JPH06508156A - 成長ホルモンから成る蛋白調合物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の名称 成長ホルモンから成る蛋白調合物 技術分野 本発明は成長ホルモンもしくはその機能的類似体の調合物に関するものであり、 特に緩衝材料として濃度が約２乃至５０ｍＭのシトラード、とりわけ濃度が約２ 乃至２０ｒｎＭのクエン酸ナトリウムから成る人間の成長ホルモン（ｈＧＨ）溶 液に関するものである。この緩衝材料は安定性の向上に用いられる。

背景技術 成長ホルモンはヒトと動物の双方のもの、たとえばヒト成長ホルモン（ｈＧＨ） 、ウシ成長ホルモン（ｂＨＧ）と、豚成長ホルモン（ｐＧＨ）である。

））　Ｇ　Ｈは１９１のアミノ酸の単鎖から成る蛋白である。

分子は２つのジスルフィド結合で架橋され、単量体フオームは２２ｋＤａの分子 ・量を有する。しかし、下垂体ヒト成長ホルモンは均質でない。たとえば、同一 遺伝子からつくられる比較的小さい２０　ｋ　Ｄ　ａ　ｈ　Ｇ　）ｌ変異体も周 知である。妊娠中の胎盤により示される「基礎ｈＧＨＪ変異体（ｈＧＨ−Ｖ）は もう１つの類似体であり、別の遺伝子の生成物である。２２ｋＤａ　ｈＧＨのよ うに、それは１９１のアミノ酸から成るが、それらの分子１３の全体を通して各 種の位置において異なっている。たとえば、１９７５年発行のビューレイ・チー ・ニー代著による「前進酵素学ｊ、第４２巻、第７３頁乃至第１６６頁及び１９ ８８年発行のフランケン・エフ代著による［内分泌及び新陳代謝臨床ジャーナル ］、第６６巻、第１１７１頁乃至第１１８０頁参照のこと。

組換えｈＧＨ（２２ｋＤａ）はここ数年の間に市販で入手できてきた。それはヒ トの組織から調製された生成物がクロイツエフエルト・ヤコブ病のような伝染性 病原体を含む虞があるので下垂体抽出生成物よりもむしろ好まれている。治療上 有用な２種類の組換えｈＧＨ調合剤が市場に出ている。権威あるものとしてはた とえば、カビ　ファーマシア　アクチボラーグ社のゲノトロピン（商標）と、Ｎ −末端で付加メチオニン残留物のある類似体、たとえばソマトノーム（商標）で ある。

ｈＧＨは下垂体機能不全小人症またはターナ−症候群の患者の線形成長を刺激す るために用いられるが、他の適応症にも示唆されている。

水性化合物中の蛋白の安定性は一般に製薬業界において問題がある。それは各種 の乾燥法たとえば凍結乾燥による蛋白の乾燥により解決されてきた。それ以来、 蛋白は乾燥形式で販売されそして貯蔵されてきた。患者はその乾燥蛋白を止むを 得ず使用前に溶剤で元に戻す必要があり、これは患者にとってはもちろん不利か つ不便である。

新しい投与装置、たとえばカビ　ファーマシア　アクチボラーグ社の米国特許第 ４，９６８，２９９号明細書に記載されたカビペン（商標）により、患者はどち らかと言えば取扱いの簡単な装置を与えた。この装置は２室のアンプルのゲノミ ックス（商標）から成り、その片方の室に凍結乾燥粉末としてのｈＧＨを入れ、 他方の室には元に戻す希釈液を入れである。患者は使用前にその製品を元に戻す 。凍結乾燥製品は最長２４ケ月の間貯蔵できる。元に戻した製品は２乃至８℃の 温度で貯蔵すると３週間は安定している。

凍結乾燥法は高価につく時間浪費の作業工程であり、蛋白の市販製品を調合する 際、この工程を避けることができる場合、それは非常に有利となる。

成長ホルモン、たとえばｈ　Ｇ　）（の注射を毎日必要とする患者で、特にその 患者が子供である時、製品の取扱い、投薬ならびに注射が容易なことが重要であ る。凍結乾燥ｈ　Ｇ　Ｈの水戻しには慎重さと注意深さが必要で、なるべくなら 避けた方がよいが、今日唯一の利用できる方法である。

