JPH07119227B2 - 生体物質処置方法、処置用化合物 - Google Patents

生体物質処置方法、処置用化合物

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JPH07119227B2
JPH07119227B2 JP60105716A JP10571685A JPH07119227B2 JP H07119227 B2 JPH07119227 B2 JP H07119227B2 JP 60105716 A JP60105716 A JP 60105716A JP 10571685 A JP10571685 A JP 10571685A JP H07119227 B2 JPH07119227 B2 JP H07119227B2
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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は臨床移植及び自己免疫疾患の処置に関する。本
発明は受容体による供給体組織の移植片拒否反応を防止
できる食作用阻止性の、また免疫変化特性を有する一群
の化合物を同定することを目的とする。
尚、本発明で使用される菌は本願出願時において当業者
に容易に入手可能である。例えば、周知のアメリカンタ
イプカルチャアコレクションによって入手可能である。
免疫抑制剤は従来臨床移植，自己免疫疾患の処置及び基
礎的免疫機能の研究を含む広範囲の医療用途に用いられ
ている。特に臓器の移植は人間の臓器不全に対し主たる
解決を与えるが、不適合な供給体／受容体の組合せでは
受容体の免疫抑制が移植組織の生存に必須である。従来
の移植片拒否反応の理解では供給体型のパツセンジヤー
（passenger）抗原提供細胞が受容体の動物移植片拒否
反応を引き起す等、免疫反応生成の前提条件と考えられ
ている。長期間にわたる試験管内での供給体臓器の培養
（高い酸素溶圧下で数週間）は選択的にかかる細胞を減
じてゆき、臓器移植を可能ならしめる。
不都合なことに一般に免疫抑制に用いられている薬は自
身有毒であり、かつ、系統的に投薬せねばならず、宿主
の免疫系を損い他の有害な効果を引起こす。
研究の結果カビの生成物であるシクロスポリン（cyclos
porin）がある程度の成功をもつて臨床移植に用い得る
ことが確立された。しかし腎毒性，肝臓毒性，系統的投
薬による患者の日和見感染，自発リンパ腫，及び高価な
長期治療はこの製品を用いる場合の主な欠点である。こ
の初期の研究からより良くより毒性の少ない免疫変化剤
の要求が存在することが明らかとなつた。
種々のカビ生成物は普通ブイヨン中で培養されるとエピ
ポリチオジオキソピペラジン（epipolythiodioxopipera
gines）を生成することは十分確立されている（総説と
してはテーラー，エー.1971年．スポリデスミン及び他
のエピポリチアジオキソピペラジンの毒物学．エス．カ
デイス，エー．シーグラー及びエス．アジル編 微生物
毒素VII,337−376頁．ニューヨーク，アカデミツクプレ
スを参照）。これら化合物は試験管内で抗菌性，抗カビ
性，抗ウイルス性及び殺アメーバ性（amoebicidal）潜
在活性につき研究された。しかしそれらの生体中への応
用は哺乳動物のもつ高い細胞障害性により非常に限られ
ていた。事実、同じことがトロウンの（トロウン，エ
ー，ダブリユー,1968.バイオケミストリー アンド バ
イオフイジツクス リサーチ コミユニケーシヨン33,4
02）合成モデル化合物,1.4−ジメチル−3,6−エピジチ
ア−2.5−ジオキソピペラジンについても示されてい
る。従つて生体中でこれらカビ又は合成化合物の効果は
ほとんど知られていない。
実験的アレルギー性脳脊髄炎は中枢神経系の自己免疫性
脱髄疾患であり、現在のところ多重硬化症の最適な実験
モデルと考えられている。このモデル疾患の発病学的研
究は免疫性損傷の細胞的性質を強く示し、従つて実験的
アレルギー性脳脊髄炎の病理学的状態へ導く免疫反応の
求心性及び遠心性肢において大食細胞が重要であると考
えられる。ここでもまたエピポリチオジオキソピペラジ
ンに属するこれらカビによる、また合成の化合物の本疾
患の病因に関する効果は全く知られていない。
本発明の目的は不適合な供給体／受容体組合せにおける
移植片拒否反応を防ぐための生体を処置する方法を提供
するにある。「生体物質」なる表現は例えば単細胞，細
胞凝集塊，完全な臓器，臓器の集合，あるいはこれらの
組合せであり、供給体又は受容体のどちらのものでもよ
い、臓器移植過程に含まれるあらゆる生体物質を意味す
る。
本発明の他の目的は人間以外の動物における自己免疫疾
患を処置する方法を提供するにある。
本発明は上に定義した生体物質を処置する方法であつ
て、生体物質を一般式（１） の化合物の有効量に単独で，又は一又は複数の製薬学的
に許容される担体又は希釈剤と共におくことを特徴と
し、 こゝで、R0及びR1は水素，ヒドロキシル，アルキル，ア
ルコキシ及びアシロキシよりなるグループから選ばれる
基であり；R2及びR3は別々に水素及びアルキルよりなる
グループより選ばれる基であり；又は共に一般式（２） の基を表わし、 こゝでR5，R6，R7，R8及びR9は水素，アルキル，ヒドロ
キシ，アルコキシ，サルフアイド及びハロゲンよりなる
