JPH06506444A - 新規インスリン類似体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 新規インスリン類似体 犬肌□□□分野 本発明は、イオン電気導入による経皮投与用の新規インスリン類似体、前記新規 インスリン類似体を含有する組成物、およびイオン電気導入による経皮投与によ る糖尿病の治療への前記インスリン類似体の利用に関する。

又肌卑背景 全身作用を獲得するための薬剤の経皮投与は近年ますます認められてきており、 この投与方法は低分子量薬剤の供給にますます多く使われている。皮膚障壁を通 過する薬剤の受動拡散輸送による従来の経皮投与は、分子サイズが比較的小さく 性質が親油性（疎水性）である薬剤の投与にのみ有用である。この投与形態が適 用されている船酔い予防バッチとニトログリセリンパッチは、両者とも親油性（ 疎水性）の低分子量薬剤である。

しかしながら、受動経皮投与は、皮膚透過性が低い薬剤にはあまり適さず、利用 できないことさえある。不運にも、そのような薬剤には薬理学的に活性な親水性 ペプチドまたはタンパク質が含まれる。

経皮投与の受動的形態に関する制限を除去するために、当業者はイオン化された 親水性薬剤の全身投与のためのイオン電気導入を検討した。イオン電気導入は電 流の作用下での生体膜を通した溶質の輸送であると説明することができる。

イオン電気導入による経皮輸送は、最初は皮膚内の水性細孔、例えば汗腺管を通 して起こると思われる。ヒトの皮膚中の細孔の正味極性は中性ｐ　Ｈであるため 、電流の適用によってそこを通る正電荷の分子の輸送を促進することができる。

今まで、イオン電気導入によりインスリンを投与するために当業者が行ってきた 努力は大きな成果がなかった。５ｔｅｐｈｅｎ、　Ｒ，Ｌ、ら、”Ｐｏｔｅｎｔ ｉａｌ　ｎｏｖｅｌ　ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　１ｎｓｕｌｉｎ　ａｄｍｉｎｉ ｓｔｒａｔｉｏｎ　：　Ｉ。

１ｏｎｔｏｐｈｏｒｅｓｉｓ”、　Ｂｉｏｍｅｄ、　Ｂｉｏｅｈｉｍ、　Ａｅｔ ａ　４３　（１９８４）　５５３−５５８を参照のこと。５ｔｅｐｈｅｎらは、 薬理学的に適当な量で比較的大きいサイズの四量体形のインスリン分子（溶液中 ）を無理に皮膚障壁を通過させることに彼らの失敗の原因があるとした。５ｔｅ ｐｈｅｎらは、より強くイオン化された優勢的に単量体形のインスリンがイオン 電気導入により好結果に経皮投与されるかもしれないと仮定した。

５ｔｅｐｈｅｎらの研究に続いて、他の研究者らはイオン電気導入による好結果 のヒトインスリンの経皮輸送を達成したことを報告している。１Ｊｅｙｅｒ　ら 、ゴｒａｎｓｄｅｒｍａｌ　Ｄｅｌｉｖｅｒｙ　ｏｆ　）ｌｕｒｏａｎ　Ｉｎ５ ｕｌｉｎ　ｔ。

Ａｌｂｉｎｏ　Ｒａｂｉｔｓ　ｌＪｓｉｎｇ　Ｂｌｅｃｔｒｉｃａｌ　Ｃｕｒｒ ｅｎｔ″’、Ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ　Ｍｅｄｉｃａｌ 　５ｃｉｅｎｃｅｓ、　２９７　（１９８９）　３２１−３２５および０ｖａｉ ｓ　５ｉｄｄｉｑｕｉら、　”Ｆａｃｉｌｉｔａｔｅｄ　Ｔｒａｎｓｄｅｒｍａ ｌ　ｏｆ　Ｉｎ５ｕｌｉｎ″、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｐｈａｒｍａ−ｃｅｕｔ ｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅｓ、７６　（１９８７）　３４１−３４５を参照のこ と。

糖尿病の治療には、現在、治療上有効な血中インスリンレベルを維持するために 、予め決められた量のインスリンの非経口投与が必要とされる。典型的に投与さ れる数日間のインスリン（皮下）注射の不便さのため、皮下注射による以外のイ ンスリンの投与経路を見つけることに多大な努力が長年費やされてきた。経皮イ オン電気導入投与は、優れたインスリン投与経路である可能性を提供する。しか しながら、今までに医薬組成物中で常用されている投与される通常のインスリン 化合物の分子、例えばブタインスリンまたはヒトインスリンは、そのような組成 物の溶液中では会合した形態、即ち二量体または四量体として存在し、四量体が 優勢的な会合種である。

