JPH06506835A - セホニシドの酵素的製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 セホニシドの酵素的製法 発明の背景 本発明は式（Ａ）； １式中、Ｒは抗菌活性を有する化合物を付与する基、Ｘは水素または医薬上許容 されるカチオン、およびＹは医薬上許容されるカチオンを意味する］で示される 抗生物質の製法に関する。

式Ａの下位群の化合物（ある化合物は「モノシト（Ｍｏｎｏｃｉｄ）　Ｊの名称 で市販されている）が、２つの米国特許第４．０４８．３１１号および第４．５ ７６．９３７号に開示されている。特に、スルホメチル基のモノナトリウム塩が 記載されており、該化合物が米国特許第４．５７６．９３７号において特許請求 されて（する。

これら化合物の抗菌活性は米国特許第４，０４８，３１１号に記載されている（ 第６１の１９行〜第９１！の４９行、表１および表２のデータ参照）。

米国特許第４．５７６．９３７号は、確かに、式Ａの化合物、特にナトリウム塩 のような塩の化学的合成法を開示している。その方法は、式（Ｂ）：の化合物を 、なかでもＯ−ホルミルマンデル酸と反応させ、式（Ｃ）：のホルミル中間体を 得ることからなる。アルカリで一〇〇ＨＯ基を加水分解し、式（Ｄ）： の対応するアルコールで、ＸおよびＹがナトリウムであるセホニシド・ナトリウ ム（ｃｅｆｏｎｉｃｉｄ　ｓｏｄｉｕｍ）と称される化合物を、８０〜８５％の 収率で得る。生成収率の低下は、おそらく、ホルミル中間体（Ｃ）とアルカリに よるセホニシド・ナトリウムの分解によるものである。中性または温和な酸性条 件下での加水分解は（Ｃ）および得られるセホニシド塩の安定性を増加させるが 、加水分解速度を有意に減少させる。別のさらに効果的な方法が必要であった。

リパーゼ、エステラーゼおよびアミダーゼのような加水分解酵素が、エステルお よびアミド結合の立体特異的および部位特異的加水分解に用いられる。リパーゼ の生物学的機能は、トリアジルグリセロールの対応する脂肪酸前駆体およびグリ セロールへの加水分解に対して触媒作用を及ぼすことである。リパーゼが、（Ｃ ）中にあるようなセファロスポリン核の一部であるエステル結合を加水分解する ことは知られていない。エステラーゼが、可溶性カルボン酸エステルをその対応 する酸およびアルコール前駆体に加水分解する。エシェリキア・コリ−（Ｓａｃ ｃｈａｒｏｒｎｙｃｅｓ　ｓｐ、　）由来のエステラーゼが、カルボキシル基が 、式（Ｅ）：（式中、Ｒ′はアルキル、アリールまたはアリールアルキル基を意 味する）のペニシリンに結合している、エステル結合を加水分解する（米国特許 第４．３４６．１６８号）。

しかし、（Ｃ）は構造的に（Ｅ）と異なる。リパーゼおよびエステラーゼに関す る最新の認識において、これらのうちいずれかの酵素が式（Ｃ）で示されている ような本発明のセファロスポリンのホルミル中間体を加水分解しつるであろうこ とを予測してはいない。

本発明に至る研究の対象は、加水分解酵素依存の酵素的方法が、約３，５〜８゜ ０のｐＨ範囲において定量的収量にて、ホルミル中間体（Ｃ）または別のそのよ うなセファロスポリンエステルをセホニシド・ナトリウムに変形するであろうが どうかを見いだすことにある。

発明の要約 本発明は、式■ ［式中、Ｘは水素または医薬上許容されるカチオン、）“は医薬上許容されるカ チオンであり、「アンル」はエステル形成基を意味するコで示される化合物を、 酵素が該アノル基を加水分解してアルコールを形成しうる条件を用い、約３５〜 ８０のｐＨ範囲にて活性なエステラーゼまたはリパーゼで処理することからなる 、式１： ［式中、Ｒは抗菌活性を有する化合物を付与する基、Ｘは水素または医薬上許容 されるカチオン、およびＹは医薬上許容されるカチオンを意味するコで示される 化合物の製法に関する。