グループより別々に選ばれ；あるいはR2及びR3は共に一
般式（３） の基を表わし、 こゝで、R10及びR11は両者共水素を表わし；あるいは共
に原子価結合を表わし；R12，R13，R14，R15は水素，ヒ
ドロキシ，アルコキシ，サルフアイド及びアシロキシよ
りなるグループより選ばれる基であり;nは２から４の範
囲の整数より選ばれる、食作用阻止性及び免疫変化特性
を生じさせる移植可能な生体物質処置方法を提供する。
式（１）に従うエピポリチオジオキソピペラジンとして
知られている一群の化合物は食作用阻止性及び免疫変化
特性を示すことが見出された。
エピポリチオジオキソピペラジンのクラスに入る多数の
化合物、特にグリオトキシン，グリオトキシン−トリ−
サルフアイド，グリオトキシン−テトラ−サルフアイ
ド，スポリデスミン,1.4−ジメチル−3.6−エピジチオ
−2.5−ジオキソピペラジン及びデヒドログリオトキシ
ンは特に移植片拒否反応を防止するのに有効であること
が見出された。
本発明の利点は移植過程中における例えば臓器など、必
ずしも受容体のものとは限らない供給された生体の処置
を可能とすることである。
供給された生体物質を処置することの一の利点はそれが
現在用いられている免疫抑制薬の副作用を除去すること
である。本発明になる処置に関係する副作用は受容体器
官への毒性，肺炎等の日和見感染，高価な長期治療等が
含まれる。
本発明による供給体の処理は供給体内にあり受容体中に
移植片拒否反応を開始させるパツセンジヤー白血球の選
択的不活性化を生じるものと仮説する。本発明による処
置は従来の処置と異なり不可逆的にパツセンジヤー白血
球を不活性化し、もつて受容体の長期間治療の必要性及
びそれに起因する不都合は副作用の必要性が回避され
る。
アスペルギルス属及びペニシリウム属のカビ，及び他の
関連するカビの種は試験管培養でグリオトキシンがその
一であるエピポリチオジオキソピペラジンのクラスの化
合物に属する代謝産物を生じることが公知で、これは広
く刊行された方法（例えばロウ，ジー他,1966.ジヤーナ
ル オブ ケミカル ソサイエテイ,1799 あるいはデ
イングレイ他,1962.ジヤーナル オブ ジエネテイツク
マイクロバイオロジー，29,127）の変形により得られ
る。
本発明者はかかる化合物は、プラスチツクへの大食細胞
付着及び微粒子物の食作用によりテストした結果食作用
阻止性の活動を示し、ステイミユレータの脾細胞を処理
すると細胞の異常反応的な、また主要組織適合遺伝子複
合体に制約される細胞障害Ｔ細胞を生じる能力が抑止さ
れることを確立した。これが移植片拒否反応のモデル系
である。代謝産物（第１図参照）はクロロホルムに可溶
で薄層クロマトグラフイー上で３つの生物学的に活性な
化合物に別々に精製される。これら化合物は精製され
（第２図）、その一つはグリオトキシン（第１図でｎ＝
２）であることが確認された。真のグリオトキシンは精
製された試料と同様な抗食細胞性で免疫変化性活性を有
することが見出された。
実質的に純粋なグリオトキシンをカビ培養から分離する
方法を以下の例に示す。
例１ （ａ）寒天スロープにアスペルギルスフミガタスを接種
する。
（ｂ）該寒天スロープより取られた分生胞子柄をイーグ
ルの最少必須培地に懸濁する。
（ｃ）該分生胞子柄を攪拌せずに20−37℃で半分まで満
たされた丸底フラスコ中でカビの生成のため十分な表面
積が確保されるようにして培養する。５−10日間カビを
成長させる。
（ｄ）カビ菌糸体を培地より分離する。
（ｅ）該培地を過により滅菌する。
（ｆ）該培地をクロロホルム等の有機溶媒で抽出する。
（ｇ）かく得られた有機溶液を乾燥させ、該有機溶媒を
真空下で蒸発させる。
（ｈ）グリオトキシンを残渣より、予備的薄層クロマト
グラフイー（シリカ上で５％のメタノールを含むジクロ
ロメタンにより展開する）により、又はカラムクロマト
グラフイー（シリカ及びメタノール・クロロホルム グ
ラジエントを用いて溶離,0−５％メタノール）を用いて
分離する。分離されたグリオトキシンはエタノールより
再結晶される。
例２ （ａ）寒天スロープにペニシリウム テルリコウスキイ
（Penicillium terilikowskii）136（アトランチツク
リサーチ ラボラトリーズ，ナシヨナル リサーチ カ
ウンスル，カナダ，ハリフアツクス エヌ エス，より
入手可能）又は培養によりグリオトキシンを生ずるのが
知られている多数の入手可能なカビ類のどれか（例えば
テイラー，エー.1971.スポリデスミン及び他のエピポリ
チアジオキソピペラジンの毒物学．エス．カデイス，エ
ー．シーグラー及びエス．ジエー．アジル編，微生物毒
素VII,377−376頁，ニユーヨーク，アカデミツクプレス
参照）を接種する。
（ｂ）以下の段階は極めて同様であるが、栄養ブイヨ
ン，カビが成長する温度及び時間はカビに必要な条件に
より変化し得ることが理解されよう。
烟色麹菌ケムカビは試験管培養でプラスチツクへの大食
細胞付着によりテストしたところ食作用阻止性の活動を
示す従来知られていなかつた２つの代謝産物をさらに生
ずることが見出された。代謝産物は３日間の培養で現わ
れ、５−７日で最大濃度に達した（第４図）。代謝産物
はクロロホルムに可溶で薄層クロマトグラフイー（第２
図）により分離・精製された。それらはグリオトキシン