インスリン四量体はわずかに偏平な球体の形状を有する。インスリン四量体の直 径はおよそ５０人であり、この直径は治療上必要とされるインスリンの血中レベ ルを生じるのに十分な量での経皮輸送（皮膚の細孔を通した）には大きすぎると 思われる。

本発明の目的は、イオン電気導入により治療上有効な量で皮膚障壁を通過して供 給することができる、より一層小さい直径を有する新規ヒトインスリン類似体を 提供することである。

光肌■！杵 簡単に言えば、本発明は中性ｐＨで負の電荷を有し且つ減少された会合傾向を有 するインスリン類似体を経皮投与する方法に関する。

該方法は、ヒトインスリン類似体の水性媒質をヒト皮膚と接触した状態に起き、 次いで前記インスリン類似体媒質に直流電流を適用しそしてそれを通して前記媒 質と接触している皮膚に直流電流を適用することを含んで成る。次いで薬理学的 に有効な量のインスリン類似体がイオン電気導入により皮膚障壁を通過する。本 発明の実施に使われるヒトインスリン類似体は、中性ｐＨにおいてヒトインスリ ンにより示されるものより少なくとも・１単位大きい負電荷を示すことにより特 徴付けられる。

本明細書中で用いる［インスリン類似体」とは、Ｃｙｓ（Ａ７）とＣｙｓ（Ｂ７ ）の間およびＣｙｓ（Ａ２０）とＣｙｓ（Ｂ１９）の間にジスルフィド架橋を含 みそしてＣｙｓ（Ａ６）とＣｙｓ（Ａｌｌ）の間に鎖内ジスルフィド架橋を含む ヒトインスリンの分子構造に類似した分子構造を有する化合物を意味する。

望ましくは、インスリン類似体媒質は、皮膚からの電気回路において陰極になり 、そしてインスリン類似体媒質のｐＨはｐＨ４〜８の範囲内である。

本発明はまた、イオン電気導入による投与に向けて改善された性質を有すること により特徴付けられる新規ヒトインスリン類似体にも関する。それらの類似体は 減少された会合傾向を有し、中性ｐＨ（こおいて増加された正味負電荷を有する けれども、この形の類似体＋１、試験管内イオン電気導入実験においてヒトイン スリンに比べて実質的に増加された皮膚透過輸送を有することが示された。負の 正味電荷は、ヒトインスリン中の少なくとも２個のアミノ酸残基をＧｌｕまたは Ａｓｐ残基により置換することにより提供される。

本発明のインスリン類似体は次の式Ｉを有することにより特徴付けることができ る： Ｂ鎖（続き） 上式中、Ｘまたは２と指示された位置の少なくとも１個のアミノ酸残基、更にＹ またはＷと指示された位置の少なくとも１個のアミノ酸残基は、独立的に、Ａｓ ｐまたはＧｌｕにより置換され、残りのＸ。

Ｙ、ＺまたはＷはヒトインスリン中の関連する位置に存在するアミノ酸残基を示 し、Ｂ鎖の末端は、場合により、ＡｓｐとＧｌｕの中から独立的に選択すること ができる１個または２個のアミノ酸残基により延長される。

上記インスリン類似体の１グループは、式■においてＸと指示された位置のｌ個 のアミノ酸残基と更にＹ、ＺまたはＷと指示された位置の少なくとも１個のアミ ノ酸残基が独立的にＡｓｐまたはＧｌｕにより置換され、残りのｘ、　ｙ、ｚま たはＷがヒトインスリン中の関連する位置に存在するアミノ酸残基を示し、Ｂ鎖 の末端が場合によりＡｓｐとＧｌｕの中から独立的に選択することができる１個 または２個のアミノ酸残基により延長されているものである。

別の好ましいグループは、式■においてＸまたはＺと指示された位置の２個のア ミノ酸残基と更にＹまたはＷと指示された位置の少なくとも１個のアミノ酸残基 が独立的にＡｓｐまたはＧｌｕにより置換され、残りのｘ、ｙ、ｚまたはＷがヒ トインスリン中の関連する位置に存在するアミノ酸残基を示し、Ｂ鎖の末端が場 合によりＡｓｐとＧｌｕの中から独立的に選択することができる１個または２個 のアミノ酸残基により延長されているものである。