蛋白を溶液として生産し、患者に販売でき、その患者が水に戻すことなく薬剤を 直接注射できる場合、成長ホルモン、特にｈ　Ｇ　Ｈの使用は容易になる。

この問題の色々な解決法が開示されてきたが、これまで製品として市場に出たも のはない。

ジェネンテック氏の国際特許出願公開第Ｗ○８９１０９６１４号公報では、グリ シンと、マンニトールと、緩衝剤とから成るｈＧＩＩの安定配合物を開示し、ま た好ましい実施例では、非イオン界面活性剤たとえばポリソルベート８０を添加 する。燐酸ナトリウムが緩衝物質として示唆されている。配合物は凍結乾燥調合 剤にした時、また水で戻した際も向上した安定性がある。

溶液にした成長ホルモンの投与の別の可能性はインターナショナル　ミネラルズ 　アンド　ケミカル社のヨーロッパ特許第２１１，６０１号明細書によればポリ オキシエチレン−ポリオキシプロピレンを含むグロック共重合体を添加すること である。この溶液は投与に際し、動物に持続性解放感を与える。

安定した、注射のできる成長ホルモン溶液、たとえば溶液にしたｈＧＨについて は市場での需要がある。最終製剤溶液が単に最低量に限った添加剤たとえばテン シトを含む場合も有利である。

ここで上述した諸問題を解決する新しい配合物を見出した。

発明の開示 ＧＨの安定性 ｈ　Ｇ　Ｉ（の安定性は蛋白の化学的ならびに物理的性質に左右される。異なる 分解径路、たとえば脱アミド化、酸化および凝集が周知である。

脱アミド化と酸化は蛋白の一次構造の変化から成る普通の化学反応である。脱ア ミド化は特に水溶液で生じるが、水溶液の低温と低ｐ　ｔｉは脱アミド化反応を 抑制する。

凝集の異なる形態は蛋白の物理的不安定性に起因する。

凝集は可溶性にも不溶性にもなり得て、両形態の双方の結合は共有結合にも非共 有結合にもなり得る。凝集は乳光溶液をつくるが、化学的にのみ示し得る非可視 凝集と成る。蛋白配合物における共有凝集の防止は前記の方法が不可逆で、その うえ免疫原性となり得る不活性種が結果として生じることもあり得るので重要で ある。−次構造の変化は蛋白の自己会合である凝集の原因となり得る配座変化も 生じさせることがある。一定の条件で起こる非共有凝集は沈澱と活性の損失に導 くことがある。

多数の反応が異なるｐ　Ｈ条件下で起こり得るので、あらゆる変態反応を排除し ながら蛋白の高溶解度と固有の配座を維持させる特定のｐＨでの蛋白の配合はほ とんど不可能である。

今まで、僅かにアルカリ性のｐＨは一般に可視粒子の予防と透明薬品の達成のた め製造業者により利用されてきた。はとんどの市販製品において、ｐＩ−１は脱 アミド化の危険性が高いにもかかわらず７以上もある。

カビ　ファーマシア　アクチボラーグ社の製品であるゲノトロビン（商標）を水 で戻す時、１６ＩＵ／ｍｌのｈＧＩｒ濃度て６．７というｐ　Ｈを達成できる。

このｐ　）（は全く透明な溶液（ｐＨ８）をつくるｐＨと、いくぶん乳光が強い が比較的低い脱アミド化速度を示すｐＨ６との間の中間のものである。

この複雑さのため、蛋白製剤を配合することはできず、又全分解径路の排除も不 可能である。凍結乾燥蛋白製品は同様の水溶液よりもずっと安定している。しか し、凍結乾燥製品は加工後は十分安定しているが、蛋白はそれでも貯蔵中に緩慢 に分解する。