トリサルフアイド（第１図にてｎ＝３）及びグリオトキ
シン テトラサルフアイド（第１図にてｎ＝４）である
のが同定された。
このように本発明はさらに実質的に純粋なグリオトキシ
ン トリー及びテトラサルフアイドをアスペルギルス
フミガタスより分離する方法を提供する。これは以下の
ものを含む。
例３ （ａ）寒天スロープにアスペルギルスフミガタスを接種
する。
（ｂ）該寒天スロープより取られた分生胞子柄をイーグ
ルの最少必須培地に懸濁する。
（ｃ）該分生胞子柄を攪拌せずに20−37℃で半分まで満
たされた丸底フラスコ中でカビの生成のため十分な表面
積が確保されるようにして培養する。５−10日間カビを
成長させる。
（ｄ）カビ菌糸体を培地より分離する。
（ｅ）該培地を過により滅菌する。
（ｆ）該培地をクロロホルム等の有機溶媒で抽出する。
（ｇ）かく得られた有機溶液を乾燥させ、該有機溶媒を
真空下で蒸発させる。
（ｈ）グリオトキシン トリー又はテトラサルフアイド
を残渣より、予備的薄層クロマトグラフイー（シリカ上
で５％のメタノールを含むジクロロメタンにより展開す
る）により、又はカラムクロマトグラフイー（シリカ及
びメタノール・クロロホルム グラジエントを用いて溶
離,0−５％メタノール）を用いて分離する。分離された
グリオトキシンはエタノールより再結晶される。
例４ （ａ）寒天スロープにペニシリウム テルリコウスキイ
136（アトランチツク リサーチ ラボラトリーズ，ナ
シヨナル リサーチ カウンスル，カナダ，ハリフアツ
クス エヌ エスより入手可能）又は培養によりグリオ
トキシンを生ずるのが知られている多数の入手可能なカ
ビ類のどれか（例えばテイラー，エー.1971.スポリデス
ミン及び他のエピポリチアジオキソピペラジンの毒物
学．エス．カデイス，エー．シーグラー及びエス．ジエ
ー．アジル編，微生物毒素VII,377−376頁，ニユーヨー
ク，アカデミツクプレス参照）を接種する。
（ｂ）以下の段階は全く同様であるが、栄養ブイヨン，
カビが成長する温度及び時間はカビに必要な条件により
変化し得ることが理解されよう。
グリオトキシン，グリオトキシン−トリサルフアイド及
びグリオトキシンーテトラサルフアイド及び関連した化
合物は大食細胞，感染に対抗して宿主の防御システムに
参加し他の免疫細胞と協働して免疫反応を生ずる白色細
胞、の食作用（第１表）を抑止するエピポリチオジオキ
ソピペラジンのクラスに属するのが見出された。本防御
システムでは、これはまた全てのステイミユレータ細胞
でも同じだが、一方の動物の細胞により抗原が他方の動
物のレスポンダーリンパ球（別の白色細胞）へ与えら
れ、その結果細胞障害性又はキラーＴ細胞が生じる。こ
のモデル、すなわち試験管内での異常反応性細胞障害性
Ｔ細胞の誘導は移植片拒否反応のモデルを表わしまた一
方で臓器移植の主要な障害でもある。この異常反応性細
胞障害性Ｔ細胞はエピポリチオジオキソピペラジンに属
するグリオトキシン及び他の化合物により廃されること
が見された。さらに他の免疫機能もまたこれら化合物に
より不可逆的に抑止される。
このように本発明は他方で構造的にはグリオトキシンに
関係し、実質的に純粋で、グリオトキシンと同様な食作
用阻止性かつ免疫変化性を示し、一般式（１）を有する
一群の化合物を提供する。
本発明はさらに一般式（１）の一又は複数の化合物を投
薬することによる（人間以外の）動物の免疫反応を変化
又は抑制する方法を提供する。
本発明はさらに動物（人間を含む）の組織又は供給体動
物を受容体への移植のその場で処置する方法であつて、
該組織の、該受容体への内移植前の、一般式（１）の一
又は複数の化合物の存在下での培養、あるいは供給体動
物への、受容体動物への該組織の内移植前における一般
式（１）の一又は複数の化合物の投薬よりなる方法を提
供する。
本発明はさらに受容体動物への移植前において感作され
た供給体免疫細胞を一般式（１）の化合物により処置す
ることにより実験的アレルギー性脳脊髄炎の開始を防ぐ
方法を提供する。
以下本発明で用いられた材料及び方法を詳しく説明す
る。本発明においては温度は全て摂氏で示し、また技術
用語及び略語は本技術分野における通常の意味を有す
る。粗製の試薬，生成物及び製剤はここに述べる手段あ
るいは公知の手段により精製できる。
実験動物：両性の、生後６−12週間のCBA/H,BALB/c及び
C57BL/10マウス及びDAラツトを用いた。
アスペルギルス フミガタスの培養上澄（SAF）の調製 先に烟色麹菌ケムカビが接種された寒天スロープより取
られた分生胞子柄はイーグルの最少必須培地F15（グラ
ンド アイランド バイオロジカル カンパニー，グラ
ンド アイランド，ニユーヨーク）に懸濁され、攪拌な
しに５−７日間,24度又は37度で培養された。カビ菌糸
体は培地をナイロン網を通すことで分離され、過によ
り滅菌される（ミレツクス−ジーエス,0.22μm,ミリポ
ア エスエー，モルスハイム，フランス） ペリシリウム テルリコウスキイの培養上澄の調整 先にペニシリウム テルリコウスキイが接種された寒天
スロープより取られた分生胞子柄はワインドリング（We
indling）培地（グルコース25g,酒石酸アンモニウム2g,
KH2PO4100mg,MgSO4500mg,酵母エキス100mg,FeSO4×H2O1
mg,CuSO4×H2O0.15mg,ZnSO4×H2O1mg,MnSO4×H2O0.15mg