上記インスリン類似体において、Ｗと指示された位置の１．　２または３個のア ミノ酸残基を独立的にＡｓｐまたはＧｌｕで置換することができる。また、Ｙと 指示された位置の１，２または３個のアミノ酸残基を独立的にＡｓｐまたはＧｌ ｕにより置換することができる。

式Ｉ中１つのＷも置換されていないか、またはＢ鎖の末端が延長されていない場 合、総置換数は好ましくは少なくとも５である。置換に好ましいＸの位置は８９ ．８１６．８２６および８２８である。

本発明に係るインスリン類似体の例は下記のものである：Ｇｌｕ（Ｂ９）、　Ｇ ｌｕ（Ａ１２）ヒトインスリン、Ａｓｐ（８９）、　Ｇｌｕ（Ａ１２）ヒトイン スリン、ＧＩＬＩ（８９）、　ＡＳＧＩ（Ａ１２）ヒトインスリン、Ｇｌｕ（８ ９）、　Ｇｌｕ（Ａ１４）ヒトインスリン、Ｇｌｕ（８９）、　Ｇｌｕ（Ｂ２２ ）、　Ｇｌｕ（８２６）　ヒトインスリン、Ａｓｐ（Ｂ９）、　Ｇｌｕ（Ｂ２２ ）、　Ｇｌ　ｕ（Ｂ２６）、　Ａｓｐ（Ａ２１）ヒトインスリン、Ｇｌ　ｕ（Ｂ ３）、　Ｇｌｕ（Ｂ１６）、　Ａｓｐ（Ａ１２）、　Ａｓｐ（Ａ２１）ヒトイン スリン、Ｇｌｕ（Ｂ１６）、　Ｇｌｕ（Ｂ２２）　ヒトインスリン、Ａｓｐ（Ｂ ｌ６）、　Ｇｌ　ｕ（Ｂ２２）ヒトインスリン、Ｇｌｕ（Ｂ１６）、　Ａｓｐ（ Ａ１４）　ヒトインスリン、Ｇｌｕ（８１６）、　Ｇｌｕ（８２１）、　Ａｓｐ （Ａ１４）ヒトインスリン、Ｇｌｕ（Ｂ２６）、　Ｇｌｕ（Ｂ２９）　ヒトイン スリン、Ａｓｐ（Ｂ２６）、　Ｇｌｕ（Ｂ３０）ヒトインスリン、Ａｓｐ（Ｂ２ ８）、　Ｇｌｕ（Ａ１２）　ヒトインスリン、Ａｓｐ（Ｂ２）、　Ｇｌｕ（Ｂ１ ６）、　Ａｓｐ（Ａ１２）、　Ａｓｐ（Ａ２１）ヒトインスリン、Ｇｌｕ（Ｂ３ ）、Ｇｌｕ（Ｂ９）、　Ｇｌｕ（Ｂ２９）ヒトインスリン、Ｇｌｕ（Ｂ９）、　 Ａｓｐ（Ｂ２２）、　Ｇｌｕ（８３１）　ヒトインスリン、Ａｓｐ（Ｂ９）、　 Ａｓｐ（Ｂ１６）、　Ｇｌｕ（８２６）、　Ｇｌｕ（８２Ｂ）、　Ａｓｐ（Ａ２ １）　ヒトインスリン、Ａｓｐ（Ｂ１６）、　Ａｓｐ（Ｂ２６）、　Ｇｌｕ（Ｂ ３１）、　Ａｓｐ（Ｂ３２）　ヒトインスリン、Ａｓｐ（Ｂ２２）、　Ｇｌｕ（ ８２６）ヒトインスリン、Ｇｌｕ（Ｂ９）、　Ａｓｐ（Ｂ２２）、　Ｇｌｕ（Ｂ ３１）ヒトインスリン、およびＡｓｐ（Ｂｌ）、　Ａｓｐ（Ｂ４）、　Ａｓｐ（ ８１０）、　Ａｓｐ（８１６）、　Ｇｌｕ（８２７）ヒトインスリン。

ｌ肌例用鞭望返所 本発明に係る新規インスリン類似体は、生来のヒトプロインスリン遺伝子中の適 当な部位のコドンを所望のアミノ酸残基置換基をフードするコドンにより置き換 えることによってプロインスリン遺伝子を変更するか、または所望のインスリン 類似体をコードする全ＤＮＡ配列を合成することにより調製することができる。

次いで、所望のインスリン類似体をコードする遺伝子を適当な発現ベクター中に 挿入し、この発現ベクターを所望の生成物を産生ずる適当な宿主生物、例えばＥ 、コリ（ＬＪＬＬＬ）、バシラス（匣吐■皿）または酵母に導入する。次いで、 発現産物が細胞から分泌されるか否かに依存して細胞または培養ブロスから発現 産物を単離する。