シトラードを緩衝物質として選んで入れた成長ホルモンを含む溶液が燐を緩衝剤 に入れたものよりもずっと安定していることがわかって全く意外であった。

本発明は、緩衝物質としてのシトラードから成る成長ホルモンもしくはその機能 性類似体の注射できる調合物に関するものである。該調合物は成長ホルモンもし くはその類似体の水溶液であり、その中に緩衝物質としてシトラードを２乃至５ ０ｍＭの濃度で、また好ましくは緩衝物質としてクエン酸ナトリウムを約５．０ 乃至７．５のｐＨ１２乃至４０ｍＭの濃度で含有している。

なるべくなら調合物はｈ　Ｇ　Ｈもしくはその機能性類似体と緩衝物質としての シトラードを２乃至２０ｍＭたとえば５ｍＭ乃至１０ｍＭの濃度の水溶液にした もの、また好ましくはクエン酸ナトリウムを緩衝物質として約６゜０乃至７．０ のｐ　Ｈで含有する。

成長ホルモンもしくはその機能性類似体の調合物はアミノ酸、たとえばグリセリ ンとアラニンまたは（および）マンニトールあるいは他の糖アルコールまたは（ および）グリセロールまたは（および）他の炭水化物と、任意的な保存料たとえ ばベンジルアルコールとから構成することができる。その溶液はアイソトニック にする必要がある。成長ホルモンは好ましくは再結合ｈ　Ｇ　Ｈである。

本発明による調合物は少なくとも１２ケ月間安定している。ここで安定というこ とは８５％以−Ｌの単量体（■ＥＦ＞と、２％以下の５ＤＳ−ＰＡＧＥによる断 片の量を意味する。

本発明の調合物はさらに成長ホルモンと成長因子の混合物から構成することもで きる。成長因子はインシュリンの様な成長因子（ＩＧＦ−１またはＩＧＦ−２） と、表皮性成長因子（Ｅ　ＧＦ　）で、天然材料もしくは再結合技術による生成 物のいずれかを意味する。

本発明はさらに成長ホルモンもしくはその機能性類似体を緩衝物質としてのシト ラードに混合させることにより、あるいは最終配合物の成分を最終ゲル精製工程 で添加することにより調合物を調剤する方法に関する。また、成長ホルモンもし くはその機能性類似体を必要とする患者に調合物を投与して処置する方法に関す るものである。

成長ホルモン（ＧＨ）は天然に産出するヒトと動物のＧＩ−■と再結合Ｇ）−（ （ｒＧＨ）　、たとえばｒｈＧＨ，ｒｂＧＨとｒ　ｐ　Ｇ　）（の双方を言う。

機能性類似体は動物とヒトの成長ホルモンと同一の治療効果をもつ調合物を言う 。

緩衝剤に含まれる成長ホルモンは初期単離生成物もしくは凍結乾燥後、戻した製 品であっても差し支えない。

成長ホルモンの濃度は使用ずみ緩衝剤の安定性と、所定の投薬の所望治療量にの み左右される。なるべくならｋ］Ｇ　Ｈの濃度は１乃至８０ＩＵ／ｍｌで、さら に好ましくは２乃至４０１Ｕ／ｍｌである。

溶液を振動させることにより観測される沈澱の形態にある凝縮は、空気の液界面 における変成の結果である。

これは充填空隙を残さず充填することで発生が防止でき、従って凝集の条件を減 少させることができる。

発明を実施するための最良の形態 実施例１ 配合研究の材料は普通のゲノトロピン（商標）の方法から得られた。ヒトの成長 ホルモンはバクテリアである大腸菌（Ｅｃｏｌｉ）Ｋ１２において形質発現プラ スミドｐＡＰＳＴｌ　１　ｈＧＨ−３をテンプレートとして用いて合成する。前 記ホルモンは合成中に細胞から原形質膜間隙に分泌される。ヒト成長ホルモンは その後、引続いて、外側バクテリア膜の分裂の後に、前記Ｅｃｏ　ｌ　ｉ原形質 膜間隙から分離される。再結合ｈＧＨを含む抽出物ＤＥＡＥ−セファローズＦＦ で分別した。２つの硫酸アンモニウム沈澱工程がつづき、その後、ＤＥＡＥ−セ ファローズＦＦで２つの分別工程を行った。先の精製工程に用いられた塩の除去 の目的に役立つゲル濾過と、最終配合成分の添加により配合が行われた。最終分 離管セファデックスＧ−２５（直径１．３ｃｍ、ヘッド高さ４５ｃｍ）を配合緩 衝剤で平衡させた。平衡とクロマトグラフィーを＋７℃の温度で行った。所望の 蛋白濃度を配合緩衝剤で希釈することにより達成できた。７つの溶液の安定性を 調査した。表１参照のこと。