及びK2MoO40.15mgよりなる）中に懸濁され、攪拌せずに
10−25日間20−24度で培養した。カビ菌糸体は培地をナ
イロン網を通すことで分離され、過により滅菌され
る。
他のエピポリチオジオキソピペラジンの入手源 以下に大要を述べる研究で用いられる天然に産するエピ
ポリチオジオキソピペラジンのメンバーは文献中の記述
に従つて得られ、グリオトキシン，グリオトキシン−ト
リ−サルフアイド及びグリオトキシンーテトラ−サルフ
アイドについては下に詳述する如くにして得られた。グ
リオトキシン，デヒドログリオトキシン及びスポリデス
ミンの確実な試料は以下の一方又は双方の入手源よりの
好意により入手した−アール・ギヤラガー，ルアクラア
ニマル リサーチ ステーシヨン，ハミルトン，ニユー
ジランド及びエー・テイラー，アトランチツク リサー
チ ラボラトリー，ハルフアツクス，ノバ スコシア．
カナダ。1.4−ジチチル−3.6−エピジチオ−2.5−ジオ
キソピペラジンはトロウンに従つて調製した（トロウ
ン，エー．ダブリユー.1968,バイオケミストリー アン
ド バイオフイジツクス リサーチ コミユニケーシヨ
ンズ 33,402頁）。全てのエピポリチオジオキソピペラ
ジンは無水エタノール中に1mg/mlの割合で溶解され、必
要になるまで部分標本として−70度で保管した。
細胞系 チオグリコール酸塩誘導腹腔マクロフアージ（TGM）は
チオグリコール酸を注入したマウス〔５−８日間経過し
た2mlの３％（W/V）チオグリコール酸（デイフコ ラブ
ズ，デトロイト，ミシガン）溶液の腹腔内（ｉ・ｐ・）
注入〕より注射器及び20−ゲージ針を用いた氷冷された
生理食塩水のｉ・ｐ・注入及びぬき取りにより得られ、
細胞遠心塗抹の染色法（デウフ クイツク セツト，エ
ーエイチエス／オーストラリア）により決定したところ
83％以上の大食細胞と単核細胞とよりなつていた。TGM
はさらに遠心法によりペレツト化されF15に５％の犢胎
児の血清（FCS）を加えたもの中に懸濁された。
コンカナバリンＡ（Con A）−活性リンパ細胞,BW5147及
びP815腫瘍細胞を生育させ中性赤又はムルバツヒヤー，
エー.,パリツシユシー．アール.,マンデイ，ジエー．ピ
ー（1984），ジヤーナル オブ イミユノロジカル メ
ソツズ，68,205−215頁）により記述された如く51Crを
用いて表示した。
腫瘍細胞系L929,BW5147,R1+,EL4及びP815,及び２次マウ
ス胎児線維芽細胞（FB）が５−６％のFCSを含むダルベ
ツコ（Dulbecco）の変形イーグル培地H16（グランド
アイランド バイオロジカル カンパニー，グランド
アイランド，ニユーヨーク）中で成長された。
ラツトの多形核細胞もまたチオグリコール酸処理された
動物より得られアイヒナー，アール・デイー及びスミー
トン，テー・シー.,スカンジナビアン ジヤーナル オ
ブ イミユノロジー，18 259−263頁（1983）に記述の
如く付着細胞から解放される。
常在性かつインフルエンザに誘発された（鼻内投薬され
た500HAUのA/WSNインフルエンザ）肺胞大食細胞がラツ
トよりPBSを用いた肺洗浄のくりかえしにより得られ
た。
ConA−活性細胞上澄の調整 ConA−活性細胞上澄の調整及び試金はラフアテイ，ケー
・ジエー他（1982）オーストラリアン ジヤーナル オ
ブ エクスペリメンタル バイオロジカル アンド メ
デイカル サイエンス58,533−544に従つた。
混合リンパ細胞培養（MLCs） リソンダー（Resonder）脾細胞懸濁液（1ml当り２×106
個の細胞を有す）は５日間、37℃で加湿された５％CO2/
95％空気中で２×106個の同種免疫脾細胞（60Co源より
の2000Rにより不活性化された）と共に、又は１×106個
の同種免疫TGMと共に、５％の犢胎児の血清及び10-4Ｍ
の２−メルカプトエタノールを含む5mlのイーグル最少
必須培地F15内で培養される。
細胞障害性試金及び抗体及び補体仲介崩壊 P815,L292,BW5147,ConA芽細胞及びTGMを用いた細胞障害
性細胞の51Cr放出試金及び崩壊はムルバツヒヤー，エ
ー，パリシユ，シー．アール及びマンデイ，ジエー．ピ
ー（1984），ジヤーナル オブ イミユノロジカル メ
ソツズ，68 205−215に記述された過程に従つた。
中性赤細胞付着試金 ムルバツヒヤー，エー．及びアイヒナー，アール．デイ
ー（1984），プロシーデイングス オブザ ナシヨナル
アカデミー オブ サイエンス（ユー．エス．エ
ー）,81 38935−3837頁）に記述された方法を用いた。
要約すると５×106−５×107個のTGM,L929又はFBが懸濁
状態で15分間、37℃にてハンク（Hank）の平衡塩溶液中
にて5mlの0.04％（W/V）中性赤（NR）（C1 50040,BDH）
中で標示された。細胞はペレツト化され２度１％のFCS
を含むF15中で洗浄され、1ml当り５×105個の細胞濃度
で再懸濁された。部分標本（0.1ml）が96個のウエルを
有する丸底組織培養板（カタログ番号75−013−05;リン
ブロ デイビジヨン，フローラボラトリーズ，ハムデ
ン，コネテイカツト）の各々のウエルに分配された。板
は当初NR−標示細胞を加える前においてエピポリチオジ
オキソピペラジン又はその希釈物に属する化合物を含む