発明の記載 本発明の方法を、７−Ｄ−マンデルアミド−３−（α−スルホメチルテトラゾー ル−５−イルチオメチル）〜３−セフェムー４−カルボン酸化合物により説明す るが、該方法は式（ｎ）の−〇アシル基を有する他のいずれのセファロスポリン に適用することもできる。「アンル」なる語は、本明細書中、いずれのアシル基 をも示すのに用いられる。その範囲は、その指定のヒドロキシル基を製造できる すべてのエステルを包含するものであり、特に前記の発明の背景に記載した方法 により式Ｉの化合物を製造する方法も照らして考えられるものである。問題の特 定のエステルは、ホルミルエステルだけでなく、酢酸、プロピオン酸、ブタン酸 、ペンタン酸あるいはヘキサン酸エステルのような炭素数２〜６の他のエステル またはその異性体形も包含する。

Ｒ基は、所望により置換されていてもよい、フェニル環により詳］バ説明されて いる。Ｒ置換基のうち別の基は４．５．６または７員の複素環である。複素環は 、１またはそれ以上の（好ましくは１．２または３個の）窒素、酸素または硫黄 原子を含有する、置換および非置換の芳香族および非芳香族基をいう。典型的な 置換基は、オキソ（＝Ｏ）、ハロゲン、ヒドロキシ、ニトロ、アミノ、／アノ、 トリフルオロメチル、炭素数１〜４のアルキル、炭素数１〜４のアルコキ／、ア ルキルスルホニル、フェニル、置換フェニル、２−フルフリリデンアミノ、ベン ジリデンアミノおよび置換アルキル基（ここで、アルキル基は１〜４個の炭素を 有する）である。

好ましい豆類型の４．５．６または７員の複素環基はへテロアリール基である。

「ヘテロアリール」なる語は、芳香族である４、５．６または７員の複素環の基 をいう。典型的なヘテロアリール基は、置換および非置換のピリジニル、フラニ ル、ピロリル、チェニル、１．２．３−トリアゾリル、１．２．４−１−リアゾ リル、イミダゾリル、チアゾリル、チアジアゾリル、ピリミジニル、オキサシリ ル、トリアジニル、およびテトラゾリルである。典型的な非芳香族複素環（すな わち、完全または部分飽和の複素環基）は、置換および非置換のアゼチジニル、 オキセタニル、チェタニル、ピペリジニル、ピペラジニル、イミダゾリジニル、 オキサゾリジニル、ピロリジニル、テトラヒドロピリミジニル、ジヒドロチアゾ リルおよびヘキサヒドロアゼピニルである。置換４．５．６または７員の複素環 の典型例は、１−アルキル−３−アゼチジニル、２−オキソ−１−イミダゾリジ ニル、３−アルキルスルホニル−２−オキソ−１−イミダゾリジニル、３−ベン ジリデンアミノ−２−オキソ−１−イミダゾリジニル、３−アルキル−２−オキ ソ−１−イミダゾリジニル、３−フェニル（または置換フェニル）−２−オキソ −１−イミダゾリジニル、３−ベンジル−２−オキソ−１−イミダゾリジニル、 ３−（２−アミノエチル）−２−オキソ−１−イミダゾリジニル、３−アミノ− ２−オキソ−１−イミダゾリジニル、３−［（アルコキシカルボニル）アミノコ −２−オキソ−１−イミダゾリジニル、３−［２−［（アルコキシカルボニル） アミノ］エチル］−２−オキソ−１−イミダゾリジニル、２−オキソ−１−ピロ リジニル、２−オキソ−３−オキサゾリジニル、４−ヒドロキシ−６−メチル− ２−ピリミジニル、２−オキソ−１−ヘキサヒドロアゼピニル、２−オキソ−３ −ピロリジニル、２−オギソー３−テトラヒドロフラニル、２，３−ジオキソ− １−ピペラジニル、２．５〜ンオキソー１−ピペラジニル、４−アルキル−２， ３−ジオキソ−１−ピペラジニルまたは４−フェニル−２，３−ジオキソ−１− ピペラジニルである。