新規インスリン類似体は、Ｍｉｋｉら（Ｈｏｐｐｅ−８ｅｙｌｅｒ’ｓ　Ｚ、　 Ｐｈｙｓｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、、３６０　（１９７９）、　１６１９−１６３２　）により記載され た方法に類似した方法による化学合成によって調製することもできる。それらは また、適当なアミノ酸残基置換を含有する別個に試験管内調製したＡ鎖またはＢ 鎖から作製し、次いで既知の方法〔例えばＣｈａｎｃｅら、Ｒｉｃｋ。

Ｄ、Ｈ，、Ｇｒｏｓｓ、　Ｅ、　（編者）　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ　：　５ｙｎｔｈ ｅｓｊｓ−Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−Ｆｕｎｃｔｉｏｎ、　Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ 　ｏｆ　ｔｈｅ　５ｅｖｅｎｔｈ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　ＰｅｐｔｉｄｅＳｙｍｐ ｏｓｉｕｍ、　ｌ１ｌｉｎｏｉｓ、　ｐｐ、７２１−７２８　）に従ってジスル フィド架橋を樹立することにより、変更されたＡ鎖とＢ鎖を一緒に連結してもよ い。

インスリン類似体は更に、欧州特許出願第０１６３５２９Ａ号（その開示は参考 により本明細書中に組み込まれる）に記載された方法に類似した方法により調製 することもできる。そのような方法によれば、ペプチド結合かまたは様々な長さ のペプチド鎖のいずれかにより１ｙｓ（８２９）がＧＩＦ（Ａ２１）に結合され ているヒトインスリンのインスリン前駆体が酵母により発現・分泌され、次いで いわゆるペプチド転移反応によりヒトインスリンに変換される。

従って、本発明のインスリン類似体は、酵母中に導入して形質転換された酵母株 を適当な培地中で培養した時、Ｌｙｓ（Ｂ２９）がペプチド結合または式■を有 するペプチド鎖ニ ーＲ，−Ｒ’−（ＩＩ） （上式中、Ｒはｎ個のアミノ酸残基を有するペプチド鎖であり、ｎはθ〜３３の 整数であり、そしてＲ１はＬｙｓまたはＡｒｇである）によりＧｌｙ（Ａ２１） に結合しているインスリン類似体の前駆体を発現および分泌することができる適 当な酵母発現ビヒクル中に、問題のインスリン類似体の前駆体をコードするＤＮ Ａ配列を挿入することにより、調製することができる。

次いで、培養ブロスから前記前駆体を回収し、そして米国特許第４、３４３．８ ９８号明細書に記載されたのと同様に、触媒としてトリプシンまたはトリプシン 様酵素を使って水と有機溶媒の混合物中で、式■を有するアミノ化合物： Ｒ”　−Ｒ”　−Ｒ’　−ＯＲ’　（ＩＩＩ）Ｃ上式中、Ｒ２はＴｈｒ、　Ａｓ ｐまたはＧｌｕであり、Ｒ３とＲ４は各々ＧｌｕもしくはＡｓｐまたはペプチド 結合であり、そしてＲ６はカルボキシ保護基（例えばメチルまたはｔｅｒｔ−ブ チル）である〕と反応せしめ、次いでカルボキシ保護基を除去し、そして反応混 合物からインスリン類似体を単離する。・インスリン類似体は、欧州特許出願第 ８６３０２１３３．３号（その開示は参考により本明細書中に組み込まれる）中 に記載された方法に類似した方法によっても調製することができる。この方法に よれば、塩基性アミノ酸（Ｌｙｓ、　Ａｒｇ）の単一ベアから成るＡ鎖とＢ鎖の 架橋を有する形のインスリン前駆体が酵母中で生産され、次いで酵素的変換によ りインスリンに変換される。

インスリン類似体の前駆体をコードする遺伝子は、対応するヒトインスリン前駆 体をコードする遺伝子を部位特異的突然変異誘発により変更して所望の変異をコ ードするコドンを挿入するかまたはそのようなコドンで置換することにより調製 することができる。インスリン類似体の前駆体をコードするＤＮＡ配列は、イン スリン類似体前駆体遺伝子に完全にまたは部分的に相当するオリゴヌクレオチド からの酵素的合成により調製することもできる。