0.1mlの部分標本溶液を有していた。37℃にて適当な培
養の後培地は投棄され、細胞単一層はマイクロプレート
をリン酸塩緩衝生理食塩水（PBS）浴（0.143M塩化ナト
リウム,0.01Mリン酸ナトリウム,pH7.4）中に一度浸漬す
ることで洗浄された。PBSは棄てられNRは、各ウエル当
り0.1mlの50％エタノールに0.05Mの酢酸を加えたものを
加えることにより残留付着細胞より解放された。この際
540mmでの光学的密度がマイクロプレート読取器により
測定された（ダイナテツク500,Dynatech500,又はエリサ
ELISA）。
異常反応性及びMHC−拘束細胞障害性Ｔ細胞の発生及び
細胞障害性テスト 用いた方法はムルバツヒヤー他、（1984），ジヤーナル
オブ イミユノロジカル メソツズ，68 205−215頁
による。要約すると雌のC57BL/10マウスがｉ・ｐ・によ
り107個の同系の雄の脾臓細胞により免疫され、少なく
とも４週間のポストプライミングの後使用された。異常
反応性で、また主要組織適合遺伝子複合体（MHC）に拘
束された細胞障害性Ｔ細胞の発生のため、先に免疫され
た動物の脾臓レスポンダ細胞が５×106個のCBA/H,又は5
5×106個の雄のC57BL/10の照射された（60Co源よりの20
00Rで）脾臓ステイミユレータ細胞とそれぞれともに培
養される。細胞は５％のFCSに10-4Ｍの２−メルカプト
エタノールを加えたものを含む5mlのF15中で12ウエル
培養皿（コスター，ケンブリツジ，マサチユーセツツ）
中で５日間、37℃にて加湿された５％CO2空気中で培養
された。
培養物は取り出され0.1の部分標本細胞が３段階希釈に
より96ウエルの丸底組織培養板へ滴定される。TGM標的
細胞は51Cr（アメルシヤム，英国）で１時間標示され、
よく洗浄し0.1mlの部分標本に1ml当り２×105個の細胞
数の割合で加えられ37℃で６時間培養された。0.1mlの
各々のウエル上澄は除去されガンマ線計数器で放射能測
定された。培地による放出は標的細胞を効果器細胞のな
い状態で培養することにより推定された。放出可能51C
の全量は標的細胞を１％トリトン−Ｘ溶液中で溶解する
ことで測定された。
比溶解百分率は式 により算出される。
精製代謝産物の分光学的研究 プロトン核磁気共鳴スペクトロスコピーを37度にて89.5
6MHzで動作するJEOL FX90Qスペクトロメータにより行つ
た。ケミカル シフトは加えたトリメチルシラン（TM
S）からppm単位でダウンフイールド測定された。赤外ス
ペクトル（IR）はユニカムSP1000スペクトロメータでKB
r中でなされた。質量スペクトル（MS）はMS−９スペク
トロメータによりなされた。
生物学的活性の計算 中性赤で標示された残留付着TGM個体群の存在を示す540
nmでの吸収をエピポリチオジオキソピペラジン含有溶液
の希釈に対してプロツトした。同様なプロツトを既知
の、あるいは同定された物質の濃度の関数として作製し
た。未知試料の有効希釈は付着TGMの最大観測損失の50
％をもたらす希釈であると定義される。また既知化合物
の精製された部分に対応するパラメータをED50又は有効
投与量と表現する。培養又は精製された部分の生物学的
活性の量は次式 で決定され、（グリオトキシン）標準は真のグリオトキ
シン溶液の濃度（通常1ml当り１〜10ug）を意味する。
濃縮クロロホルム抽出物を分析する際はさらに希釈因子
が加わる。
特定の物質に対する食作用 ５％のFCSを補われた、イーグルの最少必須培地F15（グ
ランド アイランド バイオロジカル カンパニー，グ
ランド アイランド，ニユーヨーク）中の細胞（1ml当
り５×106個）はGT（１−1000ng/ml）のない状態又は存
在下で30分間37℃で予備培養された。次いで30−180分
間種々の微粒子の食作用が開始され、ここで試金は４℃
へ初期急冷される。特に炭素（ペリカン インデイア
インク，西独）攝取をヤツフエ，ピー及びヨツフエイ，
ジエー．エム，ジヤーナル オブ アナトミー 134,72
9−740頁（1982）に述べられた方法により測定した。定
量化は、細胞の遠心分離による非食作用物質の除去の後
溶解された（50mMの酢酸と50％のエタノールによる）細
胞の800nmでの混濁度の測定及び／又は200個の単核細胞
の計数による光鏡検を含んだ。対照に対する百分率で表
現される食作用は、１）対照試料中の細胞数で割られた
処理された試料中の炭素を含む細胞数又は、２）対照試
料の懸濁度で割られた処理された試料中の800nmにおけ
る懸濁度として定義される。
鉄カルボニルの食作用はコレン，エイチ・エス・及びホ
ツデス，アール．エフ，ヨーロピアン ジヤーナル オ
ブ イミユノロジー，7,394−400頁（1977）に述べられ
た方法に従つて測定された。
螢光微小球（直径0.57um,ポリサイエンシズインコーポ
レーテツド，ウオリントン，ペンシルバニア）の攝取は
螢光活性細胞選別器により分析された。螢光強度の粒子
数（試料当り200,000事象）の関数としてのプロツトが
得られ、次いで積分された（プラニクス7,タマヤ アン
ド カンパニー，東京）。
GTの食作用抑止効果は一般に測定された抑止効果の半分
をもたらしたGT濃度で定義されるED50の値により表現さ
れる。
以下本研究で得られた結果の詳細を説明する。