これらの化合物の製法は、特許文献および一般的科学文献にて見受けられる。

セファロスポリン文献は、多くのセファロスポリンの製法、それらの参考文献中 に記載の方法から直接的に操作することで、それらの方法と式（Ｃ）から（Ｂ） を製造するのに示されている米国特許第４，０４８，３１１号および第４．５７ ６゜９３７号に開示されている合成方法を組み合わせることにより、これらの方 法を組み合わせることにより、または当該分野において公知の方法により式Ｈの 化合物を製造するのに利用することができる方法を開示している。

この加水分解法は、式■で示されるようなエステルを有する化合物が安定であり 、約３．５〜８．０の範囲のｐＨにおいて酵素により作用されうる限り、すべて の型の化合物で作動するであろうと考えられる。これらの化合物は、米国特許第 ４、５７６．９３７号およびその前の第４．０４８．３１１号に参照されている 、または記載されている化合物などの医薬上許容される塩（類）を包含する。

加水分解酵素は、酸素または窒素に水素を、そして炭素に一〇Ｈ基を付加するこ とによって１モルの水を消費する方法にてＣ−ＯおよびＣ−Ｎ結合の加水分解に 作用する。国際酵素委員会（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｅｎｚｙａ＋ｅ　Ｃ ｏｍｍ１ｓｓｉｏｎ）は、酵素の、エステル、グリコシド結合、ペプチド結合、 他のＣ−Ｎ結合および酸無水物を加水分解する能力によって加水分解酵素を６つ のグループに分類した。エステラーゼおよびリパーゼが本発明において最も有用 であると考えられる。

ベンジルエステルまたはマンデル酸エステルを加水分解することができ、特定の ｐＨ範囲で少な（とも１０％の活性を保持するエステラーゼおよびリパーゼが本 発明において作用するであろうと思われる。選択された酵素はその特定のｐＨ範 囲で少なくとも５０％またはそれ以上の活性を保持していることが最も好ましい 。エステラーゼおよびリパーゼの評論は、「リパーゼの現在および将来的使用（ Ｐｒｅｓｅｎｔ　ａｎｄ　Ｆｕｔｕｒｅ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　１ ．１ｐａｓｅｓ）　Ｊ−一エイ・アール・マクラエおよびアール・シイ・ハモン ド（＾、　Ｒ，ＭａｃｒａｅおよびＲ，Ｃ，Ｉ（ａｍｉｏｎｄ）　、バイオテク ノロジー・アンド・バイオエンジニアリング・レビュー３　（Ｂｉｏｔｅｃｈ、 Ｂｉｏｅｎｇ、Ｒｅｖ。

ｐｒｅｓｓ）　、　ニューヨーク、５７５−６１６頁（１９７２）およびケイ・ キルシュ（Ｌ　Ｋｉｒｓｃｈ）　、ジーｚンザイム（Ｔｈｅ　Ｅｎｚｙｍｅｓ） （Ｐ、　Ｄ、　Ｂｏｙｅｒ編）、アカデミツク・プレス、ニューヨーク、４３− ６９頁（１９７１）で見ることができる。

本明細書にて用いられる製法条件は、その条件下で酵素が作用するものである。

このことは、ｐＨは別として、溶媒、温度、塩、補助要因、補酵素などが、触媒 作用が有用な形で進行することを保証するような方法にて用られることを意味す る。特定の酵素は、その条件下で最も活性であるという特定の条件を有する。非 常に多（のエステラーゼおよびリパーゼが同定されかつ特徴付けられているため 、そのような条件をこの書面において列挙しない。個々の酵素に対する有用かつ 最適の条件は、多くの概論および科学文献から得ることができる。例えば、メソ ッズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙ■ｏｌｏｇｙ ）のような出版物は、多くのエステラーゼおよびリパーゼを使用するための方向 および条件を提供する。

他の本で、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｕｎｉｏｎ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉ ｓｔｒｙにより出版されている本は、多くの酵素に対する引例を示しており、そ の中で酵素の使用のための条件を見いだすことができる。このようなテキストは 、本発明において有用であると考えられるエステラーゼおよびリパーゼの情報源 を提供する。