次いで、所望の変異を有する遺伝子を含有するＤＮＡ配列を適当なプロモーター 配列、例えばＴＰＩプロモーター（ＴＰＩｐ）　（Ａｌｂｅｒ、　Ｔ。

およびＫａｗａｓａｋｉ、　Ｇ、、　Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　５ｅｑｕｅｎｃｅ 　ｏｆ　ｔｈｅ　ＴｒｉｏｓｅＰｈｏｓｐｈａｔｅ　Ｉｓｏｍｅｒａｓｅ　Ｇｅ ｎｅ　ｏｒ　Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｆｓｉａｅ、　Ｊ、　Ｍ ｏｌ。

Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｇｅｎｅｔ、■（１９８２）、　４１９−４３４）　、適当な リーダー配列および可能な転写終結配列、例えばＳ、セレビシェ−（、ｃｅｒｅ ｖｉｓ’ａｅ）ＴＰＩ由来のもの（ＴＰＬ、）と組み合わせる。それらの断片は 、前駆体をコードする遺伝子の高速転写を保証する配列を提供し、また分泌経路 中への前駆体の局在化および増殖培地中へのそれの最終的排出を行うことができ るプレ配列も提供する。発現単位には更に酵母の複製開始点、例えば２μ開始点 、および選択可能マーカー、例えばＬＥＵ　２が用意される。

本発明の目的上、本発明者らは、Ｌ、　Ｔｈ１ｍら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、八 ｃａｄ。

Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８３　（１９８６）、　６７６６−６７７０およびＪ、　Ｍ ａｒｋｕｓｓｅｎら、Ｐｒｏｔｅｉｎ［Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　１　（１９８ ７）、　２１５−２２３により記載されたように、オリゴヌクレオチドの連結に 次いで酵母発現プラスミド中への遺伝子の挿入により問題のインスリン類似体前 駆体をコードする遺伝子を調製した。

オリゴヌクレオチドから連結により前駆体Ｇｌｕ（Ｂ９）、　Ｂ（１−２９）− Ａｌａ−八１ａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ（Ａ２１）、　Ａ（１−２１）のための合成遺 伝子を作製した。それらのオリゴヌクレオチドは、調整微孔ガラス支持体上での ホスホルアミダイト化学を使って自動ＤＮＡ合成装置上で合成した（Ｂｅａｕｃ ａｇｅ。

Ｓ、　Ｌ、およびＣａｒｕｔｈｅｒｓ、　ｌＪ、Ｉｌ、　Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏ ｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　Ｈ（１９８１）、　１８５９−１８６９　）。合成前駆体 遺伝子は次のように構成された：ＤＮＡ配列の上の文字と数字は、それぞれ、Ｂ 鎖およびＡ鎖中の対応するアミノ酸残基（１文字略号を使用）とそれらの位置を 示す。

配列Ａ　Ａ　Ｋ　（ＡｌａＡｌａＬｙｓ）はＢ鎖の８２９位とＡ鎖の４１位を接 続する架橋である。

Ｗｏ　８９／１０９３７に記載のものと同様な方法により、次の配列をコードす るプラスミドを得た： ＴＰＩ、−ＭＦαＩ−シグナル−リーダー（１−８５）−前駆体遺伝子−ＴＰｌ ｔここでＭＰ（ＺｌはＳ、セレビシェＭＰ（Ｚｌ　コード配列（Ｋｕｒｊａｎ、 　Ｊ、およびＨｅｒｓｋｏｗｉｔｚ、　１．、　Ｃｅ１ｌ　３０　（１９８２） 　９３３−９４３　）であり、そしてシグナル−リーダー（１−８５）は該配列 がＭＦα１シグナル−リーダー配列の最初の８５アミノ酸残基を含むことを意味 する。

Ｓ、セレビシｘ　−（Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）　（Ｅ２−７Ｂ　ＸＢＩＩ −３６ａ／ａ、　Δｔｐｉ　Δｔｐｉ、　ｐｅｐ　４−３／ｐｅｐ　４−３）を ＹＰＧａＬ　（１％　Ｂａｃｔｏ酵母エキス、２％Ｂａｃｔｏペプトン、２％が ラスドース、１％ラクテート）上で６００　ｎｍで０．６の光学濃度まで増殖さ せた。

１００−の培養物を遠心により収得し、ｌＯ−の水で洗浄し、再遠心し、そして １．２Ｍソルビトール、２５ｍＭ　ＮａｔＢＤＴＡ　ｐＨ＝８．０および６．７ ■／ｄのジチオトレイトールを含む溶液１０Ｍ１中に再懸濁した。該懸濁液を３ ０℃にて１５分間インキュベート・し、遠心し、そして１．２Ｍソルビトール、 １０ｍＭ　Ｎａ！ＢＤＴＡ、０．１Ｍクエン酸ナトリウム　ｐＨ＝５．８および ２■のＮｏｖｏｚｙｍ＠　２３４を含む溶液１〇−中に細胞を再懸濁した。