アスペルギルス フミガタス代謝産物の精製 アスペルギルス フミガタス培養上澄より取られた生物
学的に活性な化合物はクロロホルム抽出，薄層クロマト
グラフイー及び再結晶化（第６表）により1000倍以上に
精製された。この上澄から分離された他の化合物はTGM
付着試金で不活性であつた。
ペニシリウム テルリコウスキイ代謝産物の精製 実質的に同等な過程が該カビの培養上澄中の活性代謝産
物を精製し、分離するのに用いられた。
烟色麹菌ケムカビ培養上澄中のグリオトキシン，グリオ
トキシン−トリ−サルフアイド及びグリオトキシン−テ
トラ−サルフアイドの同定 予備的研究によりこれら上澄中に存在する活性成分（第
２図中のA,B,C）は以下の特性を有することが示されて
いた。
（１）ゲル過法により決定された分子量は500以下で
ある。
（２）トリプシン，プロテアーゼ，及びオリガーゼの消
化作用に対し安定である。
（３）弱アルカリ中での加熱に弱く、酢酸鉛テストで測
定したところ随伴して硫化物放出をなす。
化合物A,B及びＣについての生物学的に活性な成分のRf
値はそれぞれ0.49,0.41及び0.34であつた。生成された
真のグリオトキシンのRf値は0.50であつた。第３図は真
のグリオトキシン（下図）及びRf値が0.49の化合物（上
図）のNMRスペクトルを示す。cm-1を単位とする以下の
周波数は該化合物につき赤外で観測されたピークを表
す。3450（ｍ）,2930（ｗ）,1670（ｓ）,1640（ｗ）,13
80（ｗ）,1280（ｗ）,1240（ｗ）,1200（ｗ）,1060
（ｗ）,720（２）,660（ｗ）及び5640（ｗ）、ただしs,
m及びｗは強，中，あるいは弱吸収を表す。真のグリオ
トキシン試料も同一の赤外スペクトルを有していた。
（ａ）TGM付着試金における有効希釈又はED50の値の真
のグリオトキシンの値に対する比。比には希釈されてな
いグリオトキシン標準溶液の濃度が乗じられている。
（ｂ）非揮発性成分の重量により除された活性。
（ｃ）個々の生物学的活性成分であり、A,B,Cはそれぞ
れTLC板より除去されエタノール又はクロロホルム−シ
クロヘキサンより再結晶されたグリオトキシン，グリオ
トキシン−トリ−サルフアイド及びグリオトキシン−テ
トラ−サルフアイドを意味する。
（ｄ）非活性±真のグリオトキシンと比較した変動係
数。
成分Ａの電子衝撃質量スペクトロコピーはM+を262,244,
226及び214で与えた。m/eが262より大きい細片は観測さ
れなかつた。成分Ａの化学イオン化はM+＋１を327,263
（M+＋１−S2）,245（M+＋１−S2−H2O）及び227（M+＋
１−S2−2H2O）で与えた。成分Ｃの化学イオン化はM+＋
１を391,359（M+＋１−Ｓ）,327（M+＋１−S2）,263（M
+＋１−S4）,245（M+＋１−S4−H2O）及び227（M+＋１
−S4−2H2O）で与えた。
高分解能化学イオン化質量分析は以下のことを示した。
成分Ａについては327.0472においてM+＋1,最適化学式＝
C13H14N2O4S2（期待値＝327.0473），成分Ｂについては
359.0193,最適化学式＝C13H14N2O4S3（期待値＝359.019
4），成分Ｃについては390.9914,最適化学式＝C13H14N2
O4S4（期待値＝390.9915）となつた。成分Ｂ及びＣにつ
いての高分解能NMRのデータを質量スペクトルデータの
フラギユメンテーシヨンパターンと結びつけるとグリオ
トキシン類似の構造が裏付けられる。
成分Ｃの光学回転（CHCl3，濃度＝2.33×104Ｍ）は(M)
404−1890°，(M)435−1500°，(M)500−970°，(M)577
−620°であつた。真のグリオトキシンの文献値は(M)
589−890°（CHCl3，濃度＝0.103M）である。発明者の
手許にある真のグリオトキシンの対応する値は(M)404−
1480°，(M)435−1200°，(M)500−864°，(M)577−593
°（CHCl3，濃度1.18×10-3Ｍ）であつた。このように
成分Ｃ又はグリオトキシン−テトラサルフアイドのORD
曲線は400から577nmの間で13−30％の増加を除くと真の
グリオトキシンのものと同一であり、二硫化物成分の同
じ絶対構造を示す。
化学的性質，安定特性,TLC易動度，高分解能NMR,IR及び
質量スペクトロスコピーを組合わせて真のグリオトキシ
ン試料と比較すると成分A,B,Cはそれぞれグリオトキシ
ン，グリオトキシン−トリ−サルフアイド及びグリオト
キシン−テトラ−サルフアイドであると同定された。事
実成分A,B,Cの高分解能質量スペクトルにおいてフラギ
ユメンテーシヨンパターンは成分Ｂ及びＣの場合の初期
の硫黄の損失を除けば同一である。
エピポリチオジオキソピペラジンの食作用への効果 これらの効果を第１表に示す。TGMによる炭素の攝取は
グリオトキシン（1ml当り1000ng）により82％まで抑止
された。観測された効果の２分の１を生じるグリオトキ
シン濃度（ng/mlで表したED50）は全ての粒子及び誘発
及び常在性細胞個体群について同様であつた。
大食細胞及び単核細胞の食作用と類似のプラスチツク表
面への付着はグリオトキシンにより，ED50の値（第１
表）に反映されている如く投与量に応じて抑止される。
第７表は大食細胞による食作用に対する種々のエピポリ