本発明の方法を実施する場合、水溶液が最も有用な媒体であると思われる。反応 は酵素が作用する温度で行う。その温度は所定の酵素の個々の特性に依存するが 、一般に外界温度と８０〜９０℃の間であると考えられる。好ましい温度範囲は 外界温度と３７℃の間にある。溶液ｐＨは、選択される酵素の作動範囲に依存し 、その作動範囲のｐＨ範囲によって制御される。補助要因、補酵素、塩はすべて 個々の酵素の特性に依存する。

反応中にて消費されない酵素は、基質、すなわち１ステルに比較して少量で用い られればよい。一連の所定の条件下、適正な時間中に基本的に基質をすべて加水 分解するに十分な量の他に特定量の酵素が要件とされることはない。酵素の適量 は、慣用の実験操作に従う周知手段により決定することができる。酵素は基質含 有の溶液中に懸濁させてもまたは溶解させてもよい。別の手段は溶媒中にある支 持体に酵素を付着させることである。酵素を固体支持体に付着させた場合、反応 は基質が該固体支持体を通過させることにより連続的工程にて行うことができ、 またはバッチ工程を用いてもよく、その場合、支持体／酵素を溶解した基質を含 む容器中にて簡単に混合することからなる。気体または固体相使用の酵素的方法 が知られているが、このような方法が本発明を実施するための好ましい手段であ るとは思われない。

加水分解を終えた後に、当該分野における公知手段により生成物が回収できる。

好ましい条件を以下の実施例において示す。生成されたアルコールを単離し、精 製する他の手段が米国特許第４，０４８，３１１号および第４．５７６．９３７ 号中に見いだすことができる。

ホルミル中間体を加水分解する能力を有する酵素を同定するために、ｐＨ７のリ ン酸緩衝液中、酵素をＨと一緒に個々にインキュベートした。４種の酵素調製物 （オレンジピール由来のアセチル・エステラーゼ、小麦麦芽およびアスペルギル ス・ニガー（＾ｓｐｅｒｇｆｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ）由来のリパーゼ、およびス ブチリシン（Ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ）　（Ａ）　）がセホニシド・ナトリウムの 製造に適していることが判明した。同一または類似する方法で用いた場合、他の エステラーゼおよびリパーゼ調製物も同一または類似の結果を付与するであろう と思われる。

反応は、酵素を、好ましくは５〜８のｐＨ範囲にあるホルミル中間体の溶液と混 合することで成し遂げられた。反応媒体のｐＨは、アルカリを定期的に添加して 一定に維持した。ホルミル中間体を純粋または不純形として得ることができた。

ホルミル中間体の適当な濃度は１〜１０％であり、適当な酵素濃度は０．２５〜 １重量％である。反応時間およびセホニンド・ナトリウムの全収量は、ホルミル 中間体の濃度、酵素濃度、温度およびｐＨのような因子に依存する。これらの条 件を調整することにより、セホニンド・ナトリウムの定量的生成が中性ｐＨでな ナノピュアー（ｎａｎｏｐｕｒｅ）水２０ｍＪ中、セファロスポラン酸誘導体Ｉ Ｉ４．３ｇの懸濁液を水浴中にて冷却した。ナノピュアー水７．５ｍｌ中の炭酸 水素ナトリウム（１，８７ｇ）を、該セファロスポラン酸（ＩＩ）懸濁液に、撹 拌かつ冷却しながら（１０分間の間に）滴下した。ついで、０−ホルミルマンブ ロイルクロリド（２，２６ｍ１）を撹拌しながら滴下した。反応混合物をさらに ４５〜６０分間撹拌した。ついで濃塩酸で該反応混合物をｐＨ２，５に酸性化し た。該酸性化混合物を、まず２０ｍ１で、次に１０ｍ１のＨＰＬＣ−グレードの 酢酸エチルで抽出した。

