2132772A1 (ja) |
| DE (1) | DE69422114T2 (ja) |
| ES (1) | ES2142908T3 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2018207779A1 (ja) * | 2017-05-09 | 2018-11-15 | 株式会社カネカ | 新規パン酵母 |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DK0939830T3 (da) * | 1996-09-06 | 2009-04-06 | Peter Ruhdal Jensen | Fremgangsmåde til forbedring af produktionen af et önsket produkt fra en celle |
| AU3421699A (en) * | 1998-04-07 | 1999-10-25 | Dsm N.V. | Improved yeast strain |
| AU781331B2 (en) * | 1999-09-22 | 2005-05-19 | Kaneka Corporation | Novel baker's yeast and doughs containing the same |
| TW200517492A (en) * | 2000-10-02 | 2005-06-01 | Kaneka Corp | Drying-resistant yeast |
| JP2009502158A (ja) * | 2005-07-26 | 2009-01-29 | カウンシル オブ サイエンティフィック アンド インダストリアル リサーチ | 酵母のストレス耐性を増加させる遺伝子類の同定方法類、およびそれらの遺伝子類の酵母株改良のための使用 |
| UA111839C2 (uk) | 2011-02-18 | 2016-06-24 | Лесаффр Е Компані | Штами saccharomyces cerevisiae, придатні для виробляння пекарських дріжджів, що є осмостійкими та стійкими до дії слабких органічних кислот, способи їх одержання та застосування |
| CN111269845B (zh) * | 2018-12-04 | 2023-07-07 | 安琪酵母(崇左)有限公司 | 提高面团产气能力的酵母组合物及其制备方法和应用 |
| TWI721879B (zh) * | 2020-05-04 | 2021-03-11 | 和碩聯合科技股份有限公司 | 決定產能參數的方法及產能參數產生系統 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IL80510A0 (en) * | 1985-11-08 | 1987-02-27 | Genetics Inst | Improved yeast strains |
-
1994
- 1994-09-14 AT AT94202643T patent/ATE187603T1/de not_active IP Right Cessation
- 1994-09-14 EP EP94202643A patent/EP0645094B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-09-14 ES ES94202643T patent/ES2142908T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1994-09-14 DE DE69422114T patent/DE69422114T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1994-09-23 CA CA002132772A patent/CA2132772A1/en not_active Abandoned
- 1994-09-23 AU AU74174/94A patent/AU673768B2/en not_active Ceased
- 1994-09-26 JP JP6229120A patent/JPH07177877A/ja active Pending
-
1997
- 1997-05-22 US US08/861,952 patent/US5968790A/en not_active Expired - Fee Related
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2018207779A1 (ja) * | 2017-05-09 | 2018-11-15 | 株式会社カネカ | 新規パン酵母 |
| CN110785484A (zh) * | 2017-05-09 | 2020-02-11 | 株式会社钟化 | 新型面包酵母 |
| JPWO2018207779A1 (ja) * | 2017-05-09 | 2020-03-12 | 株式会社カネカ | 新規パン酵母 |
| CN110785484B (zh) * | 2017-05-09 | 2023-08-29 | 株式会社钟化 | 面包酵母 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0645094A1 (en) | 1995-03-29 |
| ATE187603T1 (de) | 2000-01-15 |
| EP0645094B1 (en) | 1999-12-15 |
| CA2132772A1 (en) | 1995-03-25 |
| ES2142908T3 (es) | 2000-05-01 |
| DE69422114D1 (de) | 2000-01-20 |
| AU7417494A (en) | 1995-04-06 |
| DE69422114T2 (de) | 2000-08-24 |
| AU673768B2 (en) | 1996-11-21 |
| US5968790A (en) | 1999-10-19 |
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