チオジオキソピペラジンの効果を示す。これらの化合物
は全て食作用を抑止する。第８表はエピポリチオジオキ
ソピペラジン部分を有しない他のカビ代謝産物はかかる
活性を有しないことを示す。グリオトキシンのジメチル
チオエーテル誘導体が本試金にて活性を有しない事実は
これら化合部のエピポリチオジオキソピペラジンの必須
性を強調するものである。
ａ）値は少なくとも３個の測定の平均値と＋／−の標準
誤差を表す。
ｂ）1000ng/mlグリオトキシンにおいて対照と比較して
定義。
ａ）大食細胞付着試金におけるng/ml単位で表したED50
値。
ｂ）この系統にあつてエピポリチオジオキソピペラジン
の完全な二硫化物部分を有しない唯一の化合物を代表す
る。
ａ）ED50はTGM接着を50％抑止するのに必要な化合物の
濃度の意である。
エピポリチオジオキソピペラジンの免疫機能への影響 特に指摘しない限り以下に述べる値は全て通常の実験誤
差範囲内にあり、当業者は上記及び下記の発明の変形及
び多様化が本発明の概念より逸脱することなく可能であ
ることを理解しよう。
（１）試験管内でのエピポリチオジオキソピペラジンの
BALB/C抗C57BL/10異常反応性細胞障害性Ｔ細胞発生に対
する効果は下の通りである。
（２）試験管内でのグリオトキシンのCBA抗BALB/C異常
反応性細胞障害性Ｔ細胞の誘発は下の通りである。
CS−ConA−活性リンパ細胞上澄 ４時間以上にわたる51Crの比放出の平均百分率。自発
放出は16％であつた。滴定曲線による値は培養の1/30で
あつた。３回のくりかえしのSEMを括弧内に示す。
（３）試験管内での細胞障害性Ｔ細胞試金におけるター
ゲツト細胞崩壊に対するグリオトキシンの効果は下の通
りである。
★ED50値はng/mlで示され、ターゲツト細胞の崩壊を50
％抑止したグリオトキシン濃度を表す。
４）試験管内でのマイトジエンに応答したＴ及びＢリン
パ細胞増殖に対するエピポリチオジオキソピペラジンの
効果は下の通りである。
第５表 化合物 ED50★ グリオトキシン 15 スポリデスミン ２ デヒドログリオトキシン 25 1,4−ジメチル １−3,6−エピジチオ−2,5−ジオキソ
ピペラジン 150 ★ED50値はng/ml単位であり、これら化合物のマイトジ
エンLPS及びConAに対するＴ及びＢリンパ細胞の増殖的
応答を抑止する濃度を表す。
エピポリチオジオキソピペラジンは上述の標準テストに
示された如く液素性及び細胞免疫に対する効果により有
用である。それらは免疫細胞あるいはリンパ細胞の抑制
あるいは形成あるいは増殖に有用であり、従つて自己免
疫疾患の治療に有用であり、例えば甲状腺，皮膚及び脾
臓等の移植の拒否を抑制する。その詳細は下の通りであ
る。
移植片拒否反応の防止に際するグリオトキシンの使用 （１）甲状腺：供給体動物（マウス）から甲状腺を麻酔
下で取り出しグリオトキシン（1ml当り０−1000ng）を
含有する滅菌培地（F15）へ移した。甲状腺は37度で加
湿CO2定温器中（空気中に５％のCO2含有）で６−18時間
培養した。組織は新しいF15又はその同等物で洗浄され
受容体の同種マウスの腎臓膜下に内移植された。植接用
片機能は組織学的及び機能的に評価され、後者は放射性
ヨウ素の実際の攝取により評価された。これらの実験に
おいてグリオトキシンを受けなかつた20例の同種移植の
うち受容体マウスにより受入れられたのは１例もなかつ
た。しかし30例の処理された植接用片のうち９例は成功
した。これらの実験において受容体動物は処置（すなわ
ち免疫抑制）を手術のための麻酔以外には受けなかつ
た。
（２）皮膚：マウスの尾の皮膚についての初期の研究
は、供与体皮膚の前処理が処理なしの組織に比較して主
要組織適合遺伝子複合体不適合のマウスの生存期間を延
長することを示した。特にグリオトキシン（1ml当り100
0ng）の存在下でのF15の如き適当な培地中における供給
体組織の試験管培養は植接用片の生存を７−15日間延長
した。
（３）膵島：供給体マウスの膵島のグリオトキシン（1m
l当り1000ng,37℃で12−18時間）試験管培養は異系統の
５体の動物中５つの植接用片，すなわち同種移植の成功
をもたらした。膵島の移植及びその準備は十分に公刊さ
れている。これらの植接用片はその部位に3 1/2ケ月以
上存在した。グリオトキシンのない状態での照射同種移
植が行われたもので成功したものはなかつた。形態学的
及び機能的研究はこれらの結果を確認した。特に４体の
胎児供給体の膵島を上記の如くグリオトキシンで処理し
ストレプトゾトシンにより糖尿病性にされた同種受容体
の腎被膜下に移植した。この動物では４−６週間後に正
常血糖が達成された。上記の如くグリオトキシンで処置
された10例の同系移植は全て拒絶反応の徴候なしに成功
裡に移植された。
実験的アレルギー性脳脊髄炎におけるエピポリチオジオ
キソピペラジンの使用 本疾患の免疫損傷の外見上の細胞的性質及びその大食細
胞の試験管内における大食細胞機能に対する該化合物の
効果の良いモデルを与える。かかる疾患の誘発は受動免
疫を含み、その際先にミエリン塩基性タンパク質で免疫
された脾臓細胞が純真動物に移される。これら脾臓細胞
のグリオトキシン（1ml当り100−1000ng），スポリデス
ミン（1ml当り３−300ng）あるいは1.4−ジメチル−3.6
−エピジチオ−2.5−ジオキソピペラジン（1ml当り300