この懸濁液を３０℃にて３０分間インキュベートし、遠心により細胞を収集し、 ｌＯ−の１．２Ｍソルビトールと１０−のＣＡＳ　（１，２Ｍソルビトール、１ ０ｍＭ　ＣａＣ１，、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　［Ｔｒｉｓ　＝　トリス（ ヒドロキシメチル）アミノメタンＩ　ｐＨ＝７．５）中で洗浄し、モして２−の ＣＡＳ中に再懸濁した。形質転換のため、ＣＡＳ中に再懸濁した細胞０．１ｄを 約ｌμｇの上記プラスミドと混合し、室温で１５分間放置した。１−の（２０％ ポリエチレングリコール４０００．１１００Ｉ　ＣａＣＩｔ、１０ｍＭ　Ｔｒｉ ｓ−ＨＣＩ　、　ｐＨ＝７．５）を添加し、混合物を室温で更に３０分間放置し た。この混合物を遠心し、ベレットを０．１−のＳＯ３（１，２Ｍソルビトール 、３３％ｖ／ｖ　ＹＰＤ、６．７ｍＭ　ＣａＣ１ｔ　、１４℃ｇ、／ｒｄｏイシ ン）中に再懸濁し、３０℃にて２時間インキュベートした。次いでこの懸濁液を 遠心し、ベレットを０．５−の１．２Ｍソルビトール中に再懸濁した。次いで、 ５２℃の６−のトップアガー（１，２Ｍソルビトール＋２．５％寒天を含有する ＳｈｅｒｍａｎらのＳＣ培地（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｙｅａｓｔ　Ｇｅｎｅｔ ｉｃｓ、　ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　１ ９８１）　）を添加し、該懸濁液を、同じ寒天凝固ソルビトール含有培地を含む プレートの上に注いだ。３０℃にて３日後に形質転換体コロニーを採取し、再単 離し、液体培養を開始するのに使・った。

形質転換体株を３０°Ｃにおいて１５００１の培養槽中でＹＰＤ培地（１％酵母 エキス、２％ペプトン［Ｄｉｆｃｏ　１ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから１および２ ％グルコース）上で増殖させた。培養ブロスから発現産物を単離した。

さ１天上五腹 Ｌ−スレオニンメチルエステル酢酸塩（３８，６ｇ、　０．２モル）をジメチル ホルムアミド中に溶解させて１００　ｒｄの溶液にし、５０−の７６．５％（Ｖ ／Ｖ）ジメチルホルムアミド／水を前え、この混合物中に１０　ｇの粗製Ｇｌｕ （Ｂ９）、　［３（１−２９）−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ（Ａ１２）、 　Ａ（１−２１）ヒトインスリンを溶かし、それを１２℃でサーモスタット制御 した。次いで０．０５Ｍ酢酸カルシウム２５−中のトリプシン１ｇを添加し、１ ２℃にて２４時間後、混合物をアセトン２１に添加し、沈澱したペプチドを遠心 によって単離し、真空乾燥した。カラム母材としてシリカ−Ｃ１８を使って分取 用ＨＰＬＣカラム上でＧｌｕ（Ｂ９）、　Ｇｌｕ（Ａ２１）、　Ｂ３０Ｔｈｒ− ＯＭｅヒトインスリンを精製した。

Ｇｌｕ（Ｂ９）、　Ｇｌｕ（Ａ２１）、　Ｂ３０Ｔｈｒ−ＯＭｅヒトインスリン を１％（ｗ／ｖ）になるように水中に分散させ、１０．０のｐＨ値になるように ＩＮ水酸化ナトリウムを添加することによって溶解させた。ｐＨ値を２５℃で２ ４時間ｌ０９０に一定に維持した。約８％（胃／Ｖ）への塩化ナトリウム、約１ ．４％（Ｗ／Ｖ）への酢酸ナトリウム三水和物および約０．０１％（Ｗ／Ｖ）へ の酢酸亜鉛二水和物の添加に次いで、ｐＨ５，５へのＩＮ塩酸の添加により、形 成したＧｌｕ（Ｂ９）、　Ｇｌｕ（Ａ２１）ヒトインスリンを沈澱させた。Ｇｌ ｕ（Ｂ９）。