表１ 実施例　ＡＢＣＤ ｈＧＨＩＵ／ｍｌ　２０　２０　１０　１０クエン酸ナトリウムｍＭ　５　−　 − 燐酸ナトリウムｒｎＭ　５　１０　１０グリシンｍＭ　１２　１２　１２．　１ ２マンニド−／ＩｚｍＭ　２５０　２５０　２５０　２５０ｐ　ト１　６．２　 ６．３　６．２　７．４容積　１１１１ 出発値： ｐＨ６，２６，３６，２７，４ ＩＥＦ（％単量体）　９８　９８　９９　１００ＳＤＳ−ＤＡＧＥ 凝縮％　００−− 単量体％　９９．８　９９．６　− 断片％　０．２　０．４　−　− 可視検査　透明　透明　透明　透明 ５℃の温度で貯蔵６ケ月後の結果 ｐＨ６，３６，４６，４７，５ ＩＥＦ　（％単量体）　８８　８４　８８　７３ＳＤＳ−ＤＡＧＥ 凝縮％　ＯＯＯＯ，２ 単量体％　９９．７　９５．１　９７．５　９８．４断片％　０．３　４．９　 ２．５　１．３可視検査　透明 ５℃の温度で貯蔵１５ケ月後の結果 ｐＨ６，３６，４ ＩＥＦ（％単量体）　８６　７５ ＳＤＳ−ＤＡＧＥ 凝縮％　００．１ 単量体％　９８．９　９２．７ 断片％　１．０　７．３ 可視検査　透明　透明 ５℃の温度で貯蔵２４ケ月後の結果 ｐＨ６，４６，４ ＩＥＦ　（％単量体）　８８　７１ ＳＤＳ−ＤＡＧＥ 凝縮％　００ 単量体％　９８．３　８９．１ 断片％　１，７　１０．９ 可視検査　透明　透明 表２ 実施例　ＥＦＧＨ ｈＧＨＩＵ／ｍｌ　４　４　１０　１０ク工ン酸ナトリウムｒｒｔＭ　１０　〜 　−　５燐酸ナトリウムｍＭ　−１０１０− グリシンｍＭ　１２　１２　１２　１２マンニト一ルｍＭ　２５０　２５０　２ ５０　２５０ｐＨ６，２６，１６，３６，１ 容積　３　３　２０．３５ 出発値： ｐＩｉ　６．２　６．１　６．３　６．ＩＩＥＦ（％単量体）　９９　９９　９ ７　１００可視検査　透明　透明　透明　透明 ５℃の温度で貯蔵６ケ月後の結果 ｐＨ６，３６，２６，３６，６ ＩＥＦ（％単量体）　８９　８６　８５　９１ＳＤＳ−ＤＡＧＥ 凝縮％　０　０　０．１　０ 単量体％　９９．８　９７，１　９５，２　９８．１断片％　０．２　２．９　 ４．７　１．９可視検査　透明　透明　透明　透明 ５℃の温度で貯蔵１２ケ月後の結果 ｐｉ（６，３６，５ Ｉ　ＩＥ　Ｆ（％単量体）　７１　９０ＳＤＳ−ＤＡＧＥ 凝縮％　０．４　０ 単量体％　９３　９８．１ 断片％　６．６　１．８ 可視検査　透明 方法 濃度Ｊ１測定による等電集束法（ＩＥＦ）Ｉ　Ｅ　Ｆは脱アミド化の程度が測定 できる方法である。