−1000ng）による予備的培養は各処理において５例中５
例、完全に疾患を防止した（神経学的徴候及び中枢神経
系の病理学的検診による測定）。脾臓細胞にこれら化合
物による処理をしなかつた10例の対照中９例は麻痺し
た。
上記の使用において投与量は当然用いる化合物，投薬の
方式及び望まれる治療により変化する。
【図面の簡単な説明】
第１図は本発明になるグリオトキシン（ｎ＝２），グリ
オトキシン−トリ−サルフアイド（ｎ＝３），及びグリ
オトキシン−テトラ−サルフアイド（ｎ＝４）の一般式
を示す図、第２図は上記化合物を薄層クロマトグラフイ
ーにて精製した結果を示す写真、第３図は烟色麹菌ケム
カビの代謝産物から単離されたグリオトキシンと真のグ
リオトキシンのNMRスペクトルを示す図、第４図は烟色
麹菌ケムカビの培養により代謝産物の出現を示す図であ
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ｃ１２Ｎ 5/06 (Ｃ０７Ｄ 513/08 285:00） (Ｃ０７Ｄ 513/08 285:00 241:00） (Ｃ０７Ｄ 513/18 285:00 209:00） (Ｃ０７Ｄ 513/18 285:00 241:00 209:00） (Ｃ１２Ｐ 17/18 Ｃ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｐ 17/18 Ｃ１２Ｒ 1:80） (72)発明者 アーノ マルバツチヤー オーストラリア国 オーストラリアン キ ヤピタル テリトリー カーテン ジエニ ングス ストリート 40番地

Claims (6)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】生体物質を一般式（１） の化合物の有効量に単独で、又は一又は複数の製薬学的
    に許容される担体又は希釈剤と共におくことを特徴と
    し、 こゝで、R0及びR1は水素，ヒドロキシル，アルキル，ア
    ルコキシ及びアシロキシよりなるグループから選ばれる
    基であり；R2及びR3は別々に水素及びアルキルよりなる
    グループより選ばれる基であり；又は共に一般式（２） の基を表わし、 こゝでR5，R6，R7，R8及びR9は水素，アルキル，ヒドロ
    キシ，アルコキシ，サルフアイド及びハロゲンよりなる
    グループより別々に選ばれ；あるいはR2及びR3は共に一
    般式（３） の基を表わし、 こゝで、R10及びR11は両者共水素を表わし； あるいは共に原子価結合を表わし；R12，R13，R14，R15
    は水素，ヒドロキシ，アルコキシ，サルフアイド及びア
    シロキシよりなるグループより選ばれる基であり;nは２
    から４の範囲の整数より選ばれる、食作用阻止性及び免
    疫変化特性を生じさせる移植可能な生体物質の生体外処
    理方法。
  2. 【請求項２】該生体物質を移植に先立って特許請求の範
    囲第１項記載の一般式（１）の化合物の有効量と共に、
    単独で又は一又は複数の製薬学的に受入れ得る担体又は
    希釈剤と共に、培養することを特徴とする受容体に移植
    するための生体物質を生体外で処理する特許請求の範囲
    第１項記載の方法。
  3. 【請求項３】該生体物質をグリオトキシン，グリオトキ
    シン−トリ−サルフアイド，グリオトキシン−テトラ−
    サルフアイド，スポリデスミン,1.4−ジメチル−3.6−
    エピジチオ−2.5−ジオキソピペラジン及びデヒドログ
    リオトキシン又は特許請求の範囲第１項記載の一般式
    （１）のそれらの誘導体の存在下で、移植に先立って培
    養することよりなりR2及びR3は共に式（２）又は式
    （３）の基を表わす特許請求の範囲第1,2項記載の方
    法。
  4. 【請求項４】単独で、又は一又は複数の製薬学的に許容
    される担体又は希釈剤と共に、特許請求の範囲第１項記
    載の一般式（１）の化合物の有効量を投薬することによ
    る、人間以外の動物の免疫反応を調整又は抑制する方
    法。
  5. 【請求項５】単独で、又は一又は複数の製薬学的に許容
    される担体又は希釈剤と共に、特許請求の範囲第１項記
    載の一般式（１）を有する化合物の有効量を処理の必要
    に応じて動物に投薬することよりなる人間以外の動物の
    自己免疫疾患を処置する方法。
  6. 【請求項６】グリオトキシン，グリオトキシン−トリ−
    サルフアイド，グリオトキシン−テトラ−サルフアイ
    ド，スポリデスミン,1.4−ジメチル−3.6−エピジチオ
    −2.5−ジオキソピペラジン及びデヒドログリオトキシ
    ン，又は特許請求の範囲第１項記載の一般式（１）に示
    したそれらの誘導体を治療学的有効投与量投薬すること
    よりなり、R2及びR3は共に式（２）又は式（３）の基を
    表わす特許請求の範囲第４又は５項記載の方法。
JP60105716A 1984-05-18 1985-05-17 生体物質処置方法、処置用化合物 Expired - Lifetime JPH07119227B2 (ja)

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