Ｇｌｕ（Ａ２１）ヒトインスリン沈澱物を遠心により単離し、アニオン交換クロ マトグラフィーにより精製し、そしてゲル濾過により脱塩した。

失漣史又 Ａｓ　ＢＩ　Ａｓ　Ｂ４　Ａｓ　８１０　Ａｓ　８１６　１ｕＢ２７ヒトインス リンの盈 次の組成を有する合成前駆体遺伝子を使って、実施例１に記載の方法と同様な方 法により表題生成物を調製した。

５　６　７　Ｇ　９１０１１１２１）　１４１５１６１７１８１９２０２１イオ ン　によ　インスリンの ３つの異なるインスリン、即ち１）ヒトインスリン（１）、２）欧州特許出願第 ８６３０６７２１．１に記載のようにして得られた分子中に２つの余分な負電荷 を有するＡｓｐ（Ｂ９）、　Ｇｌｕ（Ｂ２７）ヒトインスリンである単量体イン スリン類似体（２）、３）本実施例２に記載のようにして得られた分子中に５つ の余分な負電荷を有するＡｓｐ（Ｂｌ）、　Ａｓｐ（８４）、　Ａｓｐ（８１０ ）。

Ａｓｐ（８１Ｂ）、　Ｇｌｕ（Ｂ２７）ヒトインスリンである単量体インスリン 類似体（３）を、イオン電気導入による経皮流量について試験管内で比較した。

測定はＧ１１ｋｆｅｌｄ、　Ｐ、ら、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｒｅ５ｅ ａｒｃｈ　５　（１９８８）４４３−４４６により記載されたようなセル中で実 施した。接着テープで２０回はがした無毛のマウス皮膚切片の同じ側に陽極と陰 極を配置した。電極室中のｐｌ変化を最小にするために使うＡｇ／ＡｇＣ１電極 を皮膚の表面から３５１ｍ上に置いた。陰極室に１よリン酸塩緩衝化（０，０３ Ｍ。

ｐ）（７，４）インスリン溶液を入れ、陽極室には塩類を含むかインスリンは含 まない同様な緩衝液を入れた。電極区画と受容体区画とを離してセルを皮膚と合 体させた。後者の区画に０．３％ウシ血清アルブミンを含むリン酸緩衝液を満た し、同溶液を２−７時の速度で潅流させた。イオン電気導入は、商用電力供給か ら電極に供給される０、５ｍＡ／ｃａｒの定電流で６時間行った。この実験にお けるマウス皮膚の暴露面積は０．５５Ｃ１１であり、適用される電流は０．２８ （ＯＡであった。

１時間毎に収集した潅流液の２−画分をインスリンラジオイムノアッセイにより 分析した。

表１は実験の結果を報告する。ヒトインスリン（１）を使った実験中に収集した 両分中のインスリンの濃度は検出限界より下であった。

マウス皮膚を通過したインスリン類似体（２）および（３）の試験管内セルあた りの輸送量は、供給室中の問題の類似体の濃度、即ち濃度により標準化された輸 送量に関連して表される。

表１ 要約すれば、マウス皮膚を通過するヒトインスリンの測定可能な流量は６時間の イオン電気導入の間に全（検出できなかったが、２つの単量体類似体ではほぼ一 定の流量が観察され、最大に負に荷電した類似体（３）は（２）の流量より２〜 ３倍高い流量を示した。

国際調査報告 一１１ｓｒＰｅｌｌｉ＋ｌ＋ｔｈｅ＠ｉｌ・ＰＩｍ”ｌ１１？−１１ｍｂａｎＴ ｅｍ＋ｈ＠ＩｌｌＩＭＱ階ｍ・ｅｃｕ＋＋ｗ＋−雷ｔｃ＋＋魔■奄撃戟{ｍａｈ ｅｖｅｉ−・−ｎｉｅ＋＋ツをＭｐ＜＊１ｌｌｌｌＩｎｌＮ＃ｍＴｔｈＩｔｅｍ ＠Ｔｂ＃Ｗｅａｋｅｎ、ｒｅＭＩＩｍ＋ｈ、＊ｍ１１ｈｅｌ＋Ｍ＋１ｈＰ＋＋ｅ ｅ＋ｏｕｔｎｆＯＰｌ暴−−−−２８１０３／９２−）＠Ｓ＋ｅｆｌｌｌ？Ｐａ 鴫＠内１ｏｕｎｃｅＩＩＩＭＭ６ｗｔ＋ｌｕ＆ｌ＃ｌｙ電％Ｍ轡Ｎ１１ｌｅｌｌ 軸ＩＦＩｅＮ＋υａｍ＋＋ｔｏ{ｍｙ９１４ｆｏｒｌｊｎｅｗｔｏ＋ｔｏｒＩＰ ＋ｏｒ＋ｔｖｌ１６＾フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号／／　Ｃ０７Ｋ　９９：２ ６ （Ｃ１２Ｐ　２１１０２ Ｃ１２Ｒ１：８６５） （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＳＥ）、０Ａ（ＢＦ 、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、ＣＭ、ＧＡ、ＧＮ、ＭＬ、ＭＲ，ＳＮ、ＴＤ、ＴＧ ）、ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　Ｃ３，ＦＩ、　ＨＵ、ＪＰ。