２つの電極の間で設定され且つキャリヤーの両性電解質により安定するｌ）　Ｈ 勾配でｈ　Ｇ　Ｈ成分の分離を行う。蛋白は、蛋白が勾配のその等電点でそれ自 体整合するまで移行し、その等電点においては蛋白に正味総合電荷を帯びず、従 って移行が終るに従って凝縮する。従って、分離は電荷により達成される。帯電 ｈＧＨの形の相対的分布をクーマツシーブルー染色ポリペプチドの濃度計走査に より計算する６単量体の割合が高ければ高いほど脱アミド化は少なくなる。

ポリペプチド大きさの分布（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）ソマトトロピンｈＧＨの調剤に おいて蛋白をドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）により変成させて５ＤＳ−蛋白 の陰電荷分子鎖体を産出する。その後、分子の大きさによる分離をＳＤＳの共存 においてポリアクリルアミドゲル（ＰＡＧＥ）中における電気泳動により達成し た。

ｈ　Ｇ　Ｈの相対的ポリペプチドの大きさによる分布を銀染ポリペプチドバンド の濃度計走査により計量した。

可視検査 溶液の外観をｐｈ、Ｅｕｒ第２版により目視検査を行った。

ｐＨ ｐＨをガラスとカロメルの電極を用いて測定した。

実施例Ａ、ＥとＨは本発明によるものである。

表１と２から、断片の百分率は燐酸ナトリウムで緩衝された溶液中ではクエン酸 ナトリウムによるよりもずっと高いことが明らかである。Ｂ（燐酸ナトリウム） には５℃の温度で１５ケ月で７．３％の断片と９２．７％の単量体が含まれ、Ａ （クエン酸ナトリウム）にはそれぞれ１．０％と９８．９％が含まれている。

Ｆ（燐酸ナトリウム）の断片の相対量は２．９％、単量体の百分率が５℃の温度 で６ケ刀後で９７．１％である。Ｅ（クエン酸すｌ・リウム）にはそれぞれ０． 　２％と９９．８％である。Ｂ、Ｃ，Ｄ、ＦとＧには燐酸ナトリウムが含まれ、 すべてに高い比率の断片が貯蔵後にも含まれている。Ｄは高いｐ　Ｈを有するが 、断片の量は１０ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝剤を用いる溶液Ｅのものよりも 高い。脱アミド化のグレードはＤにおいて許容できないほど高い。

実施例２ この実施例はベンジルアルコールを含む本発明による組成物とそれを含まないも のを比較するため行った。表３参照のこと。

調合物を実施例１で説明したものと同一の方法で調剤したが、調合緩衝液にはベ ンジルアルコールがふくまれていた。

表３ 実施例　ＩＫＬＡ ｈＧＨＩＵ／ｍｌ　２０　２０　２０　２０ク工ン酸ナトリウムｍＭ　１０　１ ０　５　５グリシンｍＭ　１２　−　１２　１２ マンニト一ルｍＭ　１５０　１５０　１３０　２５０ベンジルアルコール％　１ 　１　１− ｐＨ６，３６，３６，３６，２ 容積　１　１　３．５　１ ３０℃の温度で貯蔵３週間後の結果 ｐＨ６，３６，３６，２６，２ ＩＥＦ　（％単量体）　６７　６８　６４　７２透明度　透明　透明　透明　透 明 ５℃の温度で貯蔵１ケ月後の結果 ｐＨ６，３６，３６，２６，２ ＩＥＦ　（％単量体）　９９　９９　−　９７透明度　透明　透明　透明　透明 ５℃の温度で貯蔵３ケ月後の結果 ｐＨ６，３６，４６，２６，３ ＩＥＦ　（％単量体）　９４　９４　９６　９４透明度　透明　透明　透明　透 明 ５ＤＳ−ＤＡＧＥ 凝縮％　ｏ　ｏ、ｉ 単量体％　９９．８　９９．４ 断片％　０．２　０．５ 実施例２はベンジルアルコールの添加がクエン酸ナトリウムを緩衝剤として用い た場合、安定性にどのような影響を及ぼすかを示すために行った。ベンジルアル コールは注射できる多投薬調剤としての使用に条件づきの保存料である。薬局方 によれば、適当な保存料を注射できる多投薬調剤に添加して製品の微生物上の安 全性の保証をめられている。