酵素反応 酸性化した酢酸エチル抽出の水相を水浴中にて冷却し、激しく撹拌しながら２０ ％水酸化ナトリウム溶液を注意して加えてそのｐＨを上げた。ｐＨが６〜６．５ に近づいたならば、モノ−、ジーまたはトリーリン酸ナトリウム（無水物）８５ ｍｇを加え、０．５Ｍ炭酸ナトリウム溶液を用いてそのｐＨを７．５に上昇させ た。

反応混合物を水浴から取り出し、２０℃まで加温させた。アスペルギルス・ニガ ー（醸匹り月上臣ユ組虹）のリパーゼ（２００ｍｇ）を反応混合物１ｍｌに懸濁 させて加えた。０．５Ｍ炭酸ナトリウム溶液を加えて、そのｐＨを７．３５と７ ．５の間に維持した。試料を種々の間隔で採取し、ＨＰＬＣにより分析した。

ＨＰＬＣ分析において、反応生成物は米国特許第４．５７６．９３７号における 記載に従って製造したセホニシド・ナトリウムの標品と同じ保持時間を有した。

セホニシド・ナトリウムの収率はＨＰＬＣ分析による測定によれば定量的であっ た。

実施例２ １６％（ｗ／ｖ）Ｏ−ホルミルセホニシド２０ｍ１を０．５Ｍ炭酸ナトリウムで ｐＨ７，０に調整した。これに、サブチリシンＡ　（Ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ　Ａ ）　（ノボ、ノルディスク（Ｎｏｖｏ、　Ｎｏｒｄｉｓｋ）　５０　ｍ　ｇを加 え、２０℃で５０分間にわたって実施する脱遮断反応の間、０．５Ｍ炭酸ナトリ ウムを用いてｐＨを７．０に維持し、９２．９％収率でセホニンドを得た。

前記の説明および実施例は本発明の実施の仕方を示すものである。しかし、この 情報は本発明を実施の仕方を説明するにすぎず、本発明を制限するものではない 。本発明者が保留している事は、請求の範囲に示されている。

国際調査報告 フロントページの続き （７２）発明者　レンガナトハン、ベダントハデシカンアメリカ合衆国オレゴン 州９７２２９、ポートランド、ノースウェスト・ワンハンドレッド　セブンティ フィフス・ブレイス４０７３番

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. １．式（ＩＩ）： ▲数式、化学式、表等があります▼（ＩＩ）［式中、Ｘは水素または医薬上許容 されるカチオン、Ｙは医薬上許容されるカチオンであり、アシルはエステル形成 基を意味する］で示される化合物を、酵素が機能的である条件を用い、約３．５ 〜８．０のｐＨ範囲にて活性なエステラーゼまたはリパーゼで処理し、アシル基 を加水分解してアルコールを形成させることからなる、式（Ｉ）：▲数式、化学 式、表等があります▼（Ｉ）［式中、Ｒは抗菌活性を有する化合物を付与する基 、Ｘは水素または医薬上許容されるカチオン、およびＹは医薬上許容されるカチ オンを意味する］で示される化合物の製法。
2. ２．エステラーゼがオレンジピール由来のアセチル・エステラーゼである請求項 １記載の方法。
3. ３．リパーゼが小麦麦芽に由来する請求項１記載の方法。
4. ４．リパーゼがアスペルギルス・ニガーに由来する請求項１記載の方法。
5. ５．サブチリシンＡを用いる請求項１記載の方法。
6. ６．式ＩＩ中で、Ｒがフェニルである、式ＩＩＩ：▲数式、化学式、表等があり ます▼（ＩＩＩ）［式中、ＸおよびＹは請求項１の記載と同じ］で示される化合 物を用いる請求項１記載の方法。
7. ７．エステラーゼがオレンジピール由来のアセチル・エステラーゼであり、式Ｉ ＩＩが二ナトリウム塩である請求項６記載の方法。
8. ８．リパーゼが小麦麦芽に由来し、式ＩＩＩが二ナトリウム塩形である請求項６ 記載の方法。
9. ９．リパーゼがアスペルギルス・ニガーに由来し、式ＩＩＩが二ナトリウム塩形 である請求項６記載の方法。
10. １０．サブチリシンＡを用い、式ＩＩＩが二ナトリウム塩形である請求項６記載 の方法。