ＫＰ、ＫＲ，ＬＫ、ＭＧ、ＭＷ、Ｎｏ、ＰＬ、ＲＯ，ＲＵ、ＳＤ Ｉ

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. １．一般式Ｉ： Ａ鎖 【配列があります】 Ｂ鎖 【配列があります】 Ａ鎖（続き） 【配列があります】 Ｂ鎖（続き） 【配列があります】 Ｂ鎖（続き） 【配列があります】 （Ｉ） （上式中、ＸまたはＺと指示された位置の少なくとも１個のアミノ酸残基と更に ＹまたはＷと指示された位置の少なくとも１個のアミノ酸残基が独立的にＡｓｐ またはＧｌｕにより置換され、残りのＸ，Ｙ，ＺまたはＷがヒトインスリン中の 関連する位置に存在するアミノ酸残基を示し、Ｂ鎖の末端は場合により、Ａｓｐ とＧｌｕの中から独立的に選択することができる１個または２個のアミノ酸残基 により延長される） を有するインスリン類似体。
2. ２．Ｘと指示された位置の１個のアミノ酸残基と更にＹ，ＺまたはＷと指示され た位置の少なくとも１個のアミノ酸残基が独立的にＡｓｐまたはＧｌｕにより置 換され、残りのＸ，Ｙ，ＺまたはＷがヒトインスリン中の関連する位置に存在す るアミノ酸残基を示し、Ｂ鎖の末端が場合によりＡｓｐとＧｌｕの中から独立的 に選択することができる１個または２個のアミノ酸残基により延長される、請求 項１に記載のインスリン類似体。
3. ３．ＸまたはＺと指示された位置の２個のアミノ酸残基と更にＹまたはＷと指示 された位置の少なくとも１個のアミノ酸残基が独立的にＡｓｐまたはＧｌｕによ り置換され、残りのＸ，Ｙ，ＺまたはＷがヒトインスリン中の関連する位置に存 在するアミノ酸残基を示し、Ｂ鎖の末端が場合によりＡｓｐとＧｌｕの中から独 立的に選択することができる１個または２個のアミノ酸残基により延長される、 請求項２に記載のインスリン類似体。
4. ４．総置換数が少なくとも５である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のイン スリン類似体。
5. ５．Ｗと指示された位置の１個のアミノ酸残基がＡｓｐまたはＧｌｕにより置換 される、請求項１〜４のいずれか一項に記載のインスリン類似体。
6. ６．Ｗと指示された位置の２個のアミノ酸残基が独立的にＡｓｐまたはＧｌｕに より置換される、請求項１〜４のいずれか一項に記載のインスリン類似体。
7. ７．Ｗと指示された位置の３個のアミノ酸残基が独立的にＡｓｐまたはＧｌｕに より置換される、請求項１〜４のいずれか一項に記載のインスリン類似体。
8. ８．Ｙと指示された位置の１個のアミノ酸残基がＡｓｐまたはＧｌｕにより置換 される、請求項１〜４のいずれか一項に記載のインスリン類似体。
9. ９．Ｙと指示された位置の２個のアミノ酸残基が独立的にＡｓｐまたはＧｌｕに より置換される、請求項１〜４のいずれか一項に記載のインスリン類似体。
10. １０．Ｙと指示された位置の３個のアミノ酸残基が独立的にＡｓｐまたはｇｌｕ により置換される、請求項１〜４のいずれか一項に記載のインスリン類似体。
11. １１．請求項１〜１０のいずれか一項に記載のインスリン類似体を含んで成る医 薬組成物。
12. １２．糖尿病の治療用の医薬組成物の製造のための請求項１〜１０のいずれか一 項に記載のインスリン類似体の用途。
13. １３．本明細書中に記載される任意の新規特徴または特徴の組合せ。