ベンジルアルコールは　強性に影響を有するので、ベンジルアルコールが添加さ れた際に、マンニトールの量が調節された。

表３からベンジルアルコールの添加がクエン酸を緩衝剤として用いる時、安定性 に影響を及ぼさないことが明らかである。

実施例３ この実施例は、グリシンおよびマンニトールを含む本発明の組成物と、それを含 まないものを比較するために行った。表４参照のこと。

調合物を実施例１で説明したものと同一の方法で調合した。

表４ 実施例　ＭＮ ｈＧＨＩＵ／ｍｌ　２０　２０ ク工ン酸ナトリウムｍＭ　５　５ グリシンｍＭ　−１２ マンニト一ルｍＭ　−１５０ ｐＨ６，３６，３ 容積　１１ ３０°Ｃの温度で貯蔵１週間後の結果 ｐＪ−（６，３６，３ ＩＥＦ（％単量体）　９２　９１ ＳＤＳ−ＤＡＧＥ 凝縮％　ＯＯ 単量体％　９９．５　９９．６ 断片％　０．５　０．４ 可視検査　透明　透明 表４から、添加剤たとえばグリシンとマンニトールの添加がクエン酸を緩衝剤と して用いる時、安定性に影響を及ぼさないことがわかる。

フロントページの続き （７２）発明者　ホクピー　エルビー スウェーデン国、ニス−１２２４６エンスケド、シックリンスバーゲン　６ （７２）発明者　トム　シルツカ スウェーデン国、ニス−１４３００パルビー、エル　ジー　３６０　マイルスタ グバーゲン　３５９

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）緩衝物質として２乃至５０ｍＭの量のクエン酸から成るヒトの成長ホルモン 又はその機能性類似体の注射可能な調合物。 ２）調合物が成長ホルモンもしくはそれの機能性類似体の水溶液であることを特 徴とする請求の範囲第１項に記載の調合物。 ３）調合物がｈＧＨの水溶液であることを特徴とする請求の範囲第２項に記載の 調合物。 ４）調合物がｈＧＨと濃度２乃至２０ｍＭの緩衝物質としてのシトラートの水溶 液であることを特徴とする請求の範囲第３項に記載の調合物。 ５）緩衝物質として、ｐＨが約６乃至７のクエン酸ナトリウムから成ることを特 徴とする請求の範囲第２項乃至第４項のいずれか１項に記載のｈＧＨの水溶液。 ６）調合物が５ｍＭの量のクエン酸ナトリウムから成ることを特徴とする請求の 範囲第５項に記載のｈＧＨの水溶液。 ７）調合物が１０ｍＭの量のクエン酸ナトリウムから成ることを特徴とする請求 の範囲第５項に記載のｈＧＨの水溶液。 ８）調合物が１つ以上の数個の成長因子から成ることを特徴とする請求の範囲第 １項もしくは第２項に記載の成長ホルモンまたはその機能性類似体の調合物。 ９）調合物がグリシンと、マンニトールと、グリセロールまたはそのいずれかか ら成ることを特徴とする請求の範囲第１項、第２項又は第８項のいずれか１項に 記載の成長ホルモンまたはその機能性類似体の調合物。 １０）調合物が保存料から成ることを特徴とする請求の範囲第１項乃至第９項の いずれか１項に記載の成長ホルモンあるいはその機能性類似体の調合物。 １１）ホルモンがｈＧＨの水溶液であり、また保存料がベンジルアルコールであ ることを特徴とする請求の範囲第１０項に記載の成長ホルモン。 １２）ｈＧＨが再結合ｈＧＨであることを特徴とする請求の範囲第３項に記載の 成長ホルモンの調合物。 １３）成長ホルモンもしくはその機能性類似体を緩衝物質としてのシトラートと 混合するか、あるいは最終配合の成分を最終ゲル精製工程で添加することを特徴 とする請求の範囲第１項乃至第１２項のいずれか１項に記載の調合物の調合方法 。 １４）成長ホルモンもしくはその機能性類似体を必要とする患者を請求の範囲第 １項乃至第１２項のいずれか１項による配合を投与して治療